KR20220159914A - 살모넬라 갈리나룸 변이균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
살모넬라 갈리나룸 변이균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 백신 조성물은 병원성 회복 위험이 없고, 내독소의 독성이 제거되어 잔존하는 병원성이 없으며, 병변과 균의 재분리가 일어나지 않아 기존의 가금티푸스 백신보다 안전성이 현저히 개선되었다. 또한, 어린 일령의 병아리에 투여 시에도 높은 면역반응을 유도하여 일령에 관계 없이 사용 가능하며, 백신주 자체로 높은 방어력을 갖는 생균 백신으로 사용할 수 있어 가금티푸스의 예방 및 경감에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
Description
살모넬라 갈리나룸 변이균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
가금티푸스(Fowl typhoid)는 형태학적으로 그람음성인 단간균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum, S. Gallinarum)에 의해 발생하는 중요 세균성 질병으로, 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급성 및 만성의 전염병이다. 해당 질병은 모든 일령에서 나타날 수 있으며 패혈증에 의해 높은 폐사율이 나타난다. 닭이 가금티푸스에 감염되어 나타나는 일반적인 증상은 급성 폐사, 간, 비장, 그리고 신장의 종대, 간의 흰색 괴사반점 및 청동간, 수양성 내지는 점액성의 노란색 설사, 산란 감소 등이 일어날 수 있으며, 산란 중에 티푸스 발병 시 오랜 기간에 걸친 산발적인 폐사가 일어날 수 있다. 국내 가금티푸스 발병은 1992년 최초 보고 이래 2001년까지 점차 증가하였으며 2017년 발생 두수는 121,495, 2018년 112,009, 2019년 101,204로 최근에도 지속적으로 발생하고 있다. 성계나 백세미에서의 가금티푸스는 그 증상이 심하게 나타나지 않아 현장에서 항생제 처치가 이루어지는 점을 감안하면 실제 발생빈도는 더 높을 것으로 예상되며 그 경제적 피해가 막대하다.
이러한 가금티푸스의 예방을 위해 여러 백신들이 개발되어 왔으나 현재 시장에서 가장 선택 받고 있는 제품은 SG9R 약독화 생균백신이다. 생균백신은 백신 균주가 야외주와 유사한 감염경로를 거치며 면역계를 활성화하기 때문에 사균백신에 비해 더 강하고 지속기간 역시 더 길다고 알려져 있다. SG9R은 그람음성균의 핵심 항원인 지질다당류를 합성하는 유전자 중 하나인 rfaJ 유전자의 9번째 염기 아데닌이 사이토신으로 변이되며 논센스 돌연변이(nonsense mutation)가 일어나 약독화된 균주이다. rfaJ 유전자의 변이는 이후의 모든 다당류 합성이 이루어지지 못함에 따라 다당류 사슬의 길이가 짧은 반조면 균주(semi-rough strain)으로 표현형의 변이가 나타나게 된다. 짧은 다당류 사슬은 균이 항체나 보체와 같은 숙주의 면역 시스템에 대한 저항성을 낮춰 병원성이 약해져 백신으로써 사용을 가능하게 한다. 그러나, 염기 하나의 변이에 의한 약독화이기 때문에 역돌연변이에 의해 병원성을 획득할 가능성이 있으며 실제로 SG9R을 접종한 농장에서 백신주와 유사한 유전적 배경을 보이는 균이 분리되는 사례도 다수 보고되었다. 뿐만 아니라, SG9R은 백신 자체의 잠재적인 병원성도 강하여 어린 일령의 병아리 또는 영양이 부족하거나 다른 질병에 의해 면역이 억제된 개체에서는 간 병변이 나타나며 심하면 폐사할 수 있다. 따라서, 기존 백신주 대비 안전성이 개선된 신규 가금티푸스 백신이 요구되는 실정이다.
본 발명자들은 SG9R의 rfaJ 유전자를 인위적으로 결실시킨 살모넬라 갈리나룸 변이균주 Safe-9R, 및 상기 Safe-9R에서 추가적으로 lpxL 유전자와 lpxM 유전자를 각각 인위적으로 결실시킨 살모넬라 갈리나룸 변이균주 Dtx-9RL 및 Dtx-9RM을 제작하고, 상기 살모넬라 갈리나룸 약독주는 병원성 회복 위험이 전혀 없고, 내독소의 독성이 제거되어 잠재적인 병원성이 낮으면서도 특히 어린 병아리에 접종한 결과 충분한 면역효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 rfaJ 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 살모넬라 갈리나룸 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 살모넬라 갈리나룸 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 rfaJ 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 균주를 제공한다.
상기 rfaJ 유전자는 리포폴리사카라이드 1,2-글루코실트랜스퍼라제(Lipopolysaccharide 1,2-glucosyltransferase)를 코딩하는 유전자로, 예를 들어 NCBI accession number: NC_011274.1에 해당하는 genome의 염기서열 중 3904235~3905248에 해당하는 염기서열일 수 있다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_011274.1?report=fasta&from=3904235&to=3905248).
일 양상에 따른 살모넬라 갈리나룸 변이주는 rfaJ 유전자의 단일 뉴클레오티드 변이가 아닌, rfaJ 유전자 자체가 결실된 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 용어 "결실(deletion)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 넉아웃(knock-out), 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절(down-regulation)을 의미한다. 유전자를 결실시키는 방법으로는, 당해 기술분야에 알려진 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상동재조합(homologous recombination)"은 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.
일 구체예에서는, SG9R을 기반으로 상동재조합에 의해 rfaJ 유전자를 제거하였고, 상기 rfaJ 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 Safe-9R로 명명하였다.
본 명세서는 또한, 상기 Safe-9R을 기반으로, lpxL 유전자가 추가적으로 결실된 살모넬라 갈리나룸 균주를 제공한다.
본 명세서는 또한, 상기 Safe-9R을 기반으로, lpxM 유전자가 추가적으로 결실된 살모넬라 갈리나룸 균주를 제공한다.
상기 lpxL 유전자는 지질 A 생합성 라우로일트랜스퍼라제(Lipid A biosynthesis lauroyltransferase)를 코딩하는 유전자로, 예를 들어 NCBI accession number: NC_011274.1에 해당하는 genome의 염기서열 중 2027901~2028821에 해당하는 염기서열일 수 있다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_011274.1?report=fasta&from=2027901&to=2028821).
상기 lpxM 유전자는 지질 A 생합성 미리스토일트랜스퍼라제(Lipid A biosynthesis myristoyltransferase)를 코딩하는 유전자로, 예를 들어 NCBI accession number: NC_011274.1에 해당하는 genome의 염기서열 중 1245903~1246874에 해당하는 염기서열일 수 있다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_011274.1?report=fasta&from=1245903&to=1246874).
일 구체예에서는, Safe-9R을 기반으로 상동재조합에 의해 lpxL 또는 lpxM 유전자를 추가적으로 제거하였고, 상기 lpxL 또는 lpxM 유전자가 추가적으로 결실된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 Dtx-9RL 및 Dtx-9RM으로 명명하였다.
상기 Safe-9R, Dtx-9RL 및 Dtx-9RM 변이주는 항생제 내성 유전자가 추가적으로 결실된 것일 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는, 테트라사이클린 내성 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 살모넬라 갈리나룸 균주(Safe-9R, Dtx-9RL 및 Dtx-9RM 변이주; 및 항생제 내성 유전자가 추가적으로 결실된 변이주)를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 일 양상에 따른 백신 조성물의 투여로 가금티푸스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.
백신의 종류에는 크게 병원성을 약독화시킨 약독화 백신(attenuated vaccine)과 병원체를 완전히 죽인 불활화 백신(inactivated vaccine 또는 killed vaccine)이 있다. 상기 약독화 백신은 약독화백신 또는 생균백신이라고도 하며, 상기 불활화 백신은 사균백신 또는 사독백신이라고도 한다.
본 명세서에서 용어 "생균"은 생균백신 또는 생백신을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 상기 생균은 세균이나 바이러스를 병원성을 약하게 하여 동물에 투여되었을 때 질병의 임상적 증상이 없거나 감소되었음을 나타내는 바이러스를 의미하는 것이다. 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸은 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 바이러스의 계대배양을 통해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "사균"은 사균백신 또는 사독백신을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 상기 사균은 세균이나 바이러스를 가열하거나 포르말린이나 페놀 등의 화학약품에 의해서 면역원성을 잃지 않고 병원성을 불활성으로 한 것을 의미하는 것이다. 상기 불활화는 당업계에 알려진 방법이면 제한 없이 사용하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균을 가열하여 불활화시킨 것일 수 있다.
일 양상에 따른 백신 조성물은 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균백신 또는 사균백신으로 사용될 수 있다. 특히, 일 구체예에서는, 일 양상에 따른 백신 조성물을 어린 병아리에게 생균백신 형태로 접종 시 기존 백신보다 안전성이 뛰어나면서도 방어능이 우수함을 확인하여 가금티푸스 예방용 백시 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 백신 조성물의 투여량은 닭의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 달리할 수 있고, 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
상기 백신 조성물은 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 근육 내 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 수의학적으로 허용 가능한 담체일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
또한, 상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드, Marcol-Aracel, Chlorhexidine 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 바람직하게는 MONTANIDE ISA70 (VG), ISA71 (VG), ISA71R (VG), ISA206 (VG), ISA201 (VG), ISA763 (A VG), IMS1313 (VG N) 또는 GEL01를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 MONTANIDE ISA70 (VG)을 어쥬번트로 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 살모넬라 갈리나룸 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 사료 조성물을 제공한다.
상기 사료 조성물은 가금티푸스에 대한 보호 효과가 우수하여 가금티푸스의 예방 및 면역증강에 기여할 수 있다.
상기 사료 조성물은 일 양상에 따른 살모넬라 갈리나룸 변이균주의 생균 또는 사균을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가금류 사육에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료 조성물을 공급하는 경우는 가금 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또 다른 양상은 일 양상에 따른 백신 조성물을 가금에 접종하는 단계를 포함하는 가금티푸스를 예방하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 가금은 닭, 오리, 칠면조, 거위, 메추리, 꿩 및 기러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 가금은 닭일 수 있으며, 2주령 이하의 병아리일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 백신 조성물은 병원성 회복 위험이 없고, 내독소의 독성이 제거되어 잔존하는 병원성이 없으며, 병변과 균의 재분리가 일어나지 않아 기존의 가금티푸스 백신보다 안전성이 현저히 개선되었다. 또한, 어린 일령의 병아리에 투여 시에도 높은 면역반응을 유도하여 일령에 관계 없이 사용 가능하며, 백신주 자체로 높은 방어력을 갖는 생균 백신으로 사용할 수 있어 가금티푸스의 예방 및 경감에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 살모넬라 갈리나룸의 rfaJ 유전자를 결실시킨 Safe-9R, 및 Safe-9R 유래 녹아웃(knock-out) 변이주에서 rfaJ 유전자 결실을 PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A) Safe-9R 및 Safe-9R 유래 녹아웃 변이주에서 rfaJ 유전자 결실 확인. 레인1: SG9R; 레인2: Safe-9R; 레인3: △phoP/Q; 레인4: △lpxL; 레인5: △lpxM; 레인6: △pagP. (B) Safe-9R 유래 녹아웃 변이주에서 지질 A(lipid A) 생합성 관련 유전자의 결실 확인. 각 직사각형의 첫번째 레인은 녹아웃 변이주의 앰플리콘(amplicon)과 비교하기 위한 각 유전자에 대한 Safe-9R의 앰플리콘을 나타낸 것이다.
도 2의 a 내지 c는 살모넬라 갈리나룸의 rfaJ 유전자 결실(deletion)을 시퀀싱으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 OE Safe-9R 백신주의 체액성 면역 반응 결과를 나타낸 도이다. 1주령 병아리에 OE Safe-9R 백신주를 접종하고, 백신 접종 2주 후(2 wpv) 및 7주 후(7 wpv)에 혈청 샘플을 각각 수집하였다. 면역 반응은 Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum(SG) 면역원성 외막 단백질(OMP), OmpA와 OmpX, 및 총 OMP 추출물로 만든 ELISA로 분석하였다(* p <0.05).
도 4는 HD11 세포에서 각 녹아웃 변이주의 염증촉진성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 및 관련 유전자의 전사(transcription)에 대한 효과를 비교한 도이다. HD11 세포에 각 녹아웃 변이주를 감염시킨 후, 2-△△Ct 방법을 사용하여 IL-1β, IL-18, iNOS 및 TLR4 유전자의 상대적 전사 수준을 비교하였다(ns: 통계적으로 유의하지 않음, * p <0.05).
도 5는 내독소 제독 변이주의 독성을 증체율을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비활성화된 백신주를 1주령(A) 및 2주령(B) 병아리에 접종하고 체중 변화를 조사하였다(* p <0.05).
도 6은 OE 형태로 접종한 내독소 제독 변이주의 체액성 면역원성을 확인한 도이다(* p <0.05).
도 7은 생균 내독소 제독 변이주의 체액성, 및 점막 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다(* p <0.05).
도 8은 FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 분석한 PBMC에서의 CD8+ T 세포 비율을 확인한 결과를 나타낸 도이다(* p <0.05).
도 9는 FLP-FRT 재조합 시스템을 사용하여 후보 백신주에서 항생제 내성 유전자를 제거한 결과를 나타낸 도이다. 레인1, 2: Dtx9RM△kana; 레인3: Dtx9RM; 레인4: Safe9R; 레인5: 음성대조군. 사용된 프라이머는 lpxM 유전자를 타겟으로 함.
도 2의 a 내지 c는 살모넬라 갈리나룸의 rfaJ 유전자 결실(deletion)을 시퀀싱으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 OE Safe-9R 백신주의 체액성 면역 반응 결과를 나타낸 도이다. 1주령 병아리에 OE Safe-9R 백신주를 접종하고, 백신 접종 2주 후(2 wpv) 및 7주 후(7 wpv)에 혈청 샘플을 각각 수집하였다. 면역 반응은 Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum(SG) 면역원성 외막 단백질(OMP), OmpA와 OmpX, 및 총 OMP 추출물로 만든 ELISA로 분석하였다(* p <0.05).
도 4는 HD11 세포에서 각 녹아웃 변이주의 염증촉진성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 및 관련 유전자의 전사(transcription)에 대한 효과를 비교한 도이다. HD11 세포에 각 녹아웃 변이주를 감염시킨 후, 2-△△Ct 방법을 사용하여 IL-1β, IL-18, iNOS 및 TLR4 유전자의 상대적 전사 수준을 비교하였다(ns: 통계적으로 유의하지 않음, * p <0.05).
도 5는 내독소 제독 변이주의 독성을 증체율을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비활성화된 백신주를 1주령(A) 및 2주령(B) 병아리에 접종하고 체중 변화를 조사하였다(* p <0.05).
도 6은 OE 형태로 접종한 내독소 제독 변이주의 체액성 면역원성을 확인한 도이다(* p <0.05).
도 7은 생균 내독소 제독 변이주의 체액성, 및 점막 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다(* p <0.05).
도 8은 FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 분석한 PBMC에서의 CD8+ T 세포 비율을 확인한 결과를 나타낸 도이다(* p <0.05).
도 9는 FLP-FRT 재조합 시스템을 사용하여 후보 백신주에서 항생제 내성 유전자를 제거한 결과를 나타낸 도이다. 레인1, 2: Dtx9RM△kana; 레인3: Dtx9RM; 레인4: Safe9R; 레인5: 음성대조군. 사용된 프라이머는 lpxM 유전자를 타겟으로 함.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유전자 결실을 통한 개선된 백신주 제작
1-1.
rfaJ
유전자의 결실
유전자 결실은 Gene Bridges 사(독일)의 Red/ET recombination kit(catalog number: K006)를 사용하여 수행되었다. 상기 키트는 원하는 부위의 이중가닥 DNA를 분해하는 람다-레드(Lambda-Red) 기술을 응용하여, 유전자에 파괴가 일어났을 때 상동재조합(homologous recombination)을 통해 복구함으로써 유전자를 결실시킬 수 있다.
먼저, 유전자 결실을 위해 PCR을 사용하여 결실시키고자 하는 부위에 맞는 상동 부위(homology arm)를 제작하였다. rfaJ 유전자에서 제거할 부위는 279nt부터 1284nt로, 해당 유전자의 논센스 돌연변이(nonsense mutation)가 일어난 이후부터 종결코돈까지에 해당된다. 살모넬라 갈리나룸 약독화 백신주 SNU5161을 액체배지(LB: Difco, USA)에서 37℃로 16시간 배양하였다. SNU5161은 가금티푸스 약독생균백신인 SG9R을 접종한 내역이 있는 국내 가금의 간 및 분변에서 분리한 것으로, 균 동정 결과 상기 SNU5161은 SG9R과 유전적으로 동일하였다. 배양한 균을 10% 글리세롤이 포함된 증류수로 3번 세척하여 형질전환이 잘 이루어지도록 하였다. 상기하였던 키트 내에 Red/ET 재조합 단백질 발현 플라스미드를 준비된 균에 전기천공법(2000V, 10μF, 600Ohms)으로 형질전환 시켰다. 그런 다음, 1ml의 LB 브로쓰에서 30℃, 70분 동안 진탕배양하였다가 테트라사이클린(tetracycline)을 첨가한 LB 아가에서 30℃, 16시간 이상 증균시켰다.
아가에서 확인된 콜로니는 테트라사이클린이 첨가된 LB 브로쓰에서 30℃조건으로 진탕배양한 뒤 50μl의 10% L-아라비노스(L-arabinose)를 첨가하여 37℃, 1시간 동안 진탕배양하였다. 그런 다음, 배양한 균을 10% 글리세롤이 포함된 증류수로 3번 세척하고, 상기한 상동 부위를 전술한 바와 동일하게 전기천공법으로 형질전환시켰다. 그런 다음, 형질전환된 균을 LB 브로쓰에서 37℃, 3시간 동안 진탕배양하고 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 아가에서 16시간 이상 정치배양하였다. PCR을 통해 생성된 콜로니는 기존 유전자 대신 카나마이신이 첨가된 카세트가 삽입된 것을 확인하였다.
그런 다음, 백신 내의 카나마이신 내성을 제거하기 위해 rfaJ 유전자를 결실시킨 균에 1μl의 707-FLPe 플라스미드를 전기천공법으로 형질전환시키고, LB 브로쓰에서 30℃, 70분 동안 진탕배양하였다. 이후, 카나마이신이 첨가된 LB 아가와 일반 LB 아가에 중복 배양하여 항생제 내성이 사라진 균주를 선발하였다.
1-2.
lpxL, lpxM
유전자의 결실
상기 실시예 1-2에서 제작한 rfaJ 유전자를 결실시킨 변이주를 기반으로, 전술한 바와 동일한 실험방법으로 lpxL, lpxM 유전자를 추가로 결실시켰다. 상기 lpxL, lpxM 유전자는 pagP, phoP/phoQ (phoP/Q) 유전자와 함께 지질 A 생합성에 관여하며, 지질 A는 살모넬라와 같은 그람 음성균의 내독소를 구성한다. lpxL 유전자는 시작코돈부터 917nt까지를, lpxM 유전자는 시작코돈부터 종결코돈까지 모두 제거하였다.
1-3. 제작 균주의 확인
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 제작한 변이주들을 PCR 및 시퀀싱을 통해 확인하였다. 구체적으로, G-spin Genomic DNA Extraction Kit for Bacteria(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 박테리아 게놈 DNA를 추출한 후, 주형 DNA(50 ng/μL) 1 μL, 10x 버퍼 3 μL, dNTP(5 mM) 3 μL, 각 프라이머 0.5μL(10 pmol/μL) 및 Taq 중합효소 0.25μL(MGmed, Korea)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5분 후; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 35회 반복하고; 마지막으로 72℃에서 5분 진행. PCR 앰플리콘은 PCR/Gel Purification Kit(MGmed)를 사용하여 정제하고 ABI 3711 자동 시퀀서(Cosmogenetech, Korea)를 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. 뉴클레오티드 서열은 BioEdit 프로그램 버전 7.2.5를 사용하여 번역 및 비교하였다. 추출한 게놈 DNA는 HiSeq 2000 플랫폼(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 시퀀싱하였으며 BWA 버전 0.7.12를 사용하여 필터링된 데이터를 National Center for Biotechnology Information 데이터베이스의 S. enterica serovar Gallinarum str. 287/91(GenBank Accession Number NC_011274.1)에 맵핑하여 Safe-9R 및 SG9R 균주 간 차이를 확인하였다. 실험에 사용한 모든 프라이머들을 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5'-3') | 서열번호 |
| rfaJ deletion F | CTTTAAACGTAAACTTCTTGAATAAAACCCATAGGTGATGTAATGGATTAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG | 1 |
| rfaJ deletion R | AGTTTTTAATCTTTTTTTCAATAATCATAATAGAGATTTAGGCAGGGGAATAATACGACTCACTATAGGGCTC | 2 |
| phoP/phoQdeletion F | CAACGCTAGACTGTTCTTATTGTTAACACAAGGGAGAAGAGATGATGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGCG | 3 |
| phoP/phoQdeletion R | ATAACGGATGCTTAACGAGATGCGTGGAAGAACGCACAGAAATGTTTATTTAATACGACTCACTATAGGGCTC | 4 |
| lpxL deletion F | CAAAAAGATGCGAGAATACGGGGAATTGTTCGTTGAAAGACAGGATAGAAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG | 5 |
| lpxL deletion R | AAAGCTAAAAGAGGGGAAAAATTGCAGCCTGACGGCTGCAATCCTGTCAATAATACGACTCACTATAGGGCTC | 6 |
| lpxM deletion F | GACGTCGCTACACTATTCACAATTCCTTTTCGCGTCAGCAGACCCTGGAAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG | 7 |
| lpxM deletion R | CATCAGGTAGTACAGGGTTTGTCAGCATAAAGCCTCTCTTACGAGAGGCTTAATACGACTCACTATAGGGCTC | 8 |
| pagP deletion F | TATTCAGGTTAATGTTGTTATTATCACAGTCGAATTTTTGAACGGTATGTAATTAACCCTCACTAAAGGGCG | 9 |
| pagP deletion R | GGCTTTTTAATTCACAACAGAACAATGCCCTTCTCCGTCAAAACTGGAAATAATACGACTCACTATAGGGCTC | 10 |
| phoP/phoQ F | CTGTTTATCCCCAAAGCACC | 11 |
| phoP/phoQ R | GCGAGAGCGGATCAATAAAG | 12 |
| lpxL F | GCTCAACGCAAAAAGATGCG | 13 |
| lpxL R | AGGGTGACATAGCGTTCCAC | 14 |
| lpxM F | CGATTAACAAATGCGCTGAC | 15 |
| lpxM R | GTTCAACCAATACCACGCGT | 16 |
| pagP F | CGCCGTTAACCCGATACTCT | 17 |
| pagP R | GCTGTGTCGGATACCAGTAC | 18 |
| rfaJ F | TCCAGTCGATGCTGATACTG | 19 |
| rfaJ R | GTAAACCCTTCTCGCCGAAC | 20 |
| TNF-α F | CCCCTACCCTGTCCCACAA | 21 |
| TNF-α R | TGAGTACTGCGGAGGGTTCAT | 22 |
| GAPDH F | CCCCAATGTCTCTGTTGTTGAC | 23 |
| GAPDH R | CAGCCTTCACTACCCTCTTGAT | 24 |
| IL-1β F | GCTCTACATGTCGTGTGTGATGAG | 25 |
| IL-1β R | TGTCGATGTCCCGCATGA | 26 |
| iNOS F | GCATTCTTATTGGCCCAGGA | 27 |
| iNOS R | CATAGAGACGCTGCTGCCAG | 28 |
| IL-18 F | ACGTGGCAGCTTTTGAAGAT | 29 |
| IL-18 R | GCGGTGGTTTTGTAACAGTG | 30 |
| TLR-4 F | GGCAAAAAATGGAATCACGA | 31 |
| TLR-4 R | CTGGAGGAAGGCAATCATCA | 32 |
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 시퀀싱 결과를 통해 rfaJ 유전자가 성공적으로 제거되었음을 확인하였고, 변이주 모두에서 rfaJ 유전자가 제거되었음을 확인하였다. rfaJ 유전자를 결실시킨 변이주를 Safe-9R이라 명명하고, Safe-9R를 기반으로 lpxL 또는 lpxM을 추가적으로 결실시킨 녹아웃 변이주를 각각 Dtx-9RL 및 Dtx-9RM이라 명명하였다.상기 Safe-9R 균주는 2021년 2월 4일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC14464BP를 부여 받았다. 상기 Dtx-9RL 균주는 2021년 2월 4일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC14463BP를 부여 받았다. 상기 Dtx-9RM 균주는 2020년 5월 21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC18822P를 부여 받았다.
실시예 2. Safe-9R과 SG9R의 염기서열 및 상동성 분석
상기 실시예 1에서 제작한 Safe-9R의 게놈 DNA를 추출하여 모균주인 SG9R(SNU5161)과의 염기서열을 비교하였다(도 2). NGS(Next Generation Sequencing)을 통해 NCBI에 등록된 NC_011274.1을 SG9R 기준 균주로 하여 비교한 결과, rfaJ 유전자를 포함하여 6개의 유전적 차이를 확인하였으나 그 중 1개는 코딩(coding) 영역이 아니었으며 3개는 침묵 돌연변이(silent mutation)였다. 마지막 1개는 트레오닌(threonine)이 세린(serine)으로 변이된 미스센스 돌연변이(missense mutation)이나 트레오닌과 세린은 메틸기와 수소이온의 차이 외에는 거의 유사하며 병원성과 연관이 없는 단백질로 표현형 상의 큰 차이는 없을 것으로 예상되었다.
실시예 3. Safe-9R의 생화학적 성상
VITEK 기기를 이용하여 상기 실시예 1에서 제작한 Safe-9R의 생화학적 성상을 확인하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, Safe-9R은 glucose/Fer, maltose, coumarate, O129 resistance(comp vibrio)가 음성이나, 병원성 가금티푸스균이나 SG9R 백신주는 이에 대해 양성을 나타내어 생화학적 성상에서 차이를 보임을 확인하였다.
| GN Card | Safe-9R | SG(야외주) | SG9R(기존 백신주) |
| 1. adonitol | - | - | - |
| 2. cellobiose | - | - | - |
| 3. H2S | - | - | - |
| 4. D-glucose | + | + | + |
| 5. glucose/Fer | - | + | + |
| 6. D-maltose | - | + | + |
| 7. D-mannitol | + | + | + |
| 8. D-mannose | + | + | + |
| 9. lipase | - | - | - |
| 10. Urease | - | - | - |
| 11. sorbitol | - | - | - |
| 12. sucrose | - | - | - |
| 13. trehalose | + | + | + |
| 14. citrate | - | - | + |
| 15. malonate | - | - | - |
| 16. phosphatate | (-) | - | (+) |
| 17. glycine | - | - | - |
| 18. ornithine | - | - | - |
| 19. lysine | + | + | + |
| 20. decarboxylase | |||
| 21. histidine | - | - | - |
| 22. coumarate | - | + | + |
| 23. O129 resistance (comp vibrio) |
- | + | + |
실시예 4. Safe-9R의 유전적 안정성 확인 맹검계대(Blind passage)를 수행하여 상기 실시예 1에서 제작한 Safe-9R의 유전적 안정성을 확인하였다. 구체적으로, Safe-9R을 LB 브로쓰에서 37℃, 24시간 진탕배양하고 1ml을 신선한 LB 브로쓰로 넘겨 다시 동일조건으로 배양하는 방식으로 10계대를 수행한 뒤, rfaJ 유전자 결실부위의 변이를 PCR 및 시퀀싱으로 확인하였다. 상기 결과를 통해, Safe-9R은 10계대를 하여도 rfaJ 유전자의 변이가 없어 유전적으로 매우 안정함을 확인하였다.
실시예 5. Safe-9R의 백신 효능 실험
Safe-9R의 백신 효능 및 독성을 확인하였다. 구체적으로, Safe-9R 생균 백신은 6주령, 18주령 갈색 산란계에 1 x 107 cfu/chicken으로 접종하였고, 두번째 백신접종 4주 후 병원성 야외주 SG0197(1 x 108 cfu/chicken)을 공격접종하였다. OE Safe-9R 사백신은 Safe-9R을 65℃에서 2시간 동안 열처리하였고, 실온까지 점차 쿨링하여 오일 어쥬번트(Montanide ISA 70, France)로 에멀젼화 하였다(박테리아:오일 어쥬번트=3:7). 상기 OE Safe-9R 사백신은 1주령 갈색 산란계에 약 1 x 109cfu/100 μL/chick으로 근육 주사하였고, 백신 접종 2주 및 7주 후 SG0197을 공격접종하였다. 공격접종 전 혈청 샘플을 수집하였고, 감염 및 폐사율은 17일간 조사하였다. 실험에 사용한 닭들은 3일 동안 절식시킨 면역억제 계군(protein-energy malnutrition(PEM) model)을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 그룹 | 백신 접종 | 생존률 | ||
| Safe-9R 생균 백신 | 접종 | 100 (10/10)* | ||
| 미접종 | 0 (0/10) | |||
| OE Safe-9R 사백신a - 2wpvb | 접종 | 60 (6/10)* | 50 (5/10) | 80 (8/10) |
| 미접종 | 0 (0/10) | 11.1 (1/9) | 50 (5/10) | |
| OE Safe-9R 사백신a - 7wpvb | 접종 | 87.5 (7/8) | 50 (5/10) | 70 (7/10) |
| 미접종 | 80 (8/10) | 90 (9/10) | 90 (9/10) | |
aOil emulsion(OE) 사백신은 1주령에 접종하여 3주령(2wpv)와 8주령(7wpv)에 공격접종함. 모든 실험은 3회 반복실험하였음.bwpv는 백신 접종 후 주(week post-vaccination)*대조군 대비 유의적인 차이
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, Safe-9R 생균 백신은 병원성 야외주의 공격접종에 대하여 100%의 방어효과를 나타내었고, 백신 미접종 그룹과 달리 접종된 병아리들이 모두 생존하였음을 확인하였다. Safe-9R 사백신의 효능 시험결과, OE 사백신도 2wpv에 공격접종 시 유의적인 차이를 보임을 확인하였다.
다음으로, OE Safe-9R 사백신의 체액성 면역 반응을 평가하였다. 구체적으로, 상기 백신주를 15마리의 1주령 갈색 산란계에 근육 주사하여 백신 접종 2주 후 혈액 샘플을 수집하였다. OE 사백신의 항체 역가(titer)는 OmpA, OmpX 펩티드 ELISA, 외막 단백질(outer membrane protein: OMP) ELISA를 사용하여 평가하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 항-OmpA 및 항-OmpX의 항체가는 백신 접종 2주 후의 그룹(2 wpv)이 백신 미접종군에 비해 유의하게 높음을 확인하였다.
실시예 6. 내독소 제독 변이주의 독성 비교실험
내독소 제독 변이주 Dtx-9RL, Dtx-9RM과 기존 백신주 SG9R의 독성을 비교하였다. 먼저, 닭 대식세포인 HD11에 대한 염증성 사이토카인 유전자 발현 자극 능력을 비교하기 위해 상기 각 균주들을 닭 대식세포(HD11)에 접종하고 RT-qPCR을 수행하였다. 구체적으로, HD11 세포는 L-글루타민 및 페놀 레드로 변형되고 10% FBS로 보충된 RPMI 1640 배지(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 배양하였다. 살모넬라 감염 2일 전, HD11 세포 현탁액(1 x 106 cells/mL)을 24-웰 플레이트의 각 웰에 500 μL/well로 접종하고 약 85% 컨플루언스(confluence)까지 배양하였다. 밤새 배양한 박테리아를 600nm에서 0.2 O.D로 조정하고, PBS를 사용하여 10배 희석하여 MOI(multiplicity of infection)가 10이 되게 하였다. 희석된 박테리아 현탁액을 11,000g로 1분간 원심분리하고, RPMI 1640에 재현탁하였다. 배지로 세포를 2회 세척 후, 박테리아 현탁액을 접종하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2시간 동안 배양하였다. 감염 2시간 후, 세포를 1회 세척하고 gentamicin sulfate 150 μL/mL가 보충된 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 배지로 세척 후, RNeasy Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, USA)를 사용하여 총 RNA와 동일한 양의 cDNA를 합성하였다. 2X AMPIGENE qPCR Green Mix Hi-ROX(Enzo Life Sciences, USA) 5μL와 함께 정방향, 역방향 프라이머 각 0.5μL, 및 cDNA 1μL를 포함하는 반응 혼합물 10μL을 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 정규화 과정에는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였고, RT-qPCR에 사용한 모든 프라이머는 전술한 표 1에 나타내었다. 2-△△Ct 방법을 사용하여 IL-1β, IL-18, iNOS 및 TLR4 유전자의 상대적 전사 수준을 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 제작된 내독소 제독 변이주 △lpxL(Dtx-9RL)과 △lpxM(Dtx-9RM)의 사이토카인 발현량이 음성대조군과 차이가 나지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, Dtx-9RL 및 Dtx-9RM은 성공적으로 내독소가 제거되었고, IL-1β, IL-18, iNOS 및 TLR4의 전사를 유도하지 않아 내독소 제독 백신 후보주로서의 가능성을 확인하였다.
또한, 내독소 제독 변이주의 독성 약화를 평가하기 위해 면역억제 계군(PEM 모델)에 백신을 접종하고, 2주 후 3일동안 절식시킨 후 부검을 진행하여 간 병변과 접종균의 재분리 여부를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 그룹 | Dtx-9RL | Dtx-9RM | Safe-9R | SG9R | Negative |
| 병변 | 0/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| 재분리 | 0/5 | 0/5 | 4/5 | 3/5 | 0/5 |
표 4에 나타낸 바와 같이, 내독소 제독 균주에서는 균이 재분리 되지 않았으며 Dtx-9RL은 병변 또한 나타나지 않음을 확인하였다. 한편, 내독소가 제독되지 않은 균주의 경우 중등도 이상의 병변과 접종 균의 재분리가 나타남을 확인하였다.다음으로, 내독소 제독 백신주의 약독화에 따른 증체율 영향을 평가하였다. 구체적으로, OE Dtx-9RL, OE Dtx-9RM, 및 OE Safe-9R 사백신을 1주령과 2주령 병아리에 접종 후 2주 동안 체중을 매주 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 1주령 병아리에 접종 후 2주동안 증체율을 비교한 결과 Dtx-9RL이 비접종 대조군 대비 체중의 차이가 나지 않는 것을 확인하였다(도 5의 A). 또한, 2주령 병아리에 접종 후 2주동안 증체율을 비교한 결과 Dtx-9RL과 Dtx-9RM 모두 통계적으로 유의적인 차이가 나지 않음을 확인하였으며 내독소가 제독되지 않은 균주의 경우 체중 감소가 나타남을 확인하였다(도 5의 B).
실시예 7. 내독소 제독 변이주의 체액성 면역 자극 평가
Safe-9R, 내독소 제독 변이주 Dtx-9RL, Dtx-9RM과 기존 백신주 SG9R를 오일 에멀젼(OE) 형태로 접종하여 2주 후 항체가를 측정하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 구체적으로, 각 백신주는 실시예 5의 OE Safe-9R 사백신 제조방법과 동일한 방법을 사용하여 오일 에멀젼 형태로 제조하였고, 각 백신주를 15마리의 1주령 갈색 산란계에 근육 주사하여 백신 접종 2주 후 혈액 샘플을 수집하였다. 실시예 5와 동일한 방법으로 ELISA를 수행하여 항체가를 측정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 접종군에서 항체가가 음성대조군 대비 유의적으로 상승한 것을 확인하였다.
실시예 8. 생균 내독소 제독 변이주의 방어효능 평가
1주령 병아리에 생균 백신을 접종하고 1주일 뒤 공격접종하여 간 병변 및 균 재분리를 평가하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 6에 나타내었다.
먼저, 표 5에 나타낸 바와 같이, 생균 내독소 제독 변이주의 방어효능을 평가한 결과 방어효능 면에서 Dtx-9RM은 방어효능이 우수하고 다른 그룹에 비해 약한 병변이 나타났다. Dtx-9RL은 폐사율 면에서 음성대조군과 차이를 보이지 않았다.
| 그룹 | Dtx-9RL | Dtx-9RM | Safe-9R | SG9R | Negative | |||||
| 백신 일령 | A1 | B2 | A | B | A | B | A | B | A | B |
| 0a | 7 | 4 | 2 | 2 | 2 | 2 | 3 | 2 | 4 | 5 |
| 1 | 1 | 0 | 8 | 4 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 |
| 2 | 0 | 1 | 0 | 3 | 3 | 5 | 5 | 3 | 2 | 0 |
| 3 | 1 | 1 | 0 | 1 | 5 | 2 | 1 | 4 | 2 | 1 |
| 4 | 1 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 |
| 심대한 간 병변b | 20% | 60% | 0% | 40% | 80% | 70% | 60% | 70% | 60% | 40% |
| 개체 수 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
11주령에 백신접종, 2주령에 공격접종21일령에 백신접종, 2주령에 공격접종a간 병변 평가는 다음과 같음. 0: 정상; 1: 5개 미만의 괴사소; 2: 100개 미만의 괴사소; 3: 셀 수 없이 많은 괴사소 및 심대한 간비대
b간 병변 평가 2 이상의 비율
다음으로, 생균 내독소 제독 변이주의 공격접종 후 균을 재분리하고, 재분리된 균에 대하여 smooth colony와 rough colony 식별을 진행하였다. 그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 백신접종 1주차에 공격접종 시 Dtx-9RM을 제외한 모든 접종군에서 균이 재분리된 것을 확인하였다. 분리된 균은 모두 smooth strain 즉, 공격접종주로 나타났다. 백신접종 2주차에 공격접종을 진행할 경우 SG9R을 제외한 모든 접종군에서 균이 재분리 되지 않았으며, 재분리된 균 역시 모두 rough strain 즉, 백신주로 나타났다. 상기 결과를 통해, 백신 접종 1주차에 가금티푸스 감염 시 기존 백신(SG9R)으로는 충분히 방어가 되지 않고 병원성 야외주가 우점하게 되는 반면, 내독소 제독 변이주 특히, Dtx-9RM은 기존 백신주 대비 빠르게 면역을 형성함을 확인하였다.
| 1wpva 공격접종 | 2wpv 공격접종 | |||||||||
| 그룹 | Dtx-9RL | Dtx-9RM | Safe-9R | SG9R | Negative | Dtx-9RL | Dtx-9RM | Safe-9R | SG9R | Negative |
| 재분리 | 2/9b | 0/10 | 4/10 | 3/10 | 4/8b | 0/6b | 0/10 | 0/10 | 1/10 | 0/7b |
| Smooth/Roughc | 0/0 | -e | 10/0 | 5/0d | 10/0 | - | - | - | 0/4d | - |
awpv: week post-vaccinationb폐사한 닭에서는 재분리를 진행하지 않음c Salmonella 항-O 항원 항혈청으로 응집억제반응(plate agglutination test) 진행
d최대 10개의 집락, 10개 미만 시 형성된 모든 집락에 대해서 검사
e집락이 형성되지 않음
추가적으로, Safe-9R, 내독소 제독 변이주 Dtx-9RL, Dtx-9RM의 체액성 및 점막 면역원성을 기존 백신주 SG9R과 비교하였다. 구체적으로, 1주령 병아리에 백신접종 1주 후 병원성 야외주 SG0197(Korean J. Vet. Res. 2015, 55, 241-246.)을 공격접종하였고, 혈액 및 담즙 샘플을 공격접종 2주 후에 수집하여 ELISA로 분석하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Dtx-9RL을 제외한 모든 백신 접종 그룹이 높은 체액성 방어효능, 및 점막면역 자극을 보임을 확인하였다.
실시예 9. 내독소 제독 변이주의 세포성 면역 자극 평가
FACS를 사용하여 PBMC에서 CD8+ T 세포 비율을 확인하였다. 구체적으로, 1일령 병아리에 내독소 제독 변이주를 접종하고 전혈 샘플을 헤파린 함유 튜브에 수집하였다. 샘플을 그룹별로 모은 뒤 Lymphoprep(Axis Shield, Scotland)을 사용하여 PBMC를 분리하고, 2% FBS가 함유된 PBS로 세척하였다. PBMC를 계수하고 106 cells/mL의 밀도로 조정하였다. 각 그룹 당 세포 분액 50μL에 CD8+ T 세포 항체-FITC(fluorescein isothiocyanate) 3μL 및 CD4 T 세포 항체-APC(allophycocyanin)를 접종하고, 각 분액을 암실에서 얼음 위에서 15분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 세척하여 PBS 300μL에 재현탁시킨 후, FACSCalibur(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 백신접종 1주차에 내독소 제독 변이주들은 음성대조군보다 유의적으로 높은 CD8+ T 세포의 비율을 보임을 확인하였다. 그러나, 공격접종 후 Dtx-9RL과 음성대조군은 다른 그룹처럼 높은 T 세포 비율을 보이지 않았다. 따라서 내독소 제독된 백신 후보주는 약독화된 만큼 숙주에서 빠르게 극복하여 면역을 형성하는 것으로 추측되며, Dtx-9RL은 공격접종 후에도 T 세포 비율이 높아지지 않아 방어효능 및 ELISA를 통한 면역반응 평가와 같은 경향성을 보임을 확인하였다.
실시예 10. 항생제 내성 유전자 제거 백신 후보주의 제작
전술한 실시예들에서 기존 SG9R의 한계를 극복하기 위한 가금티푸스 백신 후보주 Safe-9R 및 내독소 제독 변이주 Dtx-9RL, Dtx-9RM를 제작하였다. 추가적으로, FLP-FRT 재조합 시스템을 사용하여 백신주 선별 과정에서 사용된 항생제 내성 유전자가 제거된 Dtx-9RM 유래 백신 후보주를 제작하였다.
구체적으로, Dtx-9RM의 경우 내독소를 제거하는 과정에서 Red/ET recombination kit 사용 시 타겟 서열을 항생제 내성 유전자로 대체하며 삽입된 유전자 양쪽에 FRT 부위가 존재해 FLP로 추후 제거할 수 있도록 하였다. 이 때, Dtx-9RM은 카나마이신 내성 유전자를 가지고 있으며 FLP가 삽입된 플라스미드는 테트라사이클린 내성 유전자가 삽입되어 있다. 각 백신주를 FLP 플라스미드로 형질전환시킨 후 30℃, LB-테트라(tetra) 아가에서 밤새 배양하여 선별을 진행하였다. 다음으로, 단일 콜로니를 37℃, LB 브로쓰에서 밤새 배양하여 FLP를 발현시키고, FLP가 발현되어 FRT 사이의 카나마이신 내성 유전자가 제거된 균주를 LB 아가와 LB-카나(kana) 아가에 모두 접종하여 선별을 진행하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 Dtx9RM△kana(레인1, 2)에서 사이즈가 작아진 밴드를 확인하여 항생제 내성 유전자가 성공적으로 제거된 것을 확인하였다.
상기 Dtx9RM△kana 균주는 2021년 05월 20일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC14577BP를 부여 받았다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cactaaaggg cg 72
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<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rfaJ deletion R
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cactataggg ctc 73
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<213> Artificial Sequence
<220>
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caacgctaga ctgttcttat tgttaacaca agggagaaga gatgatgcgc aattaaccct 60
cactaaaggg cg 72
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Claims (10)
- rfaJ 유전자 및 lpxL 유전자가가 결실된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 균주.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC14463BP로 기탁된 것인 살모넬라 갈리나룸 균주.
- rfaJ 유전자 및 lpxM 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 균주.
- 청구항 3에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC18822BP로 기탁된 것인 살모넬라 갈리나룸 균주.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 살모넬라 갈리나룸 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여되는 것인, 백신 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 백신 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 백신 조성물은 닭, 오리, 칠면조, 거위, 메추리, 꿩 및 기러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 가금에 접종하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 가금은 2주령 이하의 병아리인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 살모넬라 갈리나룸 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 사료 조성물.
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