KR100280333B1 - 대장균k987p필리항원에대한난황항체의분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균 K987P 필리 항원으로 면역화시킨 산란계의 계란으로부터 난황을 분리하여 PH 5.0의 증류수로 9배 희석시키고 -20℃에서 냉동처리한 후, 실온에서 융해시키고 원심분리하여 지질 및 고형질을 제거하고 남은 상층액을 여과 및 동결건조시켜 난황으로부터 난황항체를 분리하는 방법에 관한 것으로, 본 발명 분리방법에 의해 대장균 K88 필리 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항체의 제조가 가능하여 자돈의 설사 예방, 진단 및 치료에 유용하게 난황항체를 이용할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

대장균 K987P 필리 항원에 대한 난황항체의 분리방법 {Production of egg yolk antibody(anti-K987P) against fimbrial antigen of E. coli strain K987P}

본 발명은 가축의 설사유발 대장균 987P 필리 항원에 특이적으로 결합하는 난황항체를 분리하는 방법에 관한 것이다.

양돈산업의 집단, 다두 사육화 추세에 따라 돼지의 세균 및 바이러스성 설사병은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있으며, 실제로 최근 우리나라에서 돼지의 세균 및 바이러스에 의한 설사병 발생이 증가하여 어린 자돈에서의 설사로 인한 폐사 및 성장지연으로 사육 농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다. 특히, 병원성 대장균에 의한 설사병은 우리나라의 거의 모든 사육농가에서 발생되는 질병으로 알려져 있다. 대장균 설사병의 발생은 신생 자돈의 연령과 밀접한 관계가 있다. 일반적인 설사증 발병 시기를 구분하면 이유전과 이유후 설사로 구분된다. 이러한 설사증 중 가장 기본적인 발병 원인균들은 K항원을 가진 K88, K99, 987P, F41등이 대표적이며, 이들은 축종에 따라 원인균이 다르지만 거의 전 축종에 걸쳐 설사병을 유발시킨다. 그러나, 대장균 987P은 이유자돈의 설사병을 일으키는 것으로 보고되고 있으며(Ferrier, 1986, 채등, 1993), 이 대장균은 Fimbria(pili)라는 섬모를 이용하여 장독소를 생산 분비하여 장기능에 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다. 987P는 신생자돈의 소장내에 접착하여 증식하면서 설사를 일으킨다(Moon등, 1980).

대장균 987P에 의한 설사증을 예방 및 치료하기 위하여 많은 백신 및 항생제를 사용하고 있다(Nagy 등, 1978). 그러나, 백신제의 경우, 신생 자돈에게는 예방효과가 한정적이고, 항생제는 오·남용시 어린 돼지에게 내성 및 체내에 잔류 될 가능성이 있기 때문에 현재 세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다. 이러한 현실에서 모체유래 항체를 이용한 수동면역을 이용하는 것이 신생기중의 설사 방지 및 각종 질병에 매우 효과적이라는 연구가 보고되었다. 특히, 최근에는 초유를 부족하게 섭취한 신생자돈에게 각종 대장균의 독소항원에 대한 특이항체를 경구투여시 설사예방 및 치료가 가능하다고 보고 되고 있으며(Ozpinar 등, 1996, Yokoyama 등, 1992). 이와 같은 결과를 토대로 미국의 Grand laboratories Inc.는 대장균 및 Clostridium perfringens에 대한 항혈청을 이용한 예방 및 치료약을 생산하기에 이르렀다.

최근에는 모체유래 항체를 이용한 수동면역을 이용하는 것이 신생기중의 설사 방지 및 각종 질병에 매우 효과적이라는 연구가 보고되었다. 특히, 초유를 부족하게 섭취한 신생자돈에게 각종 대장균의 독소항원에 대한 특이항체를 경구투여시 설사예방 및 치료가 가능하다고 보고 된바 있으며(Ozpinar 등, 1996, Yokoyama 등, 1992). 이와 같은 결과를 토대로 미국의 Grand laboratories Inc.는 대장균 및 클로스트리디움 퍼프리겐스(Clostridium perfringens)에 대한 항혈청을 이용한 예방 및 치료약을 생산하기에 이르렀다. 이 항혈청제제 역시 항혈청을 얻기 위해서는 많은 경비와 제한된 기간만이 생산되는 불리함과 충분한 양을 얻지 못하며, 면역글로불린의 분리 및 정제에 많은 경비와 제반 기술이 필요하다는 문제점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 물리적인 방법을 주로 사용하여 대장균 K88 필리 항원에 면역화된 산란계 유래 계란 난황으로부터 상기 필리 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 난황항체를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 대장균 K99 필리 항원으로 면역화시킨 산란계의 계란으로부터 난황을 분리하여 PH 5.0의 증류수로 9배 희석시키고 -20℃에서 냉동처리한 후, 실온에서 융해시키고 원심분리하여 지질 및 고형질을 제거하고 남은 상층액을 여과 및 동결건조시켜 난황으로부터 난황항체를 분리함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 E. coli 987P Pili antigen의 분리를 위한 SDS-PAGE 실험결과 그 패턴을 보인 사진도.

도 2는 다양한 E. coil 균주의 단일항체에 대한 교차반응을 보기 위한 ELISA 실험절차도.

도 3는 산난계로부터 생산된 계란의 난황으로부터 분리된 난황항체(IgY)의 분리절차도.

도 4는 E. coli 997p pili antigen에 대한 항체 생성 수준조사를 위한 ELISA 실험 절차도.

도 5은 면역후 987p pili 항원에 대한 항체가의 변화를 보인 그래프.

도 6은 면역후 E. coli 987p pili antigen에 대한 항체의 특이성을 검정하기 위한 ELISA 실험 절차도.

도 7은 생산된 E. coli 987p 난황항체(IgY)와 987p ETEC cell과의 반응정도를 확인하기 위한 ELISA 실험 절차도.

본 발명은 E.coli K987p pili로부터 특유의 항원을 분리하는 단계; 이를 동물에 면역시킨후 항체를 생산하는 단계 및 항체를 분리하고 평가하는 단계로 구성된다. 이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하는 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정하지 아니한다.

실시예1: 균주 배양 및 회수

장독성 대장균 987P는 ECRC(Escherichia coli Reference Center, Pensilvania state University, USA)에서 분양받아 사용하였고, fimbria 항원의 분리를 위해 987P 대장균을 멸균된 Trypticase soy broth(BBL Microbiology Systems)에서 37℃, 72시간 동안 교반 배양한 후, 원심분리(15℃, 5000 xg, 30min)하여 회수하였다.

실시예2: 987P Pili의 분리 및 정제

987P pili의 분리 및 정제 방법은 Erickson(1991)의 방법을 수정·보완하여 실시하였다. 회수된 대장균은 Phosphate buffer saline(PBS, pH7.2) 70㎖로 부유시킨 후, 대장균의 활성을 없애기위해 60℃의 물에서 30분동안 중탕한 다음 세포막으로부터 pili를 분리시키기 위해 약 2분동안 간헐적으로 초음파 처리(Sonifier 450, Branson)를 4℃온도에서 실시한다. 초음파 처리를 한 대장균용액은 원심분리(14000g, 20min, 4℃)를 통하여 pili와 세포조각을 분리한다. 상층액만을 수거하여 2.5% citric acid로 pH4.0으로 적정한 후 30분동안 상온에서 교반한다. 산처리를 한 용액을 냉장고(4℃)에서 2시간 방치한 다음 pili가 포함되어 있는 침전물을 얻기 위해 원심분리(14000g, 20min, 4℃)를 실시한다. 침전물은 다시 PBS 40㎖로 부유시킨 후, 상기 산처리과정을 3회 반복 실시하여 정제된 987P pilus preparates를 분리회수 하였다.

분리된 987P pilus preparates의 순도측정은 SDS-PAGE법으로 확인하고 항원성의 검사는 Immunoblotting법에 의해 987P pilus 항원의 여부를 확인하였다.

실시예3: 987P pili의 정성검사

실험예1: 단백질 분석

Pili 단백질의 함량을 측정하기 위해 Akins(1995)의 microwave BCA방법으로 실시하였다. 분석시약은 BCA protein kit(Pierce Chemical Co.)를 사용하였고, 96-well microplate(Falcon)를 이용하여 실시하였다.

987P pili antigen을 Erickson(1991)의 분리 방법 중 산처리를 2.5% Citric acid로 대치하여 실시한 결과, 단백질 함량이 약 3.5㎎/㎖인 단백질을 분리하였다.

실험예2: SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis

분리한 987P pili는 Laemmi(1970)의 방법에 따라 SDS-PAGE로 실시하였고, 전기영동장치는 Mini-Protein II cell Kit(Bio-Rad)를 이용하였으며, Separating gel은 12%, stacking gel은 5%, 두께는 7.5 ㎜로 제조하여 사용하였다. Pili 단백질의 분자량 측정을 위한 Marker로는 Bio-Rad사의 Low marker와 High marker를 구입하여 사용하였다. 전기영동은 200V에서 50분동안 실시한후, Coomassie brilliant blue R-250을 이용하여 염색하였다.

분리된 987P pili antigen을 SDS-polyacrylamide gel(12%)로 전기영동한 후 Coomassie brillient blue R-250으로 염색한 결과, 도 1에서 보는 바와같이 주 밴드는 약 20kDa에서 나타났으며 주 밴드의 순도를 측정한 결과 95% 이상으로 매우 순수게 정제된 것으로 조사되었다.

실험예3: ELISA법에 의한 교차반응 조사

분리한 987P pili의 항원특이성을 조사하기 위하여 구입된 유사 장독성 대장균주( K99, K88a, K88b, 987P, F41)에 대한 단일클론항체(Monoclonal antibody; Mab, CVL, United Kingdom)와 분리한 987P pili와의 교차결합 반응정도의 조사를 ELISA(Enzyme linked immunosorbant assay)법으로 실시하였다(도 2).

Washing buffer는 0.15M PBS(0.2M Phosphate Buffer, 0.13M NaCl, pH 7.2)에 0.05% Tween20(Sigma)을 첨가하여 사용했으며, coating은 Bicarbonate buffer capsules(Sigma)를 이용하였다. Blocking buffer는 5% skim milk(pH 7.4, Gibco)을 이용하였다. Dilution buffer로는 PBS-T(0.05% tween 20)와 5% skim milk를 동일한 양으로 섞어서 사용하였고, substrate buffer는 0.1M sodium acetate trihydrate(NaAc.3H₂O)을 Saturated citric acid로 pH 5.5로 적정하여 사용했다. 1차 항체로는 K88a, K88b, 987P, F41, K99 단일클론항체를 0.25㎍/㎕ 수준으로 맞추어 사용하였고, 2차항체는 Sheep Anti-mouse IgG(whole molecule) peroxidase conjugate(sigma)를 1,000배로 희석하여 이용하였고, 효소에 대한 기질로는 TMB (3,3',5,5'-Tetramethyl benzidine, Merck)을 사용하였다. 환원제는 3% hydrogen peroxide(Sigma)을 이용하였고, 반응정지제는 4N H₂SO₄를 사용하였다. plate는 MicrotestⅢ flexible Assay plate(Falcon)을 사용하였다.

분리한 987 pili antigen와 다른 ETEC strains(K88a, K88b, 987P, F41)의 단일클론항체(CVL, United Kingdom)와의 교차반응을 보기 위해 EILSA 법을 이용하여 결합 정도를 조사한 결과, 표 1에서 보는 바와같이 987P pili antigen는 987P 단일클론항체에서만 특이적으로 강한 반응을 보였으며, 다른 ETEC strains과는 전혀 반응하지 않는 특이성을 가진 것으로 판단되었다.

The ELISA results of cross reaction among 987P pilus protein and the monoclonal antibodies of the different E.coli strains.

Fimbrial adhesin	Monoclonal antibodies (CVL*)
	K88a	K88b	987P	F41	K99
987P pilus adhesin	-	-	+++	-	-

주식회사 *: Purchased from CVL(United Kingdom)

실시예4: 987P pili항체의 생산

항체 생산에 사용된 동물은 체중 2.5kg의 Newzealand white종의 토끼 2두와 20주령의 Hy-line brown계의 산란계 4수를 사용하였다. 면역 방법은 분리한 987P pilus antigen 150㎍을 각각 Saline 0.5㎖에 혼합하여 Freund's complete adjuvant(FCA) 0.5㎖와 유화시킨 다음 이 유화액을 토끼의 등과 뒷다리에 각각 0.2㎖씩 총 1㎖을 피하주사와 근육주사하였고, 산란계는 흉근에 각각 0.25㎖씩 4곳에 근육주사하여 1차접종하였으며, Booster injection은 1차접종 후 2주간격으로 Freund's incomplete adjuvant(F.I.A)로 유화후 1차접종과 동일한 방법으로 12주까지 실시하였다.

혈액채취는 매주 실시하였다. 토끼는 귀정맥, 산란계는 날개 정맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관하여 실험에 이용하였다. 계란는 매일 회수하여 8℃에 저장하여 실험에 이용하였다.

난황항체는 산란계로부터 생산된 계란의 난황으로부터 매주 분리하였다. IgY 혼합물의 분리는 Akita and Nakai(1993)의 방법과 Jensenius 등 (1993)의 방법을 수정.보완하여 실시하였다. 수정된 분리방법은 가능한 한 화학물질을 배제한 물리적 방법에 의거 도 3과 같이 실시하였다.

즉, 대장균 K987P 필리 항원으로 면역화시킨 산란계의 계란으로부터 난황을 분리하여 PH 5.0의 증류수로 9배 희석시키고 -20℃에서 냉동처리한 후, 실온에서 융해시키고 원심분리하여 지질 및 고형질을 제거하고 남은 상층액을 여과 및 동결건조시켜 난황으로부터 난황항체를 분리하였다.

실시예5: 난황으로부터 분리한 항체(IgY)의 순도검사

난황항체의 순도검사는 전처리 된 항체물질의 물리적 상태와 사용목적에 따라 동결건조(Freeze drying)과정과 분무건조(Spray drying)과정을 거쳐 실시하였다. 도 3의 과정에 의거 난황으로부터 IgY 항체가 함유되어 있는 난황단백분획(난황항체)을 분리하여 이를 -20℃에 냉동보관하면서 동결건조에 사용하였다. 냉동처리된 난황항체를 -50℃로 조정된 동결건조기(일신엔지니어링; NCFD 5508)에 장착하여 진공상태(10 micron Hg)에서 2∼3일간 건조과정을 거쳐 분말화하였다. 동결건조한 분말중 IgY의 순도를 측정하기 위하여 동결건조 전과 후의 IgY함량과 항체역가를 측정하였다. 면역학적 조성분 검사는 RID(Radial Immuno-Diffusion)법에 의해 IgY의 농도를 측정을 하였고, 단백질 검사는 BCA법으로, 그리고 항체역가의 측정은 도 4의 ELISA 법을 이용하여 실시하였다.

분무건조법에 의한 총난황(whole egg yolk)의 분말화 작업은 난황 자체가 어린가축에게 풍부한 영양소원으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 항체를 분리하는 과정 도 3에서 거쳐야 할 많은 단계를 생략함으로서 시간적, 경제적 부담을 최소화 하면서도 난황중 함유된 항체의 효과를 동시에 이용할 수 있는 장점을 가지게 된다는 가설하에 실시하였다. 분무건조기에 투입전에 난황의 용량과 증류수의 용량을 2.5:1.0의 비율로 희석하여 분무건조기의 조건을 아래와 같이 조정하여 실시하였다. 희석난황액의 투입온도는 140℃, 사출온도는 72℃, 시간당 투입량은 5 L, 펌핑속도는 22,000 rpm 이었다. 난황의 분무건조 전과 후의 IgY항체의 농도, 항체역가와 단백질 농도를 측정하여 분무건조 과정으로 손실되는 항체의 함량과 역가를 조사하였다.

도 3의 과정에 의거 난황으로부터 IgY 항체가 함유되어 있는 난황단백분획(난황항체)을 분리하여 이를 동결건조한 분말중 IgY의 순도를 측정하기 위하여 동결건조 이전과 이후의 IgY함량과 항체역가를 측정한 결과 표2에 제시한 바와 같이 동결건조 분말 10 mg 중 단백질의 함량은 7.0 mg 이었으며, 이 중 IgY의 함량은 3.3 mg으로서 총단백중 47.1%가 IgY로 나타났다. 건조분말 총량 중 IgY의 순도는 33% 이었다. 동결건조 이전과 이후의 난황항체의 항체가는 모두 170,000으로서 이들 항체가 수준 간에는 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 동결건조에 따른 특이항체의 역가는 변화가 없는 것으로 판명되었다.

산업적 차원에서 고려해 볼 때에, 본 실험결과에서 제작된 동결항체분말은 IgY의 순도와 항체가가 높은 항체분말로서 가축에 극소량 복용시킴으로 설사예방 및 치료제로서 활용도가 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한, 각종 가검물로부터 987P 항원의 유무 진단과 987P 대장균의 양적측정용 ELISA Kit의 제작시 필수적인 항체물질이기 때문에 향후 산업화의 가능성은 매우 밝다고 볼 수 있다.

987 pilus antigen에 대한 항체가 생성된 계란으로부터 난황을 분리하여 이를 직접 분무식 건조법으로 난황분말을 제조하고, 건조 이전과 이후의 IgY함량과 항체역가를 측정하여 난황분말중 IgY의 순도와 항체역가의 변화상을 조사한 결과표 2에 제시한 바와 같이 총난황(whole egg yolk) 900 mL 로부터 182.5 g의 난황분말 얻었으며, 70 mg 난황분말 중 단백질의 함량은 20 mg 이었으며, 이 중 IgY의 함량은 3.43 mg으로서 총단백중 17.2%가 IgY로 나타났다. 난황분말 총량 중 IgY의 순도는 4.9% 이었다. 분무건조 이전과 이후의 난황분말의 항체역가는 각각 170,000과 130,000으로서 건조 이후의 항체역가 수준은 건조 이전보다 약 50,000 정도 역가가 낮아지는 현상을 보이므로서 분무건조시 난황특이항체의 역가는 약 23.5% 저하되는 것으로 판명되었다. 그러나 이 방법은 산업적 차원에서 고려해 볼 때에, 난황분말을 가축의 사료첨가물로 사용할 경우 영양적 효과는 물론 설사예방제로서의 항체효과와 함께 복합효과를 획득할 수 있는 장점이 있음은 물론, 난황으로부터 항체의 분리에 소요되는 생산비를 크게 절약할수 있다는 점을 고려해 볼 때에 산업화의 가능성은 매우 밝다고 볼 수 있다. 산업화가 본격화되면 사용 목적에 따라 동결건조방법을 이용하면 항체역가의 저하 없이 효율적인 생산이 가능하게 될 것으로 사료된다.

The recovery contents of egg yolk protein, IgY and antibody titer treated by different drying methods.

Items	Methods of drying
	Freeze drying	Spray drying
Initial volume of Egg yolk	15 ml	900 ml
Weight of yolk powder produced	450 mg(100%)a	182.5 g(100%)
Protein content	315 mg(70%)	50.0 g(27.4%)
IgY content	148.5 mg(33.1%)	8.6 g(4.7%)
Antibody titer(987P ETEC)	Before treatment	170,000 (100%)b
	After treatment	170,000(100%)	130,000(76.5%)

주식회사 a: Recovery rates of protein and IgY contents over the weight of yolk

powder

b: Percent changes of the antibody titer levels before- and after

treatment

실시예6: 항체가 측정과 987P 항체의 특이성검사

실험예4: 항체가 측정

987P pilus antigen에 대한 항체생성 수준 조사는 ELISA법으로 실시하였다(도 4).

Washing buffer는 0.15M PBS(0.2M Phosphate Buffer, 0.13M NaCl, pH 7.2)에 0.05% Tween 20(sigma, P-1379)을 첨가하여 사용했으며, coating 은 Bicarbonate buffer capsules (Sigma)를 이용하였다. Blocking buffer는 5% skim milk(pH 7.4, Difco)을 이용하였다. Dilution buffer로는 PBS-T(0.05% tween 20)와 5% skim milk를 동일한 양으로 섞어서 사용하였고, substrate buffer는 10% Diethanol-Amine(C₄H₁₁NO₂, Sigma)에 0.5mM MgCl₂을 첨가하여 pH 9.8로 적정한 용액을 사용했다.

효소는 Alkaline Phosphate-conjugated AffiniPure Rabbit anti-chicken IgY (IgG)(Jackson Immuo.)과 Alkaline Phosphate-conjugated AffiniPure Donkey anti-rabbit IgG(Jackson Immuno.)를 5,000배로 희석하여 이용하였고, 효소에 대한 기질로는 Phosphate substrate tablets(Phosphatase, Sigma-104)을 사용하였다. 반응억제제는 5M NaOH를 사용하였다. Plate는 MicrotestⅢ flexible Assay plate(Falcon 3991)을 사용하였다. 항체가 측정에 이용된 산란계와 토끼의 항혈청(IgG), 혹은 난황에서 분리된 IgY sample은 200배부터 3배수로 145,800배까지 희석하여 항체가 측정에 사용하였다.

실험결과 도 5에서 보는 바와같이 토끼 혈청중에는 면역 후 2주경부터 항체가 생성되기 시작하였다. 6주경부터는 급격히 증가하기 시작하여 10주경에 최고의 수준으로 항체가를 형성하여 그 이후 계속 유지하는 경향을 보였다. 한편, 닭의 혈청에서도 같은 기간에 항체의 생성이 시작되었으나 면역후 4주경부터 급격히 증가하기 시작하였다가 6주경에는 일시적 감소현상이 나타났으나 8주경부터는 최고의 항체가를 유지하였다. 두 실험동물의 혈청내 최고 항체 형성기간은 거의 비슷하게 이루어져 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.

한편, 난황중의 항체가는 면역 2주후에 낮은 수준의 항체가 생성되었으나 서서히 증가하여 6주경 이후부터는 혈청중의 항체가 보다 오히려 높게 형성되었다. 이와같은 현상은 항원의 면역후 항체의 생성이 일차적으로 혈중에 먼저 일정수준으로 형성된 후에 서서히 난황으로 이전되어 축적되는 현상으로 추정된다.

실험예5: 생산된 987P 항체의 특이성 검사

면역후 토끼 혈청, 산란계의 혈청(IgG) 및 산란계의 난황(IgY)에서 생성된 987P pilus antigen에 대한 항체의 특이성을 조사하기 위해, K99(field), K12:K99, K88+, K88ab, 987P pilus antigen을 이용하여 반응정도를 보았다. 사용된 buffer는 항체가 측정에 이용했던 것과 동일하게 사용하였고, plate는 96-well immuno-microplate (NUNC, Denmark)를 사용하였다(도 6).

987P, K88+, K88ab, K99(field), K12:K99 pili 항원이 피복된 plate에 생산된 산란계와 토끼의 항혈청(anti-987P antiserum) 그리고 난황항체(anti-987P yolk antibody)를 20,000배 희석하여 반응시킨후, 2차항체로 Alkaline Phosphate-conjugated AffiniPure Rabbit anti-chicken IgY(IgG)(Jackson Immuo.)과 Alkaline Phosphate-conjugated AffiniPure Donkey anti-rabbit IgG(Jackson Immuno.)를 5,000배로 희석하여 이용하였다. 효소에 대한 기질로는 Phosphate substrate tablets(Phosphatase, Sigma-104)을 사용하였다. 반응억제제는 5M NaOH를 사용하였다.

실험결과 표3에서 보는 바와같이 본 발명에서 생산된 혈청항체 및 난황항체는 987P strain에만 특이적으로 반응을 보여 987P 항원에 대한 특이성이 확인되었다.

Specificity of chicken serum, rabbit serum and yolk anti-987P antibody against the fimbrial antigen of the different E.coli strains by ELISA.

Fimbrial antigen	Host antibody
	Rabbit serum	Chicken serum	Egg yolk
K88+(Manitoba*)K88ab(ECRC**)987P(ECRC)K99 field(ECRC)K12:K99(ECRC)	--+++--	--+++--	--+++--

주식회사 Host antibodies were diluted to 1:20,000.

+++ : 50,000 < antibody titer < 100,000

- : 500 > antibody titer

Manitoba : Animal health centre, Veterinary Sevices branch, Manitoba

Agricultrue, MB, Canada

ECRC : E.coli reference centre, the pensylvania state university,

USA.

실시예7: 난황항체(IgY)의 항원결합능력 조사

생산된 987P 난황항체의 체내 효과를 간접적으로 알아보기 위해, 실험실적 방법으로 987P ETEC cell과 난황항체의 항원반응 정도를 ELISA법을 이용하여 실시하였다.

1×10⁹(CFU/㎖) 농도로 희석된 987P ETEC cell 10㎖을 멸균된 시험관에 분주한 후, IgY 농도가 각각 20, 40, 50, 70, 80, 90, 100㎎이 되도록 첨가하였고, IgY를 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 첨가후 37℃에서 진탕배양(60rpm/min)하였고, 2시간 후 1㎖씩 채취하여 60℃에서 30분간 열처리 후 냉장보관하여 실험에 이용하였다. 반응정도 조사는 도 7과 같이 실시하였다. 사용된 buffer는 항체가 측정에 이용했던 것과 동일하게 사용하였고, plate는 96-well immuno-microplate (NUNC, Denmark)를 사용하였다. 2nd antibody(rabbit anti-987P antibody; 1:2,000)는 AP-Donkey anti-rab. IgG(Jackson, diluted in dilution buffer(1:1,250))와 혼합 후, 2시간 전에 미리 37℃에서 배양한 후 사용하였다.

실험결과, 표4에서 보는 바와같이 987P ETEC cell이 1×10⁹(CFU/㎖) 농도로 작성한 용액 10㎖에 난황항체(IgY) 10㎎을 첨가한 군은 2시간 배양후에 cell 농도가 10⁹(CFU/㎖)에서 10⁶(CFU/㎖)으로 약 1000배 급격하게 감소하였고, IgY항체의 첨가농도가 높아질수록 서서히 감소하는 경향을 보였다. 40㎎ 이상 첨가군에서는 20㎎(IgY) 처리군보다 약 10∼15배정도 더 감소하는 것으로 나타났으나 이들간에 현저한 차이는 없는 것으로 판단된다.

본 실험의 결과, 987P 난황항체(IgY) 20∼40 mg을 1 ml 중의 가검물에 첨가시 농도가 10⁹(CFU/㎖)인 987P 대장균을 10⁵∼ 10⁶(CFU/㎖)로 감소시킬 수 있는 결합능력을 가진 것으로 판명되었다.

The changes of 987P Cell concentration according to different treatment levels of IgY

Treatment.	Cell conc.(CFU/㎖)
IgY 0 mg (Control)20 mg40 mg50 mg70 mg80 mg90 mg100 mg	1.7×1091.6×1062.6×1052.1×1051.9×1055.4×1045.0×1044.4×104

실시예8: 현장임상실험

987P 대장균 감염에 의한 난황항체의 예방 및 치료효과를 조사하기 위하여 충남 연기군에 소재한 H 양돈장에서 1997년 7월 1일부터 8월 31일까지 현장임상실험을 실시하였다. Yorkshire x Duroc 모돈으로부터 분만된 총 149두의 신생자돈을 선정하였다. 대조군(27두)은 일반적인 사양관리에 의거 사육하였으며, 처리 1군(50두)은 출생 후 설사증의 발병이 확인 된 자돈만을 선정하여 난황항체(50 mg/dose)를 1일 3회, 2일간 경구투여하면서 치료효과의 유무를 조사하였다. 처리2군(72두)은 분만 직후의 신생자돈에게 난황항체(50 mg/dose)를 6시간 간격으로 3회 경구투여 하면서 항체의 예방효과를 조사하였다.

설사 발병 유무에 대한 조사는 분만 당시부터 5일간 매일 오전에 실시하였으며, 매 조사시마다 Swab test방법으로 자돈의 직장으로부터 채취된 분변을 1ml의 0.85% saline으로 희석한 후, 원심분리(3000 x g, 10min)로 상층액을 수거하여 본 발명에서 정립한 측정법 도 7로 실시하였다.

Incidence of diarrhea in relation to the different treatment groups, in the period from birth to five days of age.

Groups	No. of piglets	Incidence of diarrhea in the newborn piglets	Recovery(%)
		First day of age		Two-five days of age
		Health		Diarrhea	Health	Diarrhea
ControlTrt 1Trt 2	275072	160-	1150-	104372	177-	37.086.0100

주식회사 Trt 1 : Piglets were treated with egg yolk antibody (50 mg (IgY), at

the onset of diarrhea, three times a day, for two days

consecutively.

Trt 2 : All Piglets were treated with egg yolk antibody (50 mg (IgY),

directly after birth, three times a day, for one day.

실험결과, 상기 표5에서 보는 바와같이 난황항체를 투여하지 않은 신생자돈은 출생 후 1일령에서 총 27두 중 11두에서 설사증이 발생했으며 5일령에서는 더욱 증가하여 17두(67%)가 설사를 유발하였으며, 10두(37%)만이 건강상태를 유지하였다. 반면에, 출생 후 1일령에 설사증이 확인된 신생자돈에게 난황항체(IgY, 50 mg)를 1일 3회씩 2일간 경구투여 하였을 때, 총 50두중 43두가 치유되어 회복율이 86%로 나타났다.

출생직후의 모든 신생자돈 72두에 난황항체(IgY, 50 mg)를 6시간 간격으로 3회 급여하였을 때, 총 72두의 신생자돈이 모두 설사로부터 예방되어 예방효과가 100%로 나타났다.

본 발명의 실험 결과, 난황항체를 출생 직후에 투여하면 대장균성 설사증을 100% 예방할 수 있는 효과가 있으며, 또한 설사중인 자돈에 투여하여도 약 86%의 치료효과가 있는 것으로 나타났다.

이상 실시예에 따라 설명한 바와같이 본 발명은 장독성 대장균중의 하나인 K987P 균주 특유의 필리 항원에 대한 난황항체를 분리하는 경제적인 방법을 제공하여 가축의 설사 예방, 진단 및 치료에 유용한 난황항체를 제공하는 매우 뛰어난 효과가 있어 동물 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

1. 대장균 K987P 필리 항원으로 면역화시킨 산란계의 계란으로부터 난황을 분리하여 PH 5.0의 증류수로 9배 희석시키고 -20℃에서 냉동처리한 후, 실온에서 융해시키고 원심분리하여 지질 및 고형질을 제거하고 남은 상층액을 여과 및 동결건조시켜 난황으로부터 난황항체를 분리함을 특징으로 하는 난황항체의 분리방법.

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