EA013598B1 - Идентификация представленных hla-a2 т-клеточных эпитопов, полученных из раково-эмбрионального антиген-незрелого рецепторного белка ламинина, и их применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в частности к нескольким опухолевым формам, включающим гематологические злокачественные опухоли. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует антиопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул HLA класса I или II человеческого раково-эмбрионального антиген-незрелого рецептора ламинина (OFA/iLR), который может быть использован в вакцинных композициях для вызывания антиопухолевых иммунных ответов.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам, молекулам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в частности к нескольким опухолевым формам, включающим гематологические злокачественные опухоли. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным эпитопам пептидов Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул НЬЛ класса I или II человеческого раково-эмбрионального антиген-незрелого рецептора ламинина (ОЕЛ/гВК.), который может быть использован в вакцине или других фармацевтических композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Уровень техники

Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухолевых клеток или из периферийной крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (СНееуег е! а1., Аппа1к Ν.Υ. 8с1. Асаб. 8с1. 1993, 690:101-112; ВокепЬегд 8.Л. 8йеббшд НдЫ оп 1ттипоШегару Гог сапсег. Ν. Епд1. I. Меб. 2004 Арг 1; 350(14):1461-3). В частности, СЭ8' Т-клетки (ТСЭ8⁺), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), с пептидами, имеющими 8-10 остатков, образованных из белков, находящихся в ядре или цитозоли, или из дефектных рибосомальных белков (ΌΚΙΡκ), играют важную роль в этом ответе. ΌΚΙΡκ являются необходимым источником для пептидов и формируют продукты дефектной трансляции в рибосомах и были впервые описаны группой авторов I. Υе\νбе1Γк (8с1шЬей и., Ап!оп Ь.С., С1ЬЬк I., №гЬигу С.С., Υе\νбе11 IV., Вепшик Ι.Κ. Вар1б бедгабайоп о! а 1агде Ггасйоп о! пе\\1у куЩкек1/еб рго!етк Ьу рго!еакошек. №11иге. 2000 Арг 13; 404(6779):770-4). Молекулы МНС человека называются также лейкоцитарными антигенами человека (НЬА).

Существуют два основных класса молекул МНС, которые могут быть распознаны Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться в большинстве клеток, имеющих ядро, которые представляют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков и крупных пептидов. Молекулы МНС класса II могут встречаться на профессиональных антиген-представляющих клетках (АПК), таких как макрофаги, дендритные клетки, на Вклетках, на эндотелиальных клетках и на измененных клетках опухолей и опухолевой строме, которые при нормальных условиях не экспрессируют молекулы МНС класса II на своих клеточных поверхностях, и либо представляют сдерживающие пептиды экзогенные белки, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза, или которые, в другом случае, входят в отдел МНС II класса (МПС) и впоследствии процессируются и погружаются на комплексы МНС класса II. Комплексы пептидов и МНСИ распознаются СЭ8⁺-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, комплексы пептидов и МНС-П распознаются СЭ4⁺-хелперными-Т-клетками (в общем описано в 'ТттипоЬюЦду Сйабек А., 1г. 1апе^ау, Раи1 Тгауегк, Магк \Vа1ро^ι. Магк I. 8Н1отсЫк).

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен быть связан с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 остатков в длину и содержат два зарезервированных остатка («домен») в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС (см. 2-ой список, опубликованный в ''[ттиподепебс!/' (Ваттепкее Н., ВасНтапп I., ЕттепсН Ν.Ρ., Васйог О.А., 81еуапоую 8. δΥ^ΡΕ^Ε ба!аЬаке Гог МНС Едапбк апб рерббе тойГк. Iттиподепеί^ск. 1999 Μν; 50(3-4): 213-9)).

На данный момент имеются многочисленные примеры ТСЭ8⁺ как мыши, так и человека, которые специфически распознают опухолевые клетки и обладают терапевтической активностью после адоптивного переноса, в некоторых случаях индуцирующей полную ремиссию. Тем не менее, несмотря на потенциал Т-клеток по устранению опухолей, из прогрессивного роста большинства видов рака, очевидно, что многие опухоли ускользают от распознавания ТСЭ8' ш у1уо. Хотя было установлено, что ряд опухолей является иммуногенным, было сложно продемонстрировать стимуляцию эффективного антиопухолевого иммунного ответа: последние данные показывают, что иммунизация может вести к сильным Тклеточным ответам против опухолеассоциированных пептидов (8ре1кег Ό.Ε., Ыепагб Ό., ВиГег Ν., ВиЬюСобоу V., В1то1б1 Ό., Ье_)еипе Е., Кпед А.М., СегоШш 1.С., Вотего Р. Вар1б апб к!гопд Нитап СЭ8' Т се11 гекропкек !о уассшабоп \νί11ι рерйбе, ША, апб СрС ойдобеохупискоНбе 7909. I. С1т. Луек!. 2005 Маг;

- 1 013598

115(3):739-46. 8скад К., 8скт1б! 8.М., Ми11ег М.К., Уешзскепк Т., Арре1 8., Уеск М.М., ОгипеЬаск Р., 8!еуапоу1с 8., Каттепзее Н.С., ВгоззаП Р. ИепбВсабоп оГ С-те1 опсодепе аз а Ьгоаб1у ехргеззеб !итогаззос1а1еб апбдеп гесодшхеб Ьу су!о!ох1с Т-1утркосу!ез. С1т. Сапсег. Кез. 2004 1ип 1; 10(11):3658-66).

Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, полученными из любого класса белков, таких как энзимы, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. С полным списком пептидов, связанных с или извлеченных из молекул МНС класса I или класса II, можно ознакомиться на сайте \\л\лг.зуГреЦ1и.огд. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например, также присутствовать только в опухолевых клетках, к примеру, как продукты мутировавших генов. Хорошими примерами являются лиганды МНС класса I, которые действуют как Т-клеточные эпитопы, из К-КА8, ВСК-АВЬ и мутировавшего р53. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими структурами, такими как антигены СТ («раковый тестикул»), которые экспрессированы в различные виды опухолей и здоровую ткань тестикул. Другие опухолеассоциированные пептиды, связывающиеся с молекулами МНС, связаны с генами, которые экспрессируются с более высоким числом копий в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками того же органа или ткани, а также при сравнении со здоровыми клетками других тканей. Для с-Ме! как пример см. 8скад К., 8скт1б! 8.М., Ми11ег М.К., Уетзскепк Т., Арре1 8., Уеск М.М., СгипеЬасН Р., 8!еуапоу1с 8., Каттепзее Н.С., ВгоззаП Р. Иепбйсабоп оГ С-те! опсодепе аз а Ьгоаб1у ехргеззеб !итог-аззос1а!еб апбдеп гесодшхеб Ьу су!о!охю Т-1утркосу!ез. С1ш. Сапсег. Кез. 2004 1ип 1; 10(11):3658-66. Другие опухолеассоциированные пептиды имеют происхождение от антигенов, которые удерживаются в опухолевых клетках, а не секретируются (например, белки из семейства муциновых генов). Другими источниками могут быть аберрантные транскрипты (сдвиг рамки), пептиды с сайтов стыковки посттрансляционных соединений белок-белок. С полным списком опухолеассоциированных антигенов, описанных в научной литературе, можно ознакомиться на сайте \у\у\у.сапсеп1П1пипйу.огд.

Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными аномалиями, такими как Ьсг/аЬ1 в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Опекал У.М., Уа1!кег М.М., ΖόηΓ В. Тке депебс Ьаз1з оГ сапсег оГ !ке к1бпеу. 1. Иго1. 2003 Эес; 170 (6 Р! 1):2163-72), которые действительно вызывают трансформационные явления, встречаются в практически всех видах опухолей. С более общим обзором генетических причин рака человека можно ознакомиться в Тке Оепебс Ваз1з оГ Нитап Сапсег (Вег! Уоде1з!ет, Кеппе1к У. 1<б1/1ег. 2002). Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), газ, с-те!, тус, рКВ, УНЬ и НЕК-2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной регуляции экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСабеу е! а1. Сапсег Кезеагск, 1998, 15:58 2601-5; Э|з1з е! а1. С1Ьа Роипб. 8утр. 1994, 187:198-211). Эти мутантные белки могут быть мишенью специфического иммунного ответа против опухоли при многих видах рака.

Раково-эмбриональный антиген-незрелый рецепторный белок ламинина (ОРАДЬКР) широко экспрессируется во многих видах опухолей человека, включая злокачественные гематопоэтические опухоли (Кокгег 1.У., Вагзоит А.Ь., Соддш кН. 1г. Тке беуе1ортеп! оГ а пей ишуегза1 !итог ге.)есбоп апбдеп ехргеззеб оп китап апб гобеп! сапсегз Гог уассшабоп, ргеуепбоп оГ сапсег, апб апб-!итог !кегару. Моб Азр ^типоЬюк 2001; 5: 191-195. Вагзоит А.Ь., Кокгег 1.У., Соддш кН. 37 кОа опсоГое!а1 апбдеп 1з ап аи!опптиподешс кото1одие оГ !ке 37 кОа 1атшт гесер!ог ргесигзог. Се11. Мо1. Вю1. Ьеб. 2000; 19: 5535-5542. Саз!гопоуо У. каткип гесер!огз апб 1аш^η^η-Ь^ηб^ηд рго!ешз биппд !итог туазюп апб те!аз!аз1з. Оуазюп Ме!аз. 1993; 13: 1-30. Соддш кН. 1г, Вагзоит А.Ь., Кокгег кУ. Титогз ехргезз Ьо!к ипк|ие Т8ТА апб сгоззрго!есбуе 44 кОа опсоГе!а1 апбдеп. Iттипο1 Тобау. 1998; 19, 405-408. Соддш кН. 1г, Вагзоит А.Ь., Кокгег кУ. 37 кПоЭа11оп опсоГе!а1 апбдеп рго!ет апб 1тта!иге кппбпп гесер!ог рго!ет аге 1бепбса1, ип1уегза1 Т-се11 тбисшд пптиподепз оп рптагу гобеп! апб китап сапсегз. Апбсалсег Кез. 1999; 19, 5535-5542), но не присутствует в нормальных взрослых дифференцированных тканях. ОРА-ГБКР может быть специфически распознан как Т-, так и В-лимфоцитами, превращая его в привлекательную молекулу-мишень при вакцинации против некоторых опухолевых форм. Опухолеспецифические Т-клеточные ответы против кроветворных клеток-мишеней могли быть воспроизведены ίη уйго и ίη у1уо при использовании дендритных клеток (ДК), трансфецированных ОРА-1БК-кодировкой РНК, (81еде1 8., Уадпег А., КаЬеШх Ό. е! а1. Соддш, 1.1г., Вагзоит, А., Кокгег, 1., 8скшйζ, Ν., Ζе^з, М. Шбисбоп оГ су!о!ох1с Т се11 гезропзез адатз! !ке опсоГое!а1 аη!^деη-^шша!и^е Γιηιιηίη гесер!ог Гог !ке беа!теп! оГ кета!о1од1са1 такдпапаез. В1ооб, 2003; 102, 4416-4423).

В патенте И8 6753314 описывается очищенный белковый комплекс, содержащий первый полипеп

- 2 013598 тид и второй полипептид, где обозначенный комплекс содержит аминокислотные последовательности первого полипептида (8ΜΠ, 8ЕО Ш N0: 359) и второго полипептида (БЛ81, 8Е0 Ш N0: 518), обозначенных как РгоРап 267а-267Ь.

В патенте υδ 4861710 раскрывается клон, содержащий рекомбинант клона кДНК для кодировки рецептора клеточной поверхности для ламинина, а также для соответствующих проб.

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического антигена и для того чтобы они были использованы в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в достаточно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в одном виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (например, число копий на клетку). Необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид («иммуногенный пептид»), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίίτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

До сих пор было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессированию II класса. Есть возможность инкубировать антиген-представляющие клетки (АПК) с интересующим антигеном для его поглощения и процессирования _ ΑϋϋΙΝ КЕРМСЕ..С1ТЕ <Ке£тап><Сйе><Аи1йог>СЬаих</Ашйог><Уеаг>1999</Уеаг><К.есЬ[1т1>СНАих1 999</КесНит><ЮТех1>1(1еп11йсаНоп о£ МАСЕ-3 ерйорез ргезеп1е<1 Ьу НЬА-ϋΚ то1еси1ез ίο С04(+) Т 1утрЬосу1е8</ГОТех1><МОЬ

Ке£_Туре=^,’£оигпаГ><К.е£_Туре>£оип1а1</Ке£_Туре><К.е£ДО>СНАиХ1999</Ке£_ ГО><ТШе_Рптагу>Мепй£1са1ю11 о£ МАОЕ-3 ерйорез ргезеп(е4 Ьу НЬА-ϋΚ то1еси1ез ίο СТЭ4(+) Т

1утрЬосу4ез</Т141е_Рг1тагу><Аи1Ьогз_Рптагу>Сйаих,Р.</Аи1Ьогз_Рг1тагуХАи1Ь огз_Рптагу>Уап(отте,У.</Аи(Ьогз_Рг1тагу><Аи1йог8_Рптагу>81гооЬап1, У.</Аи 1Ьог8_Рг1тагу><Аи1йогз_Рптагу>ТЫе1етапз,К.</Аи111огз_Рптагу><Аи1Ьогз_Рг1П1 агу>СогЙ1а18,£.</Аи1Ьог8_Рптагу><АиИ10гз_Рптагу>Еш1еп,К.</Аи1Ьог8_Рптагу> <Аи11юг5Рптагу>Е£;£егто1Н, А.М.</АиЙ1ог8_Рптагу><Аи1Ьогз_Рптагу>Вооп,Т. </Аи1Ьог5_Рптагу><Аи1Ьог8_Рптагу>уап 4сг,Вги§£;сп

Р.</Аи1Ьогз_Рг1тагу><Ва1е_Рптагу>1999/3/1</Оа£е_Рптагу><Кеу1УОГ<15>991606 23 </К еук»оге15><Кеуν,·οΓ<1ϊ>Απι ίηο Лей! 8ециепсе</Кеу«Όίά8><Кеу»оп!з>Ап11§еп Ргезеп1аНоп</Кеу\еог4з><Кеуу.ог<1з>Аг|1ще115</Кеу’Л'Ог<1з><!<еу'Л'ог<1з>Ап11§еП8,Ь,¹ еор1азт<Жеудтог<18ХКеуууог<18>С04-Ро8Й1уе ТЬутрйосу1ез</Кеутуог<18><Кеу\уог<1з>С1о11е Се11з</Кеу1¥огбз><Кеу\уог<15>Сосикиге</Кеу\¥ог45><Кеуууог<18>Пеш1п11С СхПз</Кеууюг05><КеулуоЩз>ЕрПорс5</Кеулуог0з><КеутУогс1з>НЕА-ПК Ап11§еп8</КеухУог<18><К.еу'Л'ог<18>Нитап</К.еу4тог<1Б><КеулУогд8>1тти11о1о£у</К еу1Уогд8хКеутУог4з>Ма1е</Кеуу/ог(18хКеуугогс1з>Ме1апота</Кеу1УОГс18хКеу\¥ ог<£з>Мо1еси1аг Зедиепсе Оа1а</Кеу»'ог4з><Кеу»'Ог0з>Неор1а8П1

Ргс>{е1пз</Кеу\Уогс1з><Кеу»’ог08:>Рер(111е8</Кеут.Уои1з-’<Кеу1Уогс1з>Рго1е1П8</Ке}ЗУ ог(18><Кеухуогс1з>8иррог1,Поп-и.З.Соу&аро5;1</Кеу\Уог<£з><Ксуу'ог(1з>ТЕутркосу4ез</Кеу\¥оп18><Кеу\¥ог<18>Уасстайоп</Кеутуог<1з><К.ерпп1>14о1 ίη

Р)1с<7Ксрг111(><31аг1_Ра^е>7б7</81аг1_Ра§с><Е1к1_Ра§с>778</ЕпЦ_Рагс><Рег1ос1|с аМ.Ехр.Мес!.</Репо<йса1хУо1ип1е>189<7Уо1итех155ие>5<'15Ы1е><Х2_£оигга18 ЙАЬЬгеухГ пате=8уз(ет>£.Ехр.Ме<1.</£^></г2_£оигпа181<1АЬЬгеух2г_\У'огк£опп1П>1</22_ Аогк£огтЮ></МОЕх/Сйе></К.е£тап>_(СЬаих, Р., Уапютте, V., 81гооЬап1, V., ТЬ1е1етапз, К., Сог111а1з, ί., Ьийеп, К., Е§§егтоп1, А. Μ., Вооп, Т. & уап 4ег, В. Р. (1999) Ехр. Ме<1. 189, 767-778)_.

Другие стратегии используют белки слияния, которые содержат лизосомные последовательностимишени. Экспрессированные в АПК, такие белки слияния направляют антигены в отдел процессирования II класса

- 3 013598 _ ΛΗΗΙΝ КЕРМОВ.С1ТЕ <КеГтап><С11е><Аи1ког>Магк5</Аи111ог><У еаг> 1995<ЛГ еаг><К.ес№1т>МАКК.81 995</К.ес№ш1ХП>Тех1>А 1у8озота1 (агдебгщ 81£па1 ίη 1Ье су1ор1аз1шс 1ай о£ 1Ье Ье1а скат <йгес1з НЬА-ϋΜ ίο МНС с1азз II сотрагйпеп1з</П5Тех1ХМНЬ В.еГ_Туре=1оитаГ’><КеСТуре>1оита1</Ке£_.Туре><йе£_ГО>МАКК81995</К.е1-_ П9><Т111е_Рптагу>А 1узозота1 1аг£е0п$ 81§па1 ϊη 1Ье суЮр1азпйс ίιιίΐ о£ 111 е Ье1а сЬат <Ягес15 НЬА-ОМ Ю МНС с1азз II сотраг{тепСз</Т111е_Рптагу><Аи1Ьогз Рг1тагу>Магк5_>М.8.</Аи(ког8_Рптагу>< Аи1Ьогз_Рптагу>К.ос11е,Р.А.</АиЙ1ог8_Рг11пагу><Аий1ог8_Рптагу>уап Оопзе1ааг,Е.</АиИ1огз_Рптагу><Аи1ког8_Рг1тагу>ЭДоо<1гий^,,Ь.</Аи1Ъогз_Рг1тагу хАиЙюгз _Рптагу>Ре1егз,Р.1.</Аи111ог5_Рптагу><Аи1110г8_Рптагу>ВоП11'ас1по,1.

.</Аи1Ьогз_Рптагу><Оа1е_Рптагу>1995/10</Па1е_Рптагу><Кеу'Л'Огс!з>9601770 7</Кеу№ог45ХКеу\Уогбз>Атта1</Кеуугоп1зхКеутуог<18>Вк>1о§1са1 Тгапзрог1</Кеулуог0з><Ке}У¥огс18>Се11 Сотраг1теп1а11оп</Кеу\¥оп15ХКеу¥УОГЙ5>СеИ Ьте</Кеулуог<1зхКеут>п1з>Г1иоге8сеп1 АпбЪоду

Тесйтдие,1псНгесХ</К.еу\¥ОГ(18хКеу\¥ог<18>£епейс8</Кеу\¥ог<18хКеу1Уог(1в>Не1а Се118</Кеу\«ог<18ХКеу\уог(18>Н181осоп1ра11Ы111у АпЕдепв С1а58

11<7Кеу\уогбзхКеуттог<18>Н1_А-0 Ап11§еп8</Кеуи'ог<15><Кеу1У0г<18>Нитап</Кеу\¥Огс18><Кеу№ог<18>Еу8Озоте8</Кеу «’ОгСзХКеуЛ'ОГСЬ'хМетЬгапе Ρίθΐβίη£</Κβ\3νοΓά5><Κ6>3νοι45>№β(αβο1ί8Μ</Κβγν<θΓά5><Κβ>«νοΓ<13>Μϊοβ</Κ6νν<,' огс1з><Кеу\уогЙ8>М1сго8соруД1гш1ипое1ес1гоп'-'/Кеуу/огс15><Кеу’Л'ог<1з>Рер1.1<1е5</К еул¥ог<15хКеу1Уог118>рку81о1о8у</Кеутуог<18><Кеу¥У01<18>Кесоп1Ъ1пап1 Ριϊδίοη

Рго1е1П8</Кеут¥ог(18хКеу\уог<18>Тгап8Гес1юп</Кеулуог(1зхКеу1Уог<18>и11га81г11с(и1 β</Κ.βγινοΓά8ΧΚ.βρπηί>Νοί ίη

Р11е</Нерг1п1х81аг1_Ра§е>351</8(аН_Ра§е><Еп<1_Ра§е>369</Епс1_Раее><Репо<11с аМ.СеП

- 4 013598

Гйок</Репо<Лса1><Уо1ите>131</Уо1итс><1з5г1с>2</1£зис><22_.1оита131<1ЛЪЬгс\' ><£ пате=8у51ет>1.Се11

Βίο1.</ί'></ΖΖ_ίοιΐΓπα18ΐ<.ΙΛ6ΒΓον><ΖΖ_'Λ'θΓΕίοηηΙΟ>1<7ΖΖ_\νοΓΚΓ<.>πτιΤ.Γ.)χ/ΜϋΕ>

</С Ϊ 1е><С Ие>< Аи11юг>Юх1п £ΐι βζ</ΑυίΗθΓ><Υ еаг>2001 </Уеаг><Кес№т>КООК.1 С;иЕ72001</КесМшп><ГОТех[>СП4(+) Т сейз тдиссс! Ьу а ΠΝΑ. уассапе: Ш1типо1о£1са1 сопзефиепсез οί ерйоре-зресШс 1узозота1 1аг§е11п§</ЮТех1хМБЬ К.е£_Туре=Доигпа1><Ке£_Туре>Доита1</Ке£_Туре><КеГ Ιϋ>ΚΟϋΚ.ΙθυΕΖ2001</ Ке£_1П><ТШе Рптагу>СО4(+) Т сеИз ш4исе<1 Ьу а ΌΝΑ уасс1пе: Йптипо1о£1са1 сопзефиепсез о£ ерйоре-зресйас 1узозота1

1аг§е11п§</Т111е_Рг1тагу><Аи1Ьогз_Рг1тагу>К.о<1п£иег,Е.</Аи(Ьогз_Рптагу><Аи1Ь огз_Рптагу>Нагк1пз,5.</Аи(когз_Рг1тагу><Аи111ог8 Рптагу>Е.е<1Мпе,Д.М.</Аи1к ог8_Рптагу><Аи1ког5_Рптату>йе Реге4а,Д.М.</Аи1когз_Рг1тагу><Аи1ког8_Рптагу>'\Уйй1оп,1.Е.</Аи(ког8_Рптагу> <Ра1е_Рптагу>2001/11</Оа(е_Рптагу><Ке}ТУОГ<1з>21465065</Кеу\¥ог<1з><Кеу^ ог4з>Апппо Аск!

8еяиепсе</Ксуи'огдз><Кеулуог<1з>Ап1та1</Кеул¥ог<1з><Кеугуог0з>Ап1|Ьо4|е5,У11а1 </Ксу\¥огс1з><Кеуу.’01'<1з>А|11|£еп5,СВЗб</Ксу\¥ог(1я><Ксу\¥01дз'--Ыоо<1</1<су«^,ог<1з ><Кеутеог<1з>Са1Ьер81п В</Кеуе¥ог4зхКеуу.'огс1з>СО4-РозШус ТЬутрЬосу1ез</К.еу\¥ог<1з><К.еу¥¥огс1з>СеП Ь1пе</Кеул¥ОГ(18><Кеут¥огд.з>Ер11оре8</Кеу\¥ог<1з><Кеу¥¥ог48>1ттипо1о8у</Кеу л¥Ог4з><Кеу^ог4з>Еуп1р11осу11с Скопотешп^Шз

У1ги8</Кеу1¥огд5><Кеу¥¥ог<18>Ьу808отез</Кеу\¥ог<1з><Кеу¥¥оп1з>те1аЬо118т</Ке удуогЙ8><Кеулуогд8>М1се</Кеу\УОГ<18><Кеутуоп1з>М1се,1пЬге<1 С57ВЬ</Кеутуогйэ><Кеу\¥ог<1з>Мо1еси1аг бециепсе

Оа1а</Кеу«'ог<1з><Кеу¹.¥огдз>Рер(1<1с Рга§теп18</Кеуд¥Огдз><Кеут¥ог48>рЬу81о1о§у</Кеу^оп18><Кеут¥ог08>8иррог(,Но пи.З.СгОУ&ароз;1</Кеу1¥огси><Кеу^ог<1з>8иррог1,и.8.СгО¥&аро8;1,Р.Н.8.</Кеух¥ог<1 8ХКеуе¥ог4з>Уасстс.%ОНА</Ксуу/ог0яхКсух¥ог<15>У1га1

Уасстез</Кеу¥/Огс15хКсрНп1>Ко1 ϊη

Р Пе</К.ерпп1><8иг1_Ра§е> 10421 </81агг_Ра§е><Еп0Ра £с> 10430</Еп4_Ра§е><Рег

1о<йса1>Д.Уйо1.</Репо(йса1><Уо1ип1е>75</Уо1ите><188ие>21</1з8ие><22_1оита1

8и1ЛЬЪгс¥><£ пате=8у81ет>1.У1го1.</£»</27_1оигпа18(<1АЬЬге¥><2г λνοΓ1ί£οπηΙΟ>1</ΖΖ_^,\¥ο гк£огтЮ></МЦЬ></С11е></Ке£тап>_(Маг1с8, М. 8., Коске. Р. А., уап Оопве1ааг, Е., 3¥оо4ги££, Ь., Ре1егз, Р. 1. & ВотГасию, Д. 8. (1995) Э. Се11 ΒίοΙ. 131, 351-369, КобНеиег, Р., Нагктз, 8., КекМпе, Д. М., <1е Реге4а, Д. Μ. & ΧνΐιϊΙίοη, Д. Ь. (2001)

Э. Пго1. 75, 10421-10430)_.

Также были разработаны специальные липосомные композиции для доставки пептидов и других активных фармацевтических ингредиентов в профессиональные АПК (\Уа11ег 8., Неттдеи Ь., 8с1юог О., Дцид 6., \Уегпе1 Ό., Вийпид Н.Д., Каттеикее Н.6., 81еуаиоу1е 8. Сийшд ейде: ргейе1егтшей ανίάίΐν οί Питан СЭ8 Т се118 ехрапбеб оп сайЬпНей МНС/аий-СП28-еоа1еб тктокрйетек. Д. 1ттипо1. 2003 Νον 15; 171(10):4974-8). Другой способ выбора представляет собой внешнюю загрузку профессиональных АПК на молекулы МНС ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό. В этом случае АПК инкубируются с избытком пептидов в среде клеточной культуры, что приводит к конкуренции по связыванию с молекулами МНС на поверхности АПК.

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа Т11, поддерживают эффекторные функции С'П8' киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами,

- 5 013598 могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому, выявление и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, которые могут быть распознаны СЭ4' ЦТЛ. По этой причине целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I и инициировать Т-клеточные ответы против клеток с пептидами в соединении с молекулами МНС на их клеточных поверхностях.

В соответствии с настоящим изобретением данная задача была решена обеспечением опухолеассоциированного пептида, выбранного из группы пептидов, содержащих по крайней мере одну последовательность в соответствии с любой из 8ЕО Ш N0: 1 и 8Е0 Ш N0: 2 из приложенного списка последовательностей, где пептид обладает способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I, содержащей, но не ограничивающейся аллелем НЬА, экспрессируемым наиболее часто в кавказских популяциях, НЬА-А2 (включая подвиды НЬА-А2, такие как НЬАА*0201).

Настоящее изобретение относится, кроме того, к двум новым пептидным последовательностям, полученным из молекул НЬА класса I раково-эмбрионального антиген-незрелого рецепторного белка ламинина, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для провоцирования противоопухолевых иммунных ответов. Новые пептидные последовательности были выявлены новым общеприменимым способом для идентификации неизвестных естественно процессированных лигандов НЬА класса I охарактеризованных - например, опухолеассоциированных - антигенов. Таким образом, изобретатели выявили два различных НЬА-А*0201-специфических Т-клеточных эпитопа, полученных из белка 0ЕА/1ЬК, способных вызывать специфическую реактивность Т-клетки против опухолевых клеток человека, включающих, но не ограничивающихся различными гематологическими злокачественными опухолями.

Первый аспект изобретения обеспечивает пептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с любой из 8Е0 Ш N0: 1 или 8Е0 Ш N0: 2 либо их вариант, при условии, что пептид не является интактным полипептидом человека, из которого получена аминокислотная последовательность (а именно раково-эмбриональный антиген-незрелый рецепторный белок ламинина (0ЕА/1ЬКР); входной номер указан в приложенной табл. 1, внизу).

Как здесь описывается в дальнейшем, оба пептида, формирующие основу настоящего изобретения, были выявлены как присутствующие в клетках МНС класса I. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т. е. дериваты пептидов) будут, по всей вероятности, оба вызывать специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться в зависимости от пептида. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в обозначенных пептидах (см. ниже). Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться с целью определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительно, чтобы пептид в соответствии с настоящим изобретением состоял в основном из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из 8Е0 Ш N0: 1 или 8Е0 Ш N0: 2 либо одним из их вариантов.

«Состоящий в основном из» подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8Е0 Ш N0: 1 или 8Е0 Ш N0: 2 либо одним из их вариантов, содержит дополнительно находящиеся на N и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как центральная последовательность пептида, включая соединяющий элемент, и как иммуногенный Т-хелперный эпитоп. Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в клетки в соответствии с настоящим изобретением.

«Вариантом» данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как НЬА-А, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, как определено в аспектах изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, как описано впоследствии, некоторые позиции связывающихся с НЬА-А пептидов являются типичными доменными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к

- 6 013598 соединительному элементу НЬЛ-связывающей бороздки.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с рецептором Т-клетки, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их часть либо их вариант, как дано.

Известно, что пептиды, представленные МНС класса II, образованы «центральной последовательностью», имеющей определенный НЬЛ-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, удлиняющие сегменты на Ν- и/или С-конце, которые не препятствуют функции центральной последовательности (т.е. считаются иррелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Удлиняющие сегменты Ν- и/или С-концов могут иметь длину между 1 и 10 аминокислотами, соответственно. Таким образом, представленный ίη νίνο предпочтительный пептид МНС класса II настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для загрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт получения более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков.

В другом аспекте настоящего изобретения, аналогично с ситуацией, поясненной выше для молекул МНС класса II, пептиды настоящего изобретения (хотя они преимущественно связаны с МНС класса I) могут быть применены для вызывания специфического ответа МНС класса II, так как ГЬВТ и 02 могут представлять одновременно центральные или неполные последовательности молекул НЬЛ класса II (совместимые с конкретными аллелями НЬЛ класса II, как показано в последующих таблицах). Как указано выше, удлиняющие сегменты на Ν- и/или С-концах могут иметь от 1 до 10 аминокислот в длину, соответственно. Таким образом, предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для внесения на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт получения более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды этого воплощения изобретения могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков.

Таблица А Ю1-« Центральные последовательности», имеющие определенный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент для молекул НЬА класса II. Совместимые аминокислоты обозначены курсивом. Прогнозирование было произведено компьютерными программами РАРгоС (1Шр://\у\у\у.иш-1иеЬтдеп.йе/иш/кх|/) и ^УРРЕПНУ (ййр://^тете.8у£рейЫ.бе).

НЬА4ЖВ1*0101 15 - меры

-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 +1 +2 +3 рез-т

Ί Р 1 Ь А Л К А I V А I

ΚΑίνΑΙΕΝΡΑΟνδνΐ

ΕΚΕΙίΑΑΚΑίνΑΙΕΝ

К К Τ\ν Ε К Ь Ζ Ζ А А К А IV

НЬА-ОКВ1*0301 (ΌΚ.17) 15 - меры

-3 -2-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9+1 +2+3 рез-т ν,ΈΚΕίί /1 .-1 А¹ ,ί / 1/1 / Е

ΛίΛ/Μ/ΕΝΡΑβνϊν

I N Ь К К Т IV Е К Ь Ζ Ζ А А К

ΗΕΑ.-ΏΚΒ 1 *0401 (ОК4Е>»4) 15 - меры

-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 +1 +2 +3 рез-т νΐΕΚΕΙΙΑΑΚΑΙΓΑΙΕ

ΕΚΕΣΙΑΑϋΑίνΑΙΕΝ

4Κ41+^1ΕΝΡΑ0ν5ν

ΜίΜ/ΕΝΡΑϋνδνΐ

НЬА-ОИВ 1*0701 15 - меры

-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9+1 +2 +3_рез-т_ У/ЕКЕ11ААКА1У

А I Е 22 А К А I V А I Е N Р	А	β V 8 У_20_ Е К	Ь Ζ	Ь А	А К А
I V А I Ε Ν_18_
НЬА-1)КВ1*1501 (ПК2Ь) 15 -меры__		-3-2-1 1 2 3 4 5 6	7 8
9 +1 +2 +3_рез-т_ Е К Ζ Ζ Ь А А	К	А I V А I Ε Ν_24_	. I N	ь К	В т
\\г Е К Ε Ζ Ζ .1 .1 А 20 К Ε Ζ	Ь	А А К А I V А I Е	N Р	20	ΚΑΙ

ΓΛ7ΕΝΡΑθν8νΐ18

- 8 013598

Таблица В 1ЬК2-«Центральные последовательности», имеющие определенный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент для молекул НЬА класса II. Совместимые аминокислоты обозначены курсивом. Прогнозирование было произведено компьютерными программами РАРгоС (1Шр://\у\у\у.шй-и.1сЬтдсп.бс/иш/кх|/) и 8ΥρΡεΙΤΗΥ (11ир://\у\у\у.5уГрсй1и.бс).

НЬА-ОВВ1*ОЮ1 15-меры__-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 .7 .8 .9+1+2+3_рез-т_

ΕΑδΥνΝίΡΤΙΛίΟ# Г_33_ ίΡΤΙΛΙϋλΙΤΙΗΡί

К Υ23__

НЬА-ϋΚΒ 1*0301 (ϋΚ.17) 15-меры__-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9+1 +2+3 рез-т

НЬА-ОВВ1*0401 (ΟΒ4ϋ·.ν4) 15 - меры

-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9+1 +2+3 рез-т

ΕΑδΥνΝίΡΤΙΛΙΟΤ’

ΥνΝΙΡΤΙΛΖ<7ΛΐΤ1)5 Р_20_ ΝΪ.ΡτΐΑΙΟΝΤΰ8Ρ к К_18_

НЬА-ОКВ1*0701 15 -меры__-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 +1 +2 +3 рез-т

ΕΑδΥνΝΙ,ΡΤΙΛΙ,Ον Т'26__ ΊΙΑΡ€ΝΤΰ8ΡΡΚΎ

V О_24_

НЬА-ОКВ1*1501 (ОВ.2Ь) 15 -меры__-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 +1 +2 +3_рез-т_ 1ЧИРЫ1УУО1А1РС Ν_20_ Ь Р Т I А Ь ΟΝΤΟδΡίΚ Υ_18_ Т141,СЛГР5Р1КУУ ϋ_18_

Если пептид, который имеет больше чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА-связывающему региону, являлись теми, что, по существу, не влияют на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС или представлять пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антиген-представляющими клетками.

В понятие «пептид» изобретатели включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки присоединены пептидными связями (-СО-ΝΗ-), а также и молекулы, в которых пептидная связь является обратной. Такие ретрообратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано у Мсхюгс с1 а1. (1997) 1. 1ттипо1. 159, 3230-3237, что включено сюда посредством ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, а не ориентацию боковых цепей. Мсхюгс с1 а1. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны, по крайней мере, для МНС класса II и Т-хелперных клеточных ответов. Ретрообратные пептиды, которые содержат связи ΝΗ-СО вместо пептидных связей СО-ΝΗ, более устойчивы к протеолизу.

Типично, что пептид по изобретению является таким, который, если он экспрессирован в антигенпредставляющую клетку, может процессироваться, так что получается фрагмент, который способен связываться с адекватной молекулой МНС и может быть представлен подходящей клетке и вызывать адекватный Т-клеточный ответ. Следует понимать, что полученный из пептида фрагмент может также быть пептидом по изобретению. Целесообразно, что пептид по изобретению содержит участок, который включает данную аминокислотную последовательность или ее сегмент либо ее вариант и дальнейший участок, который обладает некоторыми желаемыми свойствами. Например, дальнейший участок может включать дальнейший Т-клеточный эпитоп (независимо от того, получен ли он из одного и того же полипептида в качестве первого участка, содержащего Т-клеточный эпитоп, или нет) или он может включать белок-носитель или пептид. Таким образом, в одном воплощении пептид по изобретению является «усеченным» белком человека или слитым белком белкового фрагмента и другого участка полипептида,

- 9 013598 при условии, что человеческий участок включает одну или более аминокислотную последовательность изобретения.

В особенно предпочтительном воплощении пептид по изобретению включает аминокислотную последовательность по изобретению и по крайней мере один дальнейший Т-клеточный эпитоп, где дальнейший Т-клеточный эпитоп способен содействовать продуцированию Т-клеточного ответа, направленного на тип опухоли, который экспрессирует опухолеассоциированный антиген. Таким образом, пептиды по изобретению включают так называемые полипептиды «бусины на нити», которые могут также использоваться в качестве вакцин.

Из последующего следует понимать, что в некоторых случаях применения пептиды по изобретению могут быть использованы непосредственно (т.е. их не получают при экспрессии полинуклеотида в клетке пациента или в данной пациенту клетке); в случае такого применения предпочтительно, чтобы пептид имел менее чем 100 или 50 остатков. Предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.

Предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были способны связываться с НЬЛ-Л2. Особенно предпочтительно, если пептиды селективно связываются с НЬЛ-Л*0201.

В понятие «аберрантно экспрессированный» изобретатели включают значение, что полипептид сверхэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, или что ген является «молчащим» в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Понятием «сверхэкспрессирован» изобретатели обозначают, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.

Пептиды (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Гтос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи с1 а1. (1981) 1. Огд. С11сш. 46, 3433 и в прилагающихся ссылках. Временная защита Νаминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ршое). Повторное расщепление этой высокощелочелабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пипиридина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глутамин или аспарагин являются С-конечными остатками, для защиты боковой цепи амидо-функциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель базируется на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептидноситель является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением обратного метода соединения, опосредованного ^№дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии проверки изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от полимерного носителя с сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи, при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% элюента. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, точный выбор зависит от составляющих аминокислот пептида при синтезе. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег Т., Магбег О., А1Ьепсю Г. Ггот ргобисбоп о! рерйбез ίη тПйдгат атоипй Гог гезсагей 1о тиШ-Гопз сци-тоиез Гог бгидз оГ 1Не ГиШге. Сшт. Рйагт. Вю1есйПо1. 2004 ГеЬ; 5(1):29-43 и приведенные ссылки).

Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым сложным эфиром для получения сырого пептида. Альтернативно может быть использован солевой обмен (ТГА^уксусная кислота) перед лиофилизацией. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая позволяет получить сырой пептид без поглотителей при лиофилизации водной фазы. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, можно заказать в Са1Ьюсйет-ШуаЫосйет (Великобритания) ЬЙ, №Шпд11ат N07 2ΟΣ. Великобритания.

Очистка может быть произведена любой техникой или их комбинацией, таких как эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза, секвенирование Эдмана и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке

- 10 013598 атомами (РАБ), а также масс-спектрометрический анализ ΜΑΣΌΙ и Е81-0-ТОР.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, это только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, которые могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.

Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае присоединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Сегмент ДНК, получаемый в результате расщепления эндонуклеазами рестрикции, как описывалось ранее, подвергается воздействию бактериофага Т4 ДНК полимеразы или Е.сой ДНК полимеразы I, ферментов, удаляющих выдающиеся 3'одноцепочечные концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями, и наполняет имеющие углубления 3'-концы их полимеразными активностями.

Комбинация этих активностей вследствие этого формирует фрагменты ДНК с тупыми концами. Фрагменты с тупыми концами инкубируются затем с большим молярным избытком молекул-линкеров в присутствии фермента, способного катализировать лигирование по тупым концам молекул ДНК, такого как бактериофаг Т4 ДНК лигаза. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие последовательности полимерных сшивающих агентов на их концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляются подходящим ферментом рестрикции и связываются с вектором экспрессии, который был расщеплен ферментом, вырабатывающим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая 1п1етпа1юпа1 Вю1сс11по1оДс5 1пс, Νο\ν Науеп, СЫ, США.

Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто у 8а1к1 е1 а1. (1988) 8с1епсе 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Согласно этому методу, для ферментативного амплифицирования ДНК примыкает к двум специфическим праймерам, которые, в свою очередь, внедряются в амплифицированную ДНК. Приведенные специфические праймеры могут содержать сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые могут быть использованы для клонирования в векторы экспрессии с применением известных из уровня техники методов.

Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) экспрессируется в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего соединение по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в патентах США 4440859, выданном 3 апреля 1984 г. на имя Еи!!ег е! а1., 4530901, выданном 23 июля 1985 г. на имя ХУеЬхтап. 4582800, выданном 15 апреля 1986 г. на имя Сго\\1. 4677063, выданном 30 июня 1987 г. на имя Магк е! а1., 4678751, выданном 7 июля 1987 г. на имя Соеббек 4704362, выданном 3 ноября 1987 г. на имя Йакита е! а1., 4710463, выданном 1 декабря 1987 г. на имя Миггау, 4757006, выданном 12 июля 1988 г. на имя Тоо1е, 1т. е! а1., 4766075, выданном 23 августа 1988 г. на имя Соеббе1 е! а1., и 4810648, выданном 7 марта 1989 г. на имя 8!а1кет, которые все включены сюда путем ссылки.

ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, требуется ли эписомальное поддержание или интеграция.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину посредством стандартных способов. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клеткихозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, которая кодирует выбранный признак в трансформирован

- 11 013598 ной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.

Альтернативно ген для такого выбираемого признака может находиться на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина.

Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, учитывая раскрытые здесь идеи, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть изолирован.

Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.сой и ВасШик δυόΐίΐίδ). дрожжи (например, Зассйатотусск ссгсуМас), мицелиальные грибы (например, АкрсгдШик), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система могла быть линией клеток А\тс115.

Промотор является контрольным элементом экспрессии, образованным последовательностью ДНК, которая позволяет связывание РНК-полимеразы и приводит к транскрипции. Совместимые с отдельными бактериями-хозяевами последовательности-промоторы типично вводятся в плазмидные векторы, содержащие подходящие сайты рестрикции для вставки фрагмента ДНК настоящего изобретения. Типичными прокариотическими векторными плазмидами являются рИС18, рИС19, рВК322 и рВК329, имеющиеся в наличии в Вютаб ЕаЬота!опс8, Ктсйтопб, СА, США, а также рТгс99А и рКК223-3, имеющиеся в наличии в Рйаттааа, Р18са!а^ау, N1, США.

Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих р8УЪ имеется в наличии в Рйаттааа, Р18са!а^ау, N1, США. Этот вектор использует поздний промотор 8У40 для возбуждения экспрессии клонированных генов, наивысший уровень экспрессии был обнаружен в Т-антиген-вырабатывающих клетках, таких как клетки СО8-1. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ8С, имеющийся также в наличии в Рйаттааа. Этот вектор использует глюкокортикоид-индуцируемый промотор длинного концевого повтора опухолевого вируса молочной железы мыши для возбуждения экспрессии клонированного гена. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рК.8403-406 и рК.8413-416 и, как правило, имеются в наличии в 81га1адсис С1ошпд 8ук!ст8, Ьа бо11а, СА 92037, США. Плазмиды рК.8403, рК.8404, рК.8405 и рК.8406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (У1рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры ΗΙ83, ТКР1, ЬЕи2 и иКА.3. Плазмиды рК8413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть предпочтительно прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и типично являются штаммом Е.со11, таким как, например, Е.сой штамма ΌΗ5, имеющимся в наличии в ВсШскба Ксксатсй БаЬогаЮпск 1пс., ВсЛскба, МИ, США, и КК1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур Атспсап Турс Си1!игс Со11сс1юп (АТСС) о£ КоскуШс, ΜΌ, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и почечные клеточные линии. Дрожжевые клетки-хозяева включают УРН499, УРН500 и УРН501, которые, как правило, имеются в наличии в 81га1адспс С1ошпд 8ук!ст8, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССБ61, ΝΙΗ эмбриональные клетки швейцарской мыши ΝΙΗ/3Τ3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЕ 1658, почечные клетки обезьяны СО8-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКВ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки 8£9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии.

Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Сойсп с! а1. (1972) Ргос. №111. Асаб. δα. И8А 69, 2110 и 8атЬтоок с! а1. (1989) Мо1сси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ртшд ИагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8ртшд Иагбог, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у 8йсгтап с! а1. (1986) Мсбюбк 1п Усак! Сспсбск, А ЬаЬота!огу Мапиа1, Со1б 8ртшд Иагбог, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Всддк) (1978) №Ш.1гс 275, 104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и ЭЕЛЕ-декстран или липосомальные композиции, имеются в наличии в 81га1адспс С1ошпд 8ук1стк или Ы£с Тсс11по1оДск 1пс., СаййсткЬигд, МИ 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат модель ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными методами. Например, клетки, образующиеся в результате введения модели экспрессии настоящего изобретения, могут выращиваться для получения полипептида по изобретению. Клетки могут собираться и лизироваться, а содержимое их ДНК

- 12 013598 контролироваться на наличие ДНК с помощью такого способа, как описывается у 8ои111егп (1975) 1. Мо1. ΒίοΙ. 98, 503 или у Бегеи! е1 а1. (1985) Вю1се11. 3, 208. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител, как описывается ниже.

В дополнение к непосредственному анализу на наличие рекомбинантной ДНК успешная трансформация может быть подтверждена хорошо известными иммунологическими способами, когда рекомбинантная ДНК способна управлять экспрессией белка. Например, успешно трансформированные клетки с вектором экспрессии вырабатывают белки, проявляющие адекватную антигенность. Образцы предположительно трансформированных клеток собирают и анализируют на белок, используя подходящие антитела. Таким образом, в дополнение к самим трансформированным клеткам-хозяевам настоящее изобретение сосредоточено также на культуре таких клеток, предпочтительно моноклональной (клонально гомогенной) культуре или культуре, полученной из моноклональной культуры в питательной среде.

Следует понимать, что определенные клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодными в определенных методах лечения. Например, антигенпредставляющие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы, для экспрессирования пептидов по изобретению так, что их можно было нагружать на адекватные молекулы МНС

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (5.с.) инъекции, внутрикожной (ί.ά.) инъекции, внутрибрюшной (ί.ρ.) инъекции, внутримышечной (1.ш.) инъекции. Предпочтительными видами инъекции являются 5.с., ί.ά., ί.ρ., 1.ш. и ί.ν. Вводиться могут дозы от 1 до 500 мг пептида или ДНК.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с изобретением или эффективного объема полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего обозначенный пептид, где объем обозначенного пептида или объем обозначенного полинуклеотида или вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у обозначенного пациента. Клетка-мишень типично является опухолевой или раковой клеткой, в особенности клеткой лейкемии или клеткой лимфомы.

Пептид или кодирующая пептид нуклеиновая кислота формирует вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ех νίνο в клетки, полученные от пациента, или в клеточную линию человека, которые затем могут вводиться пациенту, или использоваться ίη νίίτο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ίη νίίτο, то она может быть полезна для трансфекции клеток, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть в основном чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом, таким как ЭеЮх. или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например с липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Бондепескег е! а1. (1993) Αηη. ΝΥ Асаб. 8с1. 690, 276-291). Пептид может быть также меченым или являться слитым белком или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют СЭ8' ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой СЭ4' Тклетками. Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СЭ4' Т-клетки. Стимулирующие эпитопы СЭ4' хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине. Полинуклеотид может быть в основном чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки.

Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством «гена-пистолета». Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть слитым белком, например, с эпитопом, который стимулирует СЭ8' Т-клетки.

Пептид для использования в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом, или подходящим 7-, или 8-, или 10-, или 11-, или 12-мерным пептидом. Более длинные пептиды могут быть также подходящими, но 9- или 10мерные пептиды, как описано в табл. 1, являются предпочтительными.

Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и апирогенной. Изолированная ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Пептиды могут вводиться внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшно, внутривенно или подкожно (см. также выше рассмотрение способа получения пептида). Предпочтительно, чтобы пептиды в качестве активных фармацевтических компонентов вводились в комбинации с адъювантом, таким как, например, ИЛ-2, ИЛ

- 13 013598

12, 0М-С8Р, неполным адъювантом Фрейнда, полным адъювантом Фрейнда или липосомальными композициями. Наиболее предпочтительные адъюванты рассматриваются, например, у Втшктап 1.А.. РаиксБ 8.С., ЭДеЬет 18., Как! ЭД.М. Рерббе-Ьакеб уасстек £ог сапсег 1ттипо!Бегару. Ехрег! 0ρίη ΒίοΙ ТНсг. 2004 РеЬ; 4(2):181-98.

Вакцинация приводит к ответам ЦТЛ, стимулированных профессиональными антигенпредставляющими клетками; после примирования ЦТЛ может появиться преимущество по стимуляции экспрессии МНС в опухолевых клетках.

Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антиген-представляющие клетки, либо на месте инъекции, с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента и введении пептида ех νίνο или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у Ζΐιοιι е! а1. (1995) В1ооб 86, 3295-3301; Ροϊΐι е! а1. (1996) 8сапб. 1. [ттипо1оду 43, 646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает, поэтому, эффективную вакцину против рака или раковых и опухолевых клеток, включающую эффективный объем пептида в соответствии с изобретением, или включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид. Также предпочтительно, чтобы вакцина была вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Наиболее предпочтительной является вакцина, включающая (синтетический) пептид или пептиды (т.е. либо отдельный, либо в комбинации с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или даже большим числом пептидов, см. также ниже).

Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть изолированный (т.е. по существу без других компонентов для введения) или она может быть доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида дендритными клетками может быть механизмом примирования иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки не могут быть трансфецированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированные пептиды из трансфецированных клеток в ткани.

Предпочтительно, если вакцина, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу. Вакцина из нуклеиновой кислоты может вводиться без адъюванта. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'к 0821 (ЛсщНа Вю!есБ, ЭДотсек!ег, МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок, и собственно адъювантов, таких как КтЫ'к Ие!ох. Также может быть использован Οιιίί А, другой полученный из сапонина адъювант, (8ирет£ок, Дания). Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом.

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу е! а1. (1996) 8еттатк ш 0псо1оду 23, 135-147; Сопбоп е! а1. (1996) №11иге Мебюте 2, 1122-1127; Оопд е! а1. (1997) №1иге Мебюте 3, 558-561; Ζΐιηί е! а1. (1996) 1. Iттиπο1. 156, 700-710; ОгаЪат е! а1. (1996) Ш! 1. Сапсег 65, 664-670; и ВигсЬе11 е! а1. (1996) с. 309-313 В: Вгеак! Сапсег, Абνаπсек ш Ью1оду апб Шегареибск, Сако е! а1. (ебк), 1обп ЫЬЬеу Еиго!ех!, которые все включены в описание путем ссылки.

Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) 1п νί!το, способ, включающий контактирование ЦТЛ ш νί!το с нагруженными антигеном молекулами МНС класса I человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпредставляющей клетки на период времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом обозначенных ЦТЛ, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением.

Соответственно, ЦТЛ являются хелперными клетками СИ8⁺. Молекулы МНС класса I могут быть экспрессированы на поверхность любой подходящей клетки и предпочтительно, если клетка является такой, которая в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса I (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы), или, если она экспрессирует, то она является дефектной для каскадов реакций процессинга антигена или представления антигена. В этом случае для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса I, возможно, по существу, в целом примирование с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ.

Антиген-представляющая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС класса I на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать вы

- 14 013598 бранный антиген на обозначенную молекулу МНС класса I. Как более детально описано ниже, молекула МНС класса I может быть легко нагружена выбранным антигеном ίη νίίτο.

Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР.

Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, ВМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, связанный с процессингом антигена.

Пептид человека, переносящий дефектную клеточную линию Т2, имеется в наличии в Лшепсап Туре Си1!ите Со11есбоп, 12301 Рагк1ауп Элуе. ЕоскуШе. Магу1апб 20852, США по каталогу № СВЬ 1992; включенный сюда путем ссылки.

Обычно обозначенная клетка-хозяин до трансфекции в основном не экспрессирует молекулы МНС класса I. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Тклеточной костимуляции, такую как любая из В7.1, В7.2, ТСАМ-1 и ЬРА 3.

Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС I класса и костимулированных молекул общедоступны в банках данных ОепБапк и ЕМВЬ.

В дальнейшем воплощении могут быть также использованы комбинации молекул НЬА, такие как, например, молекулы МНС класса II, как описано здесь в табл. А и В. Применение вакцин из рекомбинантного полиэпитопа для доставки множественных эпитопов ί.Ό8' ЦТЛ описывается у Ткоткоп е! а1. (1996) I. Тштипок 157, 822-826 и \УО 96/03144, которые оба включены сюда путем ссылки. По отношению к настоящему изобретению может быть желательным включение в одну вакцину пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), где пептид включает в любом порядке аминокислотную последовательность настоящего изобретения и другой ί.Ό8' Т-клеточный стимулирующий эпитоп. Такая вакцина была бы особенно полезна для лечения раковых заболеваний. Такие вакцины «бусины на нити» являются типичными ДНК-вакцинами. Синхронное усиление МНС класса П-зависимого иммунного ответа вместе с МНС класса ^зависимым иммунным ответом имеет преимущество, которое ведет к локальной ТЦ-подобной Т-клеточной реакции СО4-положительных Т-клеток, чем поддерживаются МНС класса ^зависимые СЭ8-положительные Т-клетки.

Для генерации ЦТЛ ίη νίίΐΌ могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах, описанных у Реор1ек е! а1. (1995) Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 92, 432-436 и 1<а\уакапи е! а1. (1992) I. Iттипо1. 148, 638643, при генерации ЦТЛ используются аутологичные противоопухолевые лимфоциты.

Р1еЬап§к1 е! а1. (1995) Еиг. ί. Iттиηο1. 25, 1783-1787 для приготовления ЦТЛ пользуются аутологичными лимфоцитами периферической крови (ЛПК). 1осктп5 е! а1. (1997) ί. Оеп. У1го1. 78, 1689-1695 описывает получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Н111 е! а1. (1995) ί. Ехр. Меб. 181, 2221-2228 апб 1еготе е! а1. (1993) I. Iттиηο1. 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ пользуется В-клетками. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. 8. \Уа11ег е! а1. (^а1!ет 8., Неггдеп Ь., 8с1юог О., Лтд О., \Уегпе1 Ό., Вийппд Н.Л Ваттепкее Н.О., 8!еуапоу1с 8. СиШпд ебде: ргебе!егттеб ау1бйу о£ китап СЭ8 Т се1к ехрапбеб оп саЛЬта!еб МНС/апб-СО28-соа!еб тютокрйетек. Т Iттиηο1. 2003 Μν 15; 171 (10):4974-8) описывают примирование Т-клеток 1п νίΙΐΌ с использованием искусственных антиген-представляющих клеток, которое является также подходящим путем генерации Т-клеток против выбранного пептида.

При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и этот метод детально описывается в патенте \¥О 97/26328, включенном сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для представления антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка, бакуловирус-инфецированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, Рог!а е! а1. (1994) У1го1оду 202, 449-955), который описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов.

Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов изобретения, применимы в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, которые селективно распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Предпочтительно, чтобы ЦТЛ распознавали обозначенную клетку при взаимодействии с комплексом НЬА/пептид (например, соединение). ЦТЛ применимы в методе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных ЦТЛ. ЦТЛ, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными ЦТЛ). Альтернативно ЦТЛ получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. «Здоровым индивидом» изобретатели обозначают, что индивид, в общем, имеет хорошее здоровье, предпочтительно, он имеет компетентную иммунную систему и, более предпочтительно, не страдает ни од

- 15 013598 ним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить.

Активированные ЦТЛ экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР), который участвует в распознании клеток, которые экспрессируют полипептид. Полезно, если кДНК, кодирующая ТКР, клонирована с активированными ЦТЛ и перенесена на дальнейшие ЦТЛ для экспрессии.

Клетками-мишенями для 0Ό8' ЦТЛ ш утуо в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли, лейкемии или лимфомы (которые экспрессируют МНС класса I) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса I).

ТКР клонов ЦТЛ по изобретению, специфические для пептидов по изобретению, клонируются. Использование ТКР в клонах ЦТЛ определяется использованием специфических моноклональных антител (ί) ТКР-вариабельной области и (ίί) ПЦР с обратной транскрипцией с праймерами, специфическими для семейств генов Уа и Ур. Библиотека кДНК изготовлена из поли-(А)-мРНК, экстрагированной из клонов ЦТЛ. Использовались праймеры, специфические для С-концового участка ТКР а и Р-цепи, а для Νконцевого участка - идентифицированные сегменты Уа и Р. Вся кДНК для цепи а и Ь ТКР амплифицировалась высокоточной ДНК-полимеразой, и амплифицированные продукты клонировались в подходящий вектор для клонирования. Клонированные гены а и Р-цепи могут быть организованы в одну цепь ТКР с помощью метода, описанного у Сйипд е! а1. (1994) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 91, 12654-12658. В этой отдельной модели цепи за сегментом Уаб следует сегмент У Ό6, затем сегмент Ср, затем трансмембранный и цитоплазматический сегмент цепи 0Ό3. Эта отдельная цепь ТКР вводится затем в ретровирусный вектор экспрессии; панель векторов может быть использована на основе их способности инфицировать взрослые человеческие 0Ό8' Т-лимфоциты и посредничать при экспрессии генов: ретровирусная система векторов Ка! является одной предпочтительной возможностью (см. Ршет е! а1. (1994) В1ооб 83, 43). Насыщенный амфотропный ретровирус используется, чтобы инфицировать очищенные Т-лимфоциты 0Ό8' или СЭ4', изолированные из периферической крови пациентов с опухолями (следуя протоколу, опубликованному у ЕоЬетй е! а1. (1994) В1ооб 84, 2878-2889, включенному сюда путем ссылки). Антитела анти-СО3 используются, чтобы инициировать пролиферацию очищенных 0Ό8' Т-клеток, которая способствует ретровирусной интеграции и стабильной экспрессии отдельной цепи ТКР. Эффективность ретровирусной трансдукции определяется окрашиванием инфицированных 0Ό8' Т-клеток антителами, специфическими для отдельной цепи ТКР. Анализ ш νίΙΐΌ трансдуцированных 0Ό8' Т-клеток устанавливает, что они проявляют такое же опухолеспецифическое уничтожение, как в случае с рестриктированным по аллотипу клоном ЦТЛ, из которого были первоначально клонированы цепи ТКР. Популяции трансдуцированных 0Ό8' Т-клеток с ожидаемой специфичностью могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии для пациентов с опухолевыми заболеваниями. Для лечения пациентов можно использовать от 10⁸ до 10¹¹ аутологичных, трансдуцированных ЦТЛ.

Другие подходящие системы для введения генов в ЦТЛ описываются в работе Могбх е! а1. (1994) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сг И8А 91, 4318-4322, включенной сюда путем ссылки. Екййат е! а1. (1993) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 90, 720-724 и Н\\п е! а1. (1993) б. Ехр. Меб. 178, 361-366 описывают также трансфекцию ЦТЛ. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает ТКР, который распознает клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, ТКР, полученный из активированных ЦТЛ.

В дополнение к ТКР, в изобретение включены молекулы, функционально эквивалентные ТКР. Они включают любую молекулу, которая функционально эквивалентна ТКР, которая может выполнять такую же функцию, как и ТКР. В частности, такие молекулы включают полученные генетической инженерией трехдоменные одноцепные ТКР, как те, что получены методом, описанным у С'бшпд е! а1. (1994) Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А 91, 12654-12658, включенным сюда путем ссылки и указанном выше. Изобретение включает также полинуклеотид, кодирующий ТКР или функционально эквивалентную молекулу, и вектор экспрессии, кодирующий ТКР или его функционально эквивалентную молекулу. Векторы экспрессии, которые подходят для экспрессирования ТКР по изобретению, включают те, что описаны выше в связи с пептидами по изобретению.

Тем не менее, предпочтительно, чтобы векторы экспрессии являлись такими, которые способны экспрессировать ТКР в следующей за ЦТЛ трансфекции.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, метод, включающий стадии (1) получение ЦТЛ от пациента; (2) введение в обозначенные клетки полинуклеотида, кодирующего ТКР, или функционально эквивалентной молекулы, как определено выше; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая определена в первом или втором или третьем аспектах изобретения, метод, включающий стадии (1) извлечение антиген-представляющих клеток, таких как дендритные клетки, у обозначенного пациента;

(2) контактирование обозначенных антиген-представляющих клеток с пептидом, как определено в первом или втором или третьем аспектах изобретения, или с полинуклеотидом, кодирующим таковой пептид, ех утуо; и (3) введение обработанных таким образом антиген-представляющих клеток пациенту.

- 16 013598

Предпочтительно, чтобы антиген-представляющие клетки являлись дендритными клетками. Соответственно, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у МигрНу е! а1. (1996) ТНе Рго8!а!е 29, 371-380 апб Т)иа е! а1. (1997) ТНе Рго§!а!е 32, 272-278.

В дальнейшем воплощении антиген-представляющие клетки, такие как дендритные клетки, контактируют с полинуклеотидом, который кодирует пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом и предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Как правило, полинуклеотид может быть включен в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антигенспецифический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. Сопд е! а1. (1997) Сепе ТНег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, \Уап е! а1. (1997) Нит. Сепе ТНег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (8рес1! е! а1. (1997) 1. Ехр. Меб. 186, 1213-1221 и 8хаЬо1с$ е! а1. (1997)), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тигшд е! а1. (1997) Еиг. 1. 1ттипо1. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (АкЫеу е! а1. (1997) 1. Ехр. Меб. 186, 1177, 1182).

Следует понимать, что с учетом методов уничтожения клеток-мишеней у пациента особенно предпочтительно, чтобы клетками-мишенями были раковые клетки, более предпочтительно раковыми клетками лейкемии или лимфомы.

Особенно предпочтительно, если пациенты, которых лечат методами изобретения, имели тип НЬАА2. Таким образом, в предпочтительном воплощении НЬА-гаплотип пациента определяется до начала лечения. Гаплотипирование НЬА может быть произведено при использовании любого подходящего метода; такие методы хорошо известны из уровня техники.

Изобретение включает, в особенности, использование пептидов по изобретению (или кодирующих их полинуклеотидов) для активной вакцинации ш νί\Ό; для манипуляции аутологичными дендритными клетками ш νίΙΐΌ при введении манипулированных таким образом дендритных клеток ш νί\Ό для активации ответов ЦТЛ; для активации аутологичных ЦТЛ ш νίΙΐΌ с последующей адоптивной терапией (т.е. манипулированные таким образом ЦТЛ вводятся пациенту); и для активации ЦТЛ здоровых доноров (МНС-совместимых или несовместимых) ш νίΙΐΌ с последующей адоптивной терапией.

В предпочтительном воплощении вакцины настоящего изобретения вводятся хозяину либо отдельно, либо в комбинации с другой противораковой терапией для ингибирования или супрессии образования опухолей.

Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'$ 0821 (Ас.|ш1а Вю!есН, ^огсекйг, МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок, и собственно адъювантов, таких как ШЫ'8 Эе!ох. Также может быть использован Οιιί1 А, другой, полученный из сапонина адъювант (8ирегГок, Дания). Также могут быть полезны другие адъюванты, такие как олигонуклеотиды СрС, стабилизированная РНК, имиквимод (имеется в продаже под названием А1бага™, изготавливаемый 3М РНатта, США), неполный адъювант Фрейнда (имеется в продаже как Моп!ашбе 18А-51, изготавливаемый 8еррю 8.А., Париж, Франция), липосомальные композиции или ГМ-КСФ. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом.

Пептиды в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве диагностических реагентов. Используя пептиды, может быть проведен анализ, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие ЦТЛ, которые специфически направлены против пептида или индуцированы при терапии. Кроме того, увеличение числа предшествующих Т-клеток может быть проверено теми пептидами, которые имеют реактивность против означенного пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для контроля прогрессирования опухолевого заболевания, экспрессирующего обозначенный антиген, из которого образован пептид.

В приложенной табл. 1 приведены пептиды, которые были использованы и идентифицированы. Помимо того, в таблице дается соответствующая позиция пептида в соответствующем белке. Инвентарный номер мышиного ОЕАДЬК в генофонде Национального Центра Биотехнологической Информации /№Шопа1 Сеп!ге Тог Вю!есНпо1оду 1пГогта!юп/Национального Института Здоровья (№Шопа1 1п8!йи!е оГ НеаИН) (см. 1Шр://\у\у\у.псЬ1.п1т.п1Н.доу) - это ААЭ26866. Инвентарные номера человеческого ОЕАДБК в генофонде Национального Центра Биотехнологической Информации Национального Института Здоровья (см. 1Шр://\у\у\у.псЬ1.п1т.п1Н.доу) - это, например, ААС50652 или ААР35883.

В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для окрашивания лейкоцитов, в особенности Т-лимфоцитов. Такое использование имеет особенное преимущество, если необходимо

- 17 013598 проверить, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие специфические ЦТЛ, которые направлены против пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для определения прогрессирования терапии в опухолевом заболевании или нарушении.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения пептиды используются для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены по стандартному способу иммунизации животных путем инъекции пептида и последующей очистки иммуноглобулина. Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии со стандартными протоколами, такими как описываются, например, в Ме11юб5 Επζνιηοΐ. (1986), 121, НуЬпбота 1ес1то1оду аиб топос1опа1 аибЬоб1е8.

Согласно дальнейшему аспекту изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит один или более упомянутых пептидов в соответствии с изобретением. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо того, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т. д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими агентами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. К1ЬЬе, НаибЬоок ок Рйаттасеибса1 Ехс1р1еий, 3. Еб., 2000, Атепсаи Р1агтасеибса1 А^оаабои аиб рйагтасеибса1 рге§8. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения опухолевых заболеваний.

Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих любую из последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 2 вводится пациенту, страдающему опухолевым заболеванием, которое ассоциировано с соответствующим пептидом или антигеном. Конкретными заболеваниями для лечения являются злокачественные опухоли, экспрессирующие 0ЕА/1ЬКР, такие как лейкемия (например, ОМЛ или ХЛЛ) или миеломы (например, ММ). Тем самым может быть инициирован ЦТЛ-специфический иммунный ответ.

В другом аспекте настоящего изобретения комбинация двух или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в качестве вакцины, либо в непосредственной комбинации, либо с аналогичной лечебной схемой. Кроме того, могут быть использованы комбинации с другими пептидами, например, с пептидами, специфическими для МНС II класса. Специалист в данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток ш гйго в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения определенных Т-клеток для определенных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе получения ΙΕΝ-γ (см. также примеры ниже), ИЛ-12 или перфорина. Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 различных пептидов, предпочтительно 4, 5, 6 или 7 различных пептидов и наиболее предпочтительно 6 различных пептидов.

Наконец, вакцина может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента.

Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в антиопухолевой иммунотерапии. В целях идентификации связанных с Т-клетками эпитопов, образованных из белка ОЕАбЬК, были синтезированы 14 пептидов (см. ниже), которые были спрогнозированы компьютерными программами РАРгоС (ййрУ/иии.иш-ШеЬтдеи.бе/иш/кх!/) и 8УЕРЕ1ТНУ (1Шр://\у\у\у.5уГрей1й.бе) для связывания с молекулой НЬА-А*0201. При анализе воспроизведения ш уйто с использованием ТАР (транспортер, ассоциированный с антиген-процессированием)-дефектной Т2 клеточной линии, только два пептида (1ЬК.1, 1ЬК.2) проявили сильную связывающую аффинность к НЬАА*0201 (фиг. 11А и В), если сравнивать с Е1и нуклеопротеином_58-66. В присутствии полностью зрелых ДК с введенным импульсным способом либо 1ЬК.1, или 1ЬК2 могли быть генерированы пептидные линии ЦТЛ, полученных от здоровых доноров НЬА-А*0201⁺.

Кривые титрования пептида демонстрируют, что 1ЬК.1 и 1ЬК.2-специфические ЦТЛ имели высокую аффинность к пептиду/МНС комплексу (фиг. 5 и 10). Обе линии ЦТЛ, специфические для 1ЬК.1 (фиг. 1) или 1ЬК2 (фиг. 6) вызывали сильную цитолитическую активность против гематологических опухолевых линий НЬА-А*0201⁺, преимущественно злокачественных бластов ОМЛ (фиг. 4А, В и 8А, В, соответственно) и клеток ХЛЛ (фиг. 3А, В, и 9А, В, соответственно), но щадили НБА-А2-негативные мишени и нормальные кроветворные клетки (1Ь1б.). Эксперименты по блокированию антител (фиг. 2 и 7) выявили рестриктированное уничтожение МНС класса I, индуцированное пептидными специфическими СЭ8' Тлимфоцитами. Для определения частоты 1ЬК.1 - и 1ЕК2-специфических Т-клеток в НЬА-А*0201⁺ ОМЛ, ХЛЛ и у пациентов с множественной миеломой применялся микроанализ секреции ЕБ18Р0Т ΙΕΝ-γ (табл. 3-5). У 25/50 (50%) и 20/50 (40%) пациентов НЬА-А*0201⁺ с гематологическими злокачественными заболеваниями могли быть выявлены значительные уровни пептидно-специфических Т-клеток для

- 18 013598

1ЬК1 или 1ЬК2, тогда как в пробах периферической крови здоровых индивидов не возникали спонтанные Т-клеточные ответы ни против 1ЬК1, ни против 1ЬК2 (табл. 2). У одного пациента с ХЛЛ и у другого с ОМЛ могли быть образованы линии аутологичных ЦТЛ, специфических как для пептидного эпитопа 1ЬК1, так и для 1ЬК2, с провоцированием эффективной цитотоксической активности против аутологичных и аллогенных НЬА-А2-совместимых клеток-мишеней.

Изобретатели предварительно показали, что ОГАЛЬК-специфические регуляторные клоны СЭ8' Тклеток, секретирующих интерлейкин-10, могут быть идентифицированы как у мышей с опухолью ОГА/1ЬК⁺ (КоЬгег IV., КоЬгег 8.Ό., Вагзоит А., Соддш ГН. 1г. О1ГГегеп(1а1 гесодшбоп оГ тигте (итогаззос1а(еб опсоГое(а1 (гапзр1ап(а(юп апйдеп апб шбМбиабу зресШс (итог (гапзр1ап(а(юп апбдепз Ьу зупдепе1с с1опеб Ва1Ь/с апб КЕМ тоизе Т се11з. 1994; 152: 745-764), так и у пациентов с запущенной карциномой груди (КоЬгег IV., Вагзоит А.Ь., Эуезз О.Ь. е( а1. Нитап Ьгеаз! сагстота ра(1еп(з беуе1ор с1опаЬ1е опсоГое(а1 апбдеп-зресШс еГГес(ог апб геди1а1огу Т 1утрЬосу(ез I 1ттипо1. 1999; 162: 6880-6892. 11. КоЬгег IV., Соддш ГН. 1г. СЭ8 Т се11 с1опез 1пЬ1ЬЬ аШбитог Т се11 Гипсбоп Ьу зесгебпд 1Ь-10. I 1995; 155: 5719). Автор 8и е( а1. (8и Ζ. е( а1. 1ттипо1од1са1 апб СЬшса1 гезропзез ш те(аз(аЬс гепа1 сапсег рабеШз уасста(еб \νί(1ι (итог ^А-(гапзГес(еб бепбпбс се11з. Сапсег Кез. 2003; 63: 2127-2133) сообщает о реактивности Т-клетки против эпитопов из ОГА/ИК, рестриктированных по МНС класса I от пациентов с метастатическим раком почек. В этом исследовании авторы сообщают также о неожиданно низкой смертности пациентов, прошедших вакцинотерапию аутологичными дендритными клетками, которые были трансфецированы РНК, кодирующей ОГА/ИК и другие предполагаемые опухолевые антигены. Тем не менее, число, рестрикция по НЬА и химическая идентичность эпитопов из ОГАбЬК в работе 8и е( а1. не раскрываются. Авторский коллектив Н6111 е( а1. (Н6111 Ь. е( а1. 1ттипо1Ьегару оГ те(аз(абс гепа1 се11 сагстота \νί(1ι (итог 1уза(е-ри1зеб аи1о1одоиз бепбгйс се11з. С1т. Сапсег Кез. 2002; 8: 3369-3376) показывает дальнейшую очевидность, что ОГА/гБК могут быть очень полезными для иммунотерапии рака, основанной на лечебных вакцинах, стимулирующих специфические клеточные иммунные ответы. Авторы обнаружили, что 5/6 пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой (ПКК), которые были вакцинированы аутологичными дендритными клетками, насыщенными аутологичными или аллогенными клеточными лизатами опухоли, проявляли признаки повышенных иммунных ответов против ОГА/ИК. Опять же и у Но1(1 е( а1. не был раскрыт ни один эпитоп из ОГА/ИК. Что интересно, пациенты с сильнейшими иммунными ответами против ОГА/ИК имели полный и частичный клинический ответ.

В образованных изобретателями небольших группах пациентов с ХЛЛ на ранней стадии (Вте! А) не было обнаружено релевантных ИЛ-10-секретирующих Т-клеток, специфических для пептидов 1ЬК1 или 1ЬК2 (данные не приводятся). Изобретатели в настоящее время проводят эксперименты для более точного выяснения возможной связи между наличием анти-ОГАЛЬКР-специфических Т-клеток, секретирующих ΙΓΝ-γ или ИЛ-10, и стадией заболевания у пациентов с ХЛЛ и множественной миеломой.

Итак, изобретатели впервые идентифицировали два различных НГА-А*0201-специфических пептидных эпитопа, образованных из белка ОГА/ИК. Эти пептиды представляют собой полезные инструменты как для проведения иммунологических исследований, так и для стратегий вакцинации при злокачественных опухолях, экспрессирующих ОГА/гБКР.

Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как дана здесь, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с настоящим изобретением или нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением или вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, где объем обозначенного пептида или объем обозначенной нуклеиновой кислоты или объем обозначенного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у обозначенного пациента.

Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в соответствии с настоящим изобретением, способ, включающий введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как определено в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в соответствии с настоящим изобретением, способ, включающий стадии (1) получение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) от пациента; (2) введение в обозначенные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей Т-клеточный рецептор (ТКР), или функционально эквивалентной молекулы, как определено в соответствии с настоящим изобретением; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

Предпочтительно, чтобы клетки-мишени являлись раковыми клетками. Более предпочтительно, чтобы упомянутый рак являлся лейкемией или лимфомой, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, какая дана в соответствии с настоящим изобретением.

Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также в отдельной модели без выхода из намеченных рамок настоящего изобретения.

- 19 013598

Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие рисунки, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрации целей и не предназначены для ограничения изобретения.

Последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1 и 8ЕЦ ГО N0: 2 демонстрируют пептидные последовательности Т-клеточного эпитопа, содержащего пептиды, которые представляются МНС класса I в соответствии с настоящим изобретением.

Последовательности 8ЕЦ ГО N0: 6 и 8ЕЦ ГО N0: 17 демонстрируют пептидные последовательности, какие были использованы в примерах.

Фиг. 1 демонстрирует распознавание различных клеточных линий ЦТЛ, специфических для ΙΕΚ.1.

Фиг. 2 демонстрирует блокировку лизиса клеток-мишеней антителами, распознающими С08, МНС класса I или ТКР для 1ЬРЬ1.

Фиг. 3 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для НЬА-А*02/1ЬВ1, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ХЛЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент.

Фиг. 4 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для НЬА-А*02/1ЬК.1, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ОМЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент.

Фиг. 5 А демонстрирует степень зависимости клеток-мишеней Т2 с введенными импульсным методом пептидами от лизиса в ΙΕΚ.1 -специфических ЦТЛ. Фиг. 5А демонстрирует ингибирование ΙΕΚ.1специфических ЦТЛ немечеными мишенями (метод ингибирования немечеными клетками-мишенями).

Фиг. 6 демонстрирует распознавание различных клеточных линий ЦТЛ, специфических для 1ЬР2.

Фиг. 7 демонстрирует блокировку лизиса клеток-мишеней антителами, распознающими С08, МНС класса I или ТКР для 1ЬР2.

Фиг. 8 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для НЬА-А*02ДЬК.2, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ОМЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент.

Фиг. 9 демонстрирует, что ЦТЛ, специфические для НЬА-А*02ДЬК.2, уничтожают опухолевые клетки у пациентов с ХЛЛ; (А) 1-ый эксперимент; (В) 2-ой эксперимент.

Фиг. 10А демонстрирует степень зависимости клеток-мишеней Т2 с введенными импульсным методом пептидами от лизиса в 1ЬВ2-специфических ЦТЛ. Фиг. 10А демонстрирует ингибирование 1ЬВ2специфических ЦТЛ немечеными мишенями (метод ингибирования немечеными клетками-мишенями).

Фиг. 11 демонстрирует анализ воспроизведения ίη νίίτο с использованием ТАР (транспортер, ассоциированный с антиген-процессированием)-дефектной Т2 клеточной линии, только два пептида (гЬК.1, 1ЕК2) проявляют сильную связывающую аффинность к НЬА-А*0201 (фиг. 11А и В), если сравнивать с Ии нуклеопротеином_58-66. При сравнении с ΙΕΚ.3 до ΙΕΚ.14 и базисным пептидом вируса гриппа (Т1иш1), пептиды ΙΕΚ.1 и 1ЬВ2 проявляют хорошую связывающую аффинность к НЬА-А*02.

Фиг. 12 демонстрирует репрезентативный тетрамерный анализ управляемого микросферами распространения А2/КР8-001 и А2/РР8-002 специфических лимфоцитов СЭ8' из периферической крови. МПК, обогащенные на лунку 1х10⁶ С08⁺ здорового донора НЬА-А2⁺ НВС-065 стимулировались еженедельно в одной лунке микросферами, связанными с анти-СО28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/КР8-001 (верхняя секция) или опухолевый антиген высокой плотности А*0201/РР8-002 (нижняя секция), как было показано ранее |^а11сг. §., οί а1. СиШпд Ебдс: Ргебе1егтшеб ανίάίΐν οί йитап С08 Т се118 ехрапбеб οη саНЬга1еб ΜНС/аηί^-С^28-сοаίеά т1сго8рйеге8. ί. 1ттипо1. 171(10):4974-8, 2003] с минимальными модификациями. После трех стимуляций ίη νίίτο клетки из обеих лунок окрашивались антителом СЭ8 Р1ТС плюс тетрамер А*0201/РР8-001 АРС и А*0201/КР8-002 РЕ. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов (левая и средняя секция) или в популяцию лимфоцитов СЭ8' (правая секция). Числа показывают процентную концентрацию тетрамера⁺ внутри лимфоцитов СЭ8'.

КР8-001=ЬЬААКАГУА1 (8Ер ГО N0: 1); ΒР8-002=А^СNТ^8Р^ (8Ер ГО N0: 2).

Примеры

Сокращения, используемые в настоящем патенте

АЬ: Антитело

Ад: Антиген

АПК: антиген-нредставляющая клетка

СО: кластер дифференцировки сргп: число импульсов в минуту

ДК: дендритная клетка

ЕВУ: вирус Эпштейна-Барра

Ε8Ι: ионизация электроспреем

НЬА: антиген человеческих лейкоцитов

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография

- 20 013598

ΙΡΝ: интерферон

Ιί: инвариантная цепь (Όϋ74)

ИЛ: интерлейкин

ΜΑ1ΌΙ: лазерная десорбция-ионизация в присутствии матрицы

МНС: главный комплекс гистосовместимости

МС: масс-спектрометрия

00.15«: оптическая плотность при длине волн в 450 нм

МПК: моноциты периферической крови

п.б.: не определено

ПЦР: полимеразная цепная реакция

РНА: фитогемагглютинин

ДСН-ПААГ: электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

И.С.: индекс стимуляции

ТОР; время пролета

Клеточные линии, пробы опухоли и моноциты периферической крови (МПК).

Все клеточные линии, использованные в этом исследовании, были взяты из Атепсап Туре Сибиге СоПесйоп (Мапаккак, VА, США). МПК, клетки-предшественники СЭ34', клетки костного мозга (КМ) и пробы опухолей были взяты у здоровых доноров, пациентов с острой миелоидной лейкемией (ОМЛ), хронической лимфоцитной лейкемией (ХЛЛ) и множественной миеломой (ММ), соответственно, после информированного согласия и одобрения Институтского наблюдательного совета.

Антитела.

Антитело против МАМ-6: А1ех1к Согр., Швейцария, полученные через фирму АХХОВА 0ЕиТ8СНР-АХ0 СтЬН, Са11икк!гакке 10, Ό-35305 СгипЬегд, Германия.

№ продукта: 8Ю-614.

Антитело против НЬА-А*02: клон ВВ7.2 от ΒΌ ΡНа^ш^идеи. № кат. 551230.

Антитело против СЭ8: клон 8ЕСI21ТЬу2^3 (Т8) от Весктап Соибег, серийный № 6602139.

Антитело против ТКР: клон ВМА031 от Весктап Соибег, серийный № ЕМ1466.

Антитело против СЭ4: клон 8ЕСП2Т4Э11 (Т4) от Весктап Соибег, серийный № 6602138.

Антитело против НМЕС-1: клон 1.10.Е3 от Весктап Соибег, серийный № ГМ0271.

Пептиды.

Пептиды Е1иМ1_58-66 (СШСЕ'ТТТЬ), ВИЧ-Ро1_476-484 ^ΚΕΡνΈ^ν, негативный контроль анализом ЕЫ8РОТ), ткигу33 (^Υ^ΚNΥΚIА, мышиный сурвивиновый пептидный эпитоп, специфический для Н2^б, негативный контроль тестами по связыванию Т2), 1ТВ159-68 (ЬЬААВАШАЦ, ίΤΚ2ι46-ι54 (А^СNТ^8Ρ^), 1ЬВ360-68 (ЪААВАШАЦ, 1ЬВ458-66 (ТЬЬААВА^, 1ЬВ57-15 ('УЪРМКЕЕП^, 11,В6,,8 (Ν .КИТАЕМ 1ЬВ766-74 (АМЕКТАОМ 1ЬВ8139-147 (ΥVN^ΡТIА^), 11,В9 8, (МЬАВЕ'ТЪВМ), 1ЬВ10249-257 (8Е^р^,т^, 1ЬВ1118-26 (ЕЬААСТНЬС), 1ЬВ12_57-66 (КЬТЬААВА^, 1ЬВ13_67-76 (/40^0/41^8 V), 1ЬВ.14₁₇₃.₁₈2 (^МVVМ^АВΕV) были куплены в ВюкугИНап (Вег1ш, Германия) с уровнем чистоты более чем 90% и анализировались высокоэффективной жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией.

Пептидный синтез и анализ.

Пептиды были синтезированы в автоматическом синтезаторе пептидов ΕΡ8221 (АЫтеб, к-апдепГеИ, Германия), следуя стратегии ЕтосАВи. После отделения от смолы с помощью обработки ТЕА/фенол/этандитиол/тиоанизол/вода (90/3.75/1.25/2.5/2.5 по объему) в течение 1 или 3 ч (аргининсодержащие пептиды) пептиды были осаждены из метил-трет-бутилового эфира, промыты один раз метилтрет-бутиловым эфиром и дважды диэтиловым эфиром и ресуспендированы в воде до начала лиофилизации. Продукты синтеза анализировались ВЭЖХ (Хапап баг, 2тккег апа1убск, Мюнхен, Германия) и масс-спектрометрией МАБШ-ТОЕ (ГиШге, С8С, Брухзаль, Германия). Пептиды с менее чем 80% чистоты были очищены на препаративной ВЭЖХ.

Анализ связывания Т2.

Анализ по связыванию целых клеток Т2 был проведен с использованием протокола, взятого из работы Сакаб е! а1. (Сакаб С., Эа1егЬа Ρ., В1уо1бш Ь. е! а1. ТНе арорЮбк 1пЫЬбог рго!еш кшу1уш тбисек !итог-кресШс СЭ8' апб СЭ4' Т се11к ш со1огес!а1 сапсег рабеШк. Сапсег Век. 2003; 63, 4507-4515).

Генерация человеческих ЦТЛ.

ЦТЛ, полученные от здоровых индивидов с типом НЬА-А*0201⁺, генерировались с использованием протокола, приводимого в другом месте (2е1к М., 81еде1 8., 80ιιηίΙζ М. е! а1. Iибисбои о! су1о1ох1с Т 1утрНосу1ек адаиМ Ьета1о1одк пеор1актк Ьу кигу1ут ВХА-1гапкГес1еб бепбббс се11к. I. Iтшиио1. 2003; 170, 5391-5397). Для индукции аутологичных ОЕА/гЬВ пептидоспецифических ЦТЛ, полученных от пациен

- 21 013598 тов с ОМЛ и ХЛЛ, СЭ8' Т-клетки выделялись из МПК с использованием иммуномагнетических гранул (МАС8®, М11!еиу1, Бергиш-Гладбах, Германия), культивировались аутологичными ОЕАЛБК, полностью зрелыми ДК с введенным импульсным методом пептидом и стимулировались заново аутологичными МПК с введенным импульсным методом пептидом в присутствии ИЛ-2 (1 нг/мл, СеПСопсерК Вайскирх, Германия). После по крайней мере четырех еженедельных рестимуляций реактивность ЦТЛ определялась стандартным 4 ч анализом с хромом-51. Анализ ингибирования немечеными мишенями и эксперименты по блокировке антител производились, как описано выше (2еЕ М., 81еде1 8., 8с1ипЦх М. е! а1. 1пбисЬоп о£ суЮЮхю Т 1утрЬосу!еб адатб! ЬетаЮ1од1с пеор1абт5 Ьу бшукт ^А-1гап5Гес1еб бепбгШс се11б. I. 1ттипо1. 2003; 170, 5391-5397).

Анализ ЕБ18РОТ.

Для определения частоты пептидоспецифических Т-клеток для ОЕАДЬК у пациентов применялись анализы ЕЫ8РОТ с использованием интерферон-у-ЕЫ8РОТ-КД (Вес!оп Оюктбоп, Хайдельберг, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Таблица 1

Пептиды и опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, как определено в настоящем изобретении _Название_Последовательность_№ послед-ти_Примечания 1 ίΜί-ΙΧΑΑΚАГУА1Д5ЕС)

ГО ΝΟ: 1_1ЬВ1_2.1ЬК2_!46.1₅,_АЕСМТ05РЬ_8ЕО ГО ΝΟ: 2_Ц.К2_3_Р111М1_5г.

₆₆_С.!ЬСГУРТЬ_8ЕО ГО ΝΟ: 3___4._ВИЧ-Ро1₄₇₆.₄₈₄_ГОКЕРУНС|У_8Е(} ГО ΝΟ: 4_негативный контроль анализом ЕЫ8РОТ 5. _тзигуЗЗ_ЕУ1.КНУЕ1А_8ЕО ГО ΝΟ: 5_мышиный сурвивиповый пептидный эпитоп, специфический для Н2^а, негативный контроль методами связывания Т2_б._1ЕКЗ_м.₆₈_ЬААКА1УА1_8Ер ГО ΝΟ: б 7. 1ЬВ4^ ЬЬЬААКАТУ 5ЕО ГО ΝΟ: 7__8._1ЬК5₇._|5_УЬСМКЕЕОУ_8ЕО ГО ΝΟ: 8___9.1ЬВ6_;„₅₈_МЬККТ\\'ЕКЬ_8Ер ГО ΝΟ:

10. 1ЬК7_йй-74 ΥΑΙΕΝΡΑΡν 5ЕО ГО ΝΟ: 10___11._ίΕΚ8₁₃₉.₁₄₇_ΥνΝΕΡΤΙΑΕ_8Ερ ГО ΝΟ:

П___12 _1ЬК917₇-1₈₈_МЕАЙ.ЕУШ.М_8Е9 ГО ΝΟ: 12___13.АЕВ.10₂₄<>.257_8Е6У9УР8У_8Е(3 ГО

N0:13___14. 1ЕК111,.₂₆_РЕААОТНЬО_8Е<3 ГО ΝΟ: 14___15._1ЕК12₅,.₆₆_КЕЕЕААКА1У_8Е<3 ГО

ΝΟ: 15___16._ϊΕΚ13₆,.₇₆_ΑΙΕΝΡΑΡνδν_8Ε9 ГО ΝΟ: 16___17._1ЬК14₁₇₃.

₁₈₂_ЬМ%А¥МЕАК.ЕУ^8ЕСг ГО N0:17__

Результаты

Пептиды: 1ЬК1 (БЬААКА1УА1,8Ες ΙΌΝΟ: 1) _и П_Н2 (АЬСИТОБРЕ, 8Ер 1ΟΝΟ:2)

Во всех анализах ЕБ18РОТ цифры для ΙΕΝ-γ-положительных проб даны в расчете на 10 МПК. До осуществления анализа Т-клетки пациентов и здоровых доноров культивировались в течение семи дней в присутствии интерлейкина-2 (ИЛ-2) (10 единиц/мл) и пептида (10 мкг/10⁶ МПК/мл).

Все проверенные пробы здоровых доноров имеют низкое число ЦТЛ, отвечающих на 1ЬК1 или 1ЬВ2 (табл. 2) при анализе ΙΓΝ-γ ЕБ18РОТ.

Таблица 2

Показания:_здоровые доноры_Пациенты с положительной пробой на: _НЬАА*02__Диагностика ЕБ18РОТ:_Интерферон гамма (ΙΡΝ-γ) ___Аминокислотная последовательность пептида:_ЬЬААР.А1УА1__АЬСМТ08РЬ_61ЬОРУРТЕ_обозначение пептида:_11.К1__ΙΕΚ.2__Р1иМ1__Исходный белок:_Незрелый Рецепторный Белок

Ламинина_Незрелый Рецепторный Белок Ламинина_Матричный Белок Вируса гриппа М1___имя пациента положительно окрашенных проб:_001_0_0_ __002_3_3__003_2_2__004_4_4_ _005_5_5__

006_4_4__007_6_б__008_7_7__009_0_0__010_0_0__011_0_

О__012_0_0__013_3_3__014_4_4__015_5_ _5___

Изо всех исследованных проб опухолей пациентов с ХЛЛ 12/20 (60%) имеют показательные (>20) ответы ЦТЛ против пептида 1ЬК1, и 9/16 (56%) имеют ответы против пептида 1ГК2 при анализе ΙΓΝ-γ ЕЫ8РОТ. Средние числа положительно окрашенных ЦТЛ для двух пептидов, образованных из ГБЕ, сравнимы с 55% (1ЬК2) и 76% (ШК!) числа ответов, полученных с помощью общего рестриктированного по НЬА-А*02 диагностического антигена из матричного белка вируса гриппа, против которого практически каждый взрослый человек должен был иметь ранее клеточные иммунные ответы (табл. 3).

- 22 013598

Таблица 3

Показания:_Пациенты с ХЛЛ__Пациенты с положительной пробой на: _НЬАА*02__Диагностика ЕЫ8РОТ:_Интерфероп гамма (ΙΡΝ-γ) ____Аминокислотная последовательность пептида:_ЬЬААК.А1УА1__АЬСНТВ5РЬ_<Э1ЬСРУРТЕ обозначение пептида: ΙΕΚ.Ι__1БК.2__Р1иМ1__Исходный белок:_Незрелый Рецепторный Белок

Ламинина

Незрелый Рецепторный Белок Ламинина

Матричный Белок Вируса гриппа М1 имя пациента:

# положительно окрашенных проб:

ООО, В.

ООО, Т.

022, Е.

027, XV.

128

033, ϋ.

122

67__η.ώ_038, Ν..45 23_140_041, Е._35_27_65_049,

С._56_78_31_052, 6._0_56_η.ά._054, 8._0_0_47_058,

Е._0_0_41_060, Р._0_0_63_065, В._1_0__58_070, М.2_2 89 _071, (3. 3 _0_ 91—082, О. 68____28__083, М._100____279_087, Ν._83____24_090,

6._121____30_091, О._93____67__125, Р.___57___

Из всех исследованных опухолевых проб пациентов с ОМЛ 6/15 (40%) имеют показательные (>20) ответы ЦТЛ против пептида ГЬК1, и 7/15 (47%) имеют ответы против пептида ШК^ при анализе ΓΕΝ-γ ЕЫ8РОТ (табл. 4).

Таблица 4

Показания:_Пациенты с ОМЛ_Пациенты с положительной пробой на: _НЬАА*02_Диагностика ЕЫ8РОТ:_Интерферон-гамма (ΙΡΝ-γ) ___Аминокислотная последовательность пептида:_ЕЬААКАГУА1_АЬСЬ1ТО8РЕ—СЛЕСРУГТЕ—обозначение пептида:_1ЬК1__ТЕЕ2__р1иМ1__Исходный белок:_Незрелый Рецепторный Белок

Ламинина_Незрелый Рецепторный Белок Ламинина_Матричный Белок Вируса гриппа М1___имя пациента:_# положительно окрашенных проб:000,

М.2_0__025, 4-„3__0__„041, Ст._2 0__055,С._1_1072,

С..З— 3__106, К._4_0__107, Ь._5_3__108, Е_56_ 34110,

В._54_27__000, М._34—34___026, С„34_34043,

Ь._33_23__056,Ν._25_112__072, О._1_1__068, О._2__32___

- 23 013598

Из всех исследованных опухолевых проб пациентов с миеломой 8/14 (57%) имеют показательные (>20) ответы ЦТЛ против пептида ШК1, и 6/14 (43%) имеют ответы против пептида ГОК2 при анализе ΙΡΝ-γ ЕЫ8РОТ (табл. 5).

Таблица 5

Показания: Миелома

Пациенты с положительной пробой на:

НЬА-А*02

Диагностика ЕЫ8РОТ:_Интерферон-гамма (ΙΡΝ-γ)___Аминокислотная последовательность пептида;_ЬЬААК.А1УА1_АЬСЫТПЗРЬ_СПДлРУВТС_обозначение пептида:_1ЬК 1__1ЬК2__Р1иМ1__Исходный белок:_Незрелый Рецепторный Белок

Ламинина_Незрелый Рецепторный Белок Ламинина_Матричный Белок Вируса гриппа М1___имя пациента:_# положительно окрашенных проб:_001 3„0__002 4 .__0__00356_0__004_ 76 1__ 005_56_3__ _006_43__0__ __007_22_3__008_23_34__009_0_27__010_0_34__ _011___34__012_23_23__013_112_112__014_1_ _1___

Итак, потенциал пептидов ГЬК.1 и -2 из ОРА-ГОКР для возбуждения клеточных иммунных ответов против раковых клеток, в особенности, лейкемий и лимфом, становится совершенно очевидным. Тклетки, специфические для упомянутых пептидов, проявляют эффекторные функции (секреция ΙΡΝ-γ).

Таблица 6: обобщение тетрамерного анализа стимулированного микросферой размножения А2/КР8-001 и А2/КР8-002-специфичеких лимфоцитов СЭ8' из периферической крови. МПК, обогащенные на лунку 1х10⁶ СЭ8', стимулировались, как на фиг. 12, микросферами, связанными с анти-СЭ28 плюс опухолевый антиген высокой плотности А*0201/КР8-001 или опухолевый антиген высокой плотности А*0201/КР8-002. Указано число подлежащих оценке доноров с Η^А-А2⁺, число подлежащих оценке доноров по крайней мере с одним четко положительным ответом, число подлежащих оценке стимуляций среди всех подлежащих оценке доноров и число подлежащих оценке стимуляций с четко положительными ответами. КР5-001=^^АΛКАIVАI (5ЕР) ГО ^: 1); КР5-002=АЬСКТО8РЬ (5ЕЕ) ГО ^: 2).

Таблица 6

Аптиге11_Параметр_Значение_А2/К.Р8-00 ^Подлежащие оценке доноры_5_А2ЖР8-001_Подлежащие оценке доноры с четко положительными

Т-клеточными ответами_5__А2/КР8-001_Подлежащие оценке стимуляции среди подлежащих оценке доноров_53__А2/В.Р 8-001—Подлежащие оценке стимуляции с четко положительными Т-клеточными ответами_29__А2/КР8-002_Подлежащие оценке доноры_5__А2/К.Р8-002_Подлежащие оценке доноры с четко положительными ответами Т-клеток_1__А2/ВР8-002_Подлежащие оценке стимуляции среди подлежащих оценке доноров_54__А2/В.Р8-002_Подлежащие оценке стимуляции с четко положительными Т-клеточными ответами_1__

Дальнейшие эксперименты, касающиеся 1БК.1 (ТЕААК.А1\’А1)

Т-клетки, распознающие пептид ГЬК.1, тестировались на К562 [человеческая клеточная линия проэритробластической лейкимии, известная также как клеточная линия хронического миелолейкоза (ХМЛ), которая в связи с крайне низким уровнем ДБА функционирует как контроль для исключения НК-клеток как эффекторных клеток], !М9 (человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия), Каграк-422 (человеческая В-клеточная лимфома), Ва1т-3 (человеческая клеточная линия В-клеточной лимфомы не Беркитта), И266 (человеческая множественная миелома), ΚΕΗ (человеческая В-клеточная предшествующая лейкемия), МЕС-1 (человеческая хроническая В-клеточная лейкемия). Те же самые Т-клетки были использованы для проверки аутологичных и аллогенных МПК здоровых доноров в качестве контроля. Все клеточные линии, за исключением МЕС-1, которая не экспрессирует аллель и К562, которая является дефектной для экспрессии гена ДБА класса Ι вообще, распознавались [ЬК1-специфическими Тклетками (см. фиг. 1). Как аллогенные, так и аутологичные клетки здоровых доноров не были распознаны, указывая на то, что:

1) ГОК1 экспрессируется в значительной степени на пептидном уровне только в опухолевых клетках, но не в мононуклеарных клетках крови Η^А-совместимых здоровых доноров;

2) ответ не направляется против аллогенных крупных или малых антигенов комплекса гистосовместимости;

- 24 013598

3) пептид О1 распознается по НЬА-рестикционной модели;

4) рестрикция является аллель-специфической (специфическая для А*02).

Мишень: ОМЛ.

Т-клетки, специфические для 1ЬЕ1, рестриктированного по НЬА-А*02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ (4 пациента; пробы ОМЛ-01, -02, -03, -06) (фиг. 4А). Клетки А*02положительных пациентов (3/4) распознавались с максимальным лизисом при соотношении Э/М (соотношение клеток-эффекторов и клеток-мишеней) 40:1 между 25,9% и 39,8%. Клетки ОМЛ А*02отрицательных пациентов с ОМЛ-06 распознаны не были.

Т-клетки, специфические для 1ЬЕ1, рестриктированного по НЬА-А*02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ во второй раз для подтверждения результатов, полученных из 1-го эксперимента (9 пациентов; пробы ОМЛ-01, -02, -04, -05, -06, -07, -09, -10, -12). Клетки А*02-положительных пациентов (5/9; ОМЛ-02, -04, -05, -09, -10) были распознаны во всех случаях. Клетки А*02отрицательных пациентов с ОМЛ (4/9; ОМЛ-01, -06, -07, -12) распознаны не были (4/4) (фиг. 4В).

На фиг. 4В представлены также данные о СО34-положнтельных клетках-предшественниках костномозгового происхождения А*02-положительных доноров (СО34-01, -02), которые не были распознаны активированными ЮМ-специфическими Т-клетками, которые были рестимулированы 1ЬЕ1 в присутствии ИЛ-2 ш νίΙΐΌ в течение 7 дней. Костно-мозговые клетки (КМ-01, -02) А*02-положительных доноров также не были распознаны этими Т-клеточными клонами.

На фиг. 2 представлены эксперименты по блокировке антител для дальнейшей характеристики специфичности Т-клеточного ответа. До экспериментов с хромом-51 при постоянном соотношении Э/М 40:1, блокирующие моноклональные антитела инкубировались с человеческой В-лимфобластоидной клеточной линией ΙΜ-9 при концентрациях моноклональных антител, как указано производителем. Эксперименты по блокировке показывают, что распознавание О1 опосредуется:

1) клетками с Т-клеточными рецепторами (ТКР),

2) распознающими их мишень в контексте МНС класса I (НЬА класса I),

3) механизмом взаимодействия, зависимым от корецептора СО8, но не СО4.

Контрольные моноклональные антитела, специфические для нерелевантных, муциноподобных белков клеточной поверхности МАМ-6 (синонимы: СА 15-3, ΌΡ3) и НМР6-1, не воздействуют на распознавание клеток ГМ-9 эффекторными Т-клетками. Физиологический раствор с фосфатным буфером использовался в этих экспериментах по блокировке в качестве негативного контроля.

Итак, эти две серии экспериментов подтверждают, что:

1) ГЬК1 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (8/8) проверенных А*02положительных пациентов с ОМЛ (8/13);

2) ГЬК1 рестриктирован по НЬА-А*02;

3) ГЬК1 -специфические Т-клетки распознают естественно процессированные ГРК2 на опухолевых клетках, тогда как, в то же самое время, пептид ГЬК1, по-видимому, отсутствует на костно-мозговых и положительных клетках-предшественниках СО34;

4) взаимодействие между мишенями и эффекторными клетками может быть специфически ингибировано моноклональными антителами против МНС класса I, ТКР или СО8.

Мишень: ХЛЛ.

Т-клетки, специфические для ШК!, рестриктированного по НЬА-А*02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ХЛЛ (5 пациентов; пробы ХЛЛ-01, -02, -03, -05, -06). Клетки А*02-положительных пациентов (3/5) были распознаны во всех случаях (3/3). Клетки А*02-отрицательных пациентов не были распознаны ни в одном случае (0/2) (фиг. 3В). Эксперимент был повторен (фиг. 3А) с 8 дальнейшими пациентами с ХЛЛ, из которых 4/8 имели положительный А*02. Клетки ХЛЛ А*02-положительных пациентов были распознаны 4/4, тогда как в случае А*02-отрицательных клеток мишеней были распознаны 0/4, эти дополнительные эксперименты подтвердили приведенные ранее результаты.

Подведем итог:

1) ГЬК1 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (7/7) проверенных А*02положительных пациентов с ХЛЛ;

2) ГЬК1 рестриктирован по НЬА-А*02.

Мишень: Т2.

Т2-клетки дефектны для экспрессии ТАР, «транспортера, связанного с процессингом антигена», который отвечает за перемещение коротких пептидов из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум (ЕК), где пептиды грузятся на пустые молекулы МНС класса I. Вследствие чего, молекулы МНС класса I клеток Т2 остаются пустыми, если не были внесены пептиды (внешняя «загрузка»). Таким образом, клетки Т2, экспрессирующие пустые молекулы НЬА-А*02 на поверхности клеток, являются оптимальными мишенями для образования кривых титрования с целью пептидно-специфического уничтожения Тклетками, рестриктированными по НЬА-А*02.

В этом эксперименте (фиг. 5А) Т-клетки, специфические для ШК!, были проверены на клетках Т2 с введенными импульсным методом хорошо описанными Т-клеточными эпитопами ВИЧ или ГЬК1 пептидом ЬЬААКАбУАР Результаты: Т-клетки распознавали только клетки Т2 с введенным импульсным ме

- 25 013598 тодом пептидом ГЬК.1. Клетки Т2 с введенным импульсным методом пептидом ВИЧ распознаны не были. Мишени Т2 с введенным импульсным методом пептидом О1 лизировались по дозозависимой модели. Лизис не достиг насыщения в спектре концентраций эксперимента.

Мишень: Т2 + ГЬК.1.

Производилось ингибирование немечеными клетками-мишенями. Для проверки, вызывают ли I^К1-специфические Т-клетки лизис клеток Т2 с введенным импульсным методом пептидом ШК! специфически и в контексте НЬА-А*02, производилось ингибирование немечеными клетками-мишенями следующим образом: меченые хромом-51 клетки Т2 нагружались пептидом при концентрации в 10 мкг пептида/10⁶ Т2-клетки/мл. Совокупность 2х10⁵ немеченых клеток Т2, которая нагружалась в равной степени тем же или контрольным пептидом, добавлялась затем в объеме в 50 мкл ВМЛ (вирус мозаики люцерны) в 10⁴ клеток Т2 с введенными импульсным методом пептидами, меченых хромом-51. Были добавлены эффекторные Т-клетки, специфические для ККЕ и производился анализ с хромом-51, как описано выше. Анализ демонстрирует, что ни иррелевантные для ШК.1-специфических ЦТЛ (сурвивин и ^42) пептиды, ни незагруженные клетки Т2, которые проявляют пустые молекулы НЬА-А*02 на своей клеточной поверхности, не конкурируют в лизисе мишеней, нагруженных пептидом ШК.1 в случае ШКЕ специфических ЦТЛ. Напротив, когда мишени с введенным импульсным методом синтетическим пептидом ШК.1 или опухолевые клетки ОМЛ, естественным образом проявляющие ШК.1 в контексте НЬАА*02, используются в качестве вторичных (немеченых) мишеней, то тогда они конкурируют с первичными клетками-мишенями («горячие» Т2 с введенным импульсным методом пептидом Ο1| при лизисе в ШЮ-специфических ЦТЛ (фиг. 5В).

Дальнейшие эксперименты, касающиеся ШК2 (АЬСЭТП8РЬ).

Т-клетки, распознающие пептид ^42 (фиг. 6), тестировались на К562 [человеческая клеточная линия про-эритробластической лейкимии, известная также как клеточная линия хронического миелолейкоза (ХМЛ), которая, в связи с крайне низким уровнем НЬА, функционирует как контроль для исключения НК-клеток как эффекторных клеток], ^9 (человеческая В-лимфобластоидная клеточная линия), Каграк422 (человеческая В-клеточная лимфома), Ва1т-3 (человеческая клеточная линия В-клеточной лимфомы не Беркитта), И266 (человеческая множественная миелома), КЕН (человеческая В-клеточная предшествующая лейкемия), Каток (синоним: КА 1; человеческая В-лимфобластная лимфома Беркитта), МЕС-1 (человеческая хроническая В-клеточная лейкемия). Те же самые Т-клетки были использованы для проверки аутологичных и аллогенных МПК здоровых доноров в качестве контроля.

Все клеточные линии, за исключением Каток и МЕС-1, которые не экспрессируют аллель НЬАА*02, и К562, являющийся дефектным для экспрессии гена НЬА класса I вообще, распознавались ^42специфическими Т-клетками. Как аллогенные, так и аутологичные клетки здоровых доноров не были распознаны, указывая на то, что:

1) ШК2 экспрессируется в значительной степени на пептидном уровне только в опухолевых клетках, но не в мононуклеарных клетках крови НЬА-совместимых здоровых доноров;

2) ответ не направляется против аллогенных крупных или малых антигенов комплекса гистосовместимости;

3) пептид ШК2 распознается по НЬА-рестикционной модели;

4) рестрикция является аллель-специфической (специфическая для А*02).

Мишень: ОМЛ.

Т-клетки, специфические для ШК^, рестриктированного по НЬА-А*02, проверялись на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ (8 пациентов; пробы ОМЛ-01, -02, -04, -05, -06, -07, -10, -12). Клетки А*02положительных пациентов (4/8; ОМЛ-02, -04, -05, -10) были распознаны во всех случаях (4/4). Клетки А*02-отрицательных пациентов с ОМЛ (4/8; ОМЛ-01, -06, -07, -12) не были распознаны (4/4) (фиг. 8А). Эксперимент проводился 2-ой раз с пробами пациентов, которые не были протестированы ранее. В этом 2-ом эксперименте Т-клетки, специфические для ΚΕΣ, рестриктированного по НЬА-А*02, были проверены снова на опухолевых клетках пациентов с ОМЛ (4 пациента; пробы ОМЛ -01, -02, -03, -06). Клетки А*02-положительных пациентов (3/4) были распознаны во всех случаях. Клетки А*02-отрицательных пациентов (0/1) распознаны не были (фиг. 8В).

На фиг. 8А представлены данные о СЭ34-положительных клетках-предшественниках костномозгового происхождения А*02-положительных доноров (СЭ34-01, -02), которые не были распознаны активированными Ш^-специфическими Т-клетками, которые были рестимулированы ^42 в присутствии ИЛ-2 ш νίίτο в течение 7 дней. Костно-мозговые клетки (КМ-01, -02) А*02-положительных доноров также не были распознаны этими Т-клеточными клонами.

На фиг. 7 представлены эксперименты по блокировке антител для дальнейшей характеристики специфичности Т-клеточных ответов. До экспериментов с хромом-51 при постоянном соотношении Э/М 40:1 блокирующие моноклональные антитела инкубировались с человеческой В-лимфобластоидной клеточной линией ^-9 при концентрациях моноклональных антител, как указано производителем. Эксперименты по блокировке показывают, что распознавание ШК^ опосредуется клетками, несущими Тклеточные рецепторы (ТКР), распознающими их мишень в контексте МНС класса I (НЬА класса I), при механизме взаимодействия, зависимым от корецептора СЭ8, но не СЭ4.

- 26 013598

Контрольные моноклональные антитела, специфические для нерелевантных, муциноподобных белков клеточной поверхности МАМ-6 (синонимы: СА 15-3, ΌΡ3) и НМРО-1, не воздействуют на распознавание клеток ГМ-9 эффекторными Т-клетками. Физиологический раствор с фосфатным буфером использовался в этих экспериментах по блокировке в качестве негативного контроля. Итак, эти две серии экспериментов подтверждают, что:

1) ГЬВ2 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (7/7) протестированных А*02положительных пациентов с ОМЛ;

2) 02 рестриктирован по НЬА-А*02;

3) Ю2-специфические Т-клетки распознают естественно процессированные ШВ2 на опухолевых клетках, тогда как, в то же самое время, пептид ΣΕΚ.2, по-видимому, отсутствует на костно-мозговых и положительных ί.Ό34 клетках-предшественниках;

4) взаимодействие между мишенями и эффекторными клетками может быть специфически ингибировано моноклональными антителами против МНС класса I, ТКР или СЭ8.

Мишень: ХЛЛ.

Т-клетки, специфические для ^42, рестриктированного по НЕА-А*02, были протестированы на опухолевых клетках пациентов с ХЛЛ (8 пациентов; пробы ХЛЛ-01, -02, -03, -04, -05, -06, -07, -08). Клетки А*02-положительных пациентов (4/8) были распознаны во всех случаях (4/4). Клетки А*02отрицательных пациентов не были распознаны ни в одном случае (фиг. 9А). Эксперимент был повторен (фиг. 9В) с 5 другими пациентами с ХЛЛ, из которых 3/5 были А*02-положительными. Клетки ХЛЛ А*02-положительных пациентов были распознаны 3/3, тогда как в случае А*02-отрицательных клетокмишеней были распознаны 0/2, эти дополнительные эксперименты подтвердили приведенные ранее результаты.

Заключение и итоги:

1) Ю2 является опухолеассоциированным антигеном у 100% (7/7) проверенных А*02положительных пациентов с ХЛЛ;

2) ШВ2 рестриктирован по НЬА-А*02.

Мишень: Т2.

Клетки Т2 дефектны для экспрессии ТАР, «транспортера, связанного с процессингом антигена», который отвечает за перемещение коротких пептидов из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум (ЕВ), где пептиды грузятся на пустые молекулы МНС класса I. Вследствие чего, молекулы МНС класса I клеток Т2 остаются пустыми, если не были внесены пептиды (внешняя «загрузка»). Таким образом, клетки Т2, экспрессирующие пустые молекулы НЬА-А*02 на поверхности клеток, являются оптимальными мишенями для образования кривых титрования с целью пептидно-специфического уничтожения Тклетками, рестриктированными по НЬА-А*02. В этом эксперименте были протестированы Т-клетки, специфические для ЕЕВ2, на клетках Т2 с хорошо описанным Т-клеточным эпитопом ВИЧ, введенным импульсным методом, либо ВВ2 пептидом Λ^СNТ^8Р^. Результаты: Т-клетки распознавали только клетки Т2 с пептидом ЕЕВ2, введенным импульсным методом. Клетки Т2 с введенным импульсным методом пептидом ВИЧ распознаны не были. Мишени Т2 с введенным импульсным методом пептидом ΣΕΒ2 лизировались по дозозависимой модели. Лизис не достиг насыщения в спектре концентраций эксперимента (фиг. 10А).

Мишень: Т2+ШВ2.

Производилось ингибирование немечеными клетками-мишенями, как описывается под заголовком «Т2+ШВ1» выше. Результаты этого эксперимента подтверждают, что ни иррелевантные для ЕЕВ2специфических ЦТЛ (сурвивин и ШВ1) пептиды, ни незагруженные клетки Т2, которые проявляют пустые молекулы НЬА-А*02 на своей клеточной поверхности, не конкурируют в лизисе мишеней, загруженных пептидом ШВ2 в случае I^Β2-специфических ЦТЛ. Напротив, когда в качестве вторичных (немеченых) мишеней используются мишени с введенным импульсным методом синтетическим пептидом ЕЕВ2, или опухолевые клетки ОМЛ, естественным образом проявляющие ШВ2 в контексте НЕА-А*02, то они конкурируют с первичными клетками-мишенями («горячие» Т2 с введенным импульсным методом пептидом I^Β2) в лизисе I^Β2-специфических ЦТЛ (фиг. 10В).

Итак, оба изобретенных пептида из ШВ являются кандидатами для разработки основанных на пептидах лечебных вакцин для раковых пациентов в целом.

- 27 013598

Перечень последовательностей <110> Имматикс Биотехнологиз ГмбХ <120> Идентификация представленных НБА-А2 Т-клеточных эпитопов, полученных из раково-эмбрионального антиген-незрелого рецепторного

	белка ламинина и их применение
<130>	130506РСТ
<160>	17
<170>	РарепСТп νθΓβϊοη 3.3
<210>	1
<211>	10
<212>	РЕТ
<213>	Ното зархепз
<400>	1
Ьеи Ьеи А1а А1а Агд А1а Не Уа1 А1а 11е
1	5 10
<210>	2
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното зараепз
<400>	2
А1а Ьеи Суз Азп ТЬг Азр 8ег Рго Ьеи
1	5
<210>	3
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното зартепз
<400>	3
С1у 11е Ьеи С1у Рке Уа1 РЬе ТЬг Ьеи
1	5
<210>	4
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното зараепз
<400>	4
11е Ьеи Ьуз О1и Рго Уа1 Ηίε (31у Уа1

5 <210> 5 <211> 9 <212> РЕТ

- 28 013598 <213> Ното зараепз <400> 5

Ьеи туг Ьеи ьуз Азп Туг Агд	Не А1а
1	5
<210>	6
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зар!епз
<400>	6
Ьеи А1а А1а Агд А1а Не Уа1	А1а Не
1	5
<210>	7
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зар±епз
<400>	7
Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Агд А1а	Не Уа1
1	5
с210>	8
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зар!епз
<400>	8
Уа1 Ьеи С1п Меб Ьуз С31и <31и	Азр Уа1
1	5
<210>	9
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	9
Азп Ьеи Ьуз Агд ТЬг Тгр С1и	Ьуз Ьеи
1	5
<210>	10
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зархепз
<400>	10
Уа1 А1а	ι Не <31 и Азп Рго А1а	Азр Уа1

5

- 29 013598

<210> <211> <212> <213>	11 9 РЕТ Ното зархепз
<400>	11

Туг Уа1 Азп Ьеи Рго Ткг	11е А1а Ьеи
1	5
<210>	12
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	12
Мек Ьеи А1а	Агд (31 и	Уа1	Ьеи	Агд	Мек
1		5
<210>	13
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	13
Зег С1и 61у	¥а1 (31п	Уа1	Рго	Зег	Уа1
1		5
<210>	14
<211>	9
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	14
Рке Ьеи А1а	А1а С1у	Ткг	ΗΪ3	ьеи	Я1у
1		5
<210>	15
<211>	10
<212>	РЕТ
<213>	Ното	гаргепг
<400>	15
Ьуз Ьеи Ьеи	Ьеи А1а	А1а	Агд	А1а	11е
1		5
с210>	16
<211>	10
<212>	РЕТ
<213>	Ното	гархепз
<400>	16
А1а Не 01 и	Азп Рго	А1а	Азр	Уа1	Зег
1		5
<210>	17
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	17
Ьеи Мек Тгр	Тгр Мек	Ьеи	А1а	Агд	(31и

10

Claims (31)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Опухолеассоциированный пептид, который выбран из группы пептидов, имеющих по меньшей мере одну последовательность в соответствии с любой из 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 2 либо их вариант, при условии, что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом.
2. 2. Опухолеассоциированный пептид по п.1, где указанный пептид обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.
3. 3. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1, 2, имеющий аминокислотные последовательности в соответствии с любой из 8Е0 ГО N0: 1 или 8Е0 ГО N0: 2.
4. 4. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-3, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I, в особенности с НЬАА*0201.
5. 5. Опухолеассоциированный пептид по п.4, в случае, когда он связан с НЬА-А*0201, пептидная связь способна вызывать продуцирование цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), которые распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий данную аминокислотную последовательность.
6. 6. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-4, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II, в особенности с НЬА-ЭВВЕ
7. 7. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-6, где пептид включает непептидные связи.
8. 8. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-7, где пептид является слитым белком.
9. 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-8.
10. 10. Нуклеиновая кислота по п.9, которая является ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями.
11. 11. Вектор экспрессии, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10.
12. 12. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11.
13. 13. Способ получения опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-8, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.12 и выделение пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды.
14. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. 16. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-8 в медицине.
17. 17. Применение нуклеиновой кислоты по п.9 или 10 или вектора экспрессии по п.11 в медицине.
18. 18. Вакцина против рака, включающая опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-8.
19. 19. Вакцина против рака, включающая нуклеиновую кислоту п.9 или 10 или вектор экспрессии по п.11.
20. 20. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-8 для получения медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, экспрессирующих полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в пп.1-8.
21. 21. Применение вектора экспрессии по п.11 для получения медикамента для уничтожения клетокмишеней у пациента, экспрессирующих полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в пп.1-8.
22. 22. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ш У1!го, предусматривающий контактирование ЦТЛ ш νίΙΐΌ с нагруженными антигеном молекулами человека МНС класса I или II, экспрессированными на поверхности подходящей антиген-презентирующей клетки в течение периода времени, достаточного для активации антиген-специфическим образом указанных ЦТЛ, где антиген является пептидом по любому из пп.1-8.
23. 23. Способ по п.22, где антиген нагружен на молекулы МНС класса I или II, экспрессированные на поверхности подходящей антиген-презентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антиген-презентирующей клеткой.
24. 24. Способ по п.22, где антиген-презентирующая клетка включает вектор экспрессии по п.11.
25. 25. Способ в соответствии с любым из пп.22-24, где молекула МНС класса I является НЕА-А*0201.
26. 26. Способ по любому по пп.22-24, где молекула МНС класса II является НЬАГОВВ1.
27. 27. Активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), полученные с помощью способа по пп.22-26, которые селективно распознают клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из пп.1-8.
28. 28. Т-клеточный рецептор (ТКР), который распознает клетку, которая экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из пп.1-8, получаемый из цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) по п.27, или молекула, функционально эквивалентная ТКР.

    - 31 013598
29. 29. Нуклеиновая кислота, кодирующая Т-клеточный рецептор (ТКР) по п.28.
30. 30. Вектор экспрессии, способный экспрессировать Т-клеточный рецептор (ТКР), кодируемый нуклеиновой кислотой по п.29.
31. 31. Применение цитотоксических Т-лимфоцитов по п.27 для получения медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, которые экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любом из пп.1-8.