CN104998259A - 一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗及其制备方法，是收集临床自然发病的鸭病毒性肝炎病例或人工感染非免疫鸭发病后的肝脏，乳化后加入黄芪、当归提取液、蜂胶酊等免疫增强剂，制备成为增强型鸭病毒性肝炎抗原，免疫产蛋种鸭后可生产抗鸭病毒性肝炎卵黄抗体。

Description

一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗及其制备方法。

二、背景技术

鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是由鸭病毒性肝炎病毒引起鸭的一种增强型以肝脏呈现出血性炎症为特征的急性烈性传染病。1945年在美国首次发现本病，并命名为I型鸭病毒性肝炎，1965年在英国发现了鸭病毒性肝炎II型，1969年在美国发现了鸭病毒性肝炎III型。目前，I型呈世界性分布，并曾报道在印度、埃及和美国发现I型鸭肝炎病毒的变异株。II型和III型鸭病毒性肝炎分别局限于英国和美国。在国内，鸭病毒性肝炎20世纪80年代初期起本病在我国大面积流行，疫情能够被鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制，但是雏鸭往往在疫苗奏效前即发病死亡。鸭肝炎I型可引起雏鸭的严重死亡，死亡率高达90％，中成鸭一般不发病。病鸭的特征是意识紊乱，频频抽搐，肝脏呈斑点状出血，胆囊肿大，胆汁颜色变淡。本专利所述鸭肝炎主要指鸭肝炎I型引起鸭肝炎。

目前对鸭肝炎的最佳预防方案是利用鸭肝炎组织灭活苗免疫母鸭，或在利用鸭肝炎组织灭活苗免疫产蛋鸭或产蛋鸡后制备高免卵黄抗体，在鸭出壳后1日龄或7日龄皮下注射1头份/只高效价抗鸭肝炎病毒卵黄抗体。但是由于鸭肝炎病料中抗原含量较低，市售卵黄抗体往往效价不高，预防效果较差，急需开发生产性能更好组织灭活苗免疫母鸭或蛋鸭。虽然也有商业生产单位用从实验室培养的鸭肝炎病毒制备的抗原，但是需很多的设备和高层次人员生产，过程也比本专利所述方法复杂。

三、发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗及其制备方法。这种抗原诱导的鸭卵黄抗体效价高于现有常规方法，简单易行，经济价值高。

本发明直接使用患鸭肝炎病死的鸭肝脏，加入免疫佐剂制备鸭肝炎病毒抗原，简单易行。

本发明所使用的黄芪是一种增强型中草药，具有补气的作用；当归是一种增强型中草药，具有补血的作用；蜂胶含有多种免疫增强的成分，如黄酮等。

一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗，通过以下制备方法得到：

1.称取等量当归和黄芪混匀，再向当归和黄芪中加入与当归和黄芪总量相等的蒸馏水(当归：黄芪：蒸馏水＝1:1:2(W/W/V)，文火煮沸30min提取有效成分，过滤提取液，并除菌；用灭菌生理盐水稀释提取液至与所述蒸馏水等量，得到黄芪当归提取液。

2.将市售蜂胶-20℃冷冻后粉碎，过20目筛，向粉碎后的蜂胶中加入蜂胶重量3-4倍的无水乙醇(W/V)，震荡溶解10-12小时；自然沉淀后，取上清液得到蜂胶酊。

3.按照1:3的比例(W/V)将鸭肝病料加入含有0.5％(V/V)甲醛溶液的生理盐水中混合，用组织捣碎机捣碎鸭肝病料，过40目滤网得到鸭肝病料过滤液；分别向鸭肝病料过滤液中加入鸭肝病料过滤液体积比1-5％的黄芪当归提取液和1-2％的蜂胶酊(边摇拌边加)，37℃灭活10-12小时，得到鸭病毒性肝炎组织灭活苗。

使用方法：

1.免疫种鸭：每只产蛋种鸭颈部皮下注射2mL按照本发明制备的鸭病毒性肝炎组织灭活苗，三周后种蛋中即含有抗鸭肝炎病毒的母源抗体。

2.制备高免卵黄抗体：每只产蛋鸭鸭颈部皮下注射2mL鸭病毒性肝炎组织灭活苗，重复2次，每次间隔2周。最后一次注射后三周，开始收集鸭蛋得到高免卵黄抗体。

四、具体实施方式：

鸭肝炎病料可以收集临床典型鸭肝炎病例的死鸭肝脏；或人工感染非免疫雏鸭，发病死亡后收集病鸭肝脏。

1.收集病死鸭肝脏1kg，冻存于-20℃冰柜，备用；

2.黄芪当归提取液的制备：

称取100g当归饮片、100g黄芪饮片，加200ml蒸馏水，置1L烧杯中，文火煮沸30min提取。利用纱布过滤提取液，再用除菌滤器滤过除菌。用灭菌生理盐水将滤出液稀释至200ml，待用。

3.蜂胶酊的制备：称取市售蜂胶100g置-20℃冰柜冷冻。取出后将蜂胶粉碎，过20目筛网，装入磨口瓶中，加入400ml无水乙醇，过夜溶解。自然沉淀后，上清部分即为蜂胶酊。

4.抗原的制备：称取100g鸭肝病料，与含0.5％(V/V)甲醛溶液的300ml生理盐水混合，用组织捣碎机捣碎病料，用40目纱网过滤，将滤出液加入1L烧杯中，置磁力搅拌器上，缓慢加入10ml黄芪当归提取液和5ml蜂胶酊，灌装入灭菌生理盐水瓶中，置37℃温箱12小时，制备成为鸭病毒性肝炎组织灭活苗。

5.免疫鸡群：将上述增强型鸭病毒性肝炎注射，颈部皮下注射100只高产蛋鸡，每只1ml，每半个月注射一次，共注射三次，最后一次注射后3周开始收集鸡蛋，收集100个高免鸡蛋待用。

6.高免卵黄抗体制备:

6.1.消毒鸡蛋：将100个高免鸡蛋用自来水清洗后，用浓度为1-2％的次氯酸钠消毒液浸泡3分钟，漓干；

6.2.分离卵黄：在无菌室打开蛋壳，倒出蛋清，取出卵黄；

6.3.稀释：在无菌室中，加入卵黄体积3倍的生理盐水(生理盐水中含0.4％(V/V)的甲醛溶液)；

6.4.搅拌过滤：在无菌条件下将卵黄稀释液搅拌成悬浊液，然后经40目滤网过滤；

6.5.分装保存：在无菌条件下将滤液分装于经消毒的玻璃瓶或一次性塑料瓶中，盖上胶塞，保存温度为4-8℃，得到高免卵黄抗体。

7.实施效果：

7.1不同疫苗制备的卵黄抗体效果比较，见表1

表1不同疫苗制备的鸭肝抗体效价测定结果

抗原种类	常规组织灭活苗制备的卵黄抗体	按本发明制备的卵黄抗体
			抗体效价(1：nlog10)	1.7	5.8

由表1可以看出，按照本发明所述方法制备的鸭病毒性肝炎组织灭活苗免疫产蛋母鸡制成的卵黄抗体效价明显高于常规组织灭活苗制备的卵黄抗体(常规组织灭活苗制备的卵黄抗体参考本实施例步骤4)制备，但是不加黄芪当归提取液及蜂胶酊)诱导的抗体滴度。

7.2临床使用效果

利用本发明制备的卵黄抗体免疫2000只患有鸭肝炎的雏鸭，免疫效果见表2。同时使用市售鸭肝炎抗体免疫2000只患有鸭肝炎的雏鸭作为对照，结果免疫注射本发明制备的卵黄抗体的患有鸭肝炎的雏鸭成活率达到95.2％。

表2不同来源鸭肝抗体免疫效果

抗体种类	市售鸭肝炎抗体	本发明制备的卵黄抗体
			成活率	81.5％	95.2％

由表2可以看出，注射按照本发明所述方法制备的卵黄抗体的患有鸭肝炎病鸭的成活率明显高于市售的鸭肝炎抗体。

Claims (1)

1.一种鸭病毒性肝炎组织灭活苗，其特征在于通过以下制备方法得到：

1)称取等量当归和黄芪混匀，再向当归和黄芪中加入与当归和黄芪总量相等的蒸馏水；所述当归：黄芪：蒸馏水W/W/V＝1:1:2，文火煮沸30min提取有效成分，过滤提取液并除菌；用灭菌生理盐水稀释提取液至与所述蒸馏水等量，得到黄芪当归提取液；

2)将市售蜂胶-20℃冷冻后粉碎，过20目筛，向粉碎后的蜂胶中加入蜂胶重量3-4倍的无水乙醇，震荡溶解10-12小时；自然沉淀后，取上清液得到蜂胶酊；

3)按照1:3的比例W/V将鸭肝病料加入含有0.5％甲醛溶液的生理盐水中混合并捣碎鸭肝病料，过40目滤网得到鸭肝病料过滤液；分别向鸭肝病料过滤液中加入鸭肝病料过滤液体积比1-5％的黄芪当归提取液和1-2％的蜂胶酊，37℃灭活10-12小时，得到鸭病毒性肝炎组织灭活苗。