BRPI0610841A2

BRPI0610841A2 - identificação de epìtopos de célula t apresentados por hla-a2, derivados da proteìna receptora de laminina imatura do antigênio oncofetal e utilizações das mesmas

Info

Publication number: BRPI0610841A2
Application number: BRPI0610841-5A
Authority: BR
Inventors: Matthias Zeis
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2010-07-27
Also published as: NZ563432A; WO2006114307A1; NO20076041L; JP2008538901A; ATE512160T1; CN101166759A; CN101166759B; AU2006239505A1; CA2606088A1; EP1874810A1; ES2367643T3; EA200702202A1; EP1717245A1; US20090041794A1; EP1717245B1; JP4870751B2; UA97092C2; AU2006239505B2; US7968097B2; EA013598B1

Abstract

IDENTIFICAçãO DE EPìTOPOS DE CéLULA T APRESENTADOS POR HLA-A2, DERIVADOS DA PROTEìNA RECEPTORA DE LAMININA IMATURA DO ANTIGêNIO ONCOFETAL E UTILIZAçOES DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a métodos imunoterápicOs e moléculas e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer, em especial a várias entidades tumorais, inclusive doenças hematológicas malignas. A presente invenção refere-se também a epitopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptideos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor. Em particular, a presente invenção refere-se a duas novas sequências peptídicas derivadas de moléculas HLA de classe I ou II do receptor de laminina imatura do antigênio oncofetal (OFA/iLR) utilizáveis em composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumor.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IDENTIFICA-ÇÃO DE EPÍTOPOS DE CÉLULA T APRESENTADOS POR HLA-A2, DE-RIVADOS DA PROTEÍNA RECEPTORA DE LAMININA IMATURA DO AN-TIGÊNIO ONCOFETAL E UTILIZAÇÕES DAS MESMAS".

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos imunoterápicos e mo-léculas e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particular,a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer, em especial a vá-rias entidades tumorais, inclusive doenças hematológicas malignas. A pre-sente invenção refere-se também a epitopos peptídicos de célula T auxiliarassociados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptí-deos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativosem composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor.

Em particular, a presente invenção refere-se a duas novas seqüências pep-tídicas derivadas de moléculas HLA de classe I ou II do receptor de lamininaimatura do antigênio oncofetal (OFA/iLR) utilizáveis em vacinas ou outrascomposições farmacêuticas para provocar respostas imunes antitumor.

Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui ci-tadas passam a fazer parte integral deste documento por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A estimulação de uma resposta imune depende da presença deantigênios reconhecidos como estranhos pelo sistema imunitário do hospe-deiro. A descoberta da existência de antigênios associados a tumores abriua possibilidade de utilizar o sistema imunitário para intervir no crescimentodo tumor. Vários mecanismos de aproveitamento das armas humorais e ce-lulares do sistema imunitário estão sendo exploradas na atualidade na imu-noterapia do câncer.

Elementos específicos da resposta imune celular são capazesde especificamente distinguir e destruir células tumorais. O isolamento decélulas T citotoxicas (CTL) a partir de populações celulares que se infiltramno tumor ou a partir do sangue periférico sugere que estas células desem-penham um papel importante nas defesas imunes naturais contra o câncer(Cheever et al., Annals NY Acad Sei 1993 690:101-112; Rosenberg SAShedding light on immunotherapy for câncer. N Engl J Med. 2004 Apr1;350(14):1461-3.). As células T CD8+ (TCD8+) em particular, que reconhe-cem as moléculas de classe I dos peptídeos do Complexo Maior de Histo-compatibilidade (MHC), formados por de 8 a 10 resíduos derivados das pro-teínas localizadas no núcleo ou no citosol ou, ainda, de proteínas ribosso-mais defeituosas (DRIPs), desempenham um papel importante nessa res-posta. As DRIPs constituem uma fonte essencial de peptídeos e são produ-tos da translação incompleta nos ribossomos, tendo sido descritas por pri-meira vez pelo grupo de J. Yewdell's (Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Nor-bury CC, Yewdell JW, Bennink JR. Rapid degradation of a large fraction ofnewly synthesized proteins by proteasomes. Nature. 2000 Apr 13;404(6779):770-4). As moléculas MHC dos seres humanos também são denominadasantigênios de leucócitos humanos (HLA).

Existem duas grandes classes de moléculas MHC que podemser reconhecidas por células T com receptores de células T: as moléculasMHC-I, encontrada na maioria das células que têm núcleo e apresentampeptídeos resultantes de clivagem proteolítica de proteínas endógenas epeptídeos maiores. Moléculas MHC-II podem ser encontradas nas célulasapresentadoras de antigênio profissionais (APC), tais como os macrófagos,células dendríticas, nas células B, nas células endoteliais e nas células alte-radas de tumores e no estroma tumoral que, em condições normais, nãoexpressam moléculas MHC de classe II nas suas superfícies celular e apre-sentam peptídeos derivados de proteínas exógenas que são absorvidas pe-Ias APCs durante o curso da endocitose ou, de outra maneira entram nocompartimento das MHC de classe II (MHC) e são subseqüentemente pro-cessadas e carregadas para os complexos de MHC de classe II. Complexosde peptídeos e MHC-I são reconhecidos pelos linfócitos T citotóxicos CD8+-positivos, complexos de peptídeos e MHC-II são reconhecidos pelas célulasT auxiliares CD4+ (descritas em termos gerais na obra Immunobiology, deCharles A., Jr. Janeway, Paul Travers, Mark Walport, Mark J. Shlomchik).

Para que um peptídeo provoque (elicite) uma resposta imunitáriacelular, é preciso que ele se ligue a uma molécula MHC. Este processo édependente dos alelos das moléculas MHC e dos polimorfismos específicosda seqüência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos que se ligam àsMHC de classe I têm normalmente de 8 a 10 resíduos de comprimento econtêm na sua seqüência dois resíduos conservados ("âncora") que intera-gem com a fenda de ligação da molécula MHC (vide a segunda listagem pu-blicada em Immunogenetics (Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP,Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and pepti-de motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4): 213-9).

Já existem numerosos exemplos de TCD8+ de camundongo e deseres humanos que reconhecem especificamente as células tumorais e têmatividade terapêutica após a transferência adotiva, induzindo a remissãocompleta em alguns casos. No entanto, apesar do potencial das células Tpara erradicar tumores, é óbvio, face ao crescimento progressivo da maioriados cânceres, que muitos tumores conseguem escapar do reconhecimentopelos TCD8+ in vivo. Embora se tenha descoberto que uma quantidade detumores são imunogênicos, tem sido difícil de demonstrar a estimulação deuma resposta imunitária antitumor efetiva: os dados mais recentes mostramque as imunizações podem induzir fortes respostas das células T contra ospeptídeos associados ao tumor (Speiser DE, Lienard D, Rufer N, Rubio-Godoy V, Rimoldi D, Lejeune F, Krieg AM, Cerottini JC, Romero P. Rapidand strong human CD8+ T cell responses to vaccination with peptide, IFA,and CpG oligodeoxynucleotide 7909. J Clin Invest. 2005 Mar;115(3):739-46.Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Gru-nebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P. Identification of C-metoncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen recognized bycytotoxic T-lymphocytes. Clin Câncer Res. 2004 Jun 1;'10(11):3658-66.).

Os antigênios que são reconhecidos pelos linfócitos T citotóxicosespecíficos do tumor, ou seja, os seus epitopos, podem ser moléculas deri-vadas de todas as classes de proteínas, entre elas as enzimas, os recepto-res, os fatores de transcrição, etc. Uma lista completa dos peptídeos que seligam às moléculas MHC de classe I ou classe II ou são eluídos delas podeser consultada em www.syfpeithi.org. Além disso, os antigênios associadosa tumores, por exemplo, também podem estar presentes apenas nas célulastumorais, por exemplo, sob a forma de produtos de genes mutados. Sãobons exemplos disso os ligantes MHC de classe I, que funcionam como epi-topos de célula T, derivados de K-ras, BCR-abl e p53 mutado. Outra impor-tante classe de antigênios associados a tumores são as estruturas de teci-dos específicos, tais como os antigênios CT (câncer do testículo), os quaissão expressos em diferentes tipos de tumores e no tecido saudável dos tes-tículos. Outros peptídeos associados a tumores que se ligam às moléculasMHC são derivados de genes que são expressos em número de cópias maiselevados nas células do câncer, em comparação com células saudáveis domesmo órgão ou tecido, bem como em comparação com células saudáveisde outros tecidos. A respeito de c-met como exemplo, vide Schag K, SchmidtSM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevano-vic S, Rammensee HG, Brossart P. Identification of C-met oncogene as abroadly expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Clin Câncer Res. 2004 Jun 1;10(11):3658-66. Outros peptídeosassociados a tumores são derivados de antigênios retidos nas células tumo-rais, isto é, não secretados (por exemplo, as proteínas derivadas da famíliade genes da mucina). Outras fontes podem ser os transcritos aberrantes (de-fasagem), peptídeos derivados dos sítios de ligação das fusões pós-translacionais proteína-proteína. Uma lista completa dos antigênios associa-dos a tumores descritos na literatura científica se encontra em www.cance-rimmunity.org.

Vários antigênios associados a tumores foram identificados. A-lém disso, têm-se feito grandes esforços de investigação para identificarmais antigênios associados a tumores. Alguns grupos de antigênios associ-ados a tumores são específicos do tecido e, no estado da técnica, são tam-bém denominados antigênios específicos do tumor. Os exemplos incluem,mas não se limitam à tirosinase no melanoma, ao PSA e PSMA no câncerda próstata e a translocações cromossomicas como, por exemplo, bcr/abl nolinfoma. No entanto, muitos dos antigênios associados a tumores identifica-dos ocorrem em múltiplos tipos de tumores, e alguns deles, como as proteí-nas oncogênicas e/ou os genes supressores de tumores (uma revisão dosgenes supressores de tumores é dada, por exemplo, para o câncer do rim,em Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of câncer of thekidney. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72), que são os verdadeiros cau-sadores do evento de transformação, ocorrem em quase todos os tipos detumores. Uma revisão mais geral das causas genéticas do câncer em sereshumanos encontra-se em The Genetic Basis of Human Câncer, de Bert Vo-gelstein, Kenneth W. Kinzler, 2002). Por exemplo, as proteínas celularesnormais que controlam o crescimento e a diferenciação celular, tais comop53 (que é um exemplo de gene supressor de tumores), ras, c-met, myc,pRB, VHL, e HER-2/neu, podem acumular mutações que resultam na regu-lação da expressão destes produtos genéticos, tornando-os oncogênicos(McCartey et al. Câncer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. CibaFound. Symp. 1994 187:198-211). Estas proteínas mutantes podem ser oalvo de uma resposta imune específica do tumor em múltiplos tipos de cân-cer.

A proteína receptora de laminina imatura do antigênio oncofetal(OFA/iLRP) é expressa amplamente em muitos tipos de tumores humanos,inclusive nas hemopatias malignas (Rohrer JW, Barsoum AL, Coggin JH Jr.The development of a new universal tumor rejection antigen expressed onhuman and rodent cancers for vaccination, prevention of câncer, and anti-tumor therapy. Mod Asp Immunobiol. 2001; 5: 191-195. Barsoum AL, RohrerJW, Coggin JH. 37kDa oncofoetal antigen is an autoimmunogenic homolo-gue of the 37kDa laminin receptor precursor. Cell Mol Biol Lett. 2000; 19:5535-5542. Castronovo V. Laminin receptors and laminin-binding proteinsduring tumor invasion and metastasis. Invasion Metas. 1993; 13: 1-30. Cog-gin JH Jr, Barsoum, AL, Rohrer JW. Tumors express both unique TSTA andcrossprotetive 44 kDa oncofetal antigen. Immunol Today. 1998; 19, 405-408.Coggin JH Jr, Barsoum AL, Rohrer JW. 37 kilo Dalton oncofetal antigen pro-tein and immature laminin receptor protein are identical, universal T-cell in-ducing immunogens on primary rodent and human cancers. Anticancer Res.1999; 19, 5535-5542), mas não está presente em tecidos adultos normaisdiferenciados. A OFA-iLRP pode ser reconhecida especificamente tanto pe-los linfócitos T como pelos linfócitos B, que fazem dela uma molécula alvoatraente para estratégias de vacinação em várias entidades de câncer. Coma utilização de células dendríticas (DC) transfectadas com RNA codificanteda OFA-iLR, foi possível gerar respostas de células T específicas do tumorcontra células alvo hematopoiéticas, tanto in vitro como in vivo (Siegel S,Wagner A, Kabelitz D et al. Coggin, J.Jr., Barsoum, A., Rohrer, J., Schmitz,N., Zeis, M. Induction of cytotoxic T cell responses against the oncofoetalantigen-immature laminin receptor for the treatment of hematological malig-nancies. Blood 2003; 102, 4416-4423.).

O documento US 6.753.314 descreve um complexo de proteínapurificada que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipep-tídeo, complexo este que compreende as seqüências de aminoácidos de umprimeiro polipeptídeo (SMI1, SEQ ID NO: 359, número identificador da se-qüência), e um segundo polipeptídeo (BAS1, SEQ ID NO: 518), denotadocomo ProPair 267a-267b.

A patente US 4.861.710 revela um clone compreendendo umclone de cDNA recombinante para codificar um receptor de superfície celularpara laminina, assim como para as respectivas sondas.

Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos T cito-tóxicos como antigenio específico do tumor, e para que sejam usadas emterapia, é preciso atender a determinados pré-requisitos. O antigenio deveser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidos saudá-veis normais ou preferivelmente em quantidades pequenas. Além disso, édesejável que o antigenio respectivo não esteja presente em apenas um tipode tumor, mas também em altas concentrações (por exemplo, número decópias por célula). É essencial a presença de epitopos na seqüência de ami-noácidos do antigenio, uma vez que este peptídeo ("peptídeo imunogênico"),derivado de um antigenio associado ao tumor, deve induzir uma resposta decélula T in vitro ou in vivo.

Até hoje têm sido descritas numerosas estratégias para introdu-zir antigênios na via de processamento de classe II. É possível incubar célu-las apresentadoras de antigênios (APCs) com o antigênio em questão paraque seja assumido e processado (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V.,Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & vander, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Outras estratégias usam prote-ínas de fusão com seqüências alvo lisossomais. Expressas em APCs, essasproteínas de fusão direcionam os antigênios para dentro do compartimentode processamento de classe II (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar,E., Woodruff, L, Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131,351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. &Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430). Também têm sido desenvol-vidas formulações lipossomais especiais para a libertação de peptídeos e deoutros ingredientes farmacêuticos ativos em pAPC (Walter S, Herrgen L, S-choor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S.Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on cali-'brated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15; 171(10): 4974-8.) Outro excelente método é o carregamento externo das molé-culas MHC de pAPC in vitro ou in vivo. Neste carregamento, as APCs sãoincubadas com um excesso de peptídeos nos meios de cultura de células,induzindo uma competição pela ligação às moléculas MHC na superfície daAPC.

As células T auxiliares desempenham um importante papel naorquestração da função efetora das CTLs na imunidade antitumoral. Os epi-topos das células T auxiliares que disparam uma resposta das células T au-xiliares do tipo Th1 apoiam as funções efetoras das células T assassinasCD8+, que incluem funções citotóxicas dirigidas contra as células tumoraisque apresentam complexos peptídeos/MHC associados ao tumor nas super-fícies celulares. Desta forma, os epitopos peptídicos de célula T auxiliar as-sociados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptídeosassociados a tumores, podem servir como ingredientes farmacêuticos ativosem composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor.

O principal objetivo no desenvolvimento de uma vacina antitumo-ral é, portanto, a identificação e caracterização de novos antigênios associa-dos a tumores e epitopos T auxiliares imunogênicos derivados desses novosantigênios, que possam ser reconhecidos por CTLs CD4+. Por isso, é objeti-vo da presente invenção disponibilizar novas seqüências de aminoácido pa-ra tais peptídeos que possam se ligar a moléculas de classe I do complexomaior de histocompatibilidade humana (MHC) e provocar respostas das cé-lulas T contra as células portadoras de peptídeos em conjunção com molé-culas MHC nas suas superfícies celulares.

De acordo com a presente invenção, este objetivo é alcançadoao apresentar um peptídeo associado a tumor, peptídeo este selecionadodentre o grupo dos pepetídeos que compreendem pelo menos uma seqüên-cia de acordo com qualquer uma das seqüências com o número de identifi-cação SEQ ID No 1 ou SEQ ID No 2 da listagem de seqüências anexa, ten-do o peptídeo a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo maiorde histocompatibilidade humano (MHC) de classe I, compreendendo, massem se limitar à alela HLA expressa com maior freqüência nas populaçõescaucasianas, HLA-A2 (inclusive subtipos de HLA-A2, tais como HLA-A*0201).

A presente invenção refere-se, além disso, a duas novas se-qüências peptídicas derivadas de moléculas HLA de classe I da proteínareceptora de laminina imatura do antigênio oncofetal, utilizáveis em compo-sições de vacinas para provocar respostas imunitárias antitumor. As novasseqüências peptídicas foram identificadas graças a uma nova abordagemcombinada e aplicável a todas as seqüências para a identificação de ligantesdesconhecidos de HLA de classe I, processados naturalmente, de determi-nados antigênios, por exemplo, antigênios associados a tumores. Assim, osinventores identificaram dois epitopos de célula T distintos, específicos paraHLA-A*0201, derivados da proteína OFA/iLR, capazes de induzir reatividadeespecífica das células T contra as células tumorais humanas, incluindo asvárias doenças hematológicas malignas, mas sem se limitar a estas.

Um primeiro aspecto da invenção apresenta um peptídeo, com-preendendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com qualquer dasSEQ ID No 1 ou SEQ ID No 2, ou uma variante delas, desde que o peptídeonão seja o polipeptídeo humano intacto do qual a seqüência de aminoácidoé derivada (isto é, a proteína receptora de laminina imatura do antigênio on-cofetal (OFA/iLRP); para o número de acesso, vide tabela 1, anexada abaixo).

Tal como descritos abaixo, os peptídeos que formam a base dapresente invenção foram, ambos, identificados como sendo apresentadospelo MHC de classe I portador de células. Assim, estes peptídeos específi-cos, bem como outros peptídeos contendo a seqüência (isto é, peptídeosderivados) com toda probabilidade provocarão, ambos, uma resposta espe-cífica de célula T, embora o grau de indução da resposta poderá variar depeptídeo para peptídeo. As diferenças, por exemplo, poderiam ser causadaspor mutações nos referidos peptídeos (vide abaixo). O profissional versadona técnica conhece bem os métodos passíveis de serem aplicados para de-terminar o grau de indução de uma resposta pelo peptídeo individual, emparticular com referência aos exemplos aqui contidos e à respectiva literatura.

De preferência, um peptídeo de acordo com a presente invençãoconsiste essencialmente em uma seqüência de aminoácidos de acordo tantocom a SEQ ID No 1 ou a SEQ ID No 2 ou uma variante delas.

A expressão "consiste essencialmente" significa que um peptí-deo de acordo com a presente invenção, em combinação com a seqüênciade acordo com a SEQ ID No 1 ou a SEQ ID No 2 ou uma variante delas,contém alongamentos complementares de aminoácidos localizados no ter-minai N e/ou no terminal C, que não estão necessariamente a formar partedo peptídeo que funciona como a seqüência principal do peptídeo compre-endendo o motivo de ligação e como epitopo auxiliar T imunogêníco. No en-tanto, esses alongamentos podem ser importantes para proporcionar umaintrodução eficiente do peptídeo de acordo com a presente invenção nascélulas.

Pelo termo "variante" da seqüência de aminoácidos em questãoos inventores querem dizer que as cadeias laterais de, por exemplo, um oudois dos resíduos de aminoacidos, estão alteradas (por exemplo, ao substi-tuí-las pela cadeia lateral de outro resíduo de aminoácido ou por outra ca-deia lateral) de tal forma que o peptídeo ainda seja capaz de se ligar a umamolécula HLA de modo substancialmente igual ao peptídeo formado pelaseqüência de aminoacidos em questão. Por exemplo, um peptídeo pode sermodificado de modo a pelo menos manter, se não melhorar a sua capacida-de de interagir e ligar-se a uma molécula MHC apropriada, como HLA-A, ede tal modo que pelo menos mantenha, se não melhore a capacidade degerar CTLs ativados que possam reconhecer e eliminar as células que ex-pressem um polipeptídeo que contenha uma seqüência de aminoacidos co-mo a definida nos aspectos da invenção. Como se pode deduzir da base dedados descrita a seguir, certas posições de peptídeos que se ligam a HLA-Asão tipicamente resíduos âncora que formam uma seqüência núcleo que seencaixa no motivo de ligação do sulco de ligação do HLA.

Estes resíduos de aminoacidos que não são essenciais para in-teragir com o receptor de células T, podem ser modificados mediante substi-tuição por outro aminoácido cuja incorporação não gere substancialmentereatividade de célula T e não elimine a ligação ao MHC relevante. Assim,pondo de parte a reserva acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquerpeptídeo (termo este em que os inventores incluem oligopeptídeos ou poli-peptídeos) que comporte as seqüências de aminoacidos, uma parte ou umavariante delas, conforme indicado.

É sabido que os peptídeos apresentados por MHC de classe IIsão compostos por uma "seqüência núcleo" que tem um determinado motivoaminoacídico específico para o HLA e, opcionalmente, extensões de terminalN e/ou C que não interfiram na função da seqüência núcleo (isto é, que se-jam considerados irrelevantes para a interação do peptídeo e da célula T).

As extensões de terminal N e/ou C podem ter entre 1 e 10 aminoacidos decomprimento respectivamente. Assim, um peptídeo preferido apresentadopor MHC de classe II in vivo de acordo com a presente invenção exibe umcomprimento total entre 9 e 30 aminoacidos. Esses peptídeos podem serusados tanto diretamente para carregar moléculas MHC de classe II como aseqüência pode ser clonada dentro dos vetores de acordo com a descriçãodada mais adiante. Como esses peptídeos formam o produto final do pro-cessamento de peptídeos maiores dentro da célula, também é possível utili-zar peptídeos mais longos. Os peptídeos da invenção podem ser de qual-quer tamanho, mas tipicamente podem ser de menos de 100.000 em pesomolecular, de preferência menos de 50.000, com maior preferência menosde 10.000 e, tipicamente, cerca de 5.000. Em termos do número de resíduosaminoacídicos, os peptídeos da invenção podem ter menos de 1000 resí-duos, preferentemente menos de 500 resíduos, e com maior preferênciamenos de 100 resíduos.

Em um outro aspecto da presente invenção, similar à situaçãoexplicada acima a respeito das moléculas MHC de classe II, os peptídeos dapresente invenção (embora relacionados principalmente com MHC de classe I),podem ser utilizados para provocar uma resposta específica de MHC declasse II, já que ILR1 e ILR2 podem apresentar seqüências simultâneas denúcleo ou parciais de moléculas HLA de classe II (que combinam com alelasde HLA de classe II, conforme demonstrado nas tabelas abaixo). Conformeexposto acima, as extensões de terminal N e/ou C podem ter comprimentoentre 1 e 10 aminoácidos respectivamente. Assim, um peptídeo preferido dapresente invenção exibe um comprimento total entre 9 e 30 aminoácidos.Esses peptídeos podem ser usados tanto diretamente para carregar molécu-las MHC de classe II como a seqüência pode ser clonada dentro dos vetoresde acordo com a descrição dada mais adiante. Como esses peptídeos for-mam o produto final do processamento de peptídeos maiores dentro da célu-la, também é possível utilizar peptídeos mais longos. Os peptídeos destavariante da invenção podem ser de qualquer tamanho, mas tipicamente po-de ser de menos de 100.000 em peso molecular, de preferência menos de50.000, com maior preferência menos de 10.000 e, tipicamente, cerca de5.000. Em termos do número de resíduos aminoacídicos, os peptídeos dainvenção podem ter menos de 1000 resíduos, preferentemente menos de500 resíduos, e com maior preferência menos de 100 resíduos.Tabela A: "Seqüências núcleo" ILR1 com determinado motivoaminoacídico específico de HLA para moléculas HLA de classe II. Os ami-noácidos correspondentes são exibidos em itálico. Os prognósticos foramelaborados com os programas de computador PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) e SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de).

HLA-DRB1*0101 15-mers

<table>table see original document page 13</column></row><table>Tabela B: "Seqüências núcleo" ILR2 com determinado motivoaminoacídico específico de HLA para moléculas HLA de classe II. Os ami-noácidos correspondentes são exibidos em itálico. Os prognósticos foramelaborados com os programas de computador PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) e SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de).

<table>table see original document page 14</column></row><table>

A se utilizar diretamente um peptídeo maior do que cerca de 12resíduos de aminoácidos para ligar-se a uma molécula MHC, é preferívelque os resíduos que flanqueiam a região de ligação do HLA núcleo sejam dotipo que não afetem substancialmente a capacidade do peptídeo de se ligarespecificamente ao sulco de ligação da molécula MHC ou de apresentar opeptídeo para o CTL. Contudo, como já se indicou acima, perceber-se-á quecontagemé possível utilizar peptídeos maiores, especialmente quando codificados porum polinucleotídeo, já que estes peptídeos maiores podem ser fragmentadospor células apresentadoras de antigênios adequadas.

Com o termo "peptídeo" os inventores abarcam não apenas asmoléculas nas quais os resíduos de aminoacidos são juntados por ligaçõespeptídicas (-CO-NH-), mas também as moléculas em que a união peptídicaestá invertida. É possível produzir estes peptidomiméticos retroinversos utili-zando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, os métodosdescritos em Meziere et al (1997) J. Immunol. 159,3230-3237, incorporado aeste documento por referência. Esta abordagem implica fazer pseudopeptí-deos contendo alterações relacionadas com a cadeia principal e não com aorientação das cadeias laterais. Meziere et al (1997) mostram que, pelo me-nos no que refere-se às respostas de célula T auxiliar e MHC de classe II,esses pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeos retroinversos contendo liga-ções NH-CO ao invés de ligações peptídicas CO-NH são muito mais resis-tente à proteólise.

Tipicamente, o peptídeo da invenção é de tal natureza que,quando expresso em uma célula apresentadora de antigênio, pode ser pro-cessado de modo a produzir um fragmento que seja capaz de ligar-se a umamolécula MHC apropriada e pode ser apresentado por uma célula adequadae provocar uma resposta de célula T apropriada. Perceber-se-á que umfragmento produzido a partir do peptídeo pode também ser um peptídeo dainvenção. Convenientemente, o peptídeo da invenção contém uma fraçãoque inclui a seqüência de aminoacidos dada ou uma parte ou variante destae uma porção adicional que confira alguma propriedade desejável. Por e-xemplo, a porção adicional pode incluir outro epitopo de célula T (quer sejaou não derivado do mesmo polipeptídeo da primeira porção que contém oepitopo de célula T) ou uma proteína veículo ou peptídeo. Assim, em umavariante da invenção o peptídeo é uma proteína humana truncada ou umaproteína de fusão ou um fragmento de proteína ou outra parte polipeptídica,desde que a parte humana inclua uma ou mais seqüências de aminoacidosconforme a invenção.Em uma variante particularmente preferida, o peptídeo da inven-ção inclui a seqüência de aminoácidos da invenção e pelo menos outro epi-topo de célula T, sendo este epitopo de célula T capaz de facilitar a produ-ção de uma resposta da célula T digirida ao tipo de tumor que expresse umantigênio associado ao tumor. Assim, os peptídeos da invenção incluem po-lipeptídeos do tipo denominado "colar de contas", que também podem serusados como vacina.

Perceber-se-á pela exposição a seguir que em algumas aplica-ções os peptídeos da invenção podem ser usados diretamente (isto é, nãosão produzidos pela expressão de um polinucleotídeo na célula do pacienteou em uma célula dada a um paciente); em tais aplicações é preferível que opeptídeo tenha menos de 100 ou 50 resíduos. Um peptídeo preferido dapresente invenção exibe um comprimento total entre 9 e 30 aminoácidos.

É preferível que os peptídeos da invenção sejam capazes de seligar a HLA-A2. É particularmente preferível que os peptídeos se liguem se-letivamente a HLA-A*0201.

Com o termo "expresso de maneira anormal" os inventores a-barcam o significado de que o polipeptídeo está superexpresso em compa-ração com os níveis normais de expressão ou que o gene está silencioso notecido do qual o tumor é derivado, mas está expresso no tumor. Por "super-expresso" os inventores entendem que o polipeptídeo está presente em nívelpelo menos 1,2 x o presente no tecido normal; de preferência, pelo menos 2x e, com maior preferência, pelo menos 5 x ou 10 x o nível presente no teci-do normal.

Os peptídeos (pelo menos aqueles que contenham ligações pep-tídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizados pelo métodoFmoc-poliamida da síntese peptídica em fase sólida descrito por Lu et al(1981) J. Org. Chem. 46,3433 e as referências ali contidas. A proteção tem-porária do grupo N-amino é proporcionada pelo grupo 9-fluorenilmetilo-xicarbonila (Fmoc). A clivagem repetitiva deste grupo protetor altamente ins-tável em meio básico é efetuada utilizando 20% de piperidina em N, N-dimetilformamida. As funcionalidades da cadeia lateral podem ser protegidascomo os seus éteres butílicos (no caso de serina treonina e tirosina), ésteresbutílicos (no caso de ácido glutâmico e ácido aspártico), derivado de butiloxi-carbonila (no caso de lisina e histidina), derivado de tritila (no caso de cisteí-na) e derivado de 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonila (no caso de argi-nina). Onde a glutamina ou a asparagina forem resíduos de terminal C, utili-za-se o grupo 4,4'-dimetoxibenzidrila para proteger as funcionalidades doamido da cadeia lateral. O suporte de fase sólida está baseado em um polí-mero polidimetil-acrilamida constituído a partir dos três monômeros dimetila-crilamida (monômero da cadeia principal), bisacriloiletileno diamina (agentereticulante) e acriloilsacosina metil éster (agente funcionalizante). O agentereticulante clivável peptídeo-resina utilizado é o derivado de ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético, instável em meio ácido. Todos os derivados deaminoácido são juntados na forma dos seus derivados anidridos simétricospré-formados, exceto a asparagina e a glutamina, que são adicionadas utili-zando um procedimento de acoplamento inverso mediado através de N, N-diciclohexil-cabodiimida/lhidroxibenzotriazol. Todas as reações de acopla-mento e desproteção são monitoradas utilizando os procedimentos de testeda ninidrina, do ácido sulfônico trinitrobenzeno ou da isotina. Ao concluir asíntese, os peptídeos são clivados do suporte de resina com remoção con-comitante dos grupos protetores da cadeia lateral mediante tratamento comácido trifluoroacético a 95% contendo uma mistura de agente depurador a50%. Os seqüestrantes comumente usados são etanoditiol, fenol, anisol eágua, sendo a escolha exacta dependente dos aminoácidos constitutivos dopeptídeo que se está a sintetizar. Também é possível utilizar uma combina-ção de métodos de fase sólida e de fase de solução para a síntese de peptí-deos (vide, por exemplo Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. From produc-tion of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities fordrugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(1):29-43 e as refe-rências ali citadas).

O ácido trifluoroacético é removido por evaporação em vácuo,com subseqüente trituração com éter dietílico, produzindo o peptídeo bruto.Alternativamente, é possível utilizar uma troca de sais (TFA -> ácido acético)antes da liofilização. Todos os agentes depuradores presentes são removi-dos através de um simples procedimento de extração que, na liofilização dafase aquosa, produz o peptídeo bruto livre de depuradores. Os reagentespara a síntese peptídica são fornecidos, geralmente, pela empresa Calbio-chem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

A purificação pode ser efetuada por qualquer técnica ou combi-nação de técnicas, tais como cromatografia por exclusão de tamanho, cro-matografia de troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica e (habi-tualmente) cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa utilizandoa separação em sistema de gradiente acetronitrila/água.

A análise dos peptídeos pode ser realizada utilizando cromato-grafia de camada fina, cromatografia líquida de alta eficiência em fase rever-sa, análise de aminoácido precedida de hidrólise ácida, bem como por es-pectrometria de massa MALDI e ESI-Q-TOF.

Outro aspecto da invenção apresenta um ácido nucléico (porexemplo, um polinucleotídeo) que codifica o peptídeo da invenção. O polinu-cleotídeo pode ser DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações destes,podendo conter ou não íntrons, contanto que codifique o peptídeo. Natural-mente, apenas os peptídeos que contêm resíduos de aminoácidos de ocor-rência natural, unidos pelas ligações peptídicas também de ocorrência natu-ral, podem ser codificados por um polinucleotídeo. Ainda outro aspecto dainvenção apresenta um vetor de expressão capaz de expressar um polipep-tídeo de acordo com a invenção.

Desenvolveu-se toda uma gama de métodos para ligar funcio-nalmente os polinucleotídeos, especialmente DNA, aos vetores, por exemplovia terminais coesivos complementares. Por exemplo, é possível juntar tre-chos homopoliméricos ao segmento do DNA a ser inserido no DNA do vetor.O segmento do vetor e do DNA são, depois, unidos pelas ligações hidrogê-nio entre as caudas homopoliméricas para formar moléculas de DNA recom-binante.

Os ligantes sintéticos que contêm um ou mais sítios de restriçãooferecem um método alternativo para unir o segmento do DNA aos vetores.O segmento do DNA gerado por digestão com endonuclease de restrição,conforme descrito acima, é tratado com bacteriófago T4 DNA polimerase ouE. coli DNA polimerase I, enzimas que removem os terminais protundentesde 3 cadeias simples com as suas atividades exonucleolíticas 3'-5' e enchema extremidade 3' vazia com as suas atividades polimerizadoras.

Portanto, a combinação dessas atividades gera segmentos deDNA com a extremidade truncada. Depois, os segmentos com a extremida-de truncada são incubados com um grande excesso molar de moléculas li-gantes na presença de uma enzima capaz de catalisar a ligação de molécu-las de DNA com a extremidade truncada, tais como DNA ligase do bacterió-fago T4. Assim, os produtos da reação são segmentos de DNA que levamseqüências ligantes poliméricas nas suas extremidades. Depois, esses seg-mentos de DNA são clivados com a enzima de restrição apropriada e ligadosao vetor de expressão que foi clivado com uma enzima que produz terminaiscompatíveis com aqueles do segmento do DNA.

Ligantes sintéticos contendo uma multiplicidade de sítios de en-donucleases de restrição podem ser obtidos comercialmente de um grandenúmero de fornecedores, entre eles a International Biotechnologies Inc, NewHaven, CN, USA.

Uma maneira desejável de modificar o DNA que codifica o poli-peptídeo da invenção consiste em utilizar a reação em cadeia da polimerase,conforme descrito por Saiki et al (1988) Science 239,487-491. Este métodopode ser utilizado para introduzir o DNA em um vetor apropriado, por exem-plo, através de técnicas de engenharia genética, em sítios de restrição apro-priados ou para modificar o DNA de outras formas proveitosas conhecidasno estado da técnica. Neste método, o DNA, para ser amplificado enzimati-camente, é flanqueado por dois iniciadores específicos que ficam incorpora-dos ao DNA amplificado. Os referidos iniciadores específicos podem contersítios de reconhecimento de endonuclease de restrição utilizáveis para clo-nagem de vetores de expressão por meio de métodos conhecidos no estadoda técnica.

O DNA (ou, no caso dos vetores retrovirais, o RNA) é, então,expresso em um hospedeiro apropriado para produzir um polipeptídeo quecompreenda o composto da invenção. Assim, o DNA que codifica o polipep-tídeo constitutivo do composto da invenção pode ser utilizado de acordo comas técnicas conhecidas e modificado de maneira apropriada à luz dos ensi-namentos contidos na presente descrição para construir um vetor de expres-são que posteriormente é utilizado para transformar uma célula hospedeiraapropriada para a expressão e produção do polipeptídeo da invenção. Taistécnicas incluem as descritas nas patentes dos Estados Unidos números4,440,859 concedida em 3 de Abril de 1984 a Rutter et al, 4,530,901 conce-dida em 23 de Julho de 1985 a Weissman, 4.582.800 concedida em 15 deAbril de 1986 a Crowl, 4,677,063 concedida em 30 de Junho de 1987 a Market al, 4.678.751 concedida em 7 de Julho de 1987 a Goeddel, 4.704.362concedida em 3 de Novembro de 1987 a Itakura et al, 4.710.463 concedidaem 1 de Dezembro de 1987 a Murray, 4.757.006 concedida em 12 de Julhode 1988 a Toole, Jr. et al, 4.766.075 concedida em 23 de Agosto de 1988 aGoeddel et al, e 4.810.648 concedida em 7 de Março de 1989 a Stalker, to-das elas passando a fazer parte do presente documento por referência.

O DNA (ou, no caso dos vetores retrovirais, o RNA) que codificao polipeptídeo constitutivo do composto da invenção pode ser associado auma grande variedade de outras seqüências de DNA para a introdução emum hospedeiro apropriado. O DNA associado dependerá da natureza dohospedeiro, da maneira como o DNA é introduzido no hospedeiro e de se oobjetivo em vista é a permanência ou a integração epissomal.

Em geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão, por e-xemplo, um plasmídeo, na orientação correta e dentro da estrutura adequa-da para a expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às seqüênciasnucleotídicas de controle regulatório transcricional e translational apropriado,reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora tais controles estejam ge-ralmente disponíveis no vetor de expressão. Depois, o vetor é introduzido nohospedeiro por meio de técnicas padrão. Geralmente, nem todos os hospe-deiros serão transformados pelo vetor. Portanto, será necessário selecionarcélulas hospedeiras transformadas. Uma técnica de seleção consiste emincorporar uma seqüência de DNA no vetor de expressão, com todos os e-lementos de controle necessários, seqüência esta que codifique uma carac-terística selecionável na célula transformada, como, por exemplo, a resistên-cia a antibióticos.

Alternativamente, o gene para esta característica selecionávelpode ser outro vetor, utilizado para co-transformar a célula hospedeira dese-jada.

Depois, as células hospedeiras que foram transformadas peloDNA recombinante da invenção são cultivadas durante tempo suficiente sobas condições apropriadas conhecidas dos especialistas, à luz dos ensina-mentos aqui descritos, para permitir a expressão do polipeptídeo, que pode-rá, então, ser recuperada.

São conhecidos muitos sistemas de expressão, inclusive bacté-rias (por exemplo E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccha-romyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo, Aspergillus), célulasde plantas, células de animais e células de insetos. De preferência, o siste-ma pode consistir em células Awells.

Um promotor é um elemento de controle de expressão formadopor uma seqüência de DNA que permite ocorrer a ligação do RNA polimera-se e da transcrição. Seqüências promotoras compatíveis com hospedeirosbacterianos exemplares são apresentadas normalmente nos plasmídeosvetores que contenham sítios de restrição convenientes para a inserção deum segmento do DNA da presente invenção. Vetores plasmídicos procarióti-cos típicos são pUC18, pUC19, pBR322 e pBR329, comercializados por Bio-rad Laboratories (Richmond, CA, EUA) e pTrc99A e pKK223-3, comerciali-zados por Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA.

Um plasmídeo vetor de célula de mamífero é pSVL, comerciali-zado por Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Este vetor usa o promotor tardioSV40 para dirigir a expressão de genes clonados, o nível máximo de ex-pressão encontrando-se em células produtoras de antigenio T, como, porexemplo, nas células COS-1. Um exemplo de um vetor de expressão induzí-vel de mamífero é pMSG, também fornecido por Pharmacia. Este vetor utili-za o promotor induzível por glucocorticóide do longo terminal repetido dovírus do tumor mamário de camundongos para dirigir a expressão do geneclonado. Plasmídeos vetores de levedura úteis são pRS403-406 e pRS413-416, que podem ser obtido de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, EUA. Os plasmídeos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 sãoplasmídeos integrativos de leveduras (Ylps) e incorporam os marcadoresselecionáveis da levedura HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídeospRS413-416 são plasmídeos centrômeros de levedura (Ycps). Outros veto-res e sistemas de expressão são conhecidos no estado da técnica para utili-zação com grande variedade de células hospedeiras.

A presente invenção também se refere a uma célula hospedeiratransformada com uma variante de polinucleotídeo vetor da presente inven-ção. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. As célulasbacterianas podem ser células hospedeiras procarióticas preferidas em al-gumas circunstâncias e, normalmente, são uma cepa de E. coli, tais como,por exemplo, a cepa de E. coli DH5, que pode ser obtida dos Bethesda Re-search Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, e RR1, obtenível da AmericanType Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, EUA (No ATCC 31343).Entre as células hospedeiras eucarióticas preferidas estão as células de le-vedura, de insetos e mamíferos, de preferência células de vertebrados, co-_mo camundongo, rato, macaco, ou linhagens de células renais e fibroblásti-cas humanas. Entre as células hospedeiras de levedura estão YPH499, Y-PH500 e YPH501, que podem ser obtidas da Stratagene Cloning Systems,La Jolla, CA 92037, EUA. Entre as células hospedeiras de mamíferos prefe-ridas estão as células de ovário de hamster chinês (CHO), obteníveis da co-leção ATCC sob a denominação CCL61, as células de embrião de camun-dongo suíço NIH/3T3, obteníveis da ATCC sob a denominação CRL 1658,células COS-1 derivadas de rins de macacos, obteníveis da ATCC sob adenominação CRL 1650, e 293, que são células renais embrionárias de se-res humanos. Células de insetos preferidas são as células Sf9, que podemser transfectadas com vetores de expressão de baculovírus.

A transformação de células hospedeiras apropriadas com umconstructo de DNA da presente invenção é obtida por meio de métodos bemconhecidos que normalmente dependem do tipo de vetor utilizado. Com re-lação à transformação das células hospedeiras procarióticas, vide, por e-xemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69,2110 e Sambrooket al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY. A transformação de células de leveduraé descrita em Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, NY. O método de Beggs (1978) Nature275,104-109 também é útil. Com relação às células de vertebrados, reagen-tes úteis para a transfeção de tais células, por exemplo, fosfato de cálcio eDEAE-dextrano ou formulações lipossomais, são obteníveis da StratageneCloning Systems ou da Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877,EUA. A eletroporação também é útil para transformar e/ou transfectar célulase é bem conhecida no estado da técnica para transformar células de levedu-ra, células de insetos e células de vertebrados.

As células transformadas com sucesso, isto é, as células quecontêm um constructo de DNA da presente invenção, podem ser identifica-das utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as células resultantesda introdução de uma construção de expressão da presente invenção podeser cultivada para produzir o polipeptídeo da invenção. As células podem sercolhidas e lisadas e o seu conteúdo de DNA pode ser examinado quanto àpresença do DNA utilizando um método como, por exemplo, o descrito porSouthern (1975) J. MoL Biol. 98,503 or Berent et al (1985) Biotech. 3,208.Alternativamente, é possível detectar a presença da proteína no sobrena-dante utilizando anticorpos, conforme descrito abaixo.

Adicionalmente ao exame direto para detectar a presença doDNA recombinante, é possível confirmar a transformação bem-sucedida pormeio de métodos imunológicos conhecidos, nos casos em que o DNA re-combinante seja capaz de dirigir a expressão da proteína. Por exemplo, ascélulas transformadas com sucesso com um vetor de expressão produzemproteínas que apresentam antigenicidade adequada. As amostras de célulastidas como provavelmente transformadas são colhidas e examinadas quantoà presença da proteína utilizando anticorpos apropriados. Assim, adicional-mente às próprias células hospedeiras transformadas, a presente invençãocontempla também o cultivo dessas células, de preferência um cultivo mo-noclonal (com homogeneidade clonal), um cultivo derivado de um cultivomonoclonal, em meio nutriente.

Observar-se-á que certas células hospedeiras da invenção sãoúteis na preparação dos peptídeos da invenção, por exemplo, as células debactéria, de levedura ou de inseto. No entanto, outras células hospedeiraspodem ser úteis em certos métodos terapêuticos. Por exemplo, as célulasapresentadoras de antigênios, tais como as células dendríticas, podem serusadas proveitosamente para expressar os peptídeos da invenção de modoa poderem ser carregados em moléculas MHC apropriadas.

Outro aspecto da invenção apresenta um método para a produ-ção de um peptídeo para injeção intravenosa (i.v.), subcutânea (s.c), intra-dérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) e intramuscular (i.m.). As vias preferidaspara a injeção do peptídeo são as s.c, i.d., i.p., i.m. e i.v. As vias preferidaspara a injeção do DNA são i.d., i.m., s.c, i.p. e i.v. Podem-se administrar do-ses entre 1 e 500 mg do peptídeo ou do DNA.

Outro aspecto da invenção apresenta um método para eliminarcélulas alvo em um paciente, células alvo estas que expressem um polipep-tídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos da invenção, o méto-do incluindo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de umpeptídeo de acordo com a invenção, ou uma quantidade eficaz de um poli-nucleotídeo ou de um vetor de expressão que codifique o referido peptídeo,sendo a quantidade do referido peptídeo ou do referido polinucleotídeo ou dovetor de expressão eficaz para provocar uma resposta imune da célula anti-alvo no paciente. A célula alvo é normalmente uma célula de tumor ou decâncer, particularmente uma célula de leucemia ou linfoma.

O peptídeo ou ácido nucléico que codifica o peptídeo constituiuma vacina contra tumor ou câncer. Pode ser administrada diretamente nopaciente, no órgão afetado ou sistemicamente, ou aplicada ex vivo em célu-las derivadas do paciente ou em uma linhagem de células de seres humanosque, subseqüentemente, são administradas ao paciente, ou ainda usada invitro para selecionar uma subpopulação a partir de células imunes derivadasdo paciente que, depois, são readministradas ao paciente. Se o ácido nu-cléico for administrado a células in vitro, pode ser útil que as células sejamtransfetadas de modo a co-expressar citoquinas imunoestimulantes, como,por exemplo, interleucina-2. O peptídeo pode ser substancialmente puro oucombinado com um adjuvante imunoestimulante como, por exemplo, Detox,ou utilizado em combinação com citoquinas imunoestimulantes ou, ainda,administrado com um sistema de administração adequado, por exemplo,lipossomas. O peptídeo também pode ser conjugado a um veículo adequa-do, tal como a hemocianina (KLH) ou manana (vide WO 95/18145 e Longe-necker et al (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). O peptídeo pode tam-bém ser marcado ou ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Aexpectativa é de que os peptídeos cujas seqüências são dadas na presenteinvenção são estimuladores dos CTL CD8+. No entanto, a estimulação émais eficiente na presença de ajuda de células T CD4+. Assim, o parceiro defusão ou as seções de uma molécula híbrida apropriada produzem epitoposestimulantes das células T CD4+. Os epitopos que estimulam CD4+ são co-nhecidos no estado da técnica, e entre eles estão os identificados no toxóidetetânico. O polinucleotídeo pode ser substancialmente puro ou estar contidoem um vetor ou em um sistema de administração apropriados.

Entre os vetores e sistemas de administração apropriados estãoos sistemas e vetores baseados no adenovírus, vírus da vaccinia, retrovírus,vírus da herpes, vírus adeno-associados ou híbridos contendo elementos demais de um vírus. Os sistemas de administração não virais incluem lipídeoscatiônicos e polímeros catiônicos e são bem conhecidos no estado da técni-ca da administração de DNA. Também é possível recorrer à administraçãofísica, por exemplo, via "canhão de genes". O peptídeo ou o peptídeo codifi-cado pelo ácido nucléico pode ser uma proteína de fusão, por exemplo, comum epitopo que estimule as células T CD8+.

O peptídeo para uso em vacina contra câncer pode ser qualquerpeptídeo apropriado. Em particular, pode ser um peptídeo adequado de noveunidades monômeras ou um peptídeo adequado de 7 ou 8 ou 10 ou 11 ouainda 12 unidades monômeras. Peptídeos mais longos também podem serapropriados, mas preferem-se os peptídeos de 9 ou 10 monômeros, confor-me descrito na tabela 1 anexa.

Apropriadamente, todo ácido nucléico administrado ao pacienteé estéril e livre de pirogênios. O DNA nu pode ser administrados por via in-tramuscular ou intradérmica ou subcutânea. Os peptídeos podem ser admi-nistrado por via intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa ousubcutânea (vide acima também a respeito do método de produzir um peptí-deo). De preferência, os peptídeos usados como componentes farmacêuti-cos ativos são administrados em combinação com adjuvantes, como, porexemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF, adjuvante de Freund incompleto, adjuvantede Freund completo ou formulações lipossomais. Os adjuvantes de prefe-rência máxima podem ser encontrados, por exemplo, em Brinkman JA,Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for câncer immu-notherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb;4(2):181-98.

A vacinação resulta em respostas CTL estimuladas por célulasapresentadoras de antigênios profissionais; uma vez preparados os CTL,pode ser vantajoso aumentar a expressão de MHC nas células tumorais.

Também pode ser útil concentrar a vacina para populações celu-lares específicas, por exemplo, células apresentadoras de antigênios, querseja pelo sítio da injeção, pela utilização de vetores e sistemas de adminis-tração concentradores, quer seja pela purificação seletiva de tal populaçãode células do paciente e administração ex vivo do peptídeo ou do ácido nu-cléico (por exemplo, células dendríticas podem ser selecionadas, conforme adescrição apresentada em Zhou et al (1995) Blood 86,3295-3301; Roth et al(1996) Scand. J. Immunology 43,646-651). Por exemplo, os vetores concen-tradores podem compreender um promotor específico do tecido ou do tumorque direcione a expressão do antigênio para um sítio apropriado.

Outro aspecto da invenção disponibiliza uma vacina eficaz con-tra o câncer ou contra células de câncer ou de tumor, compreendendo umaquantidade eficaz de um peptídeo de acordo com a invenção ou compreen-dendo um ácido nucléico codificante de tal peptídeo. Também é preferidoque a vacina seja uma vacina de ácido nucléico. É sabido que a inoculaçãocom uma vacina de ácido nucléico, como uma vacina DNA que codifica umpolipeptídeo, provoca uma resposta de célula T. A vacina de máxima prefe-rência é uma que compreende um peptídeo (sintético) ou peptídeos (sintéti-cos), tanto individualmente como em combinações de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 oumais peptídeos (vide abaixo).

Convenientemente, a vacina de ácido nucléico pode compreen-der qualquer meio de administração apropriado para o ácido nucléico. O áci-do nucléico, de preferência DNA, pode estar nu (isto é, praticamente semqualquer outro componente a ser administrado), ou pode ser administradoem um lipossoma ou como parte integrante de um sistema de administraçãode vetores virais.

Acredita-se que a absorção do ácido nucléico e a expressão dopolipeptídeo codificado pelas células dendríticas podem ser o mecanismo deiniciação da resposta imune; no entanto, as células dendríticas podem nãoestar transfectadas, mas permanecem importantes, porque podem captar opeptídeo expressado das células transfectadas no tecido.

De preferência, a vacina como, por exemplo, a vacina de DNA, éadministrada nos músculos. Também é preferido que a vacina seja adminis-trada na pele. A vacina de ácido nucléico pode ser administrada sem adju-vante. A vacina de ácido nucléico pode também ser administrada com umadjuvante como, por exemplo, BCG ou alume. Entre outros adjuvantes apro-priados estão QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), que éderivada de saponina, extratos micobacterianos e imitadores sintéticos daparede celular bacteriana, e adjuvantes de marca como, por exemplo, Ribi'sDetox. Também é possível utilizar Quil A, outro adjuvante derivado de sapo-nina (Superfos, Denmark). De preferência, a vacina de ácido nucléico é ad-ministrada sem adjuvante. Outros adjuvantes como, por exemplo, o da Fre-und, também podem ser úteis. Também pode ser conveniente administrar opeptídeo conjugado com hemocianina do molusco keyhole limpet.

A imunoterapia do câncer mediada por polinucleotídeo encontra-se descrita em Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condonet al (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medici-ne 3,558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al(1996) Int J. Câncer 65,664-670; e Burchell et al (1996) pp 309-313 In: Bre-ast Câncer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), JohnLibbey Eurotext, todos os quais passam a fazer parte integrante deste do-cumento por referência.

Ainda outro aspecto da presente invenção apresenta o uso deum peptídeo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotídeo ou vetorde expressão codificador deste peptídeo, na fabricação de um medicamentopara eliminar células alvo em um paciente, células alvo estas que expressemum polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido da inven-ção.

Outro aspecto da invenção apresenta um método para produzirlinfócitos T citotóxicos ativados (CTL) in vitro, método este compreendendo ocontato in vitro de CTL com moléculas MHC humanas de classe I carrega-das com antigênios e expressas na superfície de uma célula apresentadorade antigênio adequada durante tempo suficiente para ativar, de maneira es-pecífica para o antigênio, os referidos CTLs, sendo o antigênio um peptídeode acordo com a invenção.

Apropriadamente, os CTLs são células auxiliares CD8+. As mo-léculas MHC de classe I podem estar expressas na superfície de qualquercélula apropriada e é preferível que a célula seja uma que não expresse na-turalmente moléculas MHC de classe I (caso este em que a célula é trans-fectada para expressar tal molécula) ou, se o for, que seja defetiva nas viasde processamento ou de apresentação dos antigênios. Desta forma, é pos-sível que a célula que expressa a molécula MHC de classe I seja primed pra-ticamente por completo com um antigênio peptídico antes de ativar o CTL.

A célula apresentadora do antigênio (ou a célula estimuladora)tem, geralmente, uma molécula MHC de classe I na sua superfície e, de pre-ferência, é praticamente incapaz, por si só, de carregar dita molécula MHCde classe I com o antigênio selecionado. Como se descreve mais pormeno-rizadamente abaixo, a molécula MHC de classe I pode ser facilmente carre-gada com o antigênio selecionado in vitro.

De preferência, a célula de mamífero não possui ou possui ape-nas um nível reduzido ou função reduzida do transportador peptídico TAP.Entre as células apropriadas que não têm o transportador peptídico TAP es-tão T2, RMA-S e células de drosófila. TAP é o Transportador Associado aoProcessamento do antigênio.

O peptídeo humano que carrega a linha de células deficiente T2pode ser obtido da American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,Rockville, Maryland 20852, EUA, sob o número de catálogo CRL 1992; in-corporado a este documento por referência.

Convenientemente, dita célula hospedeira não expressa, antesda defeção, praticamente nenhuma molécula MHC de classe I. Também épreferível que a célula estimuladora expresse uma molécula importante paraa co-estimulação da célula T como, por exemplo, qualquer uma dentre B7.1,B7.2, ICAM-1 e LFA 3.

As seqüências de ácido nucléico de numerosas moléculas MHCde classe I e das moléculas co-estimuladoras são disponibilizadas publica-mente pelas bases de dados GenBank e EMBL.

Em outra modalidade, é possível utilizar combinações de molé-culas HLA como, por exemplo, as moléculas MHC de classe II listadas nastabelas A e B deste documento. O uso de vacinas à base de poliepitoposrecombinantes para a administração de múltiplos epitopos CTL CD8+ é des-crito em Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 e WO 96/03144,ambos incorporados ao presente documento por referência. Em relação àpresente invenção, pode ser desejável incluir em uma única vacina um pep-tídeo (ou um ácido nucléico codificante de um peptídeo), onde o peptídeoinclua, em qualquer ordem, uma seqüência de aminoácidos da presente in-venção e outro epitopo estimulador da célula T CD8+. Tal vacina seria parti-cularmente útil para o tratamento de cânceres. As vacinas do tipo "contas deum colar" são geralmente vacinas de DNA. O disparo de uma resposta imu-ne dependente de MHC de classe II em simultâneo com uma resposta imunedependente de MHC de classe I apresenta a vantagem de induzir uma rea-ção local de célula T semelhante a TH1 das células T CD4-positivas, apoi-ando as células T CD8-positivas dependentes de MHC de classe I.

Numerosos outros métodos podem ser utilizados para gerar CTLin vitro. Por exemplo, os métodos descritos em Peoples et al (1995) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 92,432-436 e em Kawakami et al (1992) J. Immunol.148,638643, utilizam linfócitos autólogos que se infiltram no tumor para gerarCTLs. Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787 faz uso de linfó-citos autólogos do sangue periférico (PLBs) na preparação de CTL. Jochmuset al (1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695 descreve a produção do CTL autó-logo pelo emprego de células dendríticas pulsantes com peptídeo ou poli-peptídeo ou via infeção com vírus recombinante. Hill et al (1995) J. Exp.Med. 181,2221-2228 e Jerome et al (1993) J. Immunol. 151,1654-1662 utili-za células B na produção do CTL autólogo. Adicionalmente, é possível utili-zar macrófagos pulsados com peptídeo ou polipeptídeo ou infectadas comvírus recombinante, na preparação do CTL autólogo. S. Walter et al. (WalterS, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG,Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells ex-panded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003Nov 15;17í(10):4974-8) descreve o processo de iniciação in vitro de célulasT com o uso de células apresentadoras de antigênios artificiais, que tambémé um método apropriado para a geração de células T contra o peptídeo es-colhido.

Células alogênicas também podem ser usadas na preparação deCTL e este método é descrito detalhadamente em WO 97/26328, incorpora-do a este documento por referência. Por exemplo, adicionalmente às célulasde drosófila e células T2, outras células podem ser utilizadas para apresen-tar antigênios como as células CHO, células de insetos infectadas com bacu-lovírus, células alvo infectadas com bactérias e leveduras. Adicionalmente,podem-se utilizar vírus de plantas (vide, por exemplo, Porta et al (1994) Viro-logy 202, 449-955, que descreve o desenvolvimento do vírus do mosaico docaupi como sendo um sistema de grande rendimento para a apresentaçãode peptídeos estranhos.

Os CTLs ativados direcionados contra os peptídeos da invençãosão úteis em terapia. Assim, outro aspecto da invenção apresenta os CTLativados obteníveis pelos métodos da invenção acima descritos.

Ainda outro aspecto da invenção apresenta CTLs ativados quereconhecem seletivamente uma célula que expresse um polipeptídeo com-preendendo uma seqüência de aminoácido da invenção. De preferência, oCTL reconhece a referida célula ao interagir com o complexo HLA/peptídeo(por exemplo, ligando-se a ele). Os CTLs são úteis em um método para eli-minar células alvo de um paciente, células alvo estas que expressam umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos da invenção,sendo administrado ao paciente uma quantidade eficaz de CTL ativado. OsCTLs administrados ao paciente podem ser derivados do próprio paciente eativados conforme descrito acima, isto é, são CTLs autólogos. Alternativa-mente, os CTLs não são provenientes do paciente, más de outro indivíduo.Que seja, naturalmente, de preferência de um indivíduo saudável. Por "indi-víduo saudável" os inventores entendem que o indivíduo em bom estadogeral de saúde, cujo sistema imunitário esteja a desempenhar bem as suasfunções e, dé maior preferência, não esteja sofrendo de nenhuma doençaprontamente detectável.

Os CTLs ativados expressam um receptor de células T (TCR)que participa do reconhecimento das células que expressam o polipeptídeo.É útil que o cDNA codificante do TCR seja clonado a partir do CTL ativado etransferido para outro CTL para a expressão.

In vivo, as células alvo para o CTL CD8+ de acordo com a pre-sente invenção podem ser células de tumor, leucemia ou linfoma (que ex-pressam MHC de classe I) e/ou células estromais localizadas ao redor dotumor (células tumorais) (que, algumas vezes, também expressam MHC declasse I).

Os TCRs dos clones CTLs da invenção específicos para os pep-tídeos da invenção são clonados. O uso de TCR nos clones CTL é determi-nado utilizando (i) anticorpos monoclonais variáveis e específicos da regiãoe (ii) RT PCR com iniciadores específicos para as famílias de genes Va eVp. A biblioteca cDNA é preparada a partir de mRNA poli-A extraído dos clo-nes CTL. São utilizados iniciadores específicos para a porção do terminal Cdas cadeias TCR aePe para a porção do terminal N dos segmentos Va e Pidentificados. O cDNA completo para a cadeia TCR aebé amplificado comDNA polimerase de alta fidelidade e os produtos amplificados são clonadospara um vetor de clonagem apropriado. Os genes clonados de cadeia a e Ppodem ser montados para formar uma única cadeia TCR usando o métododescrito por Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91,12654-12658.Neste construeto de cadeia individual o segmento VaJ é seguido pelo seg-mento V DJ, seguido pelo segmento Cp seguido pela transmembrana e pelosegmento citoplásmico da cadeia CD3. Depois, esta cadeia individual TCR éinserida em um vetor de expressão retroviral (é possível selecionar um grupode vetores com base na sua capacidade de infetar linfócitos T CD8+ sereshumanos e de mediar a expressão de genes: o sistema Kat de vetores retro-virais é uma possibilidade preferida (vide Finer et al (1994) Blood 83,43).Retrovírus anfotróficos de alto título são usados para infectar os linfócitos TCD8+ ou CD4+ purificados isolados a partir do sangue periférico de pacien-tes com tumores (seguindo um protocolo publicado por Roberts et al (1994)Blood 84,2878-2889, incorporado aqui por referência). Utilizam-se anticorposAnti-CD3 para provocar a proliferação das células T CD8+ purificadas, o quefacilita a integração retroviral e a expressão estável de TCRs de uma só ca-deia. A eficiência da transdução retroviral é determinada por tingimento dascélulas T CD8+ infectadas com anticorpos específicos para o TCR de cadeiaúnica. A análise in vitro das células T CD8+ demonstra que elas apresentamo mesmo extermínio de tumores específicos que aquele observado com oclone de CTL com restrição alogênica a partir do qual as cadeias TCR foramclonadas originalmente. Populações de células T CD8+ transduzidas com aespecificidade esperada podem ser úteis para a imunoterapia adotiva depacientes com tumores. Os pacientes podem ser tratados com CTLs autólo-gos transduzidos entre 108 e 1011.

Outros sistemas apropriados para introduzir genes no CTL sãodescritos em Moritz et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91,4318-4322,incorporados ao presente documento por referência. Eshhar et al (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90,720-724 e Hwu et al (1993) J. Exp. Med. 178,361-366 também descrevem a transfeção de CTL. Assim, outro aspecto dainvenção apresenta um TCR que reconhece uma célula que expressa umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoacidos da invenção,TCR este que é obtido a partir do CTL ativado.

Adicionalmente ao TCR, moléculas funcionalmente equivalentesao TCR são incluídas na invenção. Entre elas se incluem quaisquer molécu-las que sejam funcionalmente equivalentes a um TCR e possam exercer amesma função de um TCR. Em particular, tais moléculas incluem TCRs decadeia única e três domínios desenvolvidos por meio de engenharia genéti-ca, tais como as feitas pelo método descrito por Chung et al (1994) Proc.Natl. Acad. Sei. EUA 91, 12654-12658, incorporado ao presente documentopor referência. A invenção também inclui um polinucleotídeo que codifica oTCR ou a molécula funcionalmente equivalente e também um vetor de ex-pressão que codifica o TCR ou uma molécula funcionalmente equivalente.Entre os vetores de expressão apropriados para expressar o TCR da inven-ção estão os descritos acima relativamente à expressão dos peptídeos dainvenção.

No entanto, os vetores de expressão preferidos são os que se-jam capazes de expressar o TCR em um CTL após a transfeção.

Ainda outro aspecto da invenção apresenta um método para e-liminar células alvo de um paciente, células alvo estas que expressam umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoacidos da invenção, ométodo compreendendo as etapas de (1) obter o CTL do paciente; (2) intro-duzir em ditas células um polinucleotídeo que codifica um TCR ou uma mo-lécula funcionalmente equivalente, conforme acima definido; e (3) introduzirno paciente as células produzidas na etapa 2.

Ainda outro aspecto da invenção apresenta um método para ma-tar células alvo em um paciente, células alvo estas que expressam um poli-peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoacidos conforme definidono primeiro ou segundo ou terceiro aspectos da invenção, método este quecompreende as etapas de (1) obter células apresentadoras de antigênioscomo, por exemplo, células dendríticas, do paciente; (2) pôr ditas célulasapresentadoras de antigênios em contato com um peptídeo conforme defini-do no primeiro ou segundo ou terceiro aspectos da invenção ou com um po-linucleotídeo que codifique tal peptídeo ex vivo; e (3) reintroduzir no pacienteas células apresentadoras de antigênios assim tratadas.

De preferência, as células apresentadoras de antigênios são cé-lulas dendríticas. Adequadamente, as células dendríticas são células dendrí-ticas autólogas pulsadas com um peptídeo antigênico. O peptídeo antígenopode ser qualquer peptídeo antígeno apropriado que dê lugar a uma respos-ta adequada das células T. A terapia com células T utilizando células dendrí-ticas autólogas pulsadas com peptídeos provenientes de um antigênio asso-ciado ao tumor é descrita em Murphy et al (1996) The Prostate 29,371-380 eTjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278.

Em outra modalidade, as células apresentadoras de antigênioscomo, por exemplo, as células dendríticas, são postas em contato com umpolinucleotídeo que codifica o peptídeo da invenção. O polinucleotídeo podeser qualquer polinucleotídeo apropriado, sendo preferível um que seja capazde transduzir a célula dendrítica, resultando assim na apresentação de umpeptídeo e na indução da imunidade.

Convenientemente, o polinucleotídeo pode estar compreendidoem um polinucleotídeo viral ou em um vírus. Por exemplo, observou-se queas células dendríticas transduzidas pelo adenovírus induzem a imunidadeantitumoral específica do antigênio em relação a MUC1 (vide Gong et al(1997) Gene Ther. 4,1023-1028). De modo semelhante, é possível utilizarsistemas à base de adenovírus (vide, por exemplo, Wan et al (1997) Hum.Gene Ther. 8,1355-1363; é possível utilizar sistemas retrovirais (Specht et al(1997) J. Exp. Med. 186,1213-1221 e Szabolcs et al (1997). Também é pos-sível usar a transferência mediada por partículas de sangue para célulasdendríticas (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27,2702-2707); e RNA tam-bém pode ser utilizado (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186,1177 1182).Observar-se-á, em relação aos métodos para eliminar célulasalvo de um paciente, que é particularmente preferível que as células alvosejam células cancerosas, mais preferivelmente ainda células cancerosas deleucemia ou linfoma.

É particularmente preferível que os pacientes tratados segundoos métodos da invenção sejam do tipo HLA-A2. Assim, em uma variante pre-ferida, o haplótipo HLA do paciente é determinado antes do tratamento. Ahaplotipagem HLA pode ser efetuada utilizando qualquer método apropriado;tais métodos são bem conhecidos no estado da técnica.

A invenção inclui particularmente o uso dos peptídeos da inven-ção (ou dos polinucleotídeos que os codificam) para a vacinação ativa in vi-vo; para a manipulação das células dendríticas autólogas in vitro seguida daintrodução das células dendríticas assim manipuladas in vivo para ativar asrespostas CTL; para ativar CTLs autólogos in vitro seguido de terapia adoti-va (isto é, os CTLs assim manipulados são introduzidos no paciente); e paraativar CTLs de doadores saudáveis (quer com MHC correspondentes ou nãocorrespondentes) in vitro seguido de terapia adotiva.

E uma modalidade preferida, as vacinas da presente invençãosão administradas a um hospedeiro quer individualmente, quer em combina-ção com outra terapia do câncer, para inibir ou suprimir a formação de tumo-res.

A vacina de peptídeo poder ser administrada sem adjuvante. Avacina de peptídeo pode também ser administrada com um adjuvante como,por exemplo, BCG ou alume. Entre outros adjuvantes apropriados estãoQS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), que é derivada desaponina, extratos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celularbacteriana, e adjuvantes de marca como, por exemplo, Ribfs Detox. Tam-bém é possível utilizar Quil A, outro adjuvante derivado de saponina (Super-fos, Denmark). Outros adjuvantes como, por exemplo, oligonucleotídeosCpG, RNA estabilizado, Imiquimod (disponível comercialmente sob a marcaAldara™ da 3M Pharma, EUA), adjuvante de Freund incompleto (comercial-mente disponível sob o nome Montanide ISA-51 de Seppic S.A., Paris, Fran-ça), formulações lipossomais ou GM-CSF também podem ser úteis. Tam-bém pode ser conveniente administrar o peptídeo conjugado com hemocia-nina do molusco heyhole limpet.

Os peptídeos de acordo com a invenção também pode ser usa-dos como reagentes de diagnóstico. Com os peptídeos é possível analisarse em uma população de CTLs estão presentes CTLs direcionados especifi-camente contra um peptídeo ou se são induzidos pela terapia. Além disso, oaumento das células T precursoras pode ser testado com os peptídeos quepossuam reatividade contra o peptídeo definido. Além disso, o peptídeo po-de ser usado como marcador para monitorar a progressão da doença de umtumor que expresse o antigênio do qual o peptídeo é derivado.

A tabela 1 anexa traz a lista dós peptídeos tal como usados e identi-ficados. Adicionalmente, a tabela dá a posição respectiva do peptídeo dentroda respectiva proteína. O número de acesso da OFA/iLR de camundongo nobanco de genes do "National Centre for Biotechnology Information", do Nati-onal Institute of Health (see http: www.ncbi.nlm.nih.gov) é AAD26866. O nú-mero de acesso da OFA/iLR humano no banco de genes do "National Cen-tre for Biotechnology Information", do National Institute of Health (vide http:www.ncbi.nlm.nih.gov) são, por exemplo, AAC50652 ou AAP35883.

Em outra modalidade preferida, os peptídeos são usados paratingir leucócitos, nomeadamente os linfócitos T. Este uso é particularmentevantajoso quando se consegue provar que em uma população de CTLs es-tão presentes CTLs específicos direcionados contra um peptídeo. Além dis-so, o peptídeo pode ser usado como marcador para determinar a progressãode uma terapia em uma doença tumoral.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, os peptí-deos são utilizados para a produção de um anticorpo. É possível obter anti-corpos policlonais de maneira padrão ao imunizar animais via injeção dopeptídeo e subseqüente purificação da globulina imune. Anticorpos mono-clonais podem ser obtidos de acordo com protocolos padrão como, por e-xemplo, em Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and mo-noclonal antibodies.Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição far-macêutica que contenha uma ou mais dos ditos peptídeos de acordo com ainvenção. A composição é usada para administração parenteral como, porexemplo, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular ou para adminis-tração oral. Para tal, os peptídeos são dissolvidos ou suspensos em um veí-culo farmaceuticamente aceitável, de preferência um veículo aquoso. Ade-mais, a composição pode conter excipientes como tampões, ligantes, agen-tes desintegrantes, diluentes, sabores, lubrificantes, etc. Os peptídeos po-dem também ser administrados juntamente com substâncias imunoestimu-lantes como, por exemplo, citoquinas. Uma relação extensa dos excipientesutilizáveis em tal composição pode ser consultada, por exemplo, em A. Kib-be, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Phar-maceutical Association and pharmaceutical press. A composição pode serusada para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças tumorais.

A preparação farmacêutica contendo pelo menos um dos peptí-deos da presente invenção, compreendendo qualquer um dos SEQ ID No 1a SEQ ID No 2, é administrada a um paciente que sofre de uma doença tu-moral associada ao respectivo peptídeo ou antigênio. Doenças específicas aserem tratadas são as doenças malignas que expressam OFA/iLRP, comoas leucemias (por exemplo, AML ou CLL) ou mielomas (por exemplo MM).Desta forma é possível provocar uma resposta imune específica para o CTL.

Em outro aspecto da presente invenção, é possível utilizar umacombinação de dois ou vários peptídeos de acordo com a presente inven-ção, tanto em combinação direta como dentro do mesmo regime de trata-mento. Além disso, é possível utilizar combinações com outros peptídeos,por exemplo, peptídeos específicos de MHC de classe II. O profissional ver-sado saberá selecionar as combinações preferidas de peptídeos imunogêni-cos ao testar, por exemplo, a geração de células T in vitro, bem como a suaeficiência e presença total, a proliferação, afinidade e expansão de certascélulas T para certos peptídeos, e a funcionalidade das células T, por exem-plo, ao analisar a produção de IFN-y (vide também exemplo abaixo) Habitu-almente, os peptídeos mais eficientes são depois combinados para formaruma vacina para os fins acima descritos.

Uma vacina apropriada conterá 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14 ou 15 peptídeos diferentes, de preferência 4, 5, 6 ou 7 peptídeos dife-rentes, e com ainda maior preferência 6 peptídeos diferentes.

Por fim, a vacina pode ser dependente de um tipo específico decâncer de que o paciente a ser tratado esteja sofrendo, bem como do estadoda doença, dos regimes de tratamento anteriores, do estado imune do paci-ente e, naturalmente, do haplótipo HLA do paciente.

A identificação dos epitopos das células T auxiliares dos antigê-nios associados a tumores continua a ser uma importante tarefa na imunote-rapia antitumoral. Para identificar os epitopos de células T deduzidos da pro-teína OFA-iLR foram sintetizados 14 peptídeos (vide abaixo) prognosticadospelos programas de computador PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) e SYFPEITHY (http://www.syfpeithi.de) como sendo capazes de se ligarà molécula HLA-A*0201. em um ensaio de reconstituição in vitro utilizando alinhagem celular T2, desprovida de TAP (transportador associado ao pro-cessamento do antigênio), apenas dois peptídeos (iLR1, iLR2) mostraramgrande afinidade de ligação ao HLA-A*0201 (figuras 11A e 11B), quandocomparados com a nucleoproteína58-66 da gripe. Na presença de células DCplenamente maduras pulsadas quer pelo peptídeo iLR1, quer pelo peptídeoiLR2, foi possível gerar linhagens CTL derivadas de doadores de HLA-A*0201+saudáveis.

As curvas de titulação do peptídeo demonstram que os CTLsespecíficos para iLR1 e iLR2 eram de grande afinidade para o complexopeptídeo/MHC (figuras 5 e 10). As linhagens de CTL específicas para iLR1(figura 1) ou iLR2 (figura 6) provocaram grande atividade citolítica contra li-nhagens de tumores hematológicos HLA-A*0201+, blastos AML primáriosmalignos (figura 4A, B, e 8A, B, respectivamente) e células CLL (figuras 3A,B, e 9A, B, respectivamente), mas pouparam os alvos HLA-A2-negativo e ascélulas hematopoiéticas normais (ibid.). Experimentos com bloqueio de anti-corpos (figura 2 e 7) revelaram uma eliminação de células restritas às MHCde classe I induzida por linfócitos T CD8+ específicos do peptídeo. Para de-terminar a freqüência das células T específicas de iLR1 e iLR2 em pacientescom AML HLA-A*0201+, CLL e mieloma múltiplo realizou-se um ensaio desecreção de ELISPOT IFN- y (tabelas 3 - 5). Em 25/50 (50%) e 20/50 (40%)dos pacientes HLA-A*0201+ com doenças hematológicas malignas foi pos-sível detectar níveis significativos de células T específicas para os peptídeosiLR1 ou iLR2, enquanto que nas amostras de sangue periférico de indivíduossaudáveis não ocorreram respostas espontâneas de células T nem contraILR1, nem contra ILR2 (tabela 2). Em um paciente com CLL e outro comAML, foi possível gerar linhagens de CTLs autólogas específicas para epito-pos peptídicos tanto iLR1 como iLR2, elicitando atividade citotóxica eficazcontra as células alvo autólogas e alogênicas correspondentes com HLA-A2.

Os inventores demonstraram anteriormente que os clones decélula T CD8+ reguladoras especificamente da OFA/iLR e secretadoras deInterleucinã 10 podem ser identificados tanto em camundongos com tumorOFA/ÍLR+ (Rohrer JW, Rohrer SD, Barsoum A, Coggin JH Jr. Differentialrecognition of murine tumor-associated oncofoetal transplantation antigenand individually specific tumor transplantation antigens by syngeneic clonedBalb/c and RFM mouse T cells. J Immunol. 1994; 152: 745-764) como empacientes com carcinomas avançados do seio (Rohrer JW, Barsoum AL,Dyess DL et al. Human breast carcinoma patients develop clonable oncofoe-tal antigen-specific effector and regulatory T lymphocytes. J Immunol. 1999;162: 6880-6892. 11. Rohrer JW, Coggin JH Jr. CD8 T cell clones inhibit anti-tumor T cell function by secreting IL-10. J. Immunol. 1995; 155: 5719.). Su etal. (Su Z et al. Immunological and Clinicai responses in metastatic renal cân-cer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. CâncerRes. 2003; 63: 2127-2133) relataram sobre células T reativas contra epito-pos restritos às MHC de classe I de OFA/iLR provenientes de pacientes comcâncer renal metastático. Nesse estudo, os autores também relataram mor-talidade inesperadamente baixa de pacientes que haviam recebido vacinasterapêuticas com células dendríticas autólogas previamente transfectadascom o RNA codificador da OFA/iLR e outros prováveis antigênios. No entan-to, o número, a restrição HLA e a identidade química dos epitopos da O-FA/iLR não foram revelados por Sue et al. Hõltl et al. (Hóltl L et al. Immuno-therapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysate-pulsed autolo-gous dendritic cells. Clin. Câncer Res. 2002; 8: 3369-3376) trouxe novas e-vidências de que a OFA/iLR pode ser muito útil para a imunoterapia do cân-cer à base de vacinas terapêuticas que estimulem respostas imunes celula-res específicas. Os autores descobriram que 5/6 dos pacientes com carci-noma celular renal metastático (RCC) que haviam sido vacinados com célu-las dendríticas autólogas carregadas com lisados de células tumorais alogê-nicas ou autólogas, apresentaram respostas imunes melhoradas contra O-FA/iLR. Mais uma vez, nenhum epitopo de OFA/iLR foi revelado por Hóltl etal. Interessantemente, os pacientes com a resposta imune mais forte de to-das contra OFA/iLR tiveram uma resposta clínica completa e uma parcial.

Na pequena série dos inventores com pacientes CLL em faseprecoce da doença (Binet A), não foram detectáveis células T secretadorasde IL-10 relevantes específicas para os peptídeos iLR1 ou iLR2 (dados nãoexibidos). Os inventores estão atualmente envolvidos com experimentosdestinados a elucidar mais precisamente uma possível relação entre a ocor-rência de células T específicas anti-OFA/iLRP que segreguem IFN-v ou IL-10 e o estágio da doença em pacientes com CLL e mieloma múltiplo.

Em suma, os inventores identificaram pela primeira vez dois epi-topos peptídicos distintos específicos para HLA-A*0201 derivados da proteí-na OFA/iLR. Estes peptídeos representam ferramentas úteis tanto para fazerestudos imunológicos sobre tumores e desenvolver estratégias de vacinaçãoem caso de doenças malignas que expressam OFA/iLRP.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para elimi-nar células alvo de um paciente, células alvo estas que expressem um poli-peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos aqui relacionada,o método incluindo a administração ao paciente de uma quantidade eficazde um peptídeo de acordo com a presente invenção ou de um ácido nucleicode acordo com a presente invenção ou de um vetor de expressão de acordocom a presente invenção, sendo a quantidade do referido peptídeo ou aquantidade do referido ácido nucleico ou a quantidade do referido vetor deexpressão eficaz para provocar uma resposta imune da célula antialvo nopaciente.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para elimi-nar células alvo de um paciente, células alvo estas que expressem um poli-peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com ainvenção, método este que compreende a administração ao paciente umnúmero eficaz de linfócitos T citotóxicos (CTL) consoante a definição dadana presente invenção.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para elimi-nar células alvo de um paciente, células alvo estas que expressem um poli-peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos dada de acordocom a invenção, método este compreendendo as etapas de (1) obter linfóci-tos T citotóxicos (CTL) do paciente; (2) introduzir em ditas células um ácidonucléico codificador de um receptor de células T (TCR) ou uma moléculafuncionalmente equivalente, tal como definido de acordo com a presente in-venção; e (3) introduzir as células produzidas na etapa (2) no paciente.

De preferência, as células alvo são células cancerosas. Commaior preferência, o tipo de câncer é leucemia ou linfoma que expressem opolipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos dada de acor-do com a presente invenção.

Subentende-se que os recursos da invenção, tal como relevadose descritos neste documento, podem ser utilizados não apenas na respectivacombinação indicada, mas também de modo singular, sem se afastar do es-copo pretendido da presente invenção.

A invenção será agora descrita com mais detalhes, fazendo refe-rências às figuras, à lista de seqüências e aos exemplos. Os exemplos aseguir são dados exclusivamente para fins ilustrativos, sem intenção de limi-tar a invenção.

As SEQ ID No 1 à SEQ ID No 2 mostram seqüências peptídicasde epitopos de célula T contendo peptídeos apresentados por MHC de clas-se de acordo com a presente invenção.

As SEQ ID No 6 à SEQ ID No 17 mostram seqüências peptídi-cas usadas nos exemplos.

A figura 1 mostra o reconhecimento de várias linhagens celula-res por CTL específico para ILR1.

A figura 2 mostra o bloqueio da lise de células alvo por anticor-pos que reconhecem CD8, MHC de classe I ou TCR para ILR1.

A figura 3 mostra que o CTL específico para HLA-A*02/ILR1 eli-mina células tumorais de pacientes com CLL; (A) primeiro experimento; (B)segundo experimento.

A figura 4 mostra que o CTL específico para HLA-A*02/ILR1 eli-mina células tumorais de pacientes com CLL; (A) primeiro experimento; (B)segundo experimento.

A figura 5 A mostra a dependência da dose da lise de célulasalvo T2 pulsadas pelo peptídeo pelo CTL específico para ILR1. A figura 5Amostra a inibição de CTL específico para ILR1 por alvos frios (Cold TargetInhibition Assay).

A figura 6 mostra o reconhecimento de várias linhagens celula-res por CTL específico para ILR2.

A figura 7 mostra o bloqueio da lise de células alvo por anticor-pos que reconhecem CD8, MHC de classe I ou TCR para ILR2.

A figura 8 mostra que o CTL específico para HLA-A*02/ILR2 eli-mina células tumorais de pacientes com AML. (A) 1e experimento; (B) 2e ex-perimento.

A figura 9 mostra que o CTL específico para HLA-A*02/ILR2 eli-mina células tumorais de pacientes com CLL. (A) 19 experimento; (B) 2- ex-perimento.

A figura 10A mostra a dependência da dose da lise de célulasalvo T2 pulsadas pelo peptídeo pelo CTL específico para ILR2. A figura 10Bmostra a inibição de CTL específico para ILR2 por alvos frios (Cold TargetInhibition Assay).

A figura 11 mostra a reconstituição in vitro utilizando a linhagemcelular T2 desprovida de TAP (transportador associado ao processamentodo antigênio), apenas dois peptídeos (iLR1, iLR2) mostram grande afinidadede ligação a HI_A-A*0201 (figuras 11A e 11B), quando comparados com anucleoproteína58-66 da gripe. Comparados com de ILR3 a ILR14 e o peptídeode referência do vírus da influenza (Fluml), os peptídeos ILR1 e ILR2 mos-tram boa afinidade de ligação para HLA-A*02.

A figura 12 mostra a análise representativa de tetrâmeros relati-va à expansão dirigida por microesferas dos linfócitos CD8+ provenientes dosangue periférico específicos para A2/RPS-001 e A2/RPS-002. 1 x 106PBMCs enriquecidos com CD8+ por fonte de cada doador saudável de HLA-A2+ HBC-065 foram estimulados semanalmente em uma fonte com microes-feras acopladas a anti-CD28, mais antigênio de tumor de alta densidadeA*0201/RPS-001 (painel superior) ou antigênio de tumor de alta densidadeA*0201/RPS-002 (painel inferior) conforme mostrado anteriormente [Walter,S, et.al. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expandedon calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 171(10):4974-8, 2003] com poucas modificações. Após três estimulações in vitro, ascélulas de ambas as fontes foram tingidas com FITC CD8 de anticorpos,mais os tetrâmetros A*0201/RPS-001 APC e A*0201/RPS-002 PE. As célu-las são barradas na população de linfócitos (painéis da esquerda e do cen-tro) ou na população de linfócitos CD8+ (painel da direita). Os números re-presentam a percentagem de tetrâmeros+ dentro dos linfócitos CD8+. RPS-001 = LLAARAIVAI (SEQ ID-No. 1); RPS-002 = ALCNTDSPL (SEQ ID-No. 2)

EXEMPLOS

Abreviações usadas no presente pedido:

Ab: anticorpo

Ag: antigênio

APC: célula apresentadora de antigênio

CD: Cluster de diferenciação

cpm: contagens por minuto

DC: célula dendrítica

EBV: virus Epstein-Barr

ESI: ionização por electrosprayHLA: antigênio de leucócito humano

HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência

IFN: Interferon

li: cadeia invariante (CD74)

IL: interleucina

MALDI: dessorção/ionização a laser assistida por matriz

MHC: complexo maior de histocompatibilidade

MS: espectrometria de massas

OD450: densidade óptica em comprimento de onda de 450 nm

PBMC: células mononucleares do sangue periférico

PCR: reação em cadeia da polimerase

PHA: fitohemaglutinina

SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfatode sódio

S.I.: índice de estimulação

TOF: tempo de voo

Linhagens de células, amostras de tumores e células mono-nucleares do sangue periférico (PBMC)

Todas as linhas de células utilizadas neste estudo foram obtidas da Ameri-can Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). PBMC, células progenito-ras CD34+, células de medula óssea e amostras de tumores foram recolhi-das de doadores saudáveis, de pacientes com leucemia mielóide aguda (A-ML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e mieloma múltiplo (MM), respectiva-mente, com prévio consentimento informado e aprovação pela comissão deexame da instituição.Anticorpos

Anticorpo contra MAM-6: Alexis Corp., Switzerland, obtained t-hrough AXXORA DEUTSCHLAND GmbH, Gallusstrasse 10, D-35305 Grün-berg. N9 produto SIG-614.

Anticorpo contra HLA-A*02: clone BB7.2 de BD Pharmingen, nede catálogo 551230.

Anticorpo contra CD8: clone SFCI21Thy2D3 (T8) de BeckmanCoulter, parte nQ 6602139.

Anticorpo contra TCR: clone BMA031 de Beckman Coulter, partengIM1466.

Anticorpo contra CD4: clone SFCI12T4D11 (T4) de BeckmanCoulter, parte ns 6602138.

Anticorpo contra HMFG-1: clone 1.10.F3 de Beckman Coulter,parte ne IM0271.

Peptídeos

Os peptídeos FluMWee (GILGFVFTL), HIV-Pol476-484 (ILKEP-VHGV, controle negativo em ensaio ELISPOT) msurv33 (LYLKNYRIA, epito-po peptídico de survivina murina específico para H2d, controle negativo emensaios de ligação T2), iLR159.68 (LLAARAIVAI), iLR2146-is4 (ALCNTDSPL),iLR360-68 (LAARAIVAI), iLR458-66 (LLLAARAIV), iLR57-i5 (VLQMKEEDV),iLR650-58 (NLKRTWEKL), iLR766-74 (VAIENPADV), ÍLR8139-147 (YVNLPTIAL),iLR9i77-i85 (MLAREVLRM), ÍLRIO249-257 (SEGVQVPSV), iLR1118.26 (FLAAG-THLG), iLR1257-66 (KLLLAARAIV), iLR1367-76 (AIENPADVSV), ÍLR14173-182(LMWWMLAREV) foram comprados de Biosynthan (Berlim, Alemanha), commais de 90% de pureza, e foram analisados por cromatografia líquida de altaeficiência e espectrometria de massas.

Síntese e análise dos peptídeos

Os peptídeos foram sintetizados em um sintetizador de peptí-deos automatizado EPS221 (Abimed, Langenfeld, Germany) segundo a es-tratégia Fmoc/tBu. Após a remoção da resina por meio de tratamento comTFA/fenol/etanoeditiol/tioanisol/água (90/3,75/1,25/2,5/2,5 por vol.) durante 1h ou 3 h (peptídeos contendo arginina), os peptídeos foram precipitados doéter metil-terc. butila, lavados uma vez com éter metil-terc. butila e duas ve-zes com éter dietílico e ressuspendidos em água antes da liofilização. Osprodutos da síntese foram analisados com HPLC (Varian star, Zinsser analy-tics, Munique, Alemanha) e espectrometria de massas MALDI-TOF (future,GSG, Bruchsal, Alemanha). Os peptídeos com pureza inferior a 80 % forampurificados através de HPLC preparativa.

Ensaio de ligação de T2O ensaio de ligação de células inteiras 72 foi efetuado utilizandoum protocolo adotado de Casati et al. Casati C, Dalerba P, Rivoltini L et al.The apoptosis inhibitor protein survivin induces tumor-specific CD8+ andCD4+ T cells in colorretal câncer patients. Câncer Res. 2003; 63, 4507-4515.).

Geração de CTL humano

Os CTLs derivados de indivíduos HLA-A*0201+ sadios foramgerados utilizando um protocolo descrito em outra fonte (Zeis M, Siegel S,Schmitz M et al. Induction of cytotoxic T lymphocytes against hematologicneoplasms by survivin RNA-transfected dendritic cells. J Immunol. 2003;170, 5391-5397.). Para a indução de CTLs autólogos específicos para o pep-tídeo da OFA/iLR obtidos de pacientes com AML e CLL, as células T CD8+foram separadas das PBMC usando partículas imunomagnéticas (MACS®,Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Alemanha), cultivadas com DC autólogas to-talmente maduras pulsadas com o peptídeo da OFA/iLR e reestimuladascom PBMC autólogas pulsadas com peptídeo na presença de IL-2 (1ng/ml,CelIConcepts, Weisskirch, Alemanha). Após pelo menos quatro reestimula-ções semanais, determinou-se a reatividade dos CTL em um ensaio conven-cional de libertação de 4h 51Chromium. Ensaios de inibição por marcaçãofria (cold target), e os experimentos de bloqueio de anticorpos foram efetua-dos conforme anteriormente descrito (Zeis M, Siegel S, Schmitz M et al. In-duction of cytotoxic T lymphocytes against hematologic neoplasms by survi-vin RNA-transfected dendritic cells. J Immunol. 2003; 170, 5391-5397.).

Ensaio ELISPOT

Para determinar a freqüência das células T específicas do peptí-deo da OFA/iLR nos pacientes, efetuaram-se ensaios ELISPOT usando o KitInterferon-y-ELISPOT (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) de acordocom as instruções do fabricante.Tabela 1: Peptídeos e epitopos peptídicos de células auxiliares

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Resultados

Peptídeos: ILR1 (LLAARAIVAI, SEQ ID No 1) e ILR2(ALCNTDSPL, SEQ ID No 2)

Em todas as análises ELISPOT, os números para os spots IFNgama positivos são dados por 105 PBMC. Antes da análise, as células Tprovenientes de pacientes e doadores saudáveis foram mantidas em cultivodurante sete dias na presença de interleucina-2 (IL-2) (10 unidades/ml) epeptídeo (10 micrograma/106 PBMC/mililitro).

Todas as amostras de doadores saudáveis sondadas têm baixonúmero de CTL respondendo a ILR.1 ou ILR2 (tabela 2) na análise ELISPOTde IFN-y.Tabela 2

<table>table see original document page 48</column></row><table>

De todas as amostras de tumores analisadas dos pacientes comCTL, 12/20 (60%) apresentaram respostas de CTL significativas (>20) contrao peptídeo ILR1, e 9/16 (56%) apresentaram respostas contra o peptídeoILR2 na análise ELISPOT de IFN-y. Os números medianos de CTLs tingidaspositivamente para os dois peptídeos derivados de ILR confrontam-se com55% (ILR2) e 76% (ILR1) dos números de respostas obtidas com um antigê-nio de memória comum restrito de HLA-A*02 proveniente da proteína da ma-triz influenza, contra o qual praticamente todo adulto deve ter tido respostaimune celular anteriormente (tabela 3).Tabela 3 <table>table see original document page 49</column></row><table>

De todas as amostras de tumores analisadas dos pacientes comAML, 6/15 (40%) apresentaram respostas de CTL significativas (>20) contrao peptídeo ILR1, e 7/15 (47%) apresentaram respostas contra o peptídeoILR2 na análise ELISPOT de IFN-y (tabela 4).Tabela 4

<table>table see original document page 50</column></row><table>

De todas as amostras de tumores analisadas dos pacientes commieloma, 8/14 (57%) apresentaram respostas de CTL significativas (>20)contra o peptídeo ILR1, e 6/14 (43%) apresentaram respostas contra o pep-tídeo ILR2 na análise ELISPOT de IFN-y (tabela 5).Tabela 5

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Em suma, o potencial dos peptídeos ILR1 e 2 da OFA-ILRP paraevocar respostas imunes celulares contra células de câncer, especificamen-te de leucemias e linfomas, é claramente visível. As células T específicaspara ditos peptídeos mostram funções efetoras (secreção de IFN-y gamma)

Tabela 6: Resumo da análise de tetrâmeros relativa à expansãodirigida por microesferas dos linfócitos CD8+ provenientes do sangue perifé-rico específicos para A2/RPS-001 e A2/RPS-002. 1 x 106 CD8+ enrichedPBMCs per well were stimulated as in Figure 12 with microspheres coupledto anti-CD28 plus high densitiy tumor antigen A*0201/RPS-001 or high den-sity tumor antigen A*0201/RPS-002. São indicados os números de doadoresde HLA-A2+ avaliáveis, o número de doadores com pelo menos uma respos-ta claramente positiva, o número de estimulações avaliáveis entre todos osdoadores avaliáveis e o número de estimulações avaliáveis com respostasclaramente positivas. RPS-001 = LLAARAIVAI (SEQ ID-No. 1); RPS-002 =[ne3] ALCNTDSPL (SEQ ID-No. 2)

Tabela 6:

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Experimentos ulteriores com ILR1 (LLAARAIVAI)

As células T que reconhecem o peptídeo ILR1 foram testadasem K562 [linhagem de células de leucemia proeritroblástica, também conhe-cida como linhagem de células de leucemia mielogenosa crônica (CML), asquais, devido aos níveis extremamente baixos de HLA, funcionam como con-troladoras na exclusão de células NK como células efetoras], IM9 (linhagemde células linfoblastóides B humanas), Karpas-422 (linfoma da célula B hu-mana), Balm-3 (linhagem de células humanas de B-linfoma do tipo não-Burkitt), U266 (mieloma múltiplo humano), REH (leucemia da célula B pre-cursora humana), MEC-1 (leucemia crônica da célula B humana). As mes-mas células T foram utilizadas para testar PBMC autólogas e alogenicas dedoadores saudáveis como controle. Todas as linhas de células, exceto MEC-1, que não expressa a alela HLA-A*02, e K562, que é defetiva para a ex-pressão de genes HLA de classe I em geral, foram reconhecidas pelas célu-las T específicas para ILR1 (vide figura 1). Nem as células alogenicas nemas autólogas provenientes de doadores saudáveis foram reconhecidas, indi-cando que

1. ILR1 é significativamente expresso no nível de peptídeosomente em células tumorais, mas não nas células san-güíneas mononucleares provenientes de doadores saudá-veis HLA compatíveis.

2. A resposta não é dirigida contra antigênios alogênicos docomplexo de histocompatibilidade maior ou menor.

3. O peptídeo ILR1 é reconhecido de uma maneira restrita aHLA.

4. A restrição é específica para a alela (específica para A*02).Alvo: AML

As células T específicas para ILR1 restrito para HLA-A*02 foramtestadas em células tumorais de pacientes com AML (4 pacientes; amostrasAML-01, -02,-03, -06) (figura 4A). As células provenientes de pacientesA*02-positivos (3/4) foram reconhecidas com lise máxima a uma razão E:Tde 40:1 na faixa entre 25,9% e 39,8%. As células AML de paciente comAML-06 A*02-negativo não foram reconhecidas.

As células T específicas para ILR1 restrito para HLA-A*02 foramtestadas uma segunda vez em células tumorais de pacientes com confirmaros resultados obtidos no primeiro experimento (9 pacientes; amostras AML-01, -02, -04, -05, -06, -07, -09, -10, -12). As células de pacientes A*02-positivos (5/9; AML-02, -04, -05, -09, -10) foram reconhecidas em todos oscasos. As células provenientes de pacientes A*02-negativos (4/9; AML-01, -06, -07, -12) não foram reconhecidas (4/4) (figura 4B).

A figura 4B também mostra dados relativos às células progenito-ras CD34-positivas derivadas da medula óssea de doadores A*02-positivos(CD34-01), -02), que não foram reconhecidas pelas células T ativadas espe-cíficas para ILR1, que haviam sido reestimuladas com ILR1 na presença deIL-2 in vitro durante 7 dias. As células de medula óssea (BM-01, -02) de do-adores A*02-positivos também não foram reconhecidas por esses clones decélulas T.

A figura 2 mostra os experimentos com bloqueio de anticorposdestinados a caracterizar melhor a especificidade da resposta de célula T.Antes dos experimentos de libertação de 51 Cr a uma razão E:T constante de40:1, as mAbs bloqueadoras foram incubadas com a linhagem de células IM-9 de linfoblastos B humanos em concentrações de mAb de acordo com asinstruções do fabricante. Os experimentos de bloqueio indicam que o reco-nhecimento de ILR1 é mediado por

1. células com receptores para células T (TCR),

2. que reconhecem o seu alvo no contexto de MHC de classeI (HLA de classe I),

3. por um mecanismo de interação dependente do co-recep-tor CD8, mas não CD4.

O controle mAbs específico para as proteínas MAM-6 (sinôni-mos: CA 15-3, DF3) e HMFG-1, encontradas na superfície celular, seme-lhantes à mucina e irrelevantes, não exercem nenhum efeito no reconheci-mento das células IM-9 pelas células T efetoras. Usou-se PBS como contro-le negativo nesses experimentos de bloqueio.

Em suma, esses dois conjuntos de experimentos confirmam que

1. o ILR1 é um antigênio associado a tumor em 100% (8/8)dos pacientes com AML A*02-positivos testados (8/13);

2. o ILR1 é restringido por HLA-A*02;

3. as células T específica para ILR1 reconhecem ILR2 pro-cessado naturalmente nas células tumorais, enquanto queao mesmo tempo o peptídeo ILR1 parece estar ausente namedula óssea e nas células progenitoras CD34-positivas.

4. A interação entre alvos e células efetoras pode ser inibidaespecificamente com mAbs contra MHC de classe I. TCRou CD8.

Alvo: CLL

As células T específicas para ILR1 restrito para HLA-A*02 foramtestadas em células tumorais de pacientes (5 pacientes; amostras CLL-01, -02, -03 ,-05, -06). As células de pacientes A*02-positivos (3/5) foram reco-nhecidas em todos os casos (3/3). As células de pacientes A*02-positivosnão foram reconhecidas em nenhum caso (0/2) (figura 3B). Repetiu-se o ex-perimento (figura 3A) com mais 8 pacientes com CLL, dos quais 4/8 eramA*02-positivos. Como as células CLL de 4/4 pacientes A*02-positivos foramreconhecidas, enquanto 0/4 células alvo A*02-negativas foram reconhecidas,esses experimentos complementares confirmaram os resultados acimamencionados. Em suma:

1. o ILRÍ é um antigênio associado a tumor em 100% (7/7)dos pacientes com AML A*02-positivos testados;

2. o ILR1 é restringido por HLA-A*02;

Alvo: T2

As células T2 são defetivas para a expressão de TAP, o "trans-portador associado ao processamento de antigênios", o qual é responsávelpelo transporte dos peptídeos curtos do citoplasma até ao retículo endo-plasmático (ER), onde os peptídeos são carregados em moléculas MHC declasse I vazias. Conseqüentemente, as moléculas MHC de classe I das célu-las T2 permanecem vazias sem a adição de peptídeos (carregamento exter-no). Assim, as células T2 que expressam moléculas HLA-A*02 vazias nasuperfície celular são excelentes alvos para determinar as curvas de titula-ção para a destruição de células específica para o peptídeo através de célu-las T restritas a HLA-A*02.

Neste experimento (figura 5A), as células T específicas paraILR1 foram testadas em células T pulsadas quer com um epitopo de célula Tdo HIV, já bem descrito, quer com o peptídeo ILR1 LLAARAIVAI. Resulta-dos: as células T reconheceram apenas células T2 pulsadas com o peptídeoILR1. As células T2 pulsadas com o peptídeo do HIV não foram reconheci-das. Os alvos T2 pulsados com o peptídeo ILR1 foram lisados de uma ma-neira dose-dependente. A lise não atingiu a saturação na gama de concen-trações testadas.Alvo: T2 + ILR1

Realizou-se um ensaio de inibição por marcação fria (cold tar-get). Para examinar se as células T específicas de ILR1 destroem especifi-camente as células T2 pulsadas pelo peptídeo ILR1 e no contexto de HLA-A*02, realizaram-se os ensaios de inibição por marcação fria (cold target) daseguinte forma: Células T2 marcadas com 51Cr foram carregadas com peptí-deos em uma concentração de 10 microgramas peptídeo/106 células T2/ml.Depois, um total de 2x105 células T2 não marcadas, que foram previamentecarregadas por igual com o mesmo ou com um peptídeo de controle, foramjuntados em um volume de 50 microlitros AIMV para 104 células T2 pulsadaspor peptídeo e marcadas com 51Cr. Juntaram-se células T efetoras específi-cas para ILR1 e realizou-se um ensaio de libertação de 51Cr, conforme des-crito acima. A análise demonstra que nem os peptídeos irrelevantes para osCTL específicos de ILR1 (survivina e ILR2), nem as células T2 não carrega-das, as quais exibem moléculas HLA-A*02 vazias nas suas superfícies celu-lares, competem pela lise dos alvos carregados com o peptídeo ILR1 pelosCTL específico de ILR1. Pelo contrário, uma vez que se tenham utilizadocomo alvos secundários (frios) os alvos pulsados com o peptídeo sintéticoILR1 ou com células tumorais de AML apresentando naturalmente ILR1 nocontexto de HLA-A*02, então estas competem com as células alvo primárias(T2 quentes, pulsadas com o peptídeo ILR1) pela lise através dos CTLs es-pecíficos de ILR1 (figura 5B).

Experimentos ulteriores com ILR2 (ALCNTDSPL)

As células T que reconhecem o peptídeo ILR2 (figura 6) foramtestadas em K562 [linhagem de células de leucemia proeritroblástica, tam-bém conhecida como linhagem de células de leucemia mielogenosa crônica(CML), que, devido aos níveis extremamente baixos de HLA, funcionam co-mo controladoras na exclusão de células NK como células efetoras], IM9(linhagem de células linfoblastóides B humanas), Karpas-422 (linfoma dacélula B humana), Balm-3 (linhagem de células humanas de B-linfoma dotipo não-Burkitt), U266 (mieloma múltiplo humano), REH (leucemia da célulaB precursora humana), Ramos (sinônimo: RA 1; um linfoblasto B do linfomade Burkitt humano), MEC-1 (leucemia crônica humana da célula B). Asmesmas célula T foram utilizada para testar PBMC autólogas e alogênicasde doadores saudáveis para controle.

Todas as linhagens de células, exceto Ramos e MEC-1, que nãoexpressam a alela HLA-A*02, e K562, que é defetiva para a expressão dogene HLA de classe I em geral, foram reconhecidas pelas células T específi-cas para ILR2. Nem as células alogênicas nem as células autólogas prove-nientes de doadores saudáveis foram reconhecidas, indicando que1. ILR2 é significativamente expresso no nível de peptídeosomente em células tumorais, mas não nas células san-güíneas mononucleares de sangue provenientes de doado-res saudáveis HLA compatíveis.

2. A resposta não é dirigida contra antigênios alogênicos docomplexo de histocompatibilidade maior ou menor

3. O peptídeo ILR2 é reconhecido de maneira restrita a HLA.

4. A restrição é específica para a alela (específica para A*02).

Alvo: AML

As células T específicas para ILR1 restrito para HLA-A*02 foramtestadas em células tumorais de pacientes com AML (8 pacientes; amostrasAML-01, -02, -04 ,-05, -06, -07, -10, -12). As células de pacientes A*02-positivos (4/8; AML-02, -04, -05, -10) foram reconhecidas em todos os casos(4/4). As células de pacientes A*02-negativos (4/8, AML-01, -06, -07, -12)não foram reconhecidas (4/4) (figura 8A). O experimento foi realizado umasegunda vez com amostras de pacientes que não haviam sido testados an-teriormente. Nesse segundo experimento, as células T específicas para ILR1restrito para HLA-A*02 foram testadas novamente em células tumorais depacientes com AML (4 pacientes; amostras AML-01, -02, -03, -06). As célu-las de pacientes A*02-positivos (3/4) foram reconhecidas em todos os casos.As células de pacientes A*02-negativos não foram reconhecidas em (0/1)(figura 8B).

A figura 8A mostra dados relativos a células progenitoras CD34-positivas derivadas da medula óssea de doadores A*02-positivos (CD34-01,-02), que não foram reconhecidas pelas células T ativadas específicas paraILR2, que haviam sido reestimuladas com ILR2 na presença de IL-2 in vitrodurante 7 dias. As células de medula óssea (BM-01, -02) de doadores A*02-positivos também não foram reconhecidas por esses clones de células T.

A figura 7 mostra os experimentos com bloqueio de anticorposdestinados a caracterizar melhor a especificidade da resposta de célula T.Antes dos experimentos de libertação de 51 Cr a uma razão E:T constante de40:1, as mAbs bloqueadoras foram incubadas com a linhagem de células IM-9 de linfoblastos B humanos em concentrações de mAb de acordo com asinstruções do fabricante. Os experimentos de bloqueio indicam que o reco-nhecimento de ILR2 é mediado por células com receptores de células T (T-CR) que reconhecem os seus alvos no contexto de MHC de classe I (HLA declasse I), por meio de um mecanismo de interação dependente do co-receptor CD8, mas não do CD4.

O controle mAbs específico para as proteínas MAM-6 (sinôni-mos: CA 15-3, DF3) e HMFG-1, encontradas na superfície celular, seme-lhantes à mucina e irrelevantes, não exercem nenhum efeito no reconheci-mento das células IM-9 pelas células T efetoras. Usou-se PBS como contro-le negativo nesses experimentos de bloqueio. Em suma, esses dois conjun-tos de experimentos confirmam que

1. o ILR2 é um antigênio associado a tumor em 100% (7/7)dos pacientes com AML A*02-positivos testados;

2. o ILR2 é restringido por HLA-A*02;

3. as células T específica para ILR2 reconhecem ILR2 pro-cessado naturalmente nas células tumorais, enquanto queao mesmo tempo o peptídeo ILR1 parece estar ausente namedula óssea e nas células progenitoras CD34-positivas.

Alvo: CLL

As células T específicas para ILR2 restrito para HLA-A*02 foramtestadas em células tumorais de pacientes com CLL (8 pacientes; amostrasCLL-01, -02, -03 ,-04, -05,-06, -07, -08). As células de pacientes A*02-positivos (4/8) foram reconhecidas em todos os casos (4/4). As células depacientes A*02-negativos não foram reconhecidas em nenhum caso (0/4)(figura 9A). Repetiu-se o experimento (figura 9B) com mais 5 pacientes comCLL, dos quais 3/5 eram A*02-positivos. Como as células CLL de 3/3 pacien-tes A*02-positivos foram reconhecidas, enquanto 0/2 células alvo A*02-negativas foram reconhecidas, esses experimentos complementares confir-maram os resultados acima mencionados. Conclusão e sumário:

1. o ILR2 é um antigênio associado a tumor em 100% (7/7)dos pacientes com CLL A*02-positivos testados;

2. ILR2 é restringido por HLA-A*02;

Alvo: 12

As células T2 são defetivas para a expressão de TAP, o "trans-portador associado ao processamento de antigênios", o qual é responsávelpelo transporte dos peptídeos curtos do citoplasma até ao retículo endo-plasmático (ER), onde os peptídeos são carregados em moléculas MHC declasse I vazias. Conseqüentemente, as moléculas MHC de classe I das célu-las T2 permanecem vazias sem a adição de peptídeos (carregamento exter-no). Assim, as células T2 que expressam moléculas HLA-A*02 vazias nasuperfície celular são excelentes alvos para determinar as curvas de titula-ção para a destruição de células específicas para o peptídeo através de cé-lulas T restritas a HLA-A*02. Neste experimento, as células T específicaspara ILR2 foram testadas em células T2 pulsadas quer com um epitopo decélula T do HIV, já bem descrito, quer com o peptídeo ILR1 ALCNTDSPL.Resultados: as células T reconheceram apenas células T2 pulsadas com opeptídeo ILR2. As células T2 pulsadas com o peptídeo do HIV não foramreconhecidas. Os alvos T2 pulsados com o peptídeo ILR2 foram lisados deuma maneira dose-dependente. A lise não atingiu a saturação na gama deconcentrações testadas (figura 10A).

Alvo: T2 + ILR2

Realizou-se um ensaio de inibição de alvos frios conforme des-crito acima a respeito de "T2 + ILR1". Os resultados deste experimento con-firmam que nem os peptídeos irrelevantes para os CTL específicos de ILR2(survivina e ILR1), nem as células T2, que exibem moléculas HLA-A*02 va-zias nas suas superfícies celulares, competem pela lise dos alvos carrega-dos com o peptídeo ILR2 pelos CTL específico de ILR2. Pelo contrário, umavez que se tenham utilizado como alvos secundários (frios) os alvos pulsa-dos com o peptídeo sintético ILR2 ou com células tumorais de AML apresen-tando naturalmente ILR2 no contexto de HLA-A*02, então estas competemcom as células alvo primárias (T2 quentes, pulsadas com o peptídeo ILR2)pela lise através dos CTLs específicos de ILR2 (figura 10B).

Em suma, os dois peptídeos de ILR da invenção são candidatospara o desenvolvimento de vacinas terapêuticas à base de peptídeos parapacientes com câncer em geral.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Immatics biotechnologies GmbH

<120> Identificação de epítopos de célula T apresentados por

HLA-A2, derivados da proteína receptora de laminina ima-tura do antigênio oncofetal e utilizações das mesmas

<130> I30508PCT

<160> 17

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Leu Leu Ala Ala Arg Ala lie Vai Ala lie1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Leu Cys Asn Thr Asp Ser Pro Leu

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gly lie Leu Gly Phe Vai Phe Thr Leu1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

lie Leu Lys Glu Pro Vai His Gly Vai1 5<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Leu Tyr Leu Lys Asn Tyr Arg lie Ala1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Leu Ala Ala Arg Ala lie Vai Ala lie1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Leu Leu Leu Ala Ala Arg Ala lie Vai1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Vai Leu Gln Met Lys Glu Glu Asp Vai1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Asn Leu Lys Arg Thr Trp Glu Lys Leu1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 10

Vai Ala lie Glu Asn Pro Ala Asp Vai1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Tyr Vai Asn Leu Pro Thr lie Ala Leu1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Leu Ala Arg Glu Vai Leu Arg Met

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ser Glu Gly Vai Gln Vai Pro Ser Vai1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Phe Leu Ala Ala Gly Thr His Leu Gly1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Lys Leu Leu Leu Ala Ala Arg Ala lie Vai15 10<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Ala lie Glu Asn Pro Ala Asp Vai Ser Vai1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Leu Met Trp Trp Met Leu Ala Arg Glu Vai15 10

Claims

1. Peptídeo associado ao tumor, selecionado dentre o grupo depeptídeo compreendendo pelo menos uma seqüência de acordo com qual-quer uma das SEQ ID N- 1 ou SEQ ID N5 2 ou uma das suas variantes, des-de que o peptídeo não seja o polipeptídeo intacto associado a tumor humano.

2. Peptídeo associado a tumor de acordo com a reivindicação 1,em que o peptídeo consiste essencialmente em uma seqüência de aminoá-cidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N91 ou SEQ ID N9 2 ou umadas suas variantes.

3. Peptídeo associado a tumor de acordo com a reivindicação 1ou 2, em que o dito peptídeo apresenta um comprimento total entre 9 e 30aminoácidos.

4. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, consistindo em uma seqüência de aminoácidos deacordo com qualquer uma das SEQ ID N9 1 ou SEQ ID N9 2.

5. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer umasdas reivindicações de 1 a 4, tendo a capacidade de se ligar a uma moléculado complexo maior de histocompatibilidade humana (MHC) de classe I, no-meadamente à HLA-A*0201.

6. Peptídeo associado a tumor de acordo com a reivindicação 5,em que o peptídeo, quando ligado a HLA-A*0201, capaz de provocar a pro-dução de um linfócito T citotóxico (CTL) que reconhece uma célula que ex-presse um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos dada.

7. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer umasdas reivindicações de 1 a 4, tendo a capacidade de se ligar a uma moléculado complexo maior de histocompatibilidade humana (MHC) de classe II, no-meadamente à HLA-DRB1.

8. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, em que o peptídeoinclui ligações não-peptídicas.

9. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, em que o peptídeo é uma proteína de fusão.

10. Ácido nucleico codificante de um peptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 9.

11. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10 que sejaDNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações dos mesmos.

12. Vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucleicocomo definido na reivindicação 10 ou 11.

13. Célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico comodefinido na reivindicação 10 ou 11 ou um vetor de expressão como definidona reivindicação 12.

14. Método de produzir um peptídeo associado a tumor comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, método este compre-endendo o cultivo da célula hospedeira como definido na reivindicação 13 eo isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do seu meio de cultivo.

15. Composição farmacêutica compreendendo um peptídeo as-sociado a tumor como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, um ácido nucleico como definido na reivindicação 10 ou 11 ou um vetor deexpressão como definido na reivindicação 12 e um veículo farmaceuticamen-te aceitável.

16. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 9, ácido nucleico como definido na reivindicação 10 ou 11 ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 12 parauso em medicina.

17. Vacina contra câncer compreendendo um peptídeo associa-do a tumor como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, áci-do nucleico como definido na reivindicação 10 ou 11 ou um vetor de expres-são como definido na reivindicação 12.

18. Uso de um peptídeo associado a tumor como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 9 ou de um ácido nucleico comodefinido na reivindicação 10 ou 11 ou de um vetor de expressão como defi-nido na reivindicação 12 na fabricação de um medicamento para destruircélulas alvo em um paciente, células alvo estas que expressem um polipep-tídeo compreendendo uma seqüência de aminoacidos tal como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 9.

19. Método in vitro para produzir linfócitos T citotóxicos ativados(CTL), método este compreendendo o contato in vitro do CTL com moléculasMHC humanas de classe I ou II carregadas com antigênios e expressas nasuperfície de uma célula apresentadora de antigênio adequada durante tem-po suficiente para ativar, de maneira específica para o antigênio, os referidosCTLs, sendo o antigênio um peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o antigê-nio é carregado em moléculas MHC de classe I ou II expressas na superfíciede uma célula apresentadora de antigênio adequada ao contactar uma quan-tidade suficiente do antigênio com uma célula apresentadora de antigênio.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a célulaapresentadora do antigênio compreende um vetor de expressão como defi-nido na reivindicação 12.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-19 a 21, sendo a molécula MHC de classe I HLA-A*0201.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-19 a 21, em que a molécula MHC de classe II HLA-DRB1.

24. Linfócitos T citotóxicos ativados (CTL) produzidos pelo mé-todo como definido em qualquer uma das reivindicações de 19 a 23 que re-conheçam seletivamente uma célula que expresse um polipeptídeo compre-endendo uma seqüência de aminoacidos dada como definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 9.

25. Receptor de célula T (TCR) que reconhece uma célula queexpresse um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoacidoscomo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, sendo o TCRobtenível a partir do linfócito T citotóxico (CTL) como definido na reivindica-ção 24 ou uma molécula funcionalmente equivalente ao TCR.

26. Ácido nucléico codificante de um receptor de células T (TCR)como definido na reivindicação 25.

27. Vetor de expressão capaz de expressar um receptor de célu-Ias T (TCR) codificante de ácido nucléico como definido na reivindicação 26.

28. Uso de linfócitos T citotóxicos conforme definidos na reivindi-cação 24 na fabricação de um medicamento para destruir células alvo emum paciente, células alvo estas que expressem um polipeptídeo compreen-dendo uma seqüência de aminoácidos como definido em uma das reivindi-cações de 1 a 9.