BRPI0715072A2 - antagonistas de miostatina - Google Patents

Abstract

ANTAGONISTAS DE MIOSTATINA. Polipeptídeo recombinante isolado possuindo atividade antagonista de miostatina, compreendendo um peptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde otruncamento do C terminal está em uma posição de ou entre os aminoácidos 281 e 329, ou um fragmento, variação ou derivado deste.

Description

ANTAGONISTAS DE MIOSTATINA CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se a novas proteínas cora atividade antagonista de miostatina. A presente invenção também se relaciona ao uso de novas proteínas no tratamento de disfunções relacionadas à miostatina.

FUNDAMENTOS

A miostatina (ou GDF-8) é um regulador negativo do crescimento muscular e é estruturalmente relacionado à superfamília do fator de crescimento de transformação β (TGF-β) {McPherron e outros, 1977). Mais particularmente, a miostatina é um regulador negativo potente do desenvolvimento do músculo esquelético, e na vida adulta. A miostatina é também encontrada em uma ampla faixa de espécies, de peixes a mamíferos, e a proteína miostatina é altamente conservada e homóloga através das espécies (McPherron e Lee, 1997). A miostatina exerce seus efeitos biológicos através a interação com o receptor de superfície celular activina tipo IIB (Lee e outros, 2001). A miostatina é também conhecida por regular sua própria expressão através de um mecanismo que é incompletamente compreendido no momento (Spiller e outros, 2002,

Rebbapragada e outros, 2003) .

Tem sido demonstrado que a miostatina inibe a proliferação e a diferenciação de mioblastos sem induzir a apoptose ou estimular a ruptura da proteína do músculo (Thomas e outros, 2 000; Langley e outros, 2 002; Rios e outros, 2001; Taylor e outros, 2 001). Camundongos sacrificados que receberam miostatina tiveram sua massa muscular aumentada enormemente por todo o corpo. Camundongos sem miostatina possuem peso corporal aproximadamente 30% maior que camundongos normais, e exibem um aumento de 2 a 3 vezes no peso muscular individual devido à hiperplasia e hipertrofia da fibra muscular. Mutações naturais em miostatina foram identificadas como sendo responsáveis pelo fenótipo «duplo músculo", tal como as raças de gado Belgian Blue e Piedmontese (McPherron e outros, 1997; Kambadur e outros, 1997; Grobet e outros, 1997). Um fenótipo similar foi observado em um humano que possui um gene de miostatina defeituoso {Schuelke e outros, 2004) . A interpretação da função da miostatina em vários processos biológicos através de estudos de animais sem miostatina foi confundida pela incapacidade em distinguir entre os efeitos do desenvolvimento pré-natal e os efeitos que se relacionam à carência de miostatina durante a vida

jovem e adulta.

Entretanto, a miostatina tem sido envolvida em várias

disfunções associadas com desgaste muscular, ou atrofia muscular, tal como visto em indivíduos afetados por HIV, câncer, repouso prolongado, distrofia muscular ou em sarcopenia relacionada à idade (Gonzalez-Cadavid e outros, 1998; Langley e outros, 2004; Zachwieja e outros, 1999; Bogdanovich e outros, 2002; W02006/083183). Foi demonstrado que a administração in vivo de miostatina induz a caquexia, uma forma severa de perda muscular associada com câncer e sepse (Zimmers e outros, 2002) e que pode também ocorrer como um resultado de repouso prolongado. Além disso, a regulação para cima da miostatina na atrofia muscular induzida por glicocorticóide foi observada (Ma e outros, 2003) . Mudanças na expressão da miostatina têm sido apresentadas em outras condições, por exemplo, regulada para cima em cardiomiôcitos após dano cardíaco, e regulada para baixo na regeneração de músculo (Sharma e outros,

1999).

A miostatina tem também sido ligada a muitos outros

processos biológicos. Por exemplo, camundongos transgênicos sacrificados possuem estrutura de osso cortical alterada indicando uma função na osteogênese (Hamrick, 2003). Além disso, a miostatina tem se mostrado envolvida na regulação da glicose e metabolismo da gordura, assim ela pode estar envolvida no diabetes tipo 2 e obesidade (McPherron e Lee, 2002). A miostatina tem-se mostrado envolvida na resposta inflamatória durante a cura de ferimentos (W02006/083182).

A função principal executada pela miostatina na regulação do desenvolvimento muscular e diferenciação e a patologia de muitas doenças e disfunções têm levado à pesquisa por antagonistas de miostatina. Embora muitos antagonistas da miostatina tenham sido desenvolvidos tal como os anticorpos anti-miostatina (US 6096506 e US 6468535); e um receptor tipo IIB de activina truncado, pre- domínio de miostatina e folistatina (WO 02/085306) ; inibidores de miostatina liberados em cultura de células que superexpressam a miostatina <W0 00/43781); negativos dominantes de miostatina (WO 01/53350) ; e pequenos peptídeos incluindo o domínio de WMCPP que se liga a e inibe a miostatina (US 2004/0181033); não hã correntemente nenhum antagonista de miostatina em uso clínico. Assim, ainda existe uma necessidade em desenvolver antagonistas de miostatina mais potentes para uso como agentes terapêuticos. 10

Consequentemente, é um objetivo da invenção fornecer proteínas com atividade antagonista da miostatina para o tratamento de disfunções relacionadas à miostatina, e/ou para fornecer uma escolha útil ao público.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção está direcionada aos novos peptídeos recombinantemente produzidos possuindo atividade

antagonista da miostatina.

Em um aspecto a presente invenção fornece um

polipeptídio recombinante isolado possuindo atividade

antagonista de miostatina, compreendendo um peptídeo de

miostatina maduro truncado no C terminal, onde o

truncamento do C terminal está em uma posição de ou entre

os aminoácidos 281 e 329, ou um fragmento, variação ou

derivado deste.

0 polipeptídio recombinante isolado pode ser

selecionado a partir de um grupo consistindo de um peptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento do C terminal está na posição de aminoácido 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 ou 329, ou um fragmento, variação ou derivado deste.

Preferivelmente, o polipeptídio recombinante isolado da invenção é selecionado a partir do grupo consistindo de um polipeptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento no C terminal está na posição de aminoácido 329, 320, 310, 300, 295, 289, 284, 282 OU 281 (Id. de Seq. n" 3 a 11), ou um fragmento, variante ou

20

25 derivado deste, ou um polipeptídeo possuindo homologia de

seqüência substancial ao mesmo.

Mais preferivelmente, o polipeptídio recombinante

isolado da invenção é selecionado a partir do grupo consistindo de um polipeptideo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento no C terminal está na posição de aminoãcido 329, 320, 310, 300, 295, 289, 284, 282 ou 281 (Id. de Seq. n'8 4 a 6), ou um fragmento, variante ou derivado deste, ou um polipeptídeo possuindo homologia de seqüência substancial ao mesmo.

A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma seqüência de nucleotideo que codifica um polipeptídeo da invenção ou uma seqüência complementar ao

mesmo.

Variações das seqüências de polipeptídeo e de polinucleotídeo da invenção podem ser desejáveis como uma forma de produzir um antagonista de miostatina possuindo características de ligação seletivamente alterados ou possuindo biodistribuição ou meia-vida melhoradas in vivo

ou sob armazenagem.

Preferivelmente, o polipeptídeo antagonista de

miostatina da invenção é parte de uma proteína de fusão

incluindo, além do antagonista, um ou mais polipeptídeos

que melhoram uma ou mais funções selecionadas a partir do

grupo consistindo de purificação, formação de complexos de

proteína, localização ou distribuição de tecido,

admissão/administração, estabilidade in vivo e/ou meia-vida

in vivo. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir um

domínio Fc de imunoglobulina tal como um fragmento Fc de

IgGl. A proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como um marcador de epitopo, um marcador FLAG, uma seqüência de polihistidina, ou uma fusão de GST. Preferivelmente, as seqüências marcadoras compreendem Id.

de Seq. n° : 13 e 14.

0 polipeptídio antagonista de miostatina da invenção

pode incluir um ou mais residuos de aminoãcido modificados,

tal-como um aminoãcido glicosilado, um aminoãcido PEGilado,

um aminoãcido farnesilado, um aminoãcido acetilado, um

aminoãcido biotinilado, um aminoãcido conjugado a uma

metade lipídio, um aminoãcido D ou um aminoãcido conjugado

a um agente de derivação orgânico.

A invenção também fornece uma composição farmacêutica, compreendendo pelo menos um polipeptídio isolado da invenção juntamente a um veículo farmaceuticamente

aceitável.

A presente invenção também fornece um método de regulação do desenvolvimento muscular, promoção da diferenciação adipogênica e/ou promoção do crescimento de osso ou mineralização em um animal compreendendo a administração ao referido animal de uma quantidade efetiva de pelo menos um polipeptídeo da invenção. Preferivelmente, o método pode ser usado para produzir massa muscular aumentada, depósito de gordura reduzido e/ou crescimento ósseo melhorado em um carneiro, gado, cervídeo, aves, peru, suíno, cavalo, camundongo, rato, gato, cão ou humano.

O animal pode ter níveis normais ou anormais de miostatina. Em animais com níveis normais de miostatina, o tratamento com os antagonistas da invenção irá resultar em massa muscular aumentada. Em animais com massa muscular normal, tal tratamento irá resultar em um aumento em massa muscular e pode ser particularmente útil na indústria de produção de carne. Em animais com massa muscular reduzida, devido a dano ou trauma muscular, perda devido a repouso, etc. , o tratamento com os antagonistas da invenção irá restaurar a massa muscular ao normal. Em animais com niveis de miostatina anormais, a massa muscular será invariavelmente reduzida e o tratamento com antagonistas de miostatina da invenção irá restaurar a massa muscular de

volta aos níveis normais.

A invenção também fornece um método para evitar,

tratar ou reduzir a gravidade de uma condição patológica relacionada a miostatina, que é caracterizada, pelo menos em parte, por uma quantidade anormal de desenvolvimento ou atividade metabólica muscular ou de tecido adiposo em um paciente, onde o referido método compreende administrar uma quantidade efetiva de pelo menos um polipeptídeo da invenção a um paciente em necessidade deste.

A condição patológica pode incluir disfunções relacionadas â hipertrofia muscular; atrofia muscular e perda muscular associados a miopatias inflamatórias, distrofias musculares, doenças neuromotoras, doenças de junção neuromuscular, doenças do nervo periférico, miopatias devidas a anormalidades endócrinas, síndrome metabólica, HIV, câncer, sarcopenia, caquexia, inatividade ou repouso prolongado e outras condições degenerativas; falhas cardíacas; osteoporose; falha ou doença renal; falha ou doença do fígado; anorexia; obesidade; diabetes e

cicatrização de ferimentos.

Como uma outra alternativa um polipeptídeo desta

invenção pode ser conjugada a um outro composto farmaceuticamente ativo para melhorar o efeito terapêutico na célula ou tecido objetivados entregando-se um segundo composto em um esforço para tratar as doenças ou indicações terapêuticas declaradas acima. Nestas combinações, o antagonista de miostatina da invenção pode ser independentemente e seqüencialmente administrado ou co-

administrado.

A presente invenção também fornece um método de regulação do desenvolvimento muscular de um animal 0 compreendendo a administração ao referido animal de uma quantidade efetiva de pelo menos um polipeptídeo da invenção. Preferivelmente, o método pode ser usado para produzir massa muscular aumentada em um carneiro, gado, cervídeo, aves, peru, suíno, cavalo, camundongo, rato,

.5 gato, cão ou humano.

BEEVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A invenção será também descrita com referência aos

seguintes desenhos, nos quais:

A Figura 1 mostra o efeito de antagonistas de

miostatina (300, 310 e 320) (em 1 e 5 ng/mL) na proliferação do mioblastos C2C12. Os mioblastos foram

colocados em cultura por 48 e/ou 72 horas.

A Figura 2 mostra o efeito inibitório da miostatina na proliferação de mioblastos C2C12 e recuperação usando-se os antagonistas de miostatina (300, 310 e 320) em três

concentrações (1, 5 e 10 μg/mL).

A Figura 3 mostra o número de núcleos PCNA positivo em

fibras isoladas de camundongos tipo selvagem jovens (1 mês

de idade). As fibras isoladas foram incubadas com nenhum

antagonista (controle) ou com 5 μ<3 de antagonista de miostatina (300) por 24 ou 48 horas.

A Figura 4 mostra dados de ativação de célula satélite de camundongos tipo selvagem jovens (1 mês de idade). As fibras isoladas foram incubadas com nenhum antagonista (controle) ou com 5 μ<3 de antagonista de miostatina (300) por 24 ou 48 horas. Células satélites ativadas foram detectadas por marcação de PCNA através de ICC. Os núcleos PCNA positivos foram contados para 100 mionúcleos e dados brutos convertidos em aumentos percentuais que foram

normalizados aos controles. * ρ =< 0,05.

A Figura 5 mostra dados de ativação de célula satélite

de camundongos tipo selvagem adultos (2 anos de idade) . As

fibras isoladas foram incubadas com nenhum antagonista

(controle) ou com 5 μg de antagonista de miostatina (300,

310 ou 320) por 24 ou 48 horas. Células satélites ativadas

foram detectadas por marcação de PCNA através de ICC. Os

núcleos PCNA positivos foram contados para 100 mionúcleos e

dados brutos convertidos em aumentos percentuais que foram

normalizados ao controle. * ρ =< 0,05.

A Figura 6 mostra o efeito quimio-inibidor de

miostatina em mioblastos primários de camumdongos adultos

(2 anos de idade) e recuperação usando-se antagonistas de

miostatina (300, 310 ou 320).

A Figura 7 mostra o efeito quimio-inibidor de

miostatina em mioblastos primários de camumdongos jovens (1 mês de idade) e recuperação usando-se antagonistas de

miostatina (300 e 310).

A Figura 8 mostra os dados de ativação de célula

satélite de camundongos recebendo solução salina (controle)

ou antagonista de miostatina (300) (6 Mg/g de peso corporal) três vezes por semana por seis semanas.

A Figura 9 mostra a capacidade de migração de mioblastos derivados de camundongos recebendo solução salina (controle) ou antagonista de miostatina (300) (6 w/q de peso corporal) três vezes por semana por seis

semanas.

A Figura 10 mostra a capacidade de migração de macrófagos derivados de medula óssea de camundongos recebendo solução salina (controle) ou antagonista de miostatina (300) (6 ng/g de peso corporal) três vezes por

semana por seis semanas.

A Figura 11 mostra a mudança percentual média na força

muscular em camundongos recebendo solução salina (controle) ou antagonista de miostatina (300) (6 μ<3/<3 de peso corporal) três vezes por semana por seis semanas.

A Figura 12 mostra a força muscular média do controle e camundongos tratados da Figura 11 no dia 0 e dia·. 42.

A Figura 13 mostra o efeito de antagonistas de miostatina (300, 310 e 320) (em i, 5 e 10 >ig/inL) na proliferação do mioblasto humano. Os mioblastos foram

postos em cultura por 144 horas.

A Figura 14 mostra o efeito de antagonistas de

miostatina (300, 310 e 320) (em 1, 5 e 10 iig/mL) na proliferação do mioblasto ovino. Os mioblastos foram postos

em cultura por 48 horas.

A Figura 15 mostra que MyoD e Pax7 são regulados para

cima nos músculos bíceps femoral, músculo tibial anterior e gastrocnêmio depois do tratamento com antagonista de miostatina (300) em camundongo mdx. A Figura 16 mostra que o antagonismo de miostatina com 300 melhora a regeneração muscular e reduz a necrose em

camundongo mdx.

A Figura 17 mostra que o antagonismo de miostatina com

300 diminui a atividade da creatina quinase em camundongo mdx.

A Figura 18 mostra que o antagonismo de miostatina com 300 diminui a força muscular em camundongo mdx.

A Figura 19 mostra o aumento na força muscular apôs administração de longa duração de 300 em camundongo do tipo selvagem.

A Figura 2 0 mostra cura aumentada de ferimentos em camudongos após biopsia de pele quando tratados com

antagonista de miostatina (300) .

A Figura 21 mostra a deposição de colãgeno na área ferida em camundongos após queimadura de pele e sem

tratamento com 300.

A Figura 22 mostra números aumentados de marcadores

miogênicos (número total de núcleos centralmente formados

(CFN)) após queimadura de músculo quando tratado com 300

quando comparado à solução salina.

A Figura 23 mostra números aumentados de marcadores miogênicos (número de fibras com núcleos centralmente formados (CFN)) após queimadura de músculo quando tratado com 300 quando comparado à solução salina.

A Figura 24 mostra que o antagonismo de miostatina com 300 resgata a expressão de p-FoxOl após a inibição com

miostatina.

A Figura 25 mostra a mudança de peso corporal percentual média durante 22 dias após o tratamento com Dexametasona ou Dexametasona em combinação com 300. A Figura 26 mostra os pesos de depósitos de gordura retroperitoneal após o tratamento com Dexametasona ou

Dexametasona em combinação com 300.

A Figura 27 mostra a expressão de MyoD média após o tratamento com Dexametasona ou Dexametasona em combinação com 3 00.

A Figura 28 mostra a expressão de Pax7 média após o tratamento com Dexametasona ou Dexametasona em combinação

com 300.

A Figura 29 mostra os resultados do ensaio de

proliferação de mioblastos de miméticos (280 e 329) em três

concentrações (1, 5 e 10 jig/mL) além de 300 a 10 wj/kiL no

controle positivo após 4 8 horas e 72 horas; e

A Figura 30 A (controle) e B (tratado com 300) mostra

mancha de van Giesen do músculo, 21 dias após do dano da queimadura, em que as setas indicam depósitos de colãgeno no músculo, isto é, formação de tecido fibrótico rio músculo. 0 músculo tratado com solução salina (controle) mostra uma maior quantidade de depósito de colágeno quando comparado ao músculo tratado com antagonista 300. As figuras 30 C e D mostram mancha de H&E do músculo. 0 músculo tratado com solução salina (C) mostra fibras de degeneração necróticas. 0 músculo tratado com antagonista 300 (D) mostra fibras manchadas mais escuras, muitas com núcleos centralmente formados, indicando fibras nascentes e

em regeneração.

A Figura 31 mostra a alta homologia de seqüência da

seqüência de miostatina através das espécies.

DEFINIÇÕES EXEMPLARES A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem os mesmos significados conforme comumente compreendido por qualquer um habilitado na técnica ã qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e composições similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos preferidos e composições são descritos aqui. Para os propósitos da presente invenção, os seguintes termos são

definidos abaixo:

"Hipertrofia" conforme usado por toda a especificação

e reivindicações significa qualquer aumento no tamanho da célula.

"Hiperplasia" conforme usado por toda a especificação e reivindicações significa qualquer aumento no número de

células.

"Atrofia muscular" conforme usado por toda a especificação e reivindicações significa qualquer desgaste ou perda de tecido muscular resultante da carência de uso.

"Sarcopenia" conforme usado por toda a especificação e reivindicações significa um declínio em massa muscular e performance causada por idade adulta, assim como disfunções musculares relacionadas à sarcopenia ou outras disfunções relacionadas à idade caracterizadas por atrofia muscular e uma diminuição na capacidade das células satélites se

tornarem ativadas.

"Inibidor" ou "antagonista" de miostatina conforme

usado por toda a especificação e reivindicações significa

qualquer composto que atue para diminuir, ou no todo ou em

parte, a atividade da miostatina.

«Desenvolvimento muscular" deve ser compreendido como significando a divisão e/ou diferenciação de células musculares e inclui a divisão e/ou diferenciação de qualquer célula precursora, fusão de tais células entre si e/ou com fibras musculares existentes, e também inclui síntese de proteína aumentada em miofibras levando a um conteúdo de proteínas maior e maior volume de fibra

muscular (hipertrofia de fibra muscular).

0 termo «polinucleotídeo» deve ser compreendido como significando um polímero de ácidos desoxirribonucléicos ou ácidos ribonucléicos, e inclui tanto polímeros de filamento simples quanto polímeros de filamento duplo, incluindo DNA, RNA, cDNA, DNA genômico, DNA recombinante, moléculas de ácido nucléico preparadas de nucleosídeos ou nucleotídeos naturais ou artificiais, e todas as outras formas conhecidas de polinucleotídeos. O polinucleotídeo pode ser isolado de uma fonte que ocorre naturalmente, produzido usando-se técnicas biológicas recombinantes ou moleculares, ou produzido sinteticamente. Um polinucleotídeo pode inclui um gene inteiro ou qualquer parte deste, e não tem que incluir um quadro de leitura aberto. O uso de todos os polinucleotídeos de acordo com a presente invenção inclui qualquer um e todos os quadros de leitura abertos. Os quadros de leitura abertos podem ser estabelecidos usando- se técnicas conhecidas na técnica. Estas técnicas incluem a análise de seqüências de polinucleotídeo para identificar códons iniciais e de parada conhecidos. Muitos programas de computador que podem executar esta função são conhecidos na

técnica.

Uma «proteína», «peptídeo» ou «polipeptídeo» deve ser compreendido como significando um polímero de aminoácidos que ocorrem naturalmente e/ou artificiais covalentemente ligados através de ligações de peptídeo. Um polipeptídeo inclui um polipeptídeo que foi isolado a partir de uma fonte que ocorre naturalmente, *ou produzido usando-se técnicas recombinantes. Deve ser avaliado que um polipeptídeo que inclui um seqüência líder ou pró- sequência, ou um polipeptídeo que passa por uma modificação pós-traducional é objetivado para estar inserido na definição de um polipeptídeo. Este termo não inclui um polipeptídeo que tenha sido produzido sinteticamente, uma vez que polipeptídeos sintéticos podem ser problemáticos. Particularmente, polipeptídeos feitos de forma sintética podem não dobrar corretamente, e assim podem não ter a atividade biológica associada com um polipeptídeo produzido de forma recombinante ou que ocorra naturalmente.

0 termo «fragmento ou variante" deve ser compreendido para significar qualquer polinucleotídeo ou seqüência de polipeptídeo ou seqüência parcial que foi modificada por substituição, inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos ou um ou mais aminoãcidos, mas que possui substancialmente a mesma atividade ou função da seqüência

não modificada ou seqüência parcial.

Preferivelmente, um variante contém substituições conservativas. Uma "substituição conservativa" é uma em que um aminoácido é substituído por um outro aminoãcido que possui propriedades similares, tal que um habilitado na técnica de química dos peptídeos irá esperar que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo sej a substancialmente não mudada. As substituições de aminoácido podem geralmente ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, sòlübilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou natureza anfipãtica dos resíduos. Por exemplo, aminoãcidos carregados negativamente incluem ácido aspáiftico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos de ponta polares não carregados possuindo valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina e valina; glicina, e alanina; asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos que podem representar mudanças conservativas incluem (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin# asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) vai, ile, leu, met, ala, phe; (4) Iys, arg, his; and

(5) phe, tyr, trp, his.

Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com a natureza de seus grupos laterais. Aminoácido com grupos laterais alquil não polares incluem glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina. Serina e treonina possuem grupos hidroxil em suas cadeias laterais, e porque os grupos hidroxil são polares e capazes de ligação de hidrogênio, estes aminoácidos são hidrofílicos. Grupos enxofre podem ser encontrados em metionina e cisteína. Grupos de ácido carboxílico são parte da cadeia lateral ao ácido aspártico e ácido glutâmico, que por causa da acidez do grupo de ácido carboxílico, os grupos aminoácidos não são apenas polares mas podem se tornar negativamente carregados em solução. A glutamina e asparagina são similares ao ácido glutâmico e ácido aspártico exceto que as cadeias laterais possuem grupos amida. Lisina, arginina e histidina possuem um ou mais grupos aminoácidos em suas 10

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cadeias laterais, que podem aceitar prótons, e assim estes aminoãcidos atual como bases. Grupos aromáticos podem ser encontrados nas cadeias laterais de fenilalanina, tirosina e triptofano. Tirosina é polar por causa de seu grupo hidroxil, mas o triptofano é a fenilalanina são não polares. Um variante pode também, ou alternativamente,

conter mudanças não conservativas.

Um variante de polipeptídeo de acordo com a invenção pode ter pelo menos uma substituição, adição, inserção ou deleção e pode ser feito de acordo com os métodos de mutagênese conhecidos na técnica. Tais modificações podem ser feitas a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo ou derivado da invenção e pode ser introduzido usando-se técnicas de mutagênese padrões, tal como mutagênese de sítio específico direcionada a oligonucleotídeo. As mutações podem ser introduzidas em locais particulares sintetizando-se oligonucleotídeos contendo uma seqüência mutante, flanqueada por sítios de restrição que permitem a ligação a fragmentos da seqüência nativa. Seguindo a ligação, a seqüência reconstruída resultante codifica um análogo possuindo a inserção, substituição ou deleção de aminoácido desejada. Os procedimentos de mutagênese de sítio específico direcionada a oligonucleotídeo podem também ser empregados para fornecer um polinucleotídeo codificante alterado onde códons pré-determinados podem ser alterados por substituição, deleção ou inserção por métodos bem

conhecidos na técnica.

Alternativamente, uma variedade de métodos

computacionais pode ser usada para gerar proteínas

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30 antagonistas de miostatina variantes da invenção, incluindo métodos baseados em seqüência e métodos baseados em estrutura tal como automação de desenho de proteína (PDA)

conforme descrito em US 6403312.

Deve ser também avaliado que o software está disponível para prever de forma muito precisa a estrutura tridimensional de uma seqüência de peptídeo (Bradely, 2005) . Portanto, será possível para alguns habilitados na técnica usar tal software para prever o efeito de variações à seqüência de peptídeo na estrutura do peptídeo e portanto qualquer provável efeito na atividade do peptídeo. Tais variações são também incorporadas no escopo da presente

invenção.

Um polipeptídeo "derivado" da invenção significa que a seqüência de aminoácido foi alterada de alguma forma para produzir um polipeptídeo possuído estabilidade aumentada enormemente. . Por exemplo, aminoácidos podem ser substituídos pelo mesmo aminoácido de quiralidade diferente, ou aminoácidos que não ocorrem naturalmente podem ser inseridos ou substituídos no polipeptídeo. Alternativamente, o polipeptídeo pode ser quimicamente modificado para melhorar a farmacocinética, tal como por entrecruzamento com polímeros tal como polietileno glicol (US 4640835). Tais derivados podem ter meias-vidas de soro aumentadas in vivo, biodisponibilidade, taxas de dissociação e outras propriedades que os tornam muito úteis

na formulação de composições farmacêuticas.

Um polipeptídeo da invenção, ou um fragmento, variante ou derivado deste possui a função biológica de antagonizar a atividade da miostatina. Para determinar se um 10

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polipeptídeo da invenção, ou um fragmento, variante ou derivado deste, é capaz de antagonizar a atividade da miostatina, tal atividade pode ser testada desenvolvendo-se os mioblastos na presença ou ausência (controle) de um polipeptídeo candidato da invenção. Um aumento no desenvolvimento dos mioblastos, que produz miostatina e portanto limita sua própria taxa de proliferação, sobre mioblastos de controle que não receberam o polipeptídeo candidato indica que o peptídeo possui atividade antagonista de miostatina. Uma linha de célula adequada poderá ser mioblastos C2Q2 de murina (ATCC No: CRL-1772), entretanto, será avaliado que qualquer linha de célula de mioblasto adequada poderá ser usada, tais como mioblastos

ovinos, bovinos, suínos ou humanos primários.

O termo "isolado" conforme aqui usado refere-se à remoção de uma molécula tal como um polipeptídeo ou um polinucleotídeo codificante a partir de sua fonte; natural, ambiente (por exemplo, remoção de uma proteína de uma fonte de célula intacta) e o termo «purificado» conforme aqui usado significa c^e a proteína ou polipeptídeo da invenção, ou seu polinucleotídeo codificante é essencialmente livre de associação com outros polinucleotídeos, proteínas ou polipeptídeos, por exemplo, como um produto de purificação de cultura de célula hospedeira recombinante, ou como um produto purificado de uma fonte não recombinante. Um polipeptídeo «isolado" portanto é um que seja removido de seu ambiente original. Preferivelmente, tais polipeptídeos são pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, ou pelo menos cerca de 99% puro, por exemplo, onde tal grau de pureza refere-se ao percentual de polipeptídeo de antagonista de miostatina detectável ou seu polinucleotideo codificante que está presente em uma preparação relativa a outros polinucleotídeos detectãveis e/ou polipeptídeos. O termo "substancialmente purificado" ou "substancialmente isolado" conforme aqui usado significa uma mistura que contém uma molécula tal como um polipeptídeo antagonista de miostatina ou seu polinucleotideo codificante que é essencialmente livre de associação com outros polinucleotídeos, proteínas ou polipeptídeos, mas para a presença de proteínas conhecidas que podem ser removidas usando-se métodos convencionais, tal como por cromatografia de afinidade com um anticorpo específico ou ligante, e este polipeptídeo antagonista de miostatina substancialmente purificado ou substancialmente isolado ou polinucleotideo codificante retém suas características bioquímicas conforme descrito aqui ou retém pelo menos uma de suas atividades biológicas

funcionais detectãveis.

"Expressão de gene" deve ser compreendido como significando a iniciação de transcrição, a transcrição de uma seção de DNA em mRNA, e a tradução do mRNA em um polipeptídeo. ttUm modulador de expressão de gene" é definido como qualquer composto que é capaz de causar, de uma forma estatisticamente significante, um aumento ou decréscimo na expressão do gene, e pode atuar em qualquer ponto no caminho da expressão do gene.

0 termo "compreendendo" conforme usado nesta especificação e reivindicações significa consistir pelo menos em parte de, isto é, quando interpretando reivindicações independentes incluindo aquele termo, as características introduzidas por aquele termo em cada reivindicação, todas, necessitam estar presentes mas outras características podem também estar presentes.

Os termos "corresponde substancialmente a", "substancialmente homólogo" ou "identidade substancial" conforme aqui usado denota uma característica de um ácido nucléico ou uma seqüência de aminoácido, onde um ácido nucléico selecionado ou seqüência de aminoácido possui pelo menos cerca de 70 a cerca de 75% de identidade de seqüência quando comparado a uma seqüência de ácido nucléico ou aminoácido de referência selecionada. Mais tipicamente, a seqüência selecionada e a seqüência de referência terá pelo menos cerca de 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, ou mesmo 85% de identidade de seqüência e mais preferivelmente pelo menos cerca de 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95% de identidade de seqüência. Mais preferivelmente ainda, seqüências altamente homólogas freqüentemente compartilham mais de pelo menos cerca de 96, 97, 98 ou 99% de identidade de seqüência entre a seqüência selecionada e a seqüência de referência a qual ela é comparada. 0 percentual de identidade de seqüência pode ser calculado sobre o comprimento total das seqüências a serem comparadas, ou pode ser calculado excluindo-se pequenas deleções ou adições que totalizam menos de cerca de 25% aproximadamente da seqüência de referência escolhida. A seqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência maior, tal como uma parte de um gene ou seqüência de flanqueamento ou uma porção repetitiva de um cromossomo. Entretanto, no caso de homologia de seqüência de duas ou mais seqüências de polinucleotídeo, a seqüência de referência irá tipicamente compreender pelo menos cerca de 18 a 25 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos cerca de 26 a 35 nucleotídeos, e ainda mais tipicamente pelo menos cerca de 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou mesmo 100 nucleotídeos aproximadamente. Desejavelmente, estes fragmentos altamente homólogos são desejados, o grau de identidade percentual entre as duas seqüências será de pelo menos cerca de 80%, preferivelmente pelo menos cerca de 85% e mais preferivelmente cerca de 90% ou 95% ou mais, conforme facilmente determinado por um ou mais algoritmos de comparação de seqüência bem conhecidos daqueles habilitados na técnica, tal como, por exemplo, a análise do programa FASTA descrito por Pearson e Lipman (1988) .

Conforme aqui usado, *% de identidade" refere-se aos percentuais de aminoácidos idênticos situados em posições do resíduo de aminoácido correspondentes em uma seqüência quando dois ou mais polipeptídeos estão alinhados e suas seqüências analisadas usando-se um algoritmo BLAST gapped (por exemplo, Altschul e outros, Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)), que pesa os gaps na seqüência e desemparelhamentos de seqüência de acordo com as pesagens padrões fornecidas por National Institutes of Health/base de dados NCBI (Bethesda, MD; ve j a Internet www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-

bin/BLAST/nph-newblast).

0 termo "substancialmente complementar", quando usado para definir ou a seqüência de aminoácido ou a seqüência de ácido nucléico, significa que uma seqüência de interesse particular, por exemplo, uma seqüência de oligonucleotídeo, é substancialmente complementar a toda ou a uma parte da seqüência selecionada, e assim irá se ligar especificamente a uma parte de um mRNA codificando a seqüência selecionada. Como tal, tipicamente, as seqüências serão altamente complementares à seqüência "alvo" de mRNA, e terá não mais que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 desemparelhamentos de base por toda a porção complementar da seqüência. Em muitos exemplos, pode ser desejável para as seqüências serem pares exatos, isto é, serem completamente complementares à seqüência a qual o oligonucleotídeo se liga especificamente, e portanto possuem zero desemparelhamentos ao longo do trecho complementar. Como tal, seqüências altamente complementares irão tipicamente se ligar muito especificamente à região da seqüência alvo do mRNA e irão portanto ser altamente eficientes na redução, e/ou mesmo na inibição da tradução da seqüência de mRNA alvo no produto de polipeptídeo.

Seqüências de oligonucleotídeo substancialmente complementares serão mais de cerca de 80% complementares (ou *% de match exato") em relação à seqüência alvo de mRNA correspondente à qual o oligonucleotídeo especificamente se liga, e será, mais preferivelmente mais de 85% complementar à seqüência alvo de mRNA correspondente à qual o oligonucleotídeo especificamente se liga. Em certos aspectos, conforme descrito acima, será desejável ter seqüências de oligonucleotídeo ainda mais substancialmente complementares para uso na prática da invenção, e em tais exemplos, as seqüências de oligonucleotídeo serão mais de cerca de 90% complementares à seqüência alvo de mRNA correspondente à qual o oligonucleotídeo especificamente se liga, e podem, em certas modalidades ser mais de cerca de 95% complementares à seqüência alvo de mRNA correspondente à qual o oligonucleotídeo especificamente se liga, e mesmo até e incluindo 96%, 97%, 98%, 99%, e mesmo 100% de pareamento exato, complementares a toda ou a uma porção do mRNA alvo ao qual oligonucleotídeo designado

especificamente se liga.

A similaridade percentual ou complementaridade percentual de qualquer uma das seqüências divulgadas pode ser determinada, por exemplo, comparando-se a informação da seqüência usando-se o programa de computador GAP, versão 6.0, disponível a partir de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). 0 programa GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman e Wunsch (1970). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoãcidos) que são similares, divididos pelo número total de símbolos na menor das duas seqüências. Os parâmetros padrões preferidos para o programa GAP incluem:, (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) para nucleotídeos, e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess (1986), (2) uma penalidade de 3,0 para cada gap e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada gap; e (3) nenhuma penalidade para os gaps finais.

DESCRIÇÃO DETALHADA PA INVENÇÃO

A presente invenção está direcionada a novas proteínas que possuem atividade antagonista de miostatina para uso no tratamento de disfunções relacionadas à miostatina.

Especificamente, a presente invenção esta direcionada a novos negativos dominantes de miostatina compreendendo peptídeos recombinantes de miostatina maduros possuindo um truncamento de C-terminal em uma posição em ou entre as posições de aminoácido 281 a 329 de Id. de Seq. n°: 2, ou fragmentos, variantes ou derivados destes.

A proteína miostatina é inicialmente traduzida como uma molécula precursora do aminoácido 375 possuindo uma seqüência sinalizadora secretora no N-terminal, um sinal de processamento proteolítico (RSRR) da endoprotease furina, e nove resíduos de cisteína conservados na região de C- terminal para facilitar a formação de uma estrutura de «nó de cisteína". A miostatina é ativada pela clivagem da endoprotease furina em Arg 266 liberando o N-terminal, ou "peptídeo associado à latência" (LAP) e o domínio C- terminal maduro, que se dimeriza para formar a molécula de miostatina ativa. Após processamento, um homodímero do peptídeo LAP permanece não covalentemente ligado ao homodímero da miostatina madura em um complexo inativo (Lee e outros, 2001). Sabe-se muito bem que outras proteínas, por exemplo folietatina, teletonina (T-cap), GDFPlf gene relacionado a folistatina e hSGT ligam-se a e regulam a secreção e ativação do complexo de miostatina latente (Lee e McPherron, 2001; Nicolas e outros, 2002; Hill e outros, 2002; Hill e outros, 2003; Wang e outros, 2003). A seqüência de aminoácido da molécula de proteína precursora de miostatina humana está mostrada em Id. de Seq. n°:2. A seqüência de nucleotídeo correspondente codificando a proteína precursora de miostatina está mostrada em Id. de

Seq. n°:l.

Os antagonistas de miostatina prévios compreendendo os peptídeos de miostatina maduros que são truncados em C- terminal na posição de aminoácido 330 ou 350 são conhecidos (WO 2001/53350) . Estes antagonistas são truncados em uma posição de forma que cisteínas importantes sejam retidas as quais são prováveis de executar um papel importante na determinação de sua estrutura tridimensional e interações associadas com outras moléculas. Espera-se que a perda destes resíduos de cisteína importantes afete negativamente sua capacidade de funcionar. Por exemplo, uma substituição C313Y no gene da miostatina de gado causa uma perda da função resultando no fenótipo Piedmontese (Berry e ouitros,

2002) .

Surpreendentemente, foi mostrado pela primeira vez que peptídeos de miostatina madura truncados em C-terminal nas posições próximas a ou excluindo os resíduos de cisteína são biologicamente ativos. Estes novos peptídeos possuem atividade antagonista de miostatina e são úteis no tratamento de disfunções relacionadas à miostatina. Foi determinado que um peptídeo de miostatina que foi truncado em C-terminal na posição 280 que removeu de forma crítica todas exceto uma cisteína do peptídeo de miostatina, não era biologicamente ativo. Os inventores mostraram pela primeira vez que pelo menos duas metades de cisteína são exigidas em um peptídeo de miostatina maduro truncado em C- terminal a fim de reter a atividade biológica. Sem estar preso pela teoria, é considerado que um peptídeo que tenha apenas uma única metade de cisteína não será capaz de formar uma estrutura tridimensional apropriada exigida para a atividade biológica. Acredita-se que as moléculas de miostatina truncadas em C-terminal produzidas de forma recombinante da invenção incorporam em varias formas conformacionais ativas e inativas diferentes. A forma conformacional exata dos peptídeos biologicamente ativos não é conhecida. Tentativas pelos inventores em produzir versões sintéticas do peptídeo recombinante da invenção produziram apenas formas inativas (resultados não mostrados). É considerado que, para a atividade biológica, peptideos produzidos recombinantemente são necessários.

Assim, a presente invenção fornece um polipeptidio recombinante isolado possuindo atividade antagonista de miostatina, compreendendo um peptideo de miostatina maduro truncado no C-terminal, onde o truncamento do C terminal está em uma posição de ou entre os aminoácidos 281 e 329 de Id. de Seq. n' : 2, ou um fragmento, variante ou derivado

destes.

Os polipeptídios recombinantes isolados da invenção podem ser selecionados a partir de um grupo consistindo de um peptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento do C terminal está na posição de aminoácido 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327.328, 329 ou 329 de Id. de Seq. n° : 2, ou um fragmento, variante ou derivado destes.

Preferivelmente, o polipeptidio recombinante isolado da invenção é selecionado a partir do grupo consistindo de um polipeptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento no C terminal está na posição de aminoácido 329, 320, 310, 300, 295, 289, 284, 282 ou 281 (Id. de Seq. n°s 3 a 11) , ou um fragmento, variante ou derivado deste, ou um polipeptídeo possuindo homologia de seqüência substancial ao mesmo.

Mais preferivelmente, o polipeptídio recombinante isolado da invenção é selecionado a partir do grupo consistindo de um polipeptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento no C terminal está na posição de aminoãcido 320, 310 ou 300 (Xd. de Seq.

n°s 4, 5 ou 6).

Os polipeptídeos desta invenção podem ser alterados de

muitas formas para produzir variantes ou derivados que possuem farmacocinética melhorada, como será avaliado por um trabalhador habilitado. Por exemplo, grupos funcionais podem ser adicionados os quais alteram a polaridade e/ou a capacidade de formar ligações de hidrogênio e irão alterar a solubilidade dos polipeptídeos. Similarmente, um grupo funcional pode alterar a estabilidade mudando a meia-vida do soro {Werle e outros, 2006) ou controlando a liberação do polipeptídeo a partir de uma micela no sítio alvo. Também, um grupo funcional pode alterar a biocompatibilidade, por exemplo, minimizando os efeitos colaterais do polipeptídeo ao paciente. A adição de um grupo funcional capaz de se ligar às células alvo ou tecidos ou facilitar o transporte para dentro das células alvo irá melhorar a entrega e a ação de ter o polipeptídeo como alvo. É também compreendido que os peptídeos podem ser truncados a partir no N-terminal para melhorar a

farmacocinética.

Um grupo funcional conjugado a um polipeptídeo desta

invenção pode ser uma molécula objetivada biológica que se liga a uma substância biológica específica ou sítio. A substância biológica ou sítio é o alvo objetivado da entrega e molécula objetivada que se liga a ela, permitindo a entrega do composto ao tecido ou células de interesse.

Um ligante pode funcionar como uma molécula objetivada biológica ligando-se seletivamente ou possuindo uma afinidade especifica por uma outra substância. Um ligante é reconhecido e ligado por um corpo de ligação especifico ou companheiro de ligação, ou receptor. Exemplos de ligantes adequados para serem tidos como alvo são antígenos, haptenos, biotina, derivados de biotina, lecitinas, metades de galactosamina e fucosilamina, receptores, substratos, coenzimas e cofatores entre outros. Outras substâncias que podem funcionar como ligantes para entrega e objetivação são certos esteróides, prostaglandinas, carboidratos, lipideos, certas proteinas ou fragmentos de proteínas (isto é, hormônios, toxinas) e polipeptídeos naturais ou sintéticos com afinidade celular. Os ligantes também incluem várias substâncias com afinidade seletiva para "ligadores" que são produzidos através de DNA recombinante,

genética ou engenharia molecular.

Um outro tipo de molécula objetivada é um anticorpo, cujo termo é usado aqui para incluir todas as classes de anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, frações Fab, fragmentos e derivados destes. Outras moléculas alvo incluem enzimas, especialmente enzimas de superfície de célula tal como neuraminidases, proteínas de plasma, avidinas, estreptavidinas, chalonas, molécula de cavitação, tiroglobulina, fator intrínseco, globulinas, quelantes, tensoativos, substâncias organometãlicas, proteína A de estafilococos, proteína G, citocromos, lecitinas, certas resinas e polímeros orgânicos. As moléculas alvo podem incluir peptídeos, incluindo proteínas, fragmentos de proteína ou polipeptídeos que podem ser produzidos sinteticamente ou através de técnicas recombinantes conhecidas na técnica. Exemplos de peptídeos incluem proteínas de transferência de membrana que poderão facilitar a transferência do composto a um interior de célula alvo ou para translocação nuclear (vej a: WO

01/15511).

Outras modificações aos polipeptídeos da invenção incluem conjugados a um polímero biologicamente compatível tal como polietileno glicol (PEG) e derivados de polímero relacionados. Os conjugados de droga-PEG foram descritos como melhorando o tempo de circulação (meia-vida de soro prolongada) antes da quebra hidrolítica do conjugado, e liberação subsequente da molécula ligada aumentando assim a eficácia da droga. Por exemplo, US 6214966 descreve o uso de PEG e derivados de polímero relacionado para conjugação a drogas tal como proteínas, enzimas e pequenas moléculas para melhorar a solubilidade e para facilitar a liberação controlada da droga. Alternativamente, EP 1082105 (WO 99/59548) descreve o uso de polímeros de poliéster biodegradáveis como um sistema de entrega de drogas para facilitar a liberação controlada da droga conjugada.

Os novos polipeptídeos da presente invenção podem também ser modificados de uma maneira a formar moléculas quiméricas compreendendo os novos polipeptídeos fundidos a um outro polipeptídeo heterólogo ou seqüência de aminoácido. Em uma modalidade, tal molécula quimérica compreende uma fusão de um polipeptídeo da invenção com um polipeptídeo marcado que fornece um epitopo ao qual um anticorpo antimarcador pode se ligar seletivamente. 0 marcador do epitopo é geralmente colocado na terminação amino ou carboxil do novo polipeptídeo. Também, o fornecimento do marcador de epitopo permite que o polipeptídeo marcado seja facilmente purificado através de purificação por afinidade usando-se um anticorpo antimarcador ou um outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador do epitopo. Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão de um novo polipeptídeo da invenção com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica, tal fusão poderá ser à região Fc de uma molécula de XgG.

Vários polipeptídeos marcados e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem os marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina- glicina (poli-his-gli); o polipeptídeo marcado- com influenza HÁ e seu anticorpo 12CA5 (Field e outros, 1988); o marcador c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 {Evan e outros, 1985); e o marcador de glicoproteína D do vírus do Herpes Simplex (gD) e seu anticorpo (Paborsky e outros, 1990). Outros polipeptídeos marcados incluem o peptídeo-Flag (Hopp e outros, 1988); o peptídeo do epitopo KT3 (Martin e outros, 1992), peptídeo de epitopo de tubulina (Skinner e outros, 1991); e o marcador de peptídeo de proteína do gene 10 de T7 {Lutζ-Freyermuth e outros,

1990) .

Como uma outra alternativa um polipeptídeo desta invenção pode ser conjugada a um outro composto farmaceuticamente ativo para melhorar o efeito terapêutico na célula ou tecido objetivados entregando-se um segundo composto com um efeito antagonista de miostatina similar ou uma atividade diferente de modo geral. Por exemplo, a Patente U. S. de número 6.051.576 descreve o uso de formulações do tipo co-droga conjugando-se dois ou mais agentes através de uma ligação instável para melhorar as propriedades farmacêuticas e farmacológicas de compostos farmaceuticamente ativos. Por exemplo, um segundo antagonista de miostatina pode ser selecionado a partir de qualquer um ou mais inibidores de miostatina conhecido. Por exemplo, US 6096506 e US 6468535 divulgam anticorpos antimiostatina ensinam imunogenes de peptídeo de miostatina, multímeros de miostatina e imunoconjugados de miostatina capazes de elicitar uma resposta imune e bloquear a atividade da miostatina. Os inibidores de proteína da miostatina são divulgados em WO 02/085306, a qual inclui o receptor Activina tipo XI truncado, o pre- domínio de miostatina e folistatina. Outros inibidores da miostatina derivados do peptídeo de miostatina são conhecidos, e incluem por exemplo inibidores de miostatina que são liberados em cultura a partir de células que superexpressam a miostatina (WO 00/43781) ; negativos dominantes de miostatina (WO 01/53350), que incluem o alelo de Piedmontese (cisteína na posição 313 é substituída com uma tirosina) e peptídeos de miostatina maduro possuindo truncamento em C-terminal em uma posição em ou entre as posições dos aminoãcidos 330 a 375. US2004/0181033 também ensina pequenos peptídeos compreendendo a seqüência de aminoácido WMCPP, e que são capazes de se ligar a e inibir

a miostatina. Um segundo composto farmacologicamente ativo possuindo atividade diferente ao polipeptídeo antagonista de miostatina da invenção pode ser usado conjuntamente com o polipeptídeo da invenção para tratar as disfunções relacionadas â miostatina. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser administrado em conjunção com os fatores de crescimento de polipeptídeo, inibidores NSAIDs ou COX-2, alfa e beta bloqueadores, inibidores ACE, bisfosfonatos, moduladores do receptor de estrogênio, agentes antihipertensivos, antagonistas de glutamato, insulina, antibióticos, inibidores da proteína quinase C ou vários sobre as substâncias opostas como será avaliado por um trabalhador habilitado.

Outras modificações para melhorar a estabilidade e meia-vida incluem a identificação de sítios de clivagem de protease de aminoãcido suscetíveis dentro dos polipeptídeos da invenção, e a substituição de tais aminoácidos com aminoácidos alternativos para impedir a degradação da protease do polipeptídeo no plasma, in vivo. Uma pessoa habilitada na técnica irá avaliar quais tipos de grupos funcionais devem ser adicionados para alcançar o resultado desejado na administração do polipeptídeo ao paciente e assim melhorar o índice terapêutico total.

A presente invenção é também direcionada a análogos, derivação e variantes dos polipeptídeos da invenção possuindo atividade mimética de miostatina.

Análogos, derivados ou variantes dos peptídeos da invenção podem incluir modificações de seqüência ou modificações que não de seqüência. Modificações que não de seqüência podem incluir acetilação, metilação, fosfometilação, carboxilação ou glicosilação conforme

descrito acima.

Os polipeptídeos trucados em C-terminal produzidos de

forma recombinante exemplificados na presente invenção são mostrados em relação a sua posição na porção de C-terminal

da miostatina de Id. de Seq. n° : 2.

Análogos preferidos incluem peptideos cuja seqüência difere-se daquela da invenção em uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoãcido conservativas que não afetam a atividade biológica do peptxdeo. Substituições conservativas incluem tipicamente a substituição de um aminoãcido por um outro com características similares, por exemplo, substituições dentro dos seguintes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ác ido aspártico, ác ido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Exemplos de substituições conservativas podem ser

tomados a partir da Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Para o Aminoãcido Código Substituir com qualquer um de! Alanina A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys Arginina R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D- homo-Arg, Met, He, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn Asparagina N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln Ácido Aspártico D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln Cisteína ] C ] D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met7 Thr, D-Thr Glutamina ] Q D-Gln7 Asn, D-Asn7 Glu7 D-Glu, ^sp7 D-Asp Ácido Glutâmico E D-Glu7 D-Asp, Asp, Asn, D-Asn7 Gin7 D-Gln Glicina G Ala, D-Ala7 Pro, D-Pro7 .beta.-Ala Acp Histidina H Asp7 D-Asp7 Lys7 D-Lys7 Tyr Isoleucina I D-Ile7 Val7 D-Val7 Leu7 D-Leu7 Met7 D-Met Leucina L D-Leu7 Vai, D-Val7 Leu7 D-Leu7 Met7 D-Met Lisina K D - Ly s 7 Arg, D -Arg 7 homo - Arg 7 D - homo-Arg7 Met, D-Met7 He, D-Ile7 Orn7 D-Orn Metionina M D-Met7 S-Me-Cys, He, D-Ile, Leu, D-Leu7 Val7 D-Val Fenilalanina F D-Phe7 Tyr, D-Thr, L-Dopa7 His7 D- His7 Trp, D-Trp7 Trans-3,4, or 5- phenylproline, cis-374, or 5- phenylproline Prolina P D_pr0/ L-I-thioazolidine-4- carboxylic acid, D-or L-I- oxazolidine-4-carboxylic acid Serina S D-Ser7 Thr, D-Thr, allo-Thr7 Met7 D-Met7 Met(O)7 D-Met(O)7 L-Cys, D- Cys Treonina T D-Thr7 Ser, D-Ser7 allo-Thr, Met, D-Met, Met(0), D-Met(0), Vai, D- Val Tirosina Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, Hi s, D- His Valina V D-Val, Leu, D-Leu, He, D-Ile, Met, D-Met

Outros análogos incluem peptídeos com modificações que influenciam a estabilidade do peptídeo. Tais análogos podem conter, por exemplo, uma ou mais ligações de não peptideo {que substituem as ligações de peptídeo) na seqüência de peptídeo. São também incluídos os análogos que incluem resíduos outros que não os L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, por exemplo, D-aminoácidos ou aminoácidos sintéticos que ocorrem não naturalmente, por exemplo, beta ou gama aminoácidos e análogos cíclicos.

A presente invenção também considera os truncamentos em N-terminal dos polipeptídeos da invenção. Tais variantes irão compreender os polipeptídeos truncados em C-terminal da presente invenção pelo qual os aminoácidos da extremidade de N-terminal são seqüencialmente removidos e assim tal peptídeo truncado em N-terminal retém a atividade

antagonista de miostatina.

A presente invenção também considera as seqüências de

ácido nucléico que codificam os novos polipeptídeos da

presente invenção.

Estudos recentes sugerem que a miostatina é um

regulador potente da progressão do ciclo celular e funciona

em parte regulando tanto as etapas de proliferação quanto

as etapas de diferenciação de miogênese (Langley e outros,

2002; Thomas e outros, 2000). Vários estudos demonstraram um papel para a miostatina não apenas durante a miogênese embriônica, mas também no crescimento do músculo pós-natal. Estudos por Wehling e outros (Wehling e outros, 2000) e Carlson e outros (Carlson e outros, 1999) indicam que a perda muscular relacionada à atrofia devido à suspensão do membro traseiro em camundongo estava associada com niveis de miostatina aumentados em M. plantaris. Níveis de miostatina aumentados foram também associados com perda muscular severa em pacientes HIV positivos {Gonzalez- Cadavid e outros, 1998). Uma explicação para os níveis elevados de miostatina observados durante desuso do músculo é que a miostatina pode funcionar como um inibidor da ativação de célula satélite. De fato isto é suportado por estudos recentes que mostram que uma carência de miostatina resulta em uma fusão aumentada de células satélites ativadas in vivo e auto-renovação aumentada de células satélites (McCroskery e outros, 2003). Os inibidores da miostatina têm também mostrado aumentar a ativação das células satélites, assim como aumentam a migração de macrôfagos e mioblastos durante a regeneração muscular {W02006/083182) e na cura de ferimentos (W02006/083183).

Métodos adequados para analisar a atividade antagonista da miostatina dos polipeptídeos da presente invenção podem ser baseados em qualquer uma de uma variedade de metodologias conhecidas incluindo modelos animais in vivo e modelos in vitro. Por exemplo, antagonistas de miostatina potenciais da invenção podem ser primeiro testados usando-se um ensaio de ativação de célula satélite de fibra única in vitro, ensaios de proliferação de mioblastos, bioensaios (WO 2003/00120) ou ensaios de migração de mioblasto e/ou macrôfago, conforme descrito abaixo. Os polipeptídeos antagonistas de miostatina da invenção que são capazes de aumentar a ativação de célula satélite, proliferação de mioblasto e/ou migração de mioblasto ou macrófago in vitro, podem então ser testados para sua capacidade de tratar disfunções relacionadas à miostatina em modelos animais in vivo. Tais modelos incluem um modelo de camundongo idoso de sarcopenia (Kirk, 2000); um modelo de camundongo de distrofia muscular (Mdx) (Tanabe e outros, 1986); um modelo de camundongo de diabetes (Like e outros, 1976); um modelo de camundongo de obesidade (Giridharan e outros, 1998); um modelo de notexina de dano muscular (Kirkl 2000); um modelo de ferimentos na pele superficiais ou profundos (Gillitze e outros, 2001); um modelo de queimadura (Yang e outros, 2005); um modelo de caquexia de camundongo onde dexametasona é injetada no camundongo para induzir perda muscular (Ma e outro.s, 2003) ou um modelo de câncer em camundongo em que células de adenocarcinoma de colo (C26) ou células de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) são injetadas no camundongo para induzir a perda muscular associada com câncer.

Os polipeptídeos isolados da invenção preferivelmente se ligam a seu alvo com um Kd de 1 μΜ ou menos, e mais preferivelmente com um Kd de 100 nM, 10 nM ou mesmo 1 nM ou

menos.

A presente invenção está também direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um polipeptídeo novo da invenção possuindo atividade antagonista de miostatina junto com um veículo farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável. Um polipeptídeo desta invenção ou sal deste pode ser incluído em um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente, idealmente em uma quantidade suficiente para entregar a um paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva sem causar sérios efeitos tóxicos no paciente tratado. A concentração do polipeptídeo ativo na composição irá depender das taxas de absorção, distribuição, inativação e excreção do polipeptídeo, assim como de outros fatores conhecidos daqueles habilitados na técnica. Deve-se notar que os valores de dosagem irão também variar com a severidade da condição a ser aliviada. Deve-se também compreender que para qualquer indivíduo particular, os regimes e horários de dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e do julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições. Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16"

edição, Oslo, A. (ed), 1980. Soluções ou suspensões usadas para aplicação

parenteral, intradérmica, subcutânea, ou tópica podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para inj eção, solução salina, óleo f ixo, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzíIico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como o ácido etilenodiaminotetracético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para a

aplicação parenteral, tal como injeção intravenosa,

subcutânea ou intramuscular, incluem água estéril, solução

salina fisiológica, solução salina bacteriostãtica (solução

salina contendo 0,9 mg/mL de álcool benzílico) e solução

salina tamponada com fosfato. Se administrados de forma

intravenosa, os veículos preferidos são soro fisiológico ou

solução salina tamponada com fosfato.

Métodos para preparar formulações transdérmicas

incluindo formulações tópicas ou dispositivos de entrega transdérmica tais como adesivos são conhecidos daqueles habilitados na técnica. Por exemplo, veja Brown L., e Langer R., Transdermal Delivery of Drugs (1988), Annual

Review of Medicine, 39:221-229.

Os polipeptídeos desta invenção podem ser preparados com veículos que irão proteger o polipeptídeo contra eliminação rápida do corpo, tal como formulações de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Os polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser usados, tais como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colãgeno,

poliortoésteres e ácido polilãtico.

As suspensões lipossomais são também veículos

adequados para os polipeptídeos desta invenção. Os

polipeptídeos podem ser conjugados a um lipídeo por métodos

conhecidos para incorporação em um envelope lipossomal ou

os compostos podem ser encapsulados no lipossomo. Os

lipossomos podem ser preparados de acordo com métodos

conhecidos daqueles habilitados na técnica, tal como está descrito na Patente U. S. de número 4.522.811. Por exemplo, as formulações de lipossomo podem ser preparada dissolvendo-se o{s) lipídeo(s) apropriado(s) (tais como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, e colesterol) em um solvente inorgânico que é então evaporado, deixando para trás um fino filme de lipídeo seco na superfície do recipiente. Uma solução aquosa do polipeptídeo ativo da invenção ou seus derivados monofosfato, e/ou trifosfato são então introduzidos no recipiente. O recipiente é então rotacionado manualmente para liberar os agregados de lipídeo, formando assim a suspensão lipossomal.

Para administração nasal ou pulmonar, os ingredientes ativos estarão na forma de um pó fino ou uma solução ou suspensão adequada para inalação. Alternativamente, os ingredientes ativos podem estar em uma forma adequadas para direcionar a aplicação â mucosa nasal tal como uma pomada ou creme, spray nasal, gotas nasais ou um aerossol.

As composições orais podem incluir um diluente inerte ou um veículo comestível. Elas podem ser colocadas em cápsulas de gelatina ou comprimidas em comprimidos. Para o propósito de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. Os agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou os materiais adjuvantes podem ser inclusos como parte da composição. Métodos para encapsular composições (tal como em um revestimento de gelatina dura) para administração oral são bem conhecidos na técnica (Baker, Richard, Controlled Release of Biological Active Agentsf John Wiley and Sons, 1986). Técnicas para superar várias barreiras incluindo a barreira muco-camada, a barreira enzimática e a barreira da membrana são bem conhecidos na técnica (Bernkop-Schnurch e

outros, 2001) .

Comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e etc. podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza similar: Um ligante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente de desintegração tal como ácido algínico, ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio; a glidante tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como hortelã, salicilato de metila ou aromatizante de laranja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, além do material do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo graxo. Além disso, as formas de dosagem unitárias podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma Iaca, ou outros agentes entéricos. Alternativamente, os polipeptídeos desta invenção podem ser administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, hóstia, goma de mascar ou coisa parecida. Um xarope pode conter, além do(s) composto(s) ativo(s), sacarose como um agente adoçante e certos preservativos, pigmentos e corantes e aromatizantes.

A presente invenção está direcionada a um método de tratamento de uma condição patológica relacionada à miostatina em um mamífero, onde o método geralmente compreende pelo menos a etapa de administrar a um mamífero em necessidade destes, uma quantidade efetiva de pelo menos um polipeptídeo da invenção possuindo atividade antagonista de miostatina, por um tempo suficiente para impedir, tratar ou melhorar os sintomas da referida condição patológica relacionada à miostatina. Em modalidades preferidas o mamífero é um humano que possui, é suspeito de ter, ou foi diagnosticado com uma ou mais condições patológicas

relacionadas à miostatina.

A condição patológica é caracterizada, pelo menos em parte, por uma quantidade, desenvolvimento ou atividade metabólica anormais do músculo ou tecido adiposo em um mamífero e pode incluir disfunções relacionadas à hipertrofia muscular; atrofia muscular e perda muscular associados a miopatias inflamatórias, distrofias musculares, doenças neuromotoras, doenças de j unção neuromuscular, doenças do nervo periférico, miopatias devidas a anormalidades endócrinas, síndrome metabólica, HIV, câncer, sarcopenia, caquexia e outras condições degenerativas; falhas cardíacas; osteoporose; falha ou doença renal; falha ou doença do fígado; anorexia; obesidade; diabetes e cicatrização de ferimentos.

As miopatias inflamatórias que podem ser tratadas incluem: Dermatomiosite (PM/DM), Miosite de Corpos de

Inclusão (IBM) e polimiosite (PM/DM).

As distrofias musculares que podem ser tratadas incluem: Distrofia muscular de Becker (BMD), distrofia muscular congênita (CMD), distrofia muscular distai (DD), distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), distrofia muscular do tipo cinturas (LGMD), distrofia muscular fácio-escápulo-humeral (FSH ou FSHD), distrofia miotônica (MMD) e distrofia muscular

óculofaríngea (OPMD).

As doenças neuromotoras que podem ser tratadas

incluem: Atrofia muscular espinham adulta (SMA), esclerose

lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular espinham

progressiva infantil (SMA, SMAl ou WH), atrofia muscular

espinhal intermediária (SMA ou SMA2), atrofia muscular

espinham juvenil (SMA, SMA3 ou KW) e atrofia muscular bulbo

espinhal (SBMA).

Doenças da junção neuromuscular que podem ser tratadas

incluem: Síndrome miastênica congênita (CMS), síndrome de Lambert-Eaton (LES) e miastenia grave (MG).

Doenças do nervo periférico que podem ser tratadas incluem: Doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), Doença de Dejerine-Sottas (DS) e ataxia de Friedreich (FA).

Miopatias devidas a anormalidades endócrinas que podem ser tratadas incluem: Miopatia hipertiroidiana (ΉΥΡΤΜ) e

miopatia hipotiroidiana (HYPOTM).

Outras miopatias que podem ser tratadas incluem:

Doença do núcleo central (CCD), miotonia congênita (MC), miopatia da nemalina (NM), miopatia miotubular (MTM ou MM), paramiopatia congênita (PC) e paralisia periódica (PP).

Doenças metabólicas do músculo que podem ser tratadas incluem: Deficiência de maltase ácida (AMD), deficiência de carnitina (CD), deficiência de carnitina palmitil transferase (CPT), deficiência de enzima decompositora (DBD), diabetes, deficiência de lactato desidrogenase (LDHA), deficiência de mioadenilato deaminase (MAD), miopatia mitocondrial (MITO), obesidade, deficiência de fosforilase (MPD ou PYGM), deficiência de fosfofrutoquinase (PFKM), deficiência de fosfoglicerato quinase (PGK) e deficiência de fosfoglicerato mutase (PGAM ou PGAMM).

0 polipeptideo da invenção pode também ser usado para tratar ou prevenir insuficiência congestiva cardíaca; para reduzir fragilidade associada com envelhecimento; para aumentar densidade óssea (tal como para tratar osteoporose) ou acelerar o reparo de fraturas em ossos; para tratar o retardo de crescimento, para o tratamento de pequena estatura fisiológica, para atenuar a resposta catabólica de proteína tal como após uma grande operação; para reduzir a perda de proteína devido à doença crônica; para acelerar a cura de ferimentos; para acelerar a recuperação de pacientes queimados ou pacientes que passaram por grande cirurgia; para manutenção da espessura da pele; para manutenção de homeostase metabólica, para tratar falha/doença renal e falha/doença do fígado; para tratar adultos deficientes em hormônio do crescimento e para prevenir efeitos colaterais catabólicos de

glicocorticóides; e para tratar várias condições doentes do sistema neurológico, incluindo danos/doenças do Sistema Nervoso Central (CNS) tal como danos na medula espinham e derrame, e danos/doenças no Sistema Nervoso Periférico

(PNS).

Estas disfunções podem ser tratadas administrando-se uma quantidade terapêutica de um ou mais antagonista de miostatina a um indivíduo em necessidade deste.

Em tal modalidade adicional, a invenção considere o uso de um ou mais fatores de crescimento de músculo que podem ser co-administrados com as composições farmacêuticas da presente invenção para fornecer um efeito aditivo ou sinérgico ao regime de tratamento. Tais fatores de crescimento podem ser selecionados a partir do grupo consistindo de HGF7 FGF, IGF, MGF, hormônio do crescimento, etc. Tais fatores do crescimento podem ser administrados ou separadamente, seqüencialmente ou simultaneamente com as composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um polipeptídeo da invenção possuindo atividade antagonista da

miostatina.

Em uma modalidade adicional, a invenção considera o uso de um segundo composto farmacologicamente ativo possuindo diferente atividade ao polipeptídeo antagonista de miostatina da invenção a ser usado conjuntamente com o polipeptídeo da invenção para tratar disfunções relacionadas à miostatina. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser administrado em conjunção com compostos ativos selecionados a partir do grupo consistindo de fatores de crescimento de polipeptídeo (conforme mencionado acima), inibidores NSAIDs ou COX-2, alfa e beta bloqueadores, inibidores ACE, bisfosfonatos, moduladores do receptor de estrogênio, agentes antihipertensivòs, antagonistas de glutamato, insulina, antibióticos, inibidores da proteína quinase C ou vários sobre as substâncias opostas como será avaliado por um trabalhador habilitado. Tais compostos ativos podem ser administrados ou separadamente, seqüencialmente ou simultaneamente com pelo menos um polipeptídeo da invenção possuindo atividade antagonista da

miostatina.

A presente invenção está também direcionada ao uso de um ou mais inibidores de miostatina na produção de um medicamento para tratar condições patológicas relacionadas à miostatina em um paciente em necessidade deste. 0 um ou mais antagonistas de miostatina podem ser selecionados a partir do grupo de antagonistas de miostatina descrito

acima.

0 medicamente pode ser formulação para administração

local ou sistêmica. Por exemplo, o medicamento pode ser formulado para injeção diretamente em um músculo, ou pode ser formulado para administração oral para entrega sistêmica ao músculo para o tratamento de condições de perda muscular. 0 medicamento pode ser formulado para administração tópica para o tratamento de cura de ferimentos, e pode ser formulado para administração oral

para o tratamento de obesidade e diabetes.

O medicamento pode também compreender um ou mais compostos promotores de desenvolvimento muscular adicional para fornecer um efeito aditivo ou sinérgico ao tratamento de condições de perda muscular ou para aumentar: a massa muscular. 0 medicamento pode ser formulado para administração separada, seqüencial ou simultânea do um ou mais antagonistas de miostatina e o um ou mais compostos promotores de desenvolvimento muscular.

Sem estar preso pela teoria, acredita-se que os novos polipeptxdeos da presente invenção, os quais possuem atividade antagonista da miostatina, são efetivos na prevenção ou tratamento de disfunções relacionadas à miostatina em parte através de três mecanismos. Primeiramente induzindo a ativação de célula satélite, proliferação e diferenciação. As células satélites são células tronco musculares e são assim envolvidas na 3 0 regeneração de tec ido muscular. Em segundo lugar, melhorando a proliferação de mioblastos e a migração ao sítio de regeneração, e em terceiro lugar melhorando o recrutamento de macrófago. Sabe-se que os macrófagos atuam para atrair mioblastos e portando aumentam a miogênese. 0 efeito no recrutamento de macrófagos foi previamente observado com outros antagonistas de miostatina para resultar em cura de ferimentos melhorada (WO 2006/083182). Assim, a presente invenção deve também ser efetiva no

melhoramento da cura de ferimentos.

Pela primeira vez foi mostrado que os novos inibidores da miostatina, compreendendo um peptídeo de miostatina maduro truncado em C-terminal, onde o truncamento em C- terminal é anterior ao aminoãcido 329, são úteis no tratamento de doenças relacionadas à miostatina. Em modelos de sarcopenia relacionados â idade, os antagonistas de miostatina da invenção foram efetivos não apenas no melhoramento de massa e força muscular mas também na redução de depósitos de gordura relacionados à sarcopenia. Estes resultados foram surpreendentes uma vez que o truncamento em C-terminal nestes peptídeos eram próximos a ou excluíam um cisteína resultando na ruptura da estrutura tridimensional, uma característica que se acredita ser essencial para atividade biológica (Jeanplong e outros,

2001).

Pode-se dizer que esta invenção consiste, de forma ampla, nas partes, elementos e características referidas ou indicadas na especificação da aplicação, individualmente ou coletivamente, e qualquer uma ou todas as combinações de quaisquer duas ou mais referidas partes, elementos ou características, e onde os inteiros específicos são mencionados aqui, os quais possuem equivalentes conhecidos na técnica a qual esta invenção relaciona-se, tais equivalentes conhecidos são considerados para serem incorporados aqui como se individualmente expostos.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos estão incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser avaliado, por aqueles habilitados na técnica, que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles habilitados na técnica devem, à luz da presente divulgação, avaliar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e pode-se ainda obter um resultado parecido ou similar sem se afastar do

espírito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1: Antagonistas de miostatina aumentam a

proliferação de mioblastos in vitro

Métodos

Expressão e purificação de antagonistas de miostatina

Um cDNA correspondendo aos aminoácidos 267-329, 267- 320, 267-310, 267-300 e 267-280 de seqüência de miostatina bovina, aqui após referida como antagonista de miostatina 329, 320, 310, 300 e 280 respectivamente, foi individualmente amplificada por PCR e clonada em um vetor pET16-B usando-se sítios BamHI. A expressão e purificação dos antagonistas de miostatina 329, 320, 310, 300 e 280 foram feitas de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen) sob condições nativas produzindo peptídeos com um N-terminal (MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMLE D Ρ) e marcador de C-terminal (EDPAANKARKEAEL A A A T A E Q) .

Ensaio de Mioblasto

Mioblastos C2C12 bovinos foram desenvolvidos em meio de cultura DEMEM (Dulbecco's modified Eagle Médium) de acordo com técnicas padrões {Thomas e outros, 20 00). 0 ensaio de proliferação de mioblastos foi executado em placas de microtitulação de 96 cavidades não revestida. Culturas de C2C12 foram semeadas a 1000 células/cavidade. Seguindo um período de fixação de 16 horas, o meio de teste contendo ou a miostatina tipo selvagem recombinante ou os antagonistas de miostatina diferentes foram adicionados e as células foram incubadas para um período adicional de 48 ou 72 horas. Para o ensaio de competição, a miostatina tipo selvagem foi posta em competição com diferentes concentrações de antagonistas de miostatina antes da adição no meio. Após o período de incubação, a proliferação foi avaliada usando-se ensaio de ponto final fotométrico com azul de metileno conforme previamente descrito (Thomas e

outros, 2000).

Mioblastos de músculo esquelético humano (Cambrex, USA) ou mioblastos ovinos primários foram desenvolvidos em Meio de Eagle Modificado com Dulbecco (DEMEM) contendo 20% FBS, 10% de soro de cavalo e 0,5% de extrato de embrião de galinha de acordo com técnicas padrões. 0 ensaio de proliferação de mioblastos foi executado em placas de microtitulação de 96 cavidades não revestida. Culturas de célula foram semeadas a 2000 células/cavidade. Seguindo-se um período de fixação de 24 horas, meio de teste suplementado com 5% FCS contendo ou tampão como um controle ou diferentes antagonistas de miostatina (300, 310 ou 320) foi adicionado a Im 5 e 10 Mg/mL e as células foram incubadas por um período adicional de 144 horas (para células humanas) ou 48 horas (para células ovinas). Após o período de incubação, a proliferação foi avaliada usando-se ensaio de ponto final fotométrico com azul de metileno conforme previamente descrito (Thomas e outros, 2000).

Resultados

Os resultados mostram que os antagonistas de miostatina {300, 310, 320 e 329) melhoram significantemente a capacidade de proliferação de mioblastos comparada ao controle quando presente a 1 μg/mL ou 5 μg/mh durante 4 8 ou 72 horas (Figura 1 e Figura 29) . A mais alta taxa de proliferação de mioblasto foi observada no ponto de tempo de 48 horas para cada um dos antagonistas {300, 310, 320 e 329) quando presentes a uma concentração de 5 μg:/mL e 10 pg/rtiL para 329. O antagonista da miostatina 280 não mostra atividade acima do controle. Isto é provável devido ao fato de que este peptídeo contém apenas 1 resíduo de cisteína.

Adição de miostatina recombinante a 2,25 μ3/πιΙ< ao meio de controle leva a um percentual de 25% de inibição de proliferação de mioblastos após 48 horas. Esta figura foi reduzida a cerca de 10% após 72 horas (Figura 2). Quando os antagonistas de miostatina (300, 310 e 320) foram adicionados a três concentrações diferentes (1, 5 e 10 μg/mL), os efeitos de proliferação-inibição da miostatina nos mioblastos foram reduzidos a níveis similares àqueles observados no controle positivo. Xsto demonstrou que os antagonistas de miostatina tais como 300, 310 e 320 podem acelerar efetivamente a regeneração muscular melhorando a proliferação de mioblastos (Fig 2).

Para determinar se os antagonistas de miostatina são efetivos em diferentes espécies, conduziram-se ensaios de proliferação de mioblastos humanos e ovinos. Quando os antagonistas de miostatina (300, 310 e 320) foram adicionados em três concentrações diferentes (1, 5 ou 10 μg/mL durante 48 ou 144 horas), a capacidade de proliferação de mioblastos humanos e ovinos foi significativamente melhorada quando comparada ao controle

(Figura 13 e Figura 14).

Estes resultados indicam que a administração dos antagonistas de miostatina terá efeitos benéficos nos pacientes que sofrem de disfunções relacionadas ao músculo ou quaisquer outras disfunções onde uma taxa aumentada de proliferação de mioblastos é benéfica, tal como no tratamento de disfunções de perda muscular ou regeneração de tecido muscular danificado.

EXEMPLO 2: Miostatina regula a ativação de célula

satélite

Métodos

Isolamento e cultura de miofibra única

Fibras únicas foram isoladas conforme previamente descrito por Rosenblatt e outros (1995). Resumidamente, camundongos do tipo selvagem de 1 e 24 meses de idade foram sacrificados por gás CO2 seguido por deslocamento da cervical. TA foram dissecados e digeridos em colagenase tipo IA 0,2% (p/v) (>260 CDU/mg, Sigma) em meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) por 6 0 minutos a 37°C. Os músculos foram transferidos a DMEM + soro de cavalo 10% (HS) + extrato de embrião de galinha 0,5% (CEE) e as fibras foram separadas por trituração suave. As fibras isoladas foram transferidas a lâmina para câmara de 4 cavidades (Becton Dickinson) revestida com matrigel 10% (Becton Dickinson) e fixadas com metanol gelado 100% por 10 minutos após cultivo em cultura por até 72 horas a 37°C em

CO2 5%.

O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é expresso em células que estão passando ativamente por ciclo célula mas não em células quiescentes. Um grande percentual de células satélites presas às fibras musculares são quiescentes e por conseguinte não expressam PCNA. Entretanto, sob ativação, as células satélites são ativadas para expressar PCNA e regenerar o músculo por restaüração das fibras musculares. Assim, PCNA é um antígeno muito confiável para marcas as células satélites ativadas.

A fim de determinar o efeito dos antagonistas de miostatina na ativação de célula satélite, fibras musculares únicas do músculo TA de camundongo tipo selvagem jovem (1 mês) ou adulto (24 meses) foram cultivadas em cultura na presença de 5 μ9/τηΙ, de antagonista de miostatina 320, 310 ou 300, em meio de cultura por 24, 48 e 72 horas e fixados com metanol e lavados em PBS. As fibras fixas foram permeabilizadas em TritonX-100 0,5% em PBS por 10 minutos, bloqueadas em soro de cabra normal 10% e carragena lambda 0,35% em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente e então incubadas com uma diluição de 1:100 de anticorpo anti-PCNA em bloqueador durante a noite. 0 anticorpo primário foi detectado usando-se anticabra-camundongo-alexa flúor 546 e as fibras foram contracoradas com DAPI. Células satélites ativadas positivas para PCNA forma contadas sob microscópio e expressadas como um percentual de mionücleos totais.

Para testar o efeito do tratamento com antagonista de miostatina de curta duração na ativação de célula satélite, fibras únicas foram isoladas de camundongo de cada grupo de tratamento (conforme descrito no exemplo 4, abaixo) e colocadas em cultura conforme descrito acima. A ativação da célula satélite foi investigada usando-se anticorpos anti- PCNA conforme descrito.

Resultados

Antagonistas de miostatina podem ativar células satélites

Quando fibras musculares únicas de camundongo tipo selvagem jovem (1 mês de idade) foram incubadas com o antagonista de miostatina 300, um aumento significante no número de células satélites ativadas foi observado (Figura 3). Resultados similares foram vistos quando o número de células ativadas foi convertido a um aumento percentual, normalizado contra os controles (Figura 4). Este experimento foi repetido usando-se antagonistas de miostatina 300, 310 e 320 em fibras de músculo únicas de camundongos adultos (2 anos de idade). Aumentos significantes no percentual de células satélites ativadas foram observados com todos os antagonistas de miostatina testados. O maior aumentos foi observado com o antagonista de miostatina 300 após 48 horas (Figura 5) . Estes resultados confirmam que os antagonistas de miostatina 300, 310 e 320 são ativadores potentes de células satélites em músculos de camundongo tipo selvagem jovem e adulto e indicam que se pode esperar que a administração de 10

15

antagonistas de miostatina trate ou previna o inicio de disfunções associadas com uma diminuição na ativação de célula satélite tal como sarcopenia. Além disso, é esperado que os antagonistas de miostatina podem ser usados para reduzir a severidade de tais condições em casos onde a proporção das células ativadas já foi diminuída. Estes dados também mostram que os antagonitas são efetivos no aumento da ativação de células satélites em fibras musculares acima dos níveis normais de ativação de célula satélite. Portanto, os antagonistas de miostatina poderão ser usados como um tratamento antes do trauma devido a tratamentos médicos ou antes do início de condições que serão esperadas que resultem em força muscular diminuída tal como compelido na atividade ou outras condições.

EXEMPLO 3: Antagonistas de miostatina aumentam a resposta inflamatõria e a quimiotaxia de macrõfagos e

mioblastos

Métodos

Ensaio de Quimiotaxia

Mioblastos primários foram postos em cultura a partir de músculo de membro posterior de camundongo jovem {4 a 6 semanas de idade) ou adulto (24 meses de idade), de acordo com os protocolos publicados (Allen e outros, 1997; Partridge, 1997). Resumidamente, os músculos foram picados e digeridos em colagenase tipo IA 0,2% por 90 minutos. Culturas foram enriquecidas por mioblastos colocando-os previamente em placas não revestidas por 3 horas. As culturas de mioblastos foram mantidas em meio de crescimento (GM) suplementado com soro de bezerro fetal 2 0% (FCS) , HS 10% e CEE 1% em placas revestidas com Matrigel

20 10%, a 3 7 ° C/ CO2 5%. O grau de pureza da cultura foi avaliado por análise de citometria de fluxo da expressão de MyoD após 4 8 horas em cultura. As células foram coletadas usando-se tripsina, suspensas a uma concentração de IO6 células/200 μΐ, e fixadas durante a noite em 5 mL de etanol 70% a -20°C. A coloração foi executada por 30 minutos à temperatura ambiente usando-se anti-MyoD policlonal de coelho, 1:200 (Santa Cruz), seguido por Alexa flúor 488 anti-coelho conjugado, 1:500 (Molecular Probes). A análise foi executada em duplicata com IO4 eventos celulares coletados em cada ensaio. Resíduos foram excluídos por parâmetros de «scartter» (FSC) e «side scartter" (SSC). As células foram analisadas por FACScan (Becton Dickinson). Os macrófagos foram isolados por uma técnica de lavagem peritoneal e/ou derivado de soro de camundongo ativado por Zimosano de medula óssea (ZAMS) foi preparado de acordo com o protocolo publicado (Colditz e Movat, 1984).

Para o ensaio de quimiotaxia de mioblastos, um primeiro ensaio foi executado em mioblastos de camundongos de 2 anos de idade como segue. DMEM contendo soro de cavalo 2% (HS), extrato de embrião de galinha 5% (CEE) adicionado a tampão de diálise foi usado como controle positivo. A miostatina recombinante (2,5 μ9/πΟ, de miostatina) e antagonistas de miostatina 300, 310 e 320 (a uma concentração de miostatina de 5 vezes, isto é, 12,5 ng/mL) foram adicionados ao meio de controle positivo. DMEM puro foi usado como controle negativo. Em uma placa de 24 cavidades, as cavidades inferiores foram preenchidas com meio de teste ou controle. Setenta e cinco mil células foram adicionadas às cavidades superiores contendo 10

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membranas de 0,8 μιη de tereftalato de polietileno (PET) revestidas com Matrigel 1%. A placa foi incubada por 7 horas a 37°C, CO2 5%. A superfície superior das membranas foi lavada com chumaços de algodão pré-molhados para remover as células que não tinham migrado. A membrana foi então fixada, tingida em hematoxilina de Gill e montadas em úmido em lâminas. As células migradas foram contadas em quatro campos representativos por membrana e o número médio foi colocado em gráfico. Os resultados estão apresentados na Figura 6 (migração de mioblastos de camundongo adulto) e Figura 7 (migração de mioblastos de camundongo jovem).

Em um segundo ensaio de migração de mioblastos, mioblastos primários foram isolados de membro posterior de camundongo tratado com solução salina (controle) e tratado com antagonista de miostatina 300 (conforme descrito no exemplo 4 abaixo). Três meios quimioatrativos foram usados: DMEM contendo soro de cavalo 2% (HS) e extrato de embrião de galinha 5% (CEE) (quimioatrativo ideal); DMEM contendo apenas CEE 5% ou DMEM contendo apenas HS 2% (ambos quimioatrativos subideal). DMEM puro foi usado como controle negativo. Em uma placa de 24 cavidades, as cavidades inferiores foram preenchidas com meio de teste ou controle. Setenta e cinco mil células foram adicionadas às cavidades superiores. A placa foi incubada por 7 horas a 37°C, CO2 5%. A superfície superior das membranas foi lavada com chumaços de algodão pré-molhados para remover as células que não tinham migrado. A membrana foi então fixada, tingida em hematoxilina de Gill e montadas em úmido em lâminas. As células migradas foram contadas em quatro campos representativos por membrana e o número médio foi colocado em gráfico. Os resultados estão mostrados na Figura 9.

Para análise de quimiotaxia de macrófagos, isolou-se medula óssea de camundongos tratados com solução salina ; (controle) e com antagonista de miostatina 300 (conforme descrito no exemplo 4, abaixo), e foram plaqueadas a SxlO6 células/placa em DMEM 10% FBS mais meio condicionado L929 10% (contendo CDF-1) por 5 dias para induzir diferenciação de macrófago. Os macrófagos foram então coletados e 0 utilizados no ensaio. Três concentrações de DMEM contendo soro de camundongo ativado com zimosano (ZAMS) foram utilizadas, 33% (concentração quimioatrativa ideal), 22% e 11% (concentrações quimioatrativas sub-ideais). DMEM puro foi utilizado como controle negativo. Em uma placa de 24 .5 cavidades, as cavidades inferiores foram preenchidas com meios de teste ou controle. Setenta e cinco mil células foram adicionadas às cavidades superiores contendo membranas de 0,8 μνη tereftalato de polietileno (PET) . A placa foi incubada por 4h a 37 = 0, CO2 5%. A superfície superior das membranas foi lavada com bastonetes pré- umedecidos para remover as células que não migraram. A membrana foi então fixada, tingida em hematoxilina de Gill e montada a úmido em lâminas. As células foram contadas em quatro campos representativos por membrana e o número médio

foi traçado.

Resultados

Quando os mioblastos primários isolados de camundongos velhos (2 anos de idade) foram incubados com miostatina recombinante a 2,5 yg/mL em meio de controle (CEE) , uma redução significativa de aproximadamente 78% foi observada no número de mioblastos migrados. Quando os antagonistas de miostatina 300, 310 e 320 foram adicionados a 5 pg/mL, os efeitos quimioinibidores de miostatina em migração de mioblastos foi recuperado a níveis similares àqueles observados no controle {Figura 6) . Este experimento foi repetido utilizando-se mioblastos de camundongos jovens (1 mês de idade) . Novamente, a adição de antagonistas de miostatina 300 e 310 aos meios contendo miostatina recuperou a migração de células de miostatina a níveis de controle (Figura 7) . Estes resultados demonstram que os antagonistas de miostatina como 300, 310 e 320 podem efetivamente acelerar a regeneração muscular melhorando a migração de mioblastos. Conforme mostrado acima, a miostatina possui um efeito negativo no acréscimo de mioblastos à área de ferimento. Uma vez que os mioblastos são conhecidos por serem influenciados pelos fatores quimiotãticos para dirigirem seus movimentos {Bischoff, 1994; Jones, 2000), o efeito de administração in vivo de antagonista de miostatina 300 na capacidade migratória de mioblastos derivados de célula satélite foi investigado utilizando-se três quimioatrativos. Mioblastos isolados de camundongos que foram tratados com antagonista de miostatina 300 possuíam aumento significativo de taxas de migração em cada um dos meios quimioatrativos em comparação

2 5 aos macrófagos isolados de camundongos de controle tratados

com solução salina (Figura 9).

É também sabido que a miostatina possui um efeito na resposta inflamatória, em particular, a miostatina interfere na migração de macrófagos até o local do dano

3 0 durante a regeneração muscular. Para avaliar se o tratamento com antagonista de miostatina 300 in vivo afetou ou não a migração de macrófagos, um ensaio de migração in vitro foi executado nos macrófagos isolados de camundongos tratados com solução salina (controle) ou antagonista 300 por seis semanas. Os resultados mostraram que o tratamento com antagonista 3 0 0 in vivo aumentou significativãmente a capacidade migratória de macrófagos em três diferentes concentrados de meios quimioatrativos ZAMS (11%/ 22% ou 33%) comparados a macrófagos isolados de controles tratados com solução salina (Figura 10).

A capacidade de administração in vivo de antagonista de miostatina 3 00 para melhorar a taxa de migração de mioblastos e macrófagos indica que a administração de antagonistas de miostatina poderia ser utilizada como um tratamento efetivo em pacientes sofrendo de condições onde a inibição da atividade de miostatina seria clinicamente benéfica, incluindo condições de perda muscular e miopatias inflamatórias, assim como é útil para cura de ferimentos e quaisquer outras patologias onde a migração melhorada de macrófagos e mioblastos pode conferir benefícios.

Exemplo 4: Testes in vivo com mimético de miostatina

300

Métodos

Um teste animal foi conduzido para avaliar os efeitos de antagonista de miostatina 300 na melhora de função mus cu1ar. Camundongos de dezesseis meses de idade f or am divididos em dois grupos de dez. Enquanto o grupo de controle recebeu injeções subcutâneas (SC) de solução salina, o outro grupo recebeu antagonista de miostatina 300 SC a 6 pg/grama de BW três vezes por semana por seis semanas. A melhora funcional de músculo sarcopênico foi avaliada medindo-se a força muscular de camundongos no fim do teste. A força muscular foi medida em Newtons.

Resultados

OS resultados indicam que enquanto hã uma redução na força muscular dos camundongos de controle (perda de aproximadamente 5%), hã um aumento altamente significativo na força muscular de camundongos envelhecidos tratados com o antagonista 300 ao longo do período de seis semanas (Figura 11) . Os mesmos dados foram expressos como força muscular no começo e no fim do teste para ambos os grupos (Figura 12), e a mesma observação foi feita onde a força muscular foi significativamente aumentada em camundongos tratados com os antagonistas de miostatina 300. Isto se deve em parte ao aumento observado na ativação de- células satélite e migração de macrófagos e mioblastos obtidas em células e fibras isoladas destes camundongos no final do período de tratamento (Figuras 9 e 10).

Foi feita uma importante observação adicional. Aos 16 meses, camundongos do tipo selvagem envelhecidos mostraram um acúmulo significativo de gordura corporal. Em ambos os grupos de tratamento, observou-se que todos os camundongos possuíam uma redução distinta na gordura corporal comparados aos controles tratados com solução salina. Isto foi muito perceptível. Desta forma parece que o tratamento prolongado com antagonistas de miostatina reduziu a quantidade de gordura subcutânea, incluindo o acúmulo de gordura inguinal nos camundongos tratados com 300 quando comparados aos camundongos de controle (resultado não mostrado). Foi mostrado anteriormente que a deleção de miostatina durante estágios embriônicos afeta o acúmulo de gordura pós-natal. Entretanto, o resultado surpreendente aqui é que o tratamento de camundongos por um período de 6 semanas reduziu a quantidade de tecido adiposo. Isto poderia se dever aos antagonistas de miostatina mobilizarem os triglicerídeos armazenados no tecido adiposo interferindo com a biossíntese de ácido graxo ou outro mecanismo. Independentemente, este experimento claramente exemplifica o controle do tamanho de tecido adiposo pelos antagonistas de miostatina em contraste com a massa corporal magra devido a uma ausência completa de miostatina (camundongos sem miostatina) diretamente dos estágios embriônicos.

Parece assim que os antagonistas de miostatina são úteis não apenas no tratamento ou prevenção da redução de massa e força muscular induzida por sarcopenia mas também são úteis na redução de depósito de gordura aumentado que está também associado à velhice. Adicionalmente, contempla- se que os antagonistas de miostatina da presente invenção possuirão utilidade no controle/redução da quantidade de tecido adiposo em condições clínicas de obesidade, anorexia

e diabetes.

Exemplo 5: Teste de Mdx in vivo

Métodos:

Um teste in vivo foi executado, onde camundongos mdx de 4 semanas de idade foram injetados, 3 vezes por semana, com 300 (6 pg/g) ou solução salina (10 camundongos em cada tratamento) por 4 semanas. Os pesos corporais foram registrados regularmente e o sangue foi coletado para criar atividade de quinase para avaliar a extensão de dano muscular. Os testes de força foram executados como uma medida de força. Após 4 semanas de tratamento, os camundongos tiveram os mais fracos coletados e os músculos de membros traseiros individuais coletados para análise de expressão de proteína - Pax7 e MyoD (ativação/miogênese de célula satélite), e histologia.

A proteína foi extraída de três músculos de membros traseiros, bíceps femoral, tibial anterior e gastrocnêmio. pg de proteína forma separados em SDS PAGE 4 a 12 % , transferidos a membrana de nitrocelulose e imunomarcados

por Pax7 e MyoD.

Secções transversais de dez micra foram cortadas da região do meio da barriga de cada m. gastrocnêmio. Secções do músculo foram tingidas com hematoxilina e eosina (Η & E) para visualizar e medir áreas de necrose e regeneração. Estas áreas foram analisadas utilizando-se um microscópio Olympus BX50 (Olympus, Tóquio, Japão), uma câmera e software SPOT-RT 4. Ol {Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI) . As áreas foram medidas utilizando-se Image- Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

0 sangue foi coletado por sangramento de cauda em tubos de microhematócritos heparinizados de 75 mm. Os tubos foram centrifugados em uma centrífuga Micro-hematocrit (Adams) por 5 minutos e então o plasma foi removido. 0 plasma recuperado foi centrifugado novamente a 2500 χ g por minutos e então armazenado a -800C até a análise. 0 plasma foi separado dos glóbulos vermelhos do sangue em 2 horas de coleta de sangue para minimizar a hemólise. A atividade de creatinina quinase foi determinada utilizando- se um kit de creatinina quinase CK N-acetil-L-cisteína (Beckman Coulter) em 6 semanas de coleta de plasma. A força muscular foi avaliada utilizando-se um dispositivo de força muscular (MK-380S, Muromachi; Tóquio, Japão) no início, meio e fim do teste. A força máxima exercida por um camundongo enquanto era puxado para trás pelo rabo é registrada em Newtons. A média de três testes de força para cada camundongo foi calculada e a força máxima média de 10 camundongos por grupo foi determinada.

Resultados

MyoD e Pax7 são regulados para cima em resposta ao

tratamento com 3 00.

Tanto Pax7 quanto MyoD foram estabelecidos como

potentes marcadores de miogênese. Os níveis de Pax7 indicam a extensão da união de célula satélite assim como a auto- renovação de célula satélite e a expressão de MyoD indica os níveis de miogênese ocorrendo em um músculo. Para investigar os níveis de proteína Pax7 e MyoD nos músculos de camundongos mdx, uma análise "western blot" foi executada.

Conforme mostrado na Figura 15, havia uma regulação para cima substancial de Pax7 e MyoD. Pax7 é expressa tanto nas células satélite quiescentes e proliferantes. A regulação para cima de Pax7 é indicativa de ativação aumentada de células satélite, número de célula satélite mais alto e auto-renovação de célula satélite aumentada. MyoD é um gene miogênico importante e sua regulação para cima pe indicativa de um aumento na miogênese através da regulação para cima de p21 e Miogenina. A regulação para cima de Pax7 e MyoD sugere que 300 efetivamente antagoniza a miostatina à medida que está bem estabelecido que a ausência de miostatina leva a ativação e auto-renovação de célula satélite aumentada e miogênese.

Necrose reduzida e regeneração aumentada é observada

em músculos tratados com 300.

A área de percentual de regeneração e áreas necróticas são mostradas na Figura 16. Este resultado é consistente com a hipótese de que os antagonistas de miostatina aumentam a regeneração e reparo muscular ativando as células satélite, assim aumentando a formação de novas fibras musculares e reduzindo os níveis de tecido necrótico conforme indicado pela expressão de MyoD e Pax7 melhorada e valores de CK reduzidos no sangue (fig 17).

Atividade de creatinina quinase é reduzida em camundongos tratados com miostatina 300.

A creatinina quinase (CK) é uma enzima intracelular comumente utilizada como um marcador primário para monitorar a extensão de dano muscular em camundongos mdx (Bogdanovich e outros, 2 0 05) e humanos. A mudança na atividade de creatinina quinase do começo ao final do teste é mostrada na Figura 17. A redução maior na atividade de creatinina quinase nos camundongos tratados com 300 sugere menor dano muscular nestes animais devido a uma mudança na proporção de células musculares em regeneração contra o estado danificado ou necrótico. Isto corrobora os dados histológicos mostrando menos área necrótica em camundongos

tratados com 300.

Antagonismo de miostatina com 300 aumenta a força

muscular.

A média de dos três testes de força para cada camundongo foi calculada e a força máxima média de 10 camundongos por grupo pé mostrada na Figura 18. 0 aumento significativo na força muscular após 4 semanas de tratamento com 3 00 indica uma melhoria funcional nos camundongos tratados com 300. Isto é essencialmente atribuído à melhora na patologia dos músculos de camundongos mdx através dos efeitos regenerativos aumentados, através de antagonismo de miostatina resultando em recuperação parcial de função muscular. Estas descobertas sugerem que efeitos benéficos de antagonistas de miostatina em camundongos mdx são provavelmente devidos ao tratamento efetivo de dano muscular, possibilitando uma recuperação de força muscular em mdx de volta ao tipo selvagem (Amthor e outros, 2007) .

Exemplo 6: Teste de biópsia de pele in vivo.

Métodos:

Camundongos C56bl/6 a aproximadamente 10 meses de idade foram anestesiados, a pele das costas e pescoço foi raspada e dois ferimentos foram feitos na pele com uma perfuração de biópsia de 4 mm. Os camundongos foram injetados por via subcutânea com solução salina ou antagonista de miostatina 300 e 6 yg/g de peso corporal nos dias 1, 3, 5 e 7 após o ferimento. Os camundongos foram deixados para curar por 5, 7, 14, 21 e 28 dias, após os quais os mesmos foram recolhidos e as peles processadas

para histologia.

Para a histologia, as amostras de pele foram fixadas

em formalina 10%, incrustados e montados em parafina e tingidos com tintura de tricrômico de Masson. As secções foram analisadas quanto ao tamanho da área de ferimento para cada dia após os tratamentos e os valores foram traçados.

Resultados:

Para avaliar o impacto de antagonismo de miostatina na cicatrização na pele, executamos um estudo de biópsia de pele nos camundongos. Os animais tratados com 300 mostraram consistentemente menor área de ferimento quando comparados com sua contraparte de solução salina, particularmente em períodos posteriores conforme mostrado na Figura 20, indicando que o tratamento com antagonista 3 00 pode influenciar positivamente a taxa de cicatrização de pele em camundongos após um ferimento de biópsia. Estes resultados mostram que o antagonismo de miostatina pode conferir taxas melhoradas de cura em um tecido não muscular, como pele, e indicam que o uso de antagonistas de miostatina possuem aplicações para melhorar a cicatrização de pele após dano de ferimentos, queimaduras, incisões cirúrgicas e outros

traumas da pele.

Bxeitiplo 7: Teste de queimadura de pele in vivo.

Métodos:

Camundongos C56bl/6 a aproximadamente 12 meses de idade foram anestesiados, a pele das costas e pescoço foi raspada e um bastão de metal em brasa (1,5 mm de largura, 7 mm de comprimento) foi aplicada à pele exposta dos camundongos por 5 segundos. Os camundongos foram injetados por via subcutânea com solução salina ou antagonista de miostatina 300 a 6 pg/g de peso corporal nos dias 1, 3, 5, 7 e 10 após o dano. Os camundongos foram deixados para curar por 5, 7, 14, 21, 28, 35 e 46 dias, após os quais os mesmos foram recolhidos e as peles congeladas em nitrogênio líquido para análise de hidroxiprolina. Resultados:

Após o dano da queimadura na pele, um ensaio de hidroxiprolina foi executado para determinar a quantidade de depósitos de colãgeno na área do ferimento. A hidroxiprolina está presente no colãgeno e dã ao mesmo uma conformação estável helicoidal. Consequentemente, medir a quantidade de hidroxiprolina presente em um dado tecido determinará a quantidade de colágeno presente no tecido. Os grupos tratados com 300 mostraram uma tendência na direção de um nível mais baixo de colágeno na área de ferimento quando comparado com o grupo de controle, conforme mostrado na Figura 21, sugerindo que os antagonistas de miostatina poderiam ser úteis no tratamento de tecido não muscular onde o resultado desejado é fibrose reduzida após a

cicatrização.

Exemplo 8: Teste de queimadura de músculo in vivo.

Métodos:

Camundongos C56bl/6 a aproximadamente 12 meses de idade foram anestesiados, e um bastão de metal em brasa (1,5 mm de largura, 7 mm de comprimento) foi aplicada ao músculo TA por 5 segundos. Os camundongos foram injetados por via subcutânea com solução salina ou antagonista de miostatina 300 a 6 pg/g de peso corporal nos dias 1, 3, 5, 7 e 10 após o dano. Os camundongos foram deixados para curar por 5, 7, 14, 21, 28, 35 e 46 dias, após os quais os mesmos foram recolhidos e os músculos processadas para

histologia.

As amostras de músculo histológicas foram cobertas em OCT e congeladas em isopentano resfriado em nitrogênio líquido. As secções foram cortadas em um criostato a 10 pm de espessura e tingidas com H&E de Van Gieson. Marcadores de regeneração, como número total de núcleos formados centralmente (CFN) e número de fibras com CNF foram analisados para cada dia apôs os diferentes tratamentos, e os valores foram traçados.

Resultados:

Fibras musculares esqueléticas maduras possuem núcleos localizados na periferia da fibra. Entretanto, durante a regeneração muscular esquelética, os mioblastos migram para o lado danificado e se fundem às fibras pré-existentes ou se fundem entre si para formarem miofibras nascentes. Durante este processo, os núcleos destas células estão localizados no centro da fibra. Consequentemente foi utilizado o número de núcleos formados de forma central (CNF) e o número de fibras com CNF como marcadores de regeneração muscular. O dano presente nos músculos para os primeiros ponto no tempo do teste era muito disperso, e nenhum marcador de regeneração positivo foi detectado para o grupo tratado ou de controle (Figura 22 e Figura 23). Entretanto, por D21 os números de CFN em grupos tratados é significativamente maior que aqueles de grupos de controle indicando regeneração muscular aumentada nos animais tratados. Esta diferença é mantida até o dia 46 após o dano. Interessante, não hã diferença no percentual de área muscular danificada entre os grupos de tratamento e de controle do D28 em diante (dados não mostrados) . Isto indica que o aumento na regeneração nos grupos tratados com 300 conforme mostrado nos números aumentados de CNF resultou em uma melhora na regeneração muscular após a queimadura. Além disso, visualmente, as diferenças na integridade da fibra muscular entre os grupos tratado e de controle pode ser vista a partir do D21 em diante no grupo de tratamento. Também, o tingimento de van Gieson revelou um grau mais alto de fibrose no grupo de controle quando comparado aos grupos tratados no D21 após o dano (Figura 30) significando remodelamento prematura da área danificada, e consequentemente um influxo prematuro de precursores miogênicos, levando ao aumento de CFN observado do D28 em diante entre os grupos tratados e de controle. A fibrose reduzida em si é também atribuída aos efeitos do antagonista de miostatina na extensão da fibrose que ocorre durante o reparo de tecidos feridos.

Exemplo 9: Teste de Caquexia de Câncer in vitro.

Métodos:

As células C2C12 foram diferenciadas por 72 horas em meios de diferenciação {DMEM + HS 2%). Após este período de diferenciação, os miotubos foram testados com miostatina recombinante a 6 pg/mL ou uma combinação de miostatina e proteína recombinante 300 a 30, 60, 90 ou 120 pg/mL por 24 horas adicionais para determinar se 300 pode recuperar a perda muscular mediada por miostatina in vitro. Mudanças de expressão de gene de moléculas de sinalização intermediária, críticas na caquexia mediada por miostatina, foram analisadas. Consequentemente, a proteína foi isolada das células e uma análise "western blot" foi executada para medir os níveis de expressão de proteína para p-FoxOl, que foi mostrada como sendo um intermediário de sinalização crítico em caquexia mediada por miostatina (McFarlane e

outros, 2006) .

Resultados: p-FoxOl é um intermediário crítico na sinalização de moléculas em caquexia mediada por miostatina. No experimento os níveis de expressão de p-FoxOl foram normalizados a níveis totais de FoxOl. Conforme mostrado na Figura 24, o tratamento com 6 pg/mL de proteína de miostatina recombinante resulta em regulação para baixo de expressão de p-FoxOl após um tratamento de 24 horas. Este resultado é consistente com nossos dados publicados anteriormente descrevendo o mecanismo por trás da caquexia mediada por miostatina (McFarlane e outros, 2006) . Uma recuperação máxima de expressão de p-FoxOl é obtida com 90 pg/mL de 300 (Figura 24). Isto mostra que a aplicação do antagonista de miostatina 300 pode reduzir a magnitude do sinal de FoxOl que é crítico em uma proporção de condições

de condições de perda caquéxica.

Exemplo 10: Teste de Caquexia de Câncer in vivo.

Métodos:

Um estudo de caquexia crônica foi projetado onde camundongos C57B, com 4 semanas de idade, foram injetados com a droga glucocorticóide Dexametasona diariamente a uma concentração de 1 mg/kg de peso corporal. Três grupos de tratamento foram determinados: 5 camundongos recebendo injeções diárias de solução salina, 5 camundongos recebendo injeções diárias de Dexametasona e 5 camundongos recebendo injeções diárias de Dexametasona mais antagonista 300 a uma concentração de 6 pg/g de peso corporal. O peso corporal dos camundongos foi registrado diariamente e monitorado de perto por sinais de caquexia. 0 consumo de comida e água foi registrado para garantir que a perda do peso corporal não fosse devida a uma perda de apetite ou sede. Os pesos corporais, pesos dos acúmulos de gordura e expressão de MyoD e Pax7 foram avaliados.

Resultados:

Peso Corporal

A injeção diária de Desametasona resultou em uma redução de peso corporal médio quando comparado aos controles de solução salina (Figura 25). O Co-tratamento com Desametasona e antagonista 300 resultou em uma perda de peso corpóreo médio menor quando comparado aos controles (Figura 25), indicando que os antagonistas podem evitar a caquexia relacionada à perda muscular e, consequentemente, ao peso corporal em camundongos. Isto também indica que o uso de antagonistas de miostatina como 300 possui aplicações na redução dos efeitos negativos do uso de dexametasona em pacientes humanos.

Pesos de acumulo de gordura

Uma das características clínicas de pacientes sofrendo de síndrome de Gushing (superprodução de glucocorticóides) é depósito de gordura aumentado, assim o peso dos acúmulos de gordura foi analisado apôs o término dos testes.

0 tratamento com Dexametasona resultou em um aumento em peso de acúmulos de gordura retroperitoneal (esquerdo, 62,9%; direito, 60,4%) quando comparado a camundongos tratados com solução salina, com aumentos significativos estatisticamente observados nos acúmulos de gordura retroperitoneal esquerdo e direito e inguinal (p<0,05) (Figura 26) . Um aumento nos pesos de acúmulos de gordura retroperitoneal (esquerdo, 23,3%; direito, 3 9,2%) e inguinal (esquerdo, 33,2%; direito, 39%) foi também observado após o tratamento com 300, embora em um grau menor do que aquele observado após o tratamento com Dexametasona apenas. Desta forma, o tratamento com 300 recuperou parcialmente o aumento em peso de acúmulo de gordura mediado por Dexametasona7 indicando que nosso antagonista pode não só apenas ser útil no tratamento da caquexia, mas também pode ser utilizado em situações onde seria vantajoso reduzir o depósito de gordura de forma a tratar a obesidade.

Expressão de MyoD e Pax7

Isolou-se proteína do músculo gastrocnêmico direito de todos os camundongos e executou-se análises de «western blot" para MyoD e Pax7. Houve uma regulação para baixo significativa da expressão de MyoD (p<0/05) (Figura 27) e Pax7 (p<0,05) (Figura 28) após o tratamento com Dexametasona. Adicionalmente observamos uma regulação para cima significativa (recuperação) da MyoD (p<0,05) e Pax7 (p<0, 01) em camundongos tratados com Dexametasona e antagonista de miostatina 300. Consequentemente o tratamento com antagonista 3 00 parece regular a expressão de MyoD e Pax7 durante a caquexia induzida por Dexametasona. É bem reconhecido que a regulação para cima de MyoD e Pax7 são reguladores de regeneração muscular.

Durante a regeneração muscular em camundongos jovens do tipo selvagem e sem miostatina, mostrou-se que MyoD é expressa mais prematuramente e a níveis mais altos no músculo sem miostatina do que quando comparado ao músculo do tipo selvagem (McCroskery, 2005) . Uma vez que a expressão de MyoD pode ser utilizada como marcador para a detecção muito prematura de mioblastos em migração durante a regeneração muscular (Grounds, 1992), esta expressão prematura de MyoD foi interpretada como uma migração avançada de células miogênicas ao local do dano

(McCroskery7 2005).

Uma vez que Pax7 é um marcador para auto-renovação de célula satélite (Oustanina, 2004; Zammit, 2004), o nível mais alto de Pax7 sugere que 300 melhora este processo de auto-renovação. Isto está de acordo com uma descoberta anterior que sugere que a miostatina inibe a auto-renovação de célula satélite (McCroskery, 2005).

Tomados juntos, os níveis de Pax7 e MyoD mais altos resultantes da administração de 300, suporta a observação de que tratamento com 300 avançou a regeneração muscular neste modelo de perda muscular através de níveis crescentes de células satélite ativadas e subsequente miogênese e auto-renovação de célula satélite.

Exemplo 11: Teste de Sarcopenia in vivo.

Métodos:

Camundongos do tipo selvagem (32 camundongos com aproximadamente 4 a 5 meses de idade) foram injetados por via subcutânea quinzenalmente ou mensalmente com 300 (pg/g de peso corporal) ou solução salina por um período de 10 meses. A força muscular foi avaliada utilizando-se um dispositivo de força muscular (MK-380S, Muromachi; Tóquio, Japão) no fim do teste. A força máxima exercida por um camundongo enquanto era puxado para trás pelo rabo é registrada em Newtons. A média de três testes de força para cada camundongo foi calculada e a força máxima média por grupo foi determinada.

Resultados:

A força muscular é utilizada como um indicador para função muscular (Wagner e outros, 2002). Um teste animal de meses foi conduzido para avaliar os efeitos de antagonista de miostatina na melhora de função muscular em camundongos durante a progressão de estado de jovem até velho. Conforme mostrado na Figura 19, um aumento significativo na força muscular em camundongos tratados mensalmente com 300 sobre os controles com solução salina no final do teste indica uma melhora funcional nos camundongos tratados com 300 (** p<0,01). Foi mostrado que ambos os regimes de aplicação, seja aplicação de antagonista mensal (Figura 19) assim como quinzenal (dados não mostrados) foram igualmente efetivas no aumento da função muscular, mais provavelmente devido â ativação de células satélite aumentada e subsequente miogênese.

Adicionalmente aos efeitos benéficos do uso de antagonista para aumentar a força muscular em camundongos velhos, foi observado que, durante este teste, a.resposta inicial após um mês de tratamento quando os camundongos eram jovens (4 a 5 meses de idade) mostrou um aumento significativo na força muscular. Isto mostra que os antagonistas são efetivos em aumentar a função muscular em músculo com níveis normais de ativação de célula satélite e outros determinantes de função muscular. O resultado indica que o tratamento com antagonistas de miostatina antes do trauma devido a tratamentos médicos ou antes do estabelecimento de condições que se esperaria que resultassem em força muscular reduzida, como inatividade

forçada ou outras condições.

Discussão

A miostatina é um regulador negativo de crescimento muscular uma vez que a falta de miostatina leva ao crescimento muscular enquanto que altos níveis de miostatina induzem à perda muscular. Está documentado que a miostatina traz à tona sua função biológica, em parte, controlando a taxa de proliferação de mioblastos (Thomas e outros, 2000). A miostatina parece ser um potente regulador da progressão do ciclo celular e foi mostrado que níveis aumentados de miostatina bloqueiam a entrada de mioblastos na fase S, inibindo assim a proliferação de mioblastos (Thomas e outros, 2000). Mostrou-se que a miostatina se liga ao receptor de activina tipo IIB e sinaliza através da rota Smad2/3. Foi mostrado que os membros TGF beta, incluindo a miostatina, contêm resíduos de cisteína conservados que são críticos para determinar a estrutura tridimensional e são essenciais para a ligação a receptor

(Lee e McPherron, 2001).

A inibição de atividade de miostatina pode se

manifestar em um número de maneiras, como um aumento no peso corporal (McPherron e outros, 1997), massa muscular melhorada devido à hipertrofia e hiperplasia (McPherron, 1997 e Zhu e outros, 2000), uma redução no conteúdo de gordura corporal (McPherron e outros, 2002), um aumento na força muscular (WO 2006/083183) e um aumento na qualidade

óssea (Hamrick e outros, 2002).

Neste estudo, várias moléculas recombinantes foram testadas quanto a sua capacidade de antagonizar a função da miostatina. Para que os antagonistas sejam funcionais, seria esperado que os resíduos de cisteína conservados fossem críticos em determinar a estrutura tridimensional da proteína, assim atribuindo atividade biológica. Dado que os truncamentos de C terminal nas posições de aminoãcido 300, 310, 320 e 329 resultam, todas, na perda de resíduos de cisteina essenciais, resultando no rompimento da estrutura tridimensional, foi muito surpreendente que 300, 310, 320 e 329 fossem capazes de ser efetivos em neutralizar a atividade de miostatina tanto in vitro quanto in vivo. Assim, estes resultados são sem precedentes e indicam, surpreendentemente, que não apenas estes antagonistas são novos compostos, mas que sua estrutura de proteína tridimensional exata e seu mecanismo de ação são imprevisíveis. Uma vez que peptídeos que são truncados em C terminal nas posições 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 ou 329, todos contêm números suficientes de cisteínas para conferir atividade-conforme demonstrado pelos exemplos acima, é esperado que todos estes peptídeos fossem funcionais. O papel destes resíduos de cisteina em conferir função é suportado pela observação de que 280, que possui um resíduo de cisteina adicional deletado e, consequentemente, contém apenas um resíduo de cisteina, parece ser inativo (Exemplo 1).

Os presentes resultados mostram que os novos antagonistas de miostatina são capazes, apesar da perda de resíduos de cisteina chave e conformação estrutural prevista associada, para antagonizar a miostatina. Este efeito foi mostrado nos testes in vitro e in vivo aqui descritos para fornecer benefícios em: condições onde o efeito ou patologia se deve a sinalização através de níveis de miostatina aumentados, incluindo várias condições debilitantes e traumas que estão associados a níveis aumentados de miostatina, conforme descrito abaixo, onde a capacidade de antagonizar a miostatina tende a conferir resultados benéficos diretamente; e em condições conde a capacidade de antagonizar miostatina resulta na melhora de processos fisiológicos como proliferação de mioblastos, ativação e auto-renovação de células satélite, migração de mioblastos e macrófagos e outros, e onde a melhoria destes efeitos confere benefícios em tecidos onde os níveis de miostatina não são aumentados acima daqueles que ocorrem em

tecidos saudáveis.

A presente invenção tende a ser útil no tratamento ou prevenção de um número de doenças e disfunções que são caracterizadas, pelo menos em parte, por uma quantidade anormal, desenvolvimento ou atividade metab61ica.de tecido muscular ou adiposo em mamífero e pode incluir disfunções relacionadas a hipertrofia muscular; atrofia muscular e desgaste muscular associados a miopatias inflamatórias, distrofias musculares, doenças neuromotoras, doenças de junção meuromuscular, doenças do nervo periférico, miopatias devidas a anormalidades endócrinas, síndrome metabólica, HIV, câncer, sarcopenia, caquexia e outras condições degenerativas; falhas cardíacas; osteoporose; falha ou doença renal; falha ou doença do fígado; anorexia; obesidade; diabetes e cicatrização de ferimentos. Por exemplo, foi mostrado que caquexia pode ser induzida em camundongos pela administração sistemática de miostatina {Zimmers e outros, 2002). Os níveis de miostatina também mostraram elevados em animais com danos de queimaduras (Charles Η. Lang, Christine Silvis, Gerald Nystrom e Robert A. Frost, "Regulation of myostatin by glucocorticoids after thermal injury", FASEB 15, 1807-1809, 2001) e em pacientes com HIV (Gonzalez-Cadavid e outros, 1998) e se descobriu que proteína imunorreativa de miostatina no plasma aumenta após repouso prolongado (Zachwieja e outros, 1999) . Foi demonstrado que a administração dos antagonistas de s resultam em recuperação de moléculas de sinalização de caquexia mediada por miostatina (Exemplo 9) e alívio de perda de peso corporal e melhoria de regeneração muscular em um modelo de camundongo de caquexia (Exemplo 10). Assim indicando que nossos antagonistas podem ser úteis para o tratamento de indivíduos sofrendo de caquexia resultante de queimaduras, repouso prolongado, HIV ou câncer.

Tratamentos de condições como aquelas onde, acredita- se, níveis de miostatina aumentados sejam um sinal chave para induzir efeitos nocivos, obviamente serão assistidos pela capacidade de antagonizar o sinal de miostatina utilizando antagonistas como aqueles aqui descritos. E compreendido que haverá numerosas condições patológicas onde o papel de miostatina em sinalização e indução da patologia exista, mas não tenha sido descoberto ainda.

Mostrou-se que o uso dos presentes antagonistas de miostatina confere benefício em diversas condições onde não é claro se níveis aumentados de miostatina existem ou são responsáveis pelo declínio na função muscular ou de outros tecidos. É claro que a inibição de miostatina pode conferir benefícios em aumentar a proliferação de mioblastos em mioblastos do tipo selvagem (Exemplol), células satélite to tipo selvagem jovem (Exemplo 2) e em jovens camundongos de meses de idade (Exemplo 11) onde não hã indicação de níveis anormais de miostatina. São também apresentados dados mostrando os benefícios dos presentes antagonistas de miostatina em duas condições nocivas, sarcopenia e distrofia muscular, onde os efeitos benéficos tendem a se dever em muito aos efeitos gerais da proliferação de mioblastos melhorada, ativação e auto-renovação de célula satélite, migração de mioblastos e macrõfagos devido aos efeitos diretos dos presentes antagonistas.

A sarcopenia ou caquexia relacionada à idade, é caracterizada pelos níveis insuficientes de regeneração muscular e força muscular reduzida devido À redução na atividade de célula satélite e miogênese (Conboy e outros,

2005; Bockhold e outros, 1998).

Foi demonstrado que, utilizando-se os antagonistas da invenção, a regeneração muscular é aumentada por dois mecanismos principais, isto é, aumentando-se a proliferação de mioblastos (Exemplo 1), e pelo aumento da ativação de célula satélite (Exemplo 2). 0 aumento na regeneração muscular está associado a um aumento na força muscular conforme mostrado utilizando-se administração de curta duração (Exemplo 4) e de longa duração (Exemplo 11) dos antagonistas da invenção. Estes resultados demonstrados aqui também fornecem evidência de que os antagonistas da invenção podem ser utilizados para melhorar a massa e força musculares em um número de condições, como distrofia muscular (Exemplo 5); dano muscular (Exemplo 8); sarcopenia (Exemplo 11); e caquexia de câncer (Exemplos 9 e 14).

Uma vez que o mecanismo de ação é similar para outras condições, prevê-se que antagonistas serão úteis para o tratamento de indivíduos sofrendo de caquexia resultante de queimaduras, repouso prolongado, HIV ou câncer e sarcopenia. Ainda, o aumento da ativação de célula satélite e força muscular em músculos jovens do tipo selvagem (Exemplo 2 e 11) também indica que os antagonistas serão úteis para o tratamento de pacientes em período pré- operatório, assim evitando a perda muscular devido a

repouso forçado pôs-cirúrgico.

Em condições de distrofia hã ativação constante de células satélite devido aos ciclos repetidos de degeneração muscular e subsequente regeneração. Os resultados apresentados demonstram que os antagonistas de invenção são capazes de aumentar a regeneração muscular, ativação de célula satélite e força muscular em modelo de camundongo de distrofia muscular (Exemplo 5) . Uma vez que este modelo de camundongo é um modelo padrão para distrofia humana, prevê- se que indivíduos sofrendo de distrofia poderão ser tratados de forma bem sucedida com os antagonistas de

miostatina da presente invenção.

Os dois exemplos acima mostram os efeitos do tratamento dos antagonistas na força muscular em camundongos jovens e velhos (Exemplo 4) e na redução dos sintomas em camundongos mdx (Exemplo 5) , onde os efeitos benéficos tendem a se dever a proliferação de mioblastos melhorada, ativação e auto-renovação de célula satélite, migração de mioblastos e macrófagos devido aos efeitos de nossos antagonistas na redução de níveis de miostatina abaixo do tipo selvagem normal. Adicionalmente a estes exemplos, espera-se que o tratamento com os antagonistas de miostatina presentes irá conferir efeitos benéficos no 10

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tratamento de qualquer condição médica onde a função muscular será melhorada pelos efeitos da proliferação de mioblastos, ativação e auto-renovação de célula satélite, migração de mioblastos e macrôfagos. Tais condições incluem perda muscular após cirurgia, retardamento do crescimento, baixa estatura fisiológica, perda muscular devida a doença crônica, aceleração da recuperação de pacientes de queimaduras ou outras disfunções onde melhorar' a função muscular seria benéfico.

A resistência do músculo esquelético a admissão de glicose estimulada por insulina é a manifestação mais inicial conhecida do diabetes mellitus tipo 2 (Corregan e outros, 1991). Foi mostrado que a falta de miostatina atenua parcialmente os fenótipos de obesidade e de diabetes de dois modelos de camundongos, o amarelo letal de cutia (Yen e outros, 1994; e o obeso. Adicionalmente, a introdução de uma mutação de miostatina nos camundongós de amarelo letal de cutia mostrou suprimir o acúmulo de gordura em cinco vezes (McPherron e outros, 2002). Isto, juntamente aos atuais resultados mostrando que os antagonistas da presente invenção são capazes de reduzir o depósito de gordura (Exemplo 4 e 11), indicam que os indivíduos sofrendo dos efeitos do diabete, obesidade e condições hiperglicêmicas serão capazes de serem tratados com sucesso com uma dose efetiva terapeuticamente de um ou mais antagonistas de miostatina da presente invenção.

Os presentes resultados também mostram que os presentes antagonistas de miostatina são úteis na cicatrização. Cada ferimento passa por três fases distintas de cicatrização. Primeiramente a fase inflamatória para o descolamento de tecido deteriorado e para limpeza do ferimento; segundo, a fase de proliferação para o desenvolvimento de tecido de granulação; e terceiro, a fase de diferenciação ou regeneração para maturação e formação da cicatriz (Sedlarik, 1994). A fase inflamatória é caracterizada pela infiltração de células inflamatórias, como macrófagos, ao local danificado. Os presentes resultados demonstram que o uso dos presentes antagonistas aumenta a capacidade migratória de macrófagos (Exemplo 3). Isto, juntamente com o tamanho de ferimento diminuído na pele (Exemplo 6) , depósito de colãgeno reduzido na pele (Exemplo 7) e regeneração muscular aumentada conforme indicado pelos marcadores miogênicos aumentados (Exemplo 8) sugerem que os presentes antagonistas serão úteis no tratamento de cicatrização. Os resultados mostram que os efeitos benéficos podem ser esperados em ferimentos de vários tecidos onde a migração de macrófago e mioblasto aumentada, regeneração acelerada de tecidos musculares e fibrose reduzida são resultados úteis. É também esperado que os presentes antagonistas de

miostatina serão úteis no tratamento de músculo cardíaco danificado. Os níveis de miostatina são regulados para cima em cardiomiócitos após infarto do miocárdio (Sharma e outros, 1999) indicando que a inibição de miostatina pode melhorar a recuperação do músculo cardíaco após infarto.

Adicionalmente, camundongos sem miostatina possuem conteúdo de minerais ósseos e densidade óssea aumentados, assim como massa muscular aumentada (Hamrick e outros, 2002). É assim esperado que reduzir os níveis de miostatina 3 0 melhore a resistência dos ossos e reduza a osteoporose e outras doenças degenerativas ósseas.

Rabdomiossarcomas (RMSs), um dos mais comuns tumores sólidos na infância, expressam altos níveis de miostatina. Foi demonstrado que a inibição de miostatina permite que RMSs progridam na diferenciação terminal miogênica (Ricaud e outros, 2003), assim nossos antagonistas podem ser úteis para o tratamento de câncer.

Conforme discutido acima, espera-se que os antagonistas da presente invenção sejam úteis para o tratamento de humanos. Os presentes antagonistas serão igualmente úteis para tratar outras espécies, dado que a seqüência de miostatina é altamente homóloga através das espécies, e de fato as seqüências humana e bovina são idênticas (Figura 31) e nossos antagonistas têm demonstrado aumentar a proliferação de células de ovinos, murinas e humanas in vitro. Os presentes resultados também claramente demonstram que os antagonistas de miostatina da invenção podem aumentar a proliferação de mioblastos (Exemplo 1).

REFERÊNCIAS

As seguintes referências, ao grau de que elas fornecem detalhes exemplares, de procedimento ou outros detalhes suplementares àqueles aqui expostos, são especificamente incorporados aqui por referência. As especificações de patente, referidas por todo texto desta especificação, são também especificamente incorporados aqui por referência.

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APLICAÇÃO INDUSTRIAL A presente invenção fornece novas proteínas possuindo atividade antagonista de miostatina que são úteis no tratamento de disfunções relacionadas â miostatina. Tais disfunções são caracterizadas, pelo menos em parte, por uma quantidade, desenvolvimento ou atividade metabólica anormais do músculo ou tecido adiposo em um mamífero e pode incluir disfunções relacionadas à hipertrofia muscular; atrofia muscular e perda muscular associados a miopatias inflamatórias, distrofias musculares, doenças neuromotoras, doenças de junção neuromuscular, doenças do nervo periférico, miopatias devidas a anormalidades endõcrinas, síndrome metabólica, HIV, câncer, sarcopenia, caquexia e outras condições degenerativas; falhas cardíacas; osteoporose; falha ou doença renal; falha ou doença do fígado; anorexia; obesidade; diabetes e cicatrização de ferimentos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

25

<110> Orico Ltd

5

<120> antagonistas de miostatina

<130> 567032 cje

<160> 14

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 2823

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agattcactg gtgtggcaag ttgtctctca gactgtacat gcattaaaat tttgcttggc

attactcaaa agcaaaagaa aagtaaaagg aagaaacaag aacaagaaaa aagattatat tgattttaaa atcatgcaaa aactgcaact ctgtgtttat atttacctgt ttatgctgat tgttgctggt ccagtggatc taaatgagaa cagtgagcaa aaagaaaatg tggaaaaaga ggggctgtgt aatgcatgta cttggagaca aaacactaaa tcttcaagaa tagaagccat taagatacaa atcctcagta aacttcgtct ggaaacagct cctaacatca gcaaagatgt tataagacaa cttttaccca aagctcctcc actccgggaa ctgattgatc agtatgatgt ccagagggat gacagcagcg atggctcttt ggaagatgac gattatcacg ctacaacgga aacaatcatt accatgccta cagagtctga ttttctaatg caagtggatg gaaaacccaa atgttgcttc tttaaattta gctctaaaat acaatacaat aaagtagtaa aggcccaact 40 atggatatat ttgagacccg tcgagactcc tacaacagtg tttgtgcaaa tcctgagact catcaaacct atgaaagacg gtacaaggta tactggaatc cgatctctga aacttgacat gaacccaggc actggtattt ggcagagcat tgatgtgaag acagtgttgc aaaattggct caaacaacct gaatccaact taggcattga aataaaagct ttagatgaga atggtcatga 84 0 tcttgctgta accttcccag gaccaggaga agatgggctg aatccgtttt tagaggtcaa 50 ggtaacagac acaccaaaaa gatccagaag ggattttggt cttgactgtg atgagcactc aacagaatca cgatgctgtc gttaccctct aactgtggat tttgaagctt ttggatggga ttggattatc gctcctaaaa gatataaggc caattactgc tctggagagt gtgaatttgt atttttacaa aaatatcctc atactcatct ggtacaccaa gcaaacccca gaggttcagc aggcccttgc tgtactccca caaagatgtc tccaattaat atgctatatt ttaatggcaa 60 agaacaaata atatatggga aaattccagc gatggtagta gaccgctgtg ggtgctcatg

35

45

55

60 120 180 240 300 360 420 480 54 0 600 660 720 780

900 960 1020 1080 1140 1200 1260 10

agatttatat taagcgttca taacttccta aaacatggaa ggttttcccc tcaacaattt 1320 tgaagctgtg aaattaagta ccacaggcta taggcctaga gtatgctaca gtcacttaag 1380 cataagctac agtatgtaaa ctaaaagggg gaatatatgc aatggttggc atttaaccat 1440 ccaaacaaat catacaagaa agttttatga tttccagagt ttttgagcta gaaggagatc 1500 aaattacatt tatgttccta tatattacaa catcggcgag gaaatgaaag cgattctcct 1560 tgagttctga tgaattaaag gagtatgctt taaagtctat ttctttaaag ttttgtttaa 1620 tatttacaga aaaatccaca tacagtattg gtaaaatgca ggattgttat ataccatcat 1680 tcgaatcatc cttaaacact tgaatttata ttgtatggta gtatacttgg taagataaaa 1740 ttccacaaaa atagggatgg tgcagcatat gcaatttcca ttcctattat aattgacaca 1800 gtacattaac aatccatgcc aacggtgcta atacgatagg ctgaatgtct gaggctacca 1860

2 0

ggtttatcac ataaaaaaca ttcagtaaaa tagtaagttt ctcttttctt caggggcatt 1920

ttcctacacc tccaaatgag gaatggattt tctttaatgt aagaagaatc atttttctag 1980

aggttggctt tcaattctgt agcatacttg gagaaactgc attatcttaa aaggcagtca 2 04 0

aatggtgttt gtttttatca aaatgtcaaa ataacatact tggagaagta tgtaattttg 2100

tctttggaaa attacaacac tgcctttgca acactgcagt ttttatggta aaataataga 2160

3 0

aatgatcgac tctatcaata ttgtataaaa agactgaaac aatgcattta tataatatgt 2220

atacaatatt gttttgtaaa taagtgtctc cttttttatt tactttggta tatttttaca 2280

ctaaggacat ttcaaattaa gtactaaggc acaaagacat gtcatgcatc acagaaaagc 2340

aactacttat atttcagagc aaattagcag attaaatagt ggtcttaaaa ctccatatgt 2400

^ taatgattag atggttatat tacaatcatt ttatattttt ttacatgatt aacattcact 2460

tatggattca tgatggctgt ataaagtgaa tttgaaattt caatggttta ctgtcattgt 2520

gtttaaatct caacgttcca ttattttaat acttgcaaaa acattactaa gtataccaaa 2580

45 ataattgact ctattatctg aaatgaagaa taaactgatg ctatctcaac aataactgtt 2640

acttttattt tataatttga taatgaatat atttctgcat ttatttactt ctgttttgta 2700

aattgggatt ttgttaatca aatttattgt actatgacta aatgaaatta tttcttacat 2760

ctaatttgta gaaacagtat aagttatatt aaagtgtttt cacatttttt tgaaagacaa 2820 aaa

50

55

60

<210> 2

<211> 375

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

2823 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 25

30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 40

45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55

60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 só

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90

95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105

110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120

125

Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 I60

Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170

175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185

190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200

205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Glv 210 215

220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 23O 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val-Lys 245 250 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

15

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320

20

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375

35

<210> 3 <211> 63 <212> PRT 4 0 <213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 45 1 5 10 15

50

55

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 40 45

Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln 50 55 60

60 <210> 4 <211> 54 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 40 45

Phe Val Phe Leu Gln Lys 50

<210> 5

<211> 44

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser 40

<210> 6

<211> 34

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> β

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 10 I5

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Aso Tro Ile 25 30

Ile Ala

<210> 7 <211> 28 <212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg 10 15

Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 25

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20

<400> 8

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 20

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35

<400> 9

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 10 15

4 0 Arg Tyr

<210> 10

45 <211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

50

<400> 10

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 10 15

55 <210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

60 <400> 11 Α-P Phe Oly Leu f p cys Asp ^ hís ser Qiu ^ ^

15

<210> 12

<211> 14

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

30

ASP Phe Qly Leu cys Ãsp Qlu hís Thr siu ^

15

20

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> Synthetic

<400> 13

™ «y His 8is „is His His His His ^ hís hís ^r ^r ^ ^s

15

Ile Glu Gly Ar3 His Met Leu Glu ASp Pro

25

<210> 14

<211> 21

<212 > PRT

<213> E COli PETie-B vector

<400> 14

«» ASP Pro Ala f. Asn Lys Ala Arg Glu Ala Giu ^ αι& 4U 10 15

Ala Thr Ala Glu Gln 20

Claims (34)

1. Polipeptídeo recombinante isolado possuindo atividade antagonista de miostatina, caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento do C terminal está em uma posição de ou entre os aminoácidos 281 e 329, ou um fragmento, variação ou derivado deste.

2. Polipeptídeo recombinante isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo de um peptídeo de miostatina maduro truncados no C terminal, onde o truncamento do C terminal está na posição de aminoácido 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 15 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 ou 329, ou um fragmento, variação ou derivados destes.

3. Polipeptídeo recombinante isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo de um polipeptídeo de miostatina maduro truncado no C terminal, onde o truncamento no C terminal está na posição de aminoácido 329, 320, 310, 300, 295, 289, 284, 282 ou 281 (Id. de Seq. n° 3 a 11, respectivamente) , ou um fragmento, variante ou derivado deste, ou um polipeptídeo possuindo homologia de seqüência substancial ao mesmo.

4. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da reivindicação 1 ou uma seqüência complementar ao mesmo.

5. Polipeptídeo recombinante isolado, de acordo com a reivindicação 1, ou polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o aminoácido ou seqüência de nucleotídeo é modificada para produzir um antagonista de miostatina possuindo características de ligação seletivamente alteradas ou possuindo biodistribuição ou meia-vida, in vivo ou em armazenagem, melhoradas.

6. Polipeptídeo recombinante isolado ou polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos modificados são selecionados a partir do grupo consistindo de um aminoácido glicozilado, um aminoácido PEGilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma metade lipídio, um aminoácido D ou um aminoácido conjugado a um agente de derivação orgânico.

7. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender um ou mais polipeptídeos recombinantes da reivindicação 1 junto a um ou mais polipeptídeos adicionais que melhoram uma ou mais funções selecionadas do grupo consistindo de purificação, formação de complexos de proteína, localização ou distribuição de tecido, admissão/administração, estabilidade in vivo e/ou meia-vida in vivo.

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que um ou mais polipeptídeo adicionais compreendem o domínio Fc de imunoglobulina como um fragmento Fc de IgGl.

9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que um ou mais polipeptídeos adicionais compreendem uma subsequência de purificação selecionada a partir do grupo consistindo de um marcador de epitopo, um marcador FLAG, uma seqüência de polihistidina ou uma fusão GST.

10. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de compreender um polipeptídeo recombinante da reivindicação 3, uma seqüência de polihistidina e uma seqüência marcadora.

11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a seqüência de polihistidina está localizada no N terminal do polipeptídeo recombinante e a seqüência marcadora está localizada no C terminal.

12. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a seqüência de polihistidina consiste da Id. de Seq. n° 13.

13. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a seqüência marcadora de C terminal consiste da Id. de Seq. n° 14.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um polipeptídeo isolado da reivindicação 1 juntamente a um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma proteína de fusão da reivindicação 7.

16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo isolado ou proteína de fusão é conjugado(a) a um segundo composto farmaceuticamente ativo para melhorar o efeito terapêutico na célula ou tecido alvo e onde a composição farmacêutica está formulada para administração separada, seqüencial ou simultânea do polipeptídeo ou proteína de fusão isolado(a) e o segundo composto.

17. Uso de pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para regulação de crescimento muscular, promover diferenciação adipogênica e/ou promover crescimento ósseo ou mineralização em um animal em necessidade destes.

18. Uso de pelo menos uma proteína de fusão da reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para regulação de crescimento muscular, promover diferenciação adipogênica e/ou promover crescimento ósseo ou mineralização em um animal em necessidade destes.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de produzir massa muscular aumentada, depósito de gordura reduzido e/ou crescimento ósseo melhorado em um carneiro, gado, cervídeo, aves, peru, suíno, cavalo, camundongo, rato, gato, cão ou humano.

20. Uso de pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para evitar, tratar ou reduzir a gravidade de uma condição patológica relacionada a miostatina, que é caracterizada, pelo menos em parte, por uma quantidade anormal de desenvolvimento ou atividade metabólica muscular ou de tecido adiposo em um paciente necessitado.

21. Uso de pelo menos uma proteína de fusão da reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para evitar, tratar ou reduzir a gravidade de uma condição patológica relacionada a miostatina, que tem como característica, pelo menos em parte, uma quantidade anormal de desenvolvimento ou atividade metabólica muscular ou de tecido adiposo em um paciente necessitado.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 ou 21, caracterizado pelo fato de que a condição patológica está selecionada a partir do grupo consistindo de disfunções relacionada a hipertrofia muscular; atrofia muscular e desgaste muscular associados a miopatias inflamatórias, distrofias musculares, doenças neuromotoras, doença de junção meuromuscular, doenças do nervo periférico, miopatias devidas a anormalidades endócrinas, síndrome metabólica, HIV, câncer, sarcopenia, caquexia e outras condições degenerativas; falhas cardíacas; osteoporose; falha ou doença renal; falha ou doença do fígado; anorexia; obesidade; diabetes e cicatrização de ferimentos.

23 . Uso de pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar uma condição, onde a condição é uma que se beneficiaria, em parte, da ativação de célula satélite aumentada, proliferação de mioblasto, migração de macrófago e mioblasto e/ou fibrose reduzida onde o referido método compreende administrar uma quantidade efetiva de pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1 a um paciente necessitado.

24. Uso de pelo menos uma proteína de fusão da reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para prevenir, tratar ou melhorar uma condição, onde a condição é uma que se beneficiaria, em parte, da ativação de célula satélite aumentada, proliferação de mioblasto, migração de macrófago e mioblasto e/ou fibrose reduzida onde o referido método compreende administrar uma quantidade efetiva de pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1 a um paciente necessitado.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada a partir do grupo consistindo de dano muscular devido a trauma; dano muscular devido à administração de agentes como agentes quimioterápicos, radioterapia, desametasona; desgaste muscular devido a imobilização prolongada como aquela requerida após cirurgia; cicatrização de ferimentos; disfunções relacionadas a hipertrofia muscular; atrofia e dano muscular associados a miopatias inflamatórias, distrofias musculares, doenças neuromotoras, doenças da junção meuromuscular, doenças do nervo periférico, miopatias devido a anormalidades endócrinas, síndrome metabólica, HIV, câncer, sarcopenia, caquexia e outras condições degenerativas; falha cardíaca; osteoporose; falha ou doença renal; falha ou doença hepática; anorexia; obesidade e diabetes.

26. Método para produção de um polipeptídeo recombinante isolado da reivindicação 1, o referido método caracterizado pelo fato de compreender as etapas: a. truncar peptídeos de miostatina maduros no C terminal, na posição 329, 320, 310, 300, 295, 289, 284, 2 82 ou 281; b. amplificar por PCR o referido peptídeo truncado; c. clonar o referido peptídeo em um vetor adequado com uma seqüência marcadora de C terminal e N terminal; d. transfectar o referido vetor em um hospedeiro adequado; e. expressar o referido peptídeo e purifica-lo utilizando as referidas seqüências marcadoras; f. remover opcionalmente uma ou ambas as referidas seqüências marcadoras.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o marcador de histidina de N terminal é removido por digestão de enzima de restrição.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a seqüência marcadora de C terminal é removida por digestão de enzima de restrição.

29. Polipeptídeo recombinante isolado, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método de qualquer uma das reivindicações 26, 27 ou 28.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 ou 25, caracterizado pelo fato de que, quando a condição a ser tratada ou prevenida é sarcopenia, uma quantidade efetiva do pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1 ou proteína de fusão da reivindicação 7, seja administrada.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a administração é diária.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que por semana.

33. Uso, de acordo caracterizado pelo fato de que

34. Uso, de acordo caracterizado pelo fato de que a administração é três vezes com a reivindicação 30, a administração é quinzenal. com a reivindicação 30, a administração é mensal.