CN114209821A - 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114209821A
CN114209821A CN202111652396.4A CN202111652396A CN114209821A CN 114209821 A CN114209821 A CN 114209821A CN 202111652396 A CN202111652396 A CN 202111652396A CN 114209821 A CN114209821 A CN 114209821A
Authority
CN
China
Prior art keywords
duck
antigen
circovirus
disease
inactivated vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111652396.4A
Other languages
English (en)
Inventor
宋扬
孙凯
徐刚
李应鹤
于镭
李倩
冯艳男
李婷婷
胡秀艳
刘洋
曹宝珠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Original Assignee
Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd filed Critical Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Priority to CN202111652396.4A priority Critical patent/CN114209821A/zh
Publication of CN114209821A publication Critical patent/CN114209821A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12211—Orthoreovirus, e.g. mammalian orthoreovirus
    • C12N2720/12221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12211—Orthoreovirus, e.g. mammalian orthoreovirus
    • C12N2720/12234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法，所述三联灭活疫苗包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，所述灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原和鸭腺病毒病3型抗原。本发明进一步公开了制备所述三联灭活疫苗的方法。本发明的防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病的3型三联灭活疫苗安全性良好，不会产生抗原成份的相互干扰或影响。免疫保护效力试验证明，本发明三联灭活疫苗能够同时预防鸭呼肠孤病毒，鸭圆环病毒和鸭腺病毒病3型，可避免多次接种免疫出现的不良反应，具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等优点。

Description

防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的 三联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种防治鸭病毒病的三联灭活疫苗，尤其涉及同时防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗，本发明进一步涉及该三联灭活疫苗的制备方法，属于防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备领域。
背景技术
鸭圆环病毒主要侵害宿主的免疫系统，造成宿主免疫功能低下，进而易引发二重甚至多重感染，造成巨大的经济损失。鸭圆环病毒不能在各种细胞系及鸡胚中增殖，所以通过对鸭圆环病毒的分离纯化并以全病毒作为抗原制备疫苗困难较大。杆状病毒表达系统具备完整的翻译后修饰系统，明显优于细菌和酵母，且易于操作及大规模生产等。
新型鸭呼肠孤病毒病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病，自2017年以来，在山东、河南、江苏等地区的养鸭场中发现。其易感日龄多在5d-25d范围内，发病率一般在10％-70％之间，死亡率一般在50％-60％之间。日龄越小，发病和死亡率越高。在天气寒冷的环境下，发病率和死亡率都有明显升高。
鸭腺病毒病3型最初于2014年在广东流行逐渐扩大到全国各地特别是南方数省。该病仅见于番鸭，多在15～20日龄发病，发病率40％～50％，死亡率35％～43％。剖检病变的特征为肝脏肿大、色泽变淡或黄化、肝脏出血、坏死，心包积液、心肌出血或坏死，肾脏肿大、出血、坏死。目前，该病已给现地养殖户带来了巨大的经济损失。
近年来，中国养鸭产业快速发展、规模不断壮大，但养殖水平和技术相对落后，各种鸭流行性疫病相继发生。从检测中国不同省份的鸭子的病料来看，其中鸭圆环病毒、新型呼肠孤病毒和鸭腺病毒3型是鸭的三种常发疫病，给中国养殖业造成了巨大的经济损失。
迄今为止，对于这三种疫病尚未有效的措施进行防控，由此尽快研制出一种安全有效的三联灭活疫苗尤为关键。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种安全且有效的同时防治新型鸭呼肠孤病毒病毒、鸭圆环病毒和鸭腺病毒3型的三联灭活疫苗；
本发明的目的之二是提供一种制备所述的三联灭活疫苗方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了同时防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒3型的三联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其中，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原和鸭腺病毒3型抗原。
所述的鸭圆环病毒抗原可以是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白；最为本发明一种优选的具体实施方式，优选为码子优化后的鸭圆环病毒cap基因采用真核表达的方式得到重组鸭圆环病毒cap蛋白；
作为参考，本发明提供了一种制备重组鸭圆环病毒cap蛋白的方法，包括：构建携带鸭圆环病毒cap基因的重组杆状病毒穿梭载体；将重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9细胞得到重组杆状病毒；扩增重组杆状病毒。
所述的鸭呼肠孤病毒抗原优选是将新型鸭呼肠孤病毒S株(其微生物保藏编号为：CGMCC No.20000)在LMH细胞中进行增殖得到的病毒液。
所述鸭腺病毒3型抗原的制备可以是将鸭腺病毒3型生产用毒种接种易感鸭胚，收获胚液，得到鸭肝炎病毒抗原。
本发明中所用到的鸭腺病毒3型生产用毒种可以是任何一种通过商业途径购买得到的鸭腺病毒3型毒种，本发明中所用的鸭腺病毒3型生产用毒种是鸭腺病毒3型FZ株，微生物保藏编号为：CGMCC No.21928，其分类命名是：鸭腺病毒3型，保藏时间是：2021年11月4日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的三联联灭活疫苗中，鸭呼肠孤病毒液不小于107.0TCID50，鸭腺病毒3型不小于105.5ELD50，每羽份疫苗中DuCV-cap蛋白含量不小于5μg。
本发明中所述的免疫佐剂可以任何一种常规的免疫佐剂，作为本发明的一种具体的实施方式，所述的免疫佐剂可以为白油、司班-80(span-80)、硬脂酸铝或吐温-80中的任何一种或多种。
本发明所述灭活疫苗部分还可包括冻干保护剂。
本发明进一步提供了一种制备所新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒病和鸭腺病毒3型的三联灭活疫苗的方法，包括：
(1)油相制备：取白油与司班-80混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌后灭菌，备用；
(2)水相制备：将灭活的鸭呼肠孤病毒抗原，鸭腺病毒3型抗原以及重组鸭圆环病毒cap蛋白混合得到抗原混合液；抗原混合液与无菌吐温-80混匀直至吐温-80完全溶解；
(3)乳化：取油相在组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相，加完水相后再搅拌，即得。
作为本发明的一种优选的实施方案，步骤(1)中将取白油与司班-80按照94：6的比例混合均匀加入2％的硬脂酸铝；所述的搅拌是搅拌至淡黄色且澄清透明后121℃高压蒸汽灭菌。
作为本发明的一种优选的实施方案，步骤(2)的抗原混合液中控制鸭呼肠孤病毒液不小于107.0TCID50，3型鸭腺病毒不小于105.5ELD50，每羽份疫苗中DuCV-cap蛋白含量不小于5μg；抗原混合液与无菌吐温-80(Tween-80)按照97.5：2.5的比例震荡混匀直至吐温-80完全溶解。
作为本发明的一种优选的实施方案，取油相3份放入组织匀浆机内慢速搅拌，同时徐徐加入水相2份，加完后再以10000r/min的转速搅拌4min-5min。
安全性试验检验结果表明，本发明制备的三联灭活疫苗接种雏鸭，观察期间雏鸭全部健活，无局部和全身不良反应，具有良好的安全性。
根据本发明三联灭活疫苗免疫保护效力试验结果可见，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在28日时达到最高，中和抗体效价均不低于1:256。雏鸭免疫后21日攻击鸭圆环病毒强毒，21日后采全血以RT-QPCR方法检测全血中DuCV核酸拷贝数，结果免疫组雏鸭10/10保护，攻毒对照组雏鸭10/10发病；雏鸭免疫后3周进行鸭腺病毒3型强毒株攻毒试验。结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭100％保护；21攻毒对照组100％发病。
本发明提供的三联灭活疫苗不会产生抗原成份的相互干扰或影响，能够同时预防鸭呼肠孤病，鸭圆环病和鸭腺病毒3型，可避免多次接种免疫出现的不良反应，具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、3型鸭腺病毒病三联灭活疫苗的制备
1.毒种
新型鸭呼肠孤病毒S株(微生物保藏编号为：CGMCC No.20000，其分类命名是：新型鸭呼肠孤病毒，保藏时间是：2020年7月6日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。
2.灭活疫苗的制备及检验
2.1鸭圆环杆状病毒制备
2.1.1鸭圆环病毒CAP基因的设计与合成
将鸭圆环病毒cap基因经密码子优化后，在序列两端添加EcoRⅠ和Hind III酶切位点，委托生物公司克隆至pFastBacⅠ载体，形成重pFB-DuCV-cap。
2.1.2重组穿梭杆粒rBacmid-DUCV-cap的构建与制备
2.1.2.1重组穿梭杆粒的构建
将1μL重组质粒pFB-DuCV-cap加入至200μL于冰上融化的DH10Bac感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，迅速置于冰上2min，加入900μL的S.O.C培养基，37℃220rpm振荡培养4h，然后用S.O.C培养基做10-1，10-2，10-3三个稀释度，每个稀释度取150μL均匀的涂布于LB选择性琼脂平板上，37℃温箱避光培养36-48h，直至清晰蓝白菌落出现。
2.1.2.2重组杆状病毒穿梭载体DNA的提取
将LB选择性平板放于4℃冰箱2h，使菌落充分显色，将平板取出进行蓝白斑的筛选，挑取平板上较大的散在白色单菌落，重新划线接种于LB选择性平板进行第二次的蓝白斑筛选，37℃过夜培养后，同样，挑取平板上较大的散在白色单菌落接种至含50μg/ml的卡那霉素，7μg/ml的庆大霉素，10μg/ml的四环霉素的LB液体培养基中37℃220rpm振荡培养16个小时，提取杆粒DNA。
2.1.2.3重组杆状病毒穿梭载体DNA的PCR鉴定
以提取的重组杆状病毒穿梭载体DNA为模板，利用DuCV-cap-R/DuCV-cap-F引物进行PCR扩增。
表1 PCR扩增引物
Figure BDA0003445076570000061
循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，共设置30个循环；72℃延伸10min。预计PCR扩增片段长度约为774bp，验证正确的杆粒DNA命名为rBacmid-DuCV-cap。
2.1.3重组杆粒转染Sf9细胞
转染前选择状态良好的Sf9细胞铺于6孔板，取适量传代Sf9细胞使用台盼蓝染色30s左右，滴于血球计数板观察细胞活性并计数。将细胞活性≥97％的细胞铺于6孔板，每孔106个细胞左右。2h(或过夜)后细胞贴壁，可用于转染。转染过程如下(细胞传代、转染均在无菌条件下操作)：
1、准备两个灭菌的1.5ml EP管，各分装0.1ml无抗生素、无胎牛血清的Sf-900培养基；
2、分别加入3μl重组杆粒(2μg)、6μl转染试剂，轻轻混匀，室温静置5min。
3、将含有转染试剂的培养基转移到含有杆粒的培养基中，轻轻混匀，室温静置20min；期间取出贴壁的Sf9细胞，弃去原培养基，使用无抗生素、无胎牛血清的Sf-900培养基轻轻洗两遍，每孔加入2ml无抗生素、无胎牛血清的Sf-900培养基；
4、将混合液均匀滴加到6孔板的一个细胞孔中，另一孔为正常细胞对照。转染第3～5天，观察细胞变化。
2.1.4重组杆状病毒的扩增
将状态良好的Sf9细胞悬液传至细胞瓶，细胞贴壁后，接种10μl P0代病毒液。接毒约72h，Sf9细胞开始出现病变，第5或6天，待细胞出现变大变圆、胞内颗粒状物非常明显时，收获病毒液，-80℃避光保存。
2.1.5 DuCV-cap蛋白的测定
利用Bradford蛋白定量测定试剂盒，采用微孔酶标仪法，测定DUCV-cap蛋白浓度，试验严格按照说明书进行。
2.1.6灭活及灭活检验
2.1.6.1灭活
收获的鸭圆环杆状病毒液中缓慢加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1％，充分混匀，37℃灭活24小时，期间每两个小时搅拌一次。灭活后的病毒液置2～8℃保存。
2.1.6.2灭活检验
取灭活后的病毒液，接种于已形成良好单层的Sf9细胞，置27℃培养观察4日，反复冻融2次后，再盲传2代，观察细胞病变情况。
2.2鸭呼肠孤病毒制备
2.2.1病毒液制备
将状态良好的LMH细胞悬液传至细胞瓶，按培养基总量的2％将毒种接种长满单层的LMH细胞，置37℃5％CO2培养箱中培养，吸附1小时后，补加血清含量为2％的DMEM细胞培养液，继续在37℃5％CO2培养箱中培养。接毒后细胞培养40-48小时，当细胞病变达到80％以上时，收获细胞及细胞培养物。反复冻融2次后，使用TCID50方法检测病毒滴度。
2.2.2病毒含量测定
将LMH细胞制备为单细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔100μl(细胞含量4.0×105个/ml)，置37℃含5％CO2培养箱中培养24h。将病毒液用DMEM培养基作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9 4个稀释度，各加入培养24h的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μl，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。上述细胞孔加入含2％新生牛血清的DMEM培养液，每孔100μl。置37℃含5％CO2培养箱中培养5日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，按Reed-Muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度(TCID50)。
2.2.3灭活及灭活检验
2.2.3.1灭活
收获的鸭呼肠孤病毒液中缓慢加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1％，充分混匀，37℃灭活24小时，期间每两个小时搅拌一次。灭活后的病毒液置2～8℃保存。
2.2.3.2灭活检验
取灭活后的病毒液，接种于已形成良好单层的LMH细胞，置37℃培养观察4日，反复冻融2次后，再盲传2代，观察细胞病变情况。
2.3鸭腺病毒3型原液的制备及检验
2.3.1制苗用鸭腺病毒3型病毒液的制备
用灭菌生理盐水将鸭腺病毒3型生产用毒种做1000倍稀释，分别经尿囊腔接种11日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。弃去24小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集24～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(ELD50)测定。病毒含量应不低于105.5ELD50/0.2ml。
2.3.2灭活及检验
2.3.2.1灭活
将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻，分别边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％。37℃灭活16h，期间不断搅拌。灭活后病毒液置2～8℃保存，保存期不超过30天。
2.3.2.2灭活检验
取灭活后的病毒液，接种于11日龄易感番鸭胚，置37℃培养观察168h，记录番鸭胚存活情况，收获健活番鸭胚尿囊液再盲传1代，记录番鸭胚存活情况。
2.4灭活疫苗的配制
2.4.1油相制备
取白油与司班-80(span-80)按照94：6的比例充分混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌至淡黄色且澄清透明后，121℃高压蒸汽灭菌备用。
2.4.2水相制备
将灭活检验合格的3种病毒液以等比例混合，鸭呼肠孤病毒液不小于107.0TCID50，3型鸭腺病毒不小于105.5ELD50每羽份疫苗中DuCV-cap蛋白含量不小于5μg。抗原液与无菌吐温-80(Tween-80)按照97.5：2.5的比例震荡混匀，直至吐温-80完全溶解。
2.5乳化
取油相3份放入组织匀浆机内，慢速搅拌，同时徐徐加入水相2份，加完后再以10000r/min搅拌4min-5min。
2.6成品检验
2.6.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验。
2.6.2安全检验
取1日龄健康易感雏鸭20羽，随机分为2组，一组为试验组，在其颈部皮下注射2ml灭活疫苗；另一组为对照组，在其颈部皮下注射等量生理盐水。接种后每日观察试验动物精神、采食、有无不良反应。
3.试验结果
3.1鸭圆环杆状病毒制备
3.1.1 DuCV-cap蛋白的测定
根据测得的不同浓度标准品OD值，以OD值为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程，计算DuCV-cap蛋白浓度为2.3mg/ml。
3.1.2灭活检验
灭活后的鸭圆环杆状病毒接种SF9细胞，并盲传2代，细胞均无病变产生，结果表明病毒液灭活完全。
3.2鸭呼肠孤病毒制备
3.2.1鸭呼肠孤病毒病毒含量测定
将鸭呼肠孤病毒种毒接种长满单侧的LMH细胞，培养44小时收获，反复冻融2次，测定病毒含量为107.5TCID50/ml。
3.2.2灭活检验
灭活后的呼肠孤病毒接种LMH细胞，并盲传2代，细胞均无病变产生，结果表明病毒液灭活完全。
3.3鸭腺病毒3型原液的制备
3.3.1鸭腺病毒3型病毒含量测定
将鸭腺病毒3型病毒液做10倍系列稀释，每个稀释度接种易感鸭胚5枚，每枚0.2ml，培养观察168h，记录鸭胚的死亡情况。按Reed-Muench法计算病毒液的病毒含量为105.83ELD50 /0.2ml。
3.3.2灭活检验
灭活后的鸭肝炎病毒接种10日龄易感鸭胚，并盲传1代，鸭胚均全部健活，结果表明病毒液灭活完全。
3.4成品检验
3.4.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录对灭活疫苗进行无菌检验。结果表明成品无菌检验合格。
3.4.2安全检验
疫苗接种雏鸭，观察期间雏鸭全部健活，无局部和全身不良反应。
试验例1鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、3型鸭腺病毒病三联灭活疫苗的效力检验
1试验方法
1.1鸭呼肠孤病毒部分
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗1ml，接种3周后同样方式进行加强免疫1次。第2组不免疫，作空白对照。首免后每周采血分离血清，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体水平。
1.2鸭圆环病毒部分
1日龄健康易感雏鸭30只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组10只为攻毒对照组，每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。免疫后21日，各组雏鸭腿部肌肉注射鸭圆环病毒1.0ml。攻毒后21日翅静脉采血。按新鲜血液与抗凝剂6:1的比例加入抗凝剂，用RT-QPCR方法检测全血中DuCV核酸拷贝数。免疫组应至少8/10保护，攻毒对照组应至少8/10发病。
1.3鸭腺病毒3型部分
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组不免疫，作空白对照。接种后21日，各组雏鸭腿部肌肉注射鸭腺病毒3型0.5ml，隔离饲养10日，剖检各组鸭只观察肝脏病变(3型鸭腺病毒病发病标准：剖检雏鸭可见肝脏肿大、色泽变淡或黄化)。免疫组应至少8/10保护，攻毒对照组应至少8/10发病。
2检验结果
2.1鸭呼肠孤病毒部分抗体水平
雏鸭免疫后每周采血，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体水平，结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在28日时达到最高，中和抗体效价均不低于1:256。
表2血清中鸭呼肠孤病毒抗体水平
Figure BDA0003445076570000121
注：“-”代表阴性
2.2鸭圆环病毒部分
雏鸭免疫后21日攻击鸭圆环病毒强毒，21日后采全血以RT-QPCR方法检测全血中DuCV核酸拷贝数，结果免疫组雏鸭10/10保护，攻毒对照组雏鸭10/10发病，结果见表3。
表3鸭圆环病毒免疫攻毒保护结果
Figure BDA0003445076570000122
注：“+”代表Ct≤26，判为阳性，“-”Ct＞26判为阴性。
2.3鸭腺病毒3型部分
雏鸭免疫后3周进行攻毒试验。结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭100％保护；21攻毒对照组100％发病。
表4鸭腺病毒3型攻毒保护结果
Figure BDA0003445076570000131
注：“+”代表发病，“-”代表健康。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈药集团生物疫苗有限公司
<120> 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法
<130> HLJ-3002-210106A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 770
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
ctcgaggcac gcgaattatc aaagtcaatg tcgagtgcga gttacgtctc tatgtaattc 60
tgcgcgtcca ctcctgctgc gttgtccgat tcacgaaaac tcatgcacac gctgtcatgc 120
accatttagt attgagtgcg gtcgacccgt gcgaggtaac gtctccagag gaggagggcc 180
gcgactttgt cccatcaccg gcaccatgta tgatgggatt gggccaaaaa tatctccgct 240
gtactctaga aggctctcag gtcctctgct gcttgtcgaa ccatagggat ctatcgacca 300
ccctgtggtc gcagtattta ccatatgtcc atccttgtct ataacagtcg acccatgcgt 360
attactattt tgatatatct tatgtgccgg cctaagggtg atagccacac cattaataat 420
gtagtaatca tagggataat ggtaattcgg agttgacccc gttatgtaac tgttcgtgtc 480
accaaatata gcccatcttc atttcaaacc gcatatctta ttaccgcgcg ctggtgggtc 540
tgtgtattca gcaccctcat ctaagcttaa actctgtcat ttgccagcag ctgtcggacc 600
agtctgtagt cgaaaaagtc gcctacgatg ttccttgtgg ccctacatgt cactacggaa 660
aaccgtcgtc ggggtcttgc gattcgtagc cttcgtcttc tgaatctcct gcgtagaccc 720
cgcctcttcc tccgaccacg atatgcacgc cgataggagc gacctcgcat 770

Claims (10)

1.防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其特征在于，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原和和鸭腺病毒病3型抗原；其中，用于制备鸭腺病毒病3型抗原的毒株是鸭腺病毒3型FZ株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.21928。
2.根据权利要求1所述的的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将鸭圆环病毒cap基因采用真核表达的方式得到的重组鸭圆环病毒cap蛋白。
4.根据权利要求3所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将鸭圆环病毒cap基因采用真核表达的方式包括：构建携带鸭圆环病毒cap基因的重组杆状病毒穿梭载体；将重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9细胞得到重组杆状病毒；扩增重组杆状病毒，得到重组鸭圆环病毒cap蛋白。
5.根据权利要求1所述的的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭呼肠孤病毒抗原是将鸭呼肠孤病毒S株在LMH细胞中进行增殖得到病毒液；所述鸭呼肠孤病毒S株的微生物保藏编号为：CGMCC No.20000。
6.根据权利要求1所述的的三联灭活疫苗，其特征在于，所述鸭腺病毒病3型抗原的制备是将鸭腺病毒3型生产用毒种接种易感鸭胚，收获胚液得到鸭腺病毒3型抗原。
7.根据权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为白油、司班-80、硬脂酸铝或吐温-80中的任何一种或多种。
8.根据权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，还含有冻干保护剂。
9.一种制备权利要求1-8任何一项所述三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括：
(1)油相制备：取白油与司班-80混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌后灭菌，备用；
(2)水相制备：将灭活的鸭呼肠孤病毒抗原，鸭腺病毒病3型抗原以及重组鸭圆环病毒cap蛋白混合得到抗原混合液；抗原混合液与无菌吐温-80混匀直至吐温-80完全溶解；
(3)乳化：取油相在组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相，加完水相后再搅拌，即得。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将取白油与司班-80按照94：6的比例混合均匀加入2％的硬脂酸铝；所述的搅拌是搅拌至淡黄色且澄清透明后121℃高压蒸汽灭菌；
步骤(2)的抗原混合液中控制鸭呼肠孤病毒液不小于107.0TCID50，鸭腺病毒3型不小于105.5ELD50，每羽份疫苗中重组鸭圆环病毒cap蛋白含量不小于5μg；抗原混合液与无菌吐温-80按照97.5：2.5的比例震荡混匀直至吐温-80完全溶解；
步骤(3)中取油相3份放入组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相2份，加完后再以10000r/min的转速搅拌4min-5min。
CN202111652396.4A 2021-12-30 2021-12-30 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法 Pending CN114209821A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111652396.4A CN114209821A (zh) 2021-12-30 2021-12-30 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111652396.4A CN114209821A (zh) 2021-12-30 2021-12-30 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114209821A true CN114209821A (zh) 2022-03-22

Family

ID=80707025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111652396.4A Pending CN114209821A (zh) 2021-12-30 2021-12-30 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114209821A (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192234A1 (en) * 1999-11-22 2002-12-19 Goutebroze Sylvain Gabriel Duck pneumovirus and corresponding vaccines
WO2010119112A1 (en) * 2009-04-15 2010-10-21 Ceva Sante Animale Recombinant avian herpes virus vectors and vaccine for immunizing waterfowl species
CN110628726A (zh) * 2019-09-30 2019-12-31 山东信得科技股份有限公司 一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法
CN110628944A (zh) * 2019-08-07 2019-12-31 山东省农业科学院家禽研究所 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
CN111053897A (zh) * 2019-12-19 2020-04-24 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN111349619A (zh) * 2020-03-31 2020-06-30 山东百瑞凯来生物科技有限公司 一种鸭圆环病毒组织灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法
CN111420042A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 山东百瑞凯来生物科技有限公司 一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法
CN113198011A (zh) * 2021-04-28 2021-08-03 重庆永健生物技术有限责任公司 一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗及其应用
CN113384692A (zh) * 2020-12-28 2021-09-14 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭呼肠弧病毒、鸭圆环病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN113491767A (zh) * 2020-12-31 2021-10-12 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192234A1 (en) * 1999-11-22 2002-12-19 Goutebroze Sylvain Gabriel Duck pneumovirus and corresponding vaccines
WO2010119112A1 (en) * 2009-04-15 2010-10-21 Ceva Sante Animale Recombinant avian herpes virus vectors and vaccine for immunizing waterfowl species
CN110628944A (zh) * 2019-08-07 2019-12-31 山东省农业科学院家禽研究所 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
CN110628726A (zh) * 2019-09-30 2019-12-31 山东信得科技股份有限公司 一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法
CN111053897A (zh) * 2019-12-19 2020-04-24 广州渔跃生物技术有限公司 一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN111349619A (zh) * 2020-03-31 2020-06-30 山东百瑞凯来生物科技有限公司 一种鸭圆环病毒组织灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法
CN111420042A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 山东百瑞凯来生物科技有限公司 一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法
CN113384692A (zh) * 2020-12-28 2021-09-14 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭呼肠弧病毒、鸭圆环病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN113491767A (zh) * 2020-12-31 2021-10-12 哈药集团生物疫苗有限公司 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法
CN113198011A (zh) * 2021-04-28 2021-08-03 重庆永健生物技术有限责任公司 一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王秀娟: "雏番鸭鸭3型腺病毒与鸭圆环病毒共感染诊断报告", 《福建畜牧兽医》, vol. 43, no. 5, pages 55 - 56 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111000993B (zh) 一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法
CN106947746B (zh) 鸡传染性支气管炎致弱疫苗株ldl-t株及其应用
CN113491767A (zh) 鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠弧病毒病、鸭病毒性肝炎三联灭活疫苗及其制备方法
CN102068694A (zh) 鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法
CN105582533B (zh) 一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗
CN102068695A (zh) 鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病四联灭活疫苗的生产方法
CN113384692A (zh) 鸭呼肠弧病毒、鸭圆环病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN109097340B (zh) 一种禽腺病毒、一种四联疫苗及其制备方法
CN108465107B (zh) 一种鸭2型腺病毒和番鸭细小病毒病二联灭活疫苗
CN104056265B (zh) 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法
CN105920596B (zh) 一种番鸭细小病毒病、小鹅瘟二联疫苗
CN109055320B (zh) 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用
CN105802918B (zh) 鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法和应用
CN108939063B (zh) 一种番鸭三联灭活疫苗
CN113832113B (zh) 新型鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用
CN102139104A (zh) 鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法
CN116286670A (zh) 一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用
CN104195114A (zh) 一种禽肺病毒及其应用
CN111110839B (zh) 一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗
CN111073863B (zh) 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
CN114209821A (zh) 防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病和鸭腺病毒病3型的三联灭活疫苗及其制备方法
CN107982532B (zh) 一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法
CN112999343A (zh) 一种鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法
CN111000995A (zh) 猪用三联灭活疫苗及其制备方法和应用
CN110974949A (zh) 猪用二联灭活疫苗及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination