CN110628726A - 一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法，所述二价灭活疫苗由鸭腺病毒2型病毒和DAdV‑3‑GD MM病毒作为灭活抗原制备得到。本发明所筛选的病毒，其制备的番鸭腺病毒2型和3型二价灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果显示，本发明中制备的番鸭腺病毒2型和3型二价灭活疫苗对番鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法
背景技术
禽腺病毒(avian adenovirus)是家禽常见的传染病病原之一，可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的临床和病理症候群，包括心包积水、肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病等多种禽类的病症。
鸭(Anas platyrhynchos domestica)源腺病毒包括富AT腺病毒属的鸭源腺病毒A型(Duck atadenovirus A,DAdV-A)和禽腺病毒属的鸭源腺病毒B型(DAdV-B)。DAdV-A即鸭腺病毒1型(Duck adenovirus type 1，DAdV-1)，又称为产蛋下降综合征病毒(Egg dropsyndrome virus,EDSV)，与产蛋下降综合症相关，要引起蛋鸭产蛋量下降。DAdV-B又称为鸭腺病毒2型(DAdV-2)，1977年从法国番鸭爆发的大规模疾病中分离获得，2011年被命名，感染该病毒的番鸭(Cairna moschata)主要临床表现为消瘦、跛行，直到2014年才利用高通量测序技术获得全基因组序列，随后ICTV将其科学命名为DAdV-B。
近年来，广东、福建、安徽、浙江等番鸭饲养区流行一种以肝脏肿大、表面出血以及颜色变淡为特征的新发疫病，俗称番鸭“白肝病”。经病原的分离鉴定及病毒人工感染试验，初步表明该病病原为DAdV-2和另一种新型番鸭腺病毒，有专家将这种新型腺病毒命名为鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3，DAdV-3)，但该命名尚未被国际病毒分类委员会(ICTV)接受。通过对该新型番鸭腺病毒的流行病学调查，发现该病在我国几乎在所有番鸭养殖区域都有流行，给番鸭养殖业造成较大的经济损失。目前，国内外尚无有效预防和治疗番鸭腺病毒2型和新型腺病的商品化疫苗(或抗体)，研制安全有效的疫苗和抗体迫在眉睫。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种番鸭腺病毒二价灭活疫苗，用于预防雏番鸭2型和3型腺病毒的感染，从而弥补现有技术的不足。
本发明技术方案如下：
一种番鸭新型腺病毒株，其中，该病毒株命名为DAdV-3-GD MM株，于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。
一种番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，所述番鸭腺病毒二价灭活疫苗由鸭腺病毒2型病毒和如权利要求1所述的DAdV-3-GD MM株作为灭活抗原制备得到。
所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，所用鸭腺病毒2型病毒于2018年保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633，所保藏病毒株命名为DAdV-2-GD株。
所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，取两等份灭活后的鸭腺病毒2型和番鸭新型腺病毒的病毒液与佐剂进行混合。
所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，两等份灭活后的鸭腺病毒2型和番鸭新型腺病毒的病毒液与SEPPIC 71R油佐剂佐剂按3∶7比例进行混合乳化。
所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，先低速搅拌SEPPIC 71R油佐剂2分钟，同时徐徐加入鸭腺病毒2型和番鸭新型腺病毒两种灭活病毒液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。
所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，用于制备番鸭腺病毒二价灭活疫苗疫苗的DAdV-2-GD病毒效价≥10-6.8TCID50/0.1ml，用于制备番鸭腺病毒二价灭活疫苗疫苗的DAdV-3-GD MM病毒效价≥10-6.5TCID50/0.1ml。
所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其中，利用超滤浓缩方法分别将DAdV-2-GD病毒和DAdV-3-GD MM病毒进行倍浓缩，分别将两种浓缩病毒液置于灭活瓶内，按总体积的0.02％-0.05％加入β-丙内酯，4℃灭活8-12h，再37℃水浴2h，结束灭活。
一种番鸭腺病毒二价灭活疫苗，其中，所述番鸭腺病毒二价灭活疫苗采用如上所述的方法制备得到。
有益效果
本发明所筛选的病毒，其制备的番鸭腺病毒2型和3型二价灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的番鸭腺病毒2型和3型二价灭活疫苗对番鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中DAdV-2-GD病毒含量测定结果(10n TCID50/0.1ml)。
图2为本发明实施例2中DAdV-3-GD MM病毒含量测定结果(10nTCID50/0.1ml)。
图3为采用血清学方法测定疫苗免疫后抗体水平结果(注：出现沉淀线即为阳性)。
图4为采用免疫攻毒法测定的疫苗效力检验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
病毒的分离与鉴定
1.1鸭腺病毒2型的分离和鉴定
从广东某番鸭养鸭场12日龄发病番鸭中采集病料，采集发病番鸭的肝脏、脾脏、肾脏等的组织研磨，按1∶3(w/v)比例加含双抗的无菌PBS匀浆，反复冻融3次后8000r/min离心10分钟，上清液经0.22um滤器过滤除菌后保存备用。将含1％病毒过滤液接种番鸭胚成纤维细胞，无血清的M199培养液进行培养，37℃静置培养60～78小时，可出现明显的细胞病变，收集病毒液，取上清液提取DNA，利用Hexon蛋白基因特异，经测序鉴定，证明该病毒为鸭腺病毒2型，命名为DAdV-2-GD株。
1.2番鸭新型腺病毒(鸭3型腺病毒)的分离和鉴定
从广东省茂名市某番鸭场9日龄番鸭发病，选取发病症状典型的病死番鸭肝脏、脾脏、肾脏，胰腺等组织50～100g，用研钵研磨组织，按1∶3(w/v)比例加含双抗(含1000U青霉素/ml+1000ug链霉素/ml)的无菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)匀浆，反复冻融3次后8000r/min离心10分钟，取上清液经0.22um滤器过滤除菌，无菌检验合格后保存备用。将病毒过滤液接种12-13日龄番鸭胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的番鸭胚，收获24-144小时死亡番鸭胚和144小时存活番鸭胚尿囊液，置2-8℃冷却12-24小时，收获番鸭胚尿囊液及绒毛尿囊膜。取上清液提取DNA，利用Hexon蛋白基因特异，经测序鉴定，证明该病毒为鸭腺病毒3型，命名为DAdV-3-GD MM株。
实施例2
DAdV-2-GD株毒种的制备
挑选已长满单层的番鸭胚成纤维细胞，弃掉原培养液，加入终浓度1％毒种(GD株原始毒种第3代)无血清的M199维持液，37℃静置培养60～78小时，可出现明显的细胞病变，当细胞病变达80％以上时收获。按此方法连传10代，取第10代细胞毒按培养液1-3％的比例接种于长至单层弃掉原培养液的LMH细胞，37℃吸附1h后弃去病毒液，再加入无牛血清的DMEM/F12病毒维持液，37℃、5％CO2条件下静置培养72-96h，收获病毒液，反复冻融1-2次。收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3～5代，直至80％细胞出现病变且病变时间控制在72-96h内，收获病毒命名为D1。按照同样方法继续繁毒4～7代，分别测定各代次病毒含量，结果见图1。将同代次检验无菌的病毒液混合，定量分装，置于-80℃冰箱保存。
将效价最高代次的毒用于疫苗的制备。由病毒含量测定结果规定疫苗用毒效价应≥10-6.8TCID50/0.1ml。
2、DAdV-3-GD MM株毒种的制备
取番鸭新型腺病毒第3代胚毒尿囊液，经0.22μL滤器过滤后，按培养液3-5％的比例接种于长至单层弃掉原培养液的LMH细胞，37℃吸附1h后弃去病毒液，再加入无牛血清的DMEM/F12病毒维持液，37℃、5％CO2条件下静置培养72-96h，收获病毒液，反复冻融1-2次。收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3-6代，直至80％细胞出现病变且病变时间控制在72-96h内，收获病毒命名为F1。按照同样方法继续繁毒4-7代，分别测定各代次病毒含量，结果见图2。将同代次检验无菌的病毒液混合，定量分装，置于-80℃冰箱保存。
将效价最高代次的毒用于疫苗的制备。由病毒含量测定结果规定疫苗用毒效价应≥10-6.5TCID50/0.1ml。
3.疫苗的制备
3.1病毒的浓缩
利用超滤浓缩方法(赛多利斯膜包30KD)分别将DAdV-2-GD和DAdV-3-GD MM均进行倍浓缩，用于二联疫苗的制备。
3.2病毒的灭活
分别将两种细胞毒液置于灭活瓶内，按总体积的0.02％-0.05％加入β-丙内酯(BPL)，4℃灭活8-12h，再37℃水浴2h，结束灭活。
3.3半成品检验
3.3.1无菌检验 取灭活的病毒液，按2015年版《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
3.3.2灭活检验 取灭活后的病毒液接种9日龄SPF鸡胚或11日龄鸭胚，0.2ml/胚，观察7日，鸡胚及鸭胚仍全部存活。
3.4灭活疫苗的制备
取两等份的两种灭活的抗原液与SEPPIC 71R油佐剂按3∶7比例进行乳化，先开动电机低速搅拌71R佐剂2分钟，同时徐徐加入抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
4.疫苗成品检验
4.1性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，应不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，结果符合规定。
4.2装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检查，结果符合规定。
4.3无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。
4.4安全检验 皮下免疫7日龄雏番鸭10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml，观察21日，生长发育均正常，精神状态良好，剖检注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。
5疫苗免疫效果检测
5.1血清学方法 将疫苗以0.5ml/只的剂量颈部皮下注射7日龄番鸭10只，另取10只同日龄番鸭不免疫作对照，免疫后第2周开始每周采血，分离血清，直至免疫后第8周，用琼脂免疫扩散试验法分别测定鸭腺病毒2型、3型血清抗体效价，检测结果见图3。
5.2免疫攻毒法 取90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗1.5ml/只，另取20只同日龄种番鸭不免疫作对照。免疫组于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭1日龄时免疫组子代取20只，随机分为A、C两组，每组10只，对照组子代取20只，随机分为B、D两组，每组10只。A、B组攻毒DAdV-2-GD株，C、D组攻毒DAdV-3-GD MM株，每只腿部肌肉注射0.5ml/只(DAdV-2-GD株病毒含量107.5TCID50/0.1ml，DAdV-3-GD MM株病毒含量107.2TCID50/0.1ml)。观察并详细记录免疫组番鸭和对照组番鸭子代的发病情况，结果见图4。
结果显示：雏番鸭腺病毒二联灭活疫苗免疫免后第3周开始，鸭腺病毒2腺和3型琼扩抗体效价均能达到10/10以上阳性，而对照未免疫番鸭，琼扩抗体效价均为阴性。种番鸭免疫后子代番鸭进行攻毒，攻毒后雏番鸭观察14日，种番鸭免疫组子代雏鸭母源抗体较高，DAdV-2-GD和DAdV-3-GD MM攻毒后免疫组雏番鸭全部存活，剖检只有DAdV-2-GD攻毒A组有1只鸭子出现肝脏轻微肿大，颜色稍微变浅的症状，其余免疫A组和C组鸭子肝脏和肾脏等内脏器官均正常，A组子代保护保护率和C组子代保护率均为100％；对照B组雏番鸭DAdV-2-GD攻毒后全部发病，B组死亡4只，死亡番鸭和攻毒后14天存活番鸭子进行剖杀，剖检均可见肝脏肿大，肝脏发白、颜色变浅、部分黄染，肾脏充血肿大，肾脏肿大出血。对照D组雏番鸭DAdV-3-GD MM攻毒后全部发病，D组10只番鸭全部死亡，死亡番鸭剖检均可见肝脏肿大，有不同程度的出血点或出血斑，十二指肠出血，脾脏肿大出血，胆囊肿大，肾脏充血肿大等典型病变。
综上，本发明制备的鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗免疫番鸭后，子代雏番鸭腺病毒2型、3型的母源抗体较高，通过番鸭腺病毒2型和3型的攻毒试验，均能够有效的预防子代雏番鸭腺病毒病的发生。
本发明所筛选的病毒，其制备的番鸭腺病毒2型和3型二价灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的番鸭腺病毒2型和3型二价灭活疫苗对番鸭群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种番鸭新型腺病毒株，其特征在于，该病毒株命名为DAdV-3-GD MM株，于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。
2.一种番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述番鸭腺病毒二价灭活疫苗由鸭腺病毒2型病毒和如权利要求1所述的DAdV-3-GD MM株作为灭活抗原制备得到。
3.根据权利要求2所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所用鸭腺病毒2型病毒于2018年保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633，所保藏病毒株命名为DAdV-2-GD株。
4.根据权利要求3所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，取两等份灭活后的鸭腺病毒2型和番鸭新型腺病毒的病毒液与佐剂进行混合。
5.根据权利要求4所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，两等份灭活后的鸭腺病毒2型和番鸭新型腺病毒的病毒液与SEPPIC 71R油佐剂佐剂按3∶7比例进行混合乳化。
6.根据权利要求5所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，先低速搅拌SEPPIC 71R油佐剂2分钟，同时徐徐加入鸭腺病毒2型和番鸭新型腺病毒两种灭活病毒液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。
7.根据权利要求3所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，用于制备番鸭腺病毒二价灭活疫苗疫苗的DAdV-2-GD病毒效价≥10-6.8TCID50/0.1ml，用于制备番鸭腺病毒二价灭活疫苗疫苗的DAdV-3-GD MM病毒效价≥10-6.5TCID50/0.1ml。
8.根据权利要求3所述的番鸭腺病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，利用超滤浓缩方法分别将DAdV-2-GD病毒和DAdV-3-GD MM病毒进行倍浓缩，分别将两种浓缩病毒液置于灭活瓶内，按总体积的0.02％-0.05％加入β-丙内酯，4℃灭活8-12h，再37℃水浴2h，结束灭活。
9.一种番鸭腺病毒二价灭活疫苗，其特征在于，所述番鸭腺病毒二价灭活疫苗采用如权利要求2-8任一项所述的方法制备得到。
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