JP5993827B2 - ミオスタチンアンタゴニスト - Google Patents

Description

本発明は、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する新規なタンパク質に関する。本発明はさらに、ミオスタチンに関連づけられる障害の処置における新規なタンパク質の使用に関する。

ミオスタチン（またはＧＤＦ−８）は筋肉成長の負の調節因子であり、構造的にはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに関連づけられる（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７ａ）。より具体的には、ミオスタチンは成長の間および生涯における骨格筋の強力な負の調節因子である。ミオスタチンはまた、魚類から哺乳動物までの広範囲の様々な種に見出され、ミオスタチンタンパク質は種間において高度に保存され、相同的である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、１９９７ａ）。ミオスタチンは、その生物学的作用を、細胞表面受容体アクチビンＩＩＢ型との相互作用を介して及ぼす（Ｌｅｅら、２００１）。ミオスタチンはまた、現時点では完全には理解されていない機構を介して自分自身の発現を調節することが知られている（Ｓｐｉｌｌｅｒら、２００２；Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａら、２００３）。

ミオスタチンは、アポトーシスを誘導することなく、または、筋肉タンパク質の分解を刺激することなく、筋芽細胞の増殖および分化を阻害することが明らかにされている（Ｔｈｏｍａｓら、２０００；Ｌａｎｇｌｅｙら、２００２；Ｒｉｏｓら、２００１；Ｔａｙｌｏｒら、２００１）。ミオスタチンについてのノックアウトマウスは、大きく増大した筋肉量をその身体全体にわたって有する。ミオスタチン欠損（ｎｕｌｌ）マウスは、正常なマウスよりもおよそ３０％大きい体重を有し、筋線維の過形成および肥大のために個体の筋肉重量における２倍〜３倍の増大を示す。ミオスタチンにおける自然の突然変異が、「筋肉二倍（ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ）」表現型（例えば、Ｂｅｌｇｉａｎ ＢｌｕｅおよびＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅのウシ系統など）に関わっているとして特定されている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７ｂ；Ｋａｍｂａｄｕｒら、１９９７；Ｇｒｏｂｅｔら、１９９７）。類似した表現型が、ミオスタチン遺伝子が欠損するヒトにおいて認められている（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、２００４）。ミオスタチン欠損動物の研究による様々な生物学的プロセスにおけるミオスタチンの役割の解釈は、出生前の発達影響と、ミオスタチンが若年期および成体期の期間中に存在しないことに関連づけられる影響とを区別することができないことによって混乱している。

しかしながら、ミオスタチンは、筋肉消耗または筋萎縮（例えば、ＨＩＶ、ガン、長期のベッド安静、筋ジストロフィーに冒された個体において見られる筋肉消耗または筋萎縮など）に関連する数多くの障害において、あるいは、加齢に伴うサルコペニアにおいて関係している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、１９９８；Ｌａｎｇｌｅｙら、２００４；Ｚａｃｈｗｉｅｊａら、１９９９；Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、２００２；国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８３）。ミオスタチンのインビボ投与は、悪液質、すなわち、ガンおよび敗血症に関連し（Ｚｉｍｍｅｒｓら、２００２）、また、長期に及ぶベッド安静の結果として同様に生じ得る筋肉消耗の重篤な形態を誘導することが明らかにされた。さらには、グルココルチコイド誘導の筋萎縮におけるミオスタチンのアップレギュレーションが認められている（Ｍａら、２００３）。ミオスタチン発現における変化が他の状態において示されており、例えば、心臓損傷後の心筋細胞においてアップレギュレーションされており、また、再生途中の筋肉ではダウンレギュレーションされている（Ｓｈａｒｍａら、１９９９）。

ミオスタチンはまた、多くの他の生物学的プロセスに結びつけられている。例えば、ノックアウト遺伝子組変えマウスは、変化した皮質骨構造を有しており、このことは骨形成における役割を示している（Ｈａｍｒｉｃｋ、２００３）。さらには、ミオスタチンは、グルコースおよび脂肪の代謝を調節することに関与することが示されており、従って、ミオスタチンは２型糖尿病および肥満に関係するかもしれない（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、２００２）。ミオスタチンはまた、創傷治癒期間中の炎症性応答に関与することも示されている（国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８２）。

筋肉の成長および分化、ならびに、多くの疾患および障害の病理学においてミオスタチンによって果たされる重要な役割は、ミオスタチンのアンタゴニストについての研究をもたらしている。多くのミオスタチンアンタゴニストが開発されており、例えば、抗ミオスタチン抗体（米国特許第６０９６５０６号および米国特許第６４６８５３５号）；切断されたアクチビンＩＩＢ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチン（国際特許出願公開ＷＯ０２／０８５３０６）；ミオスタチンを過剰発現する細胞から培養液に放出されるミオスタチン阻害剤（国際特許出願公開ＷＯ００／４３７８１）；ミオスタチンの優性ネガティブ体（国際特許出願公開ＷＯ０１／５３３５０）；および、ミオスタチンに結合し、ミオスタチンを阻害するＷＭＣＰＰドメインを含む小ペプチド（米国特許出願公開第２００４／０１８１０３３号）などが開発されているが、現在、どのミオスタチンアンタゴニストも臨床使用されていない。従って、治療剤として使用するためのより強力なミオスタチンアンタゴニストを開発することが依然として求められている。

国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８２ 米国特許第６０９６５０６号 米国特許第６４６８５３５号 国際特許出願公開ＷＯ０２／０８５３０６ 国際特許出願公開ＷＯ００／４３７８１ 国際特許出願公開ＷＯ０１／５３３５０ 米国特許出願公開第２００４／０１８１０３３号

従って、ミオスタチンに関連づけられる障害を処置するための、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有するタンパク質を提供すること、および／または、有用な選択肢を人々に提供することが本発明の目的である。

本発明は、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する新規な組換え産生されたペプチドに関する。

１つの局面において、本発明は、Ｃ末端切断がアミノ酸２８１およびアミノ酸３２９での位置またはアミノ酸２８１〜アミノ酸３２９の間での位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体を含む、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する単離された組換えポリペプチドを提供する。

本発明の単離された組換えポリペプチドは、Ｃ末端切断が、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位、３０５位、３０６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１３位、３１４位、３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位または３２９位のアミノ酸位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体からなる群から選択することができる。

好ましくは、本発明の単離された組換えポリペプチドは、Ｃ末端切断が、３２９位、３２０位、３１０位、３００位、２９５位、２８９位、２８４位、２８２位または２８１位のアミノ酸位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンポリペプチド（それぞれ、配列番号３〜配列番号１１）、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体、あるいは、それに対する実質的な配列相同性を有するポリペプチドからなる群から選択される。

より好ましくは、本発明の単離された組換えポリペプチドは、Ｃ末端切断が、３２０位、３１０位または３００位のアミノ酸位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンポリペプチド（それぞれ、配列番号４〜配列番号６）、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体、あるいは、それに対する実質的な配列相同性を有するポリペプチドからなる群から選択される。

本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその相補的な配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

本発明のポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列の変種は、選択的に変化させられた結合特性を有するミオスタチンアンタゴニスト、あるいは、改善された生体分布、または、インビボもしくは棚での改善された半減期を有するミオスタチンアンタゴニストを作製するための手段として望ましい場合がある。

好ましくは、本発明のミオスタチンアンタゴニストポリペプチドは、精製、タンパク質複合体の形成、組織局在化もしくは組織分布、取り込み／投与、インビボ安定性および／またはインビボ半減期からなる群から選択される１つまたは複数の機能を高める１つまたは複数のポリペプチドを本発明のアンタゴニストに加えて含む融合タンパク質の一部である。例えば、融合タンパク質は免疫グロブリンのＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントなど）を含むことができる。融合タンパク質は精製配列を含むことができ、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列またはＧＳＴ融合物などを含むことができる。好ましくは、タグ配列は配列番号１３および配列番号１４を含む。

本発明のミオスタチンアンタゴニストポリペプチドは、１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含むことができ、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質成分にコンジュゲート化されたアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、有機誘導体化剤にコンジュゲート化されたアミノ酸などを含むことができる。

本発明はまた、本発明の少なくとも１つの単離されたポリペプチドを医薬的に許容され得るキャリアとともに含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、動物において筋肉成長を調節し、脂肪生成分化を促進させ、かつ／または、骨の成長もしくは無機化を促進させる方法であって、前記動物に本発明の少なくとも１つのポリペプチドの効果的な量を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、この方法は、増大した筋肉量、低下した脂肪沈着、および／または、改善された骨成長を、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽、七面鳥、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ネコ、イヌまたはヒトにおいて生じさせるために使用することができる。

動物はミオスタチンの正常なレベルまたは異常なレベルを有し得る。正常なレベルのミオアスタチンを有する動物において、本発明のアンタゴニストによる処置は、増大した筋肉量をもたらす。正常な筋肉量を有する動物において、そのような処置は筋肉量における増大をもたらし、食肉生産業界では特に有用であり得る。筋損傷または外傷に起因する低下した筋肉量、ベッド安静に起因する消耗などを有する動物において、本発明のアンタゴニストによる処置は筋肉量を正常に回復させる。異常なミオスタチンレベルを有する動物においては、筋肉量が常に低下し、本発明のミオスタチンアンタゴニストによる処置は筋肉量を正常なレベルに向かって回復させる。

本発明はまた、患者における筋肉組織または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性によって少なくとも部分的には特徴づけられるミオスタチン関連の病理学的状態を防止するか、または、そのような病理学的状態を処置するか、または、そのような病理学的状態の重篤度を軽減するための方法であって、本発明の少なくとも１つのポリペプチドの効果的な量をその必要性のある患者に投与することを含む方法を提供する。

そのような病理学的状態には、筋肥大に関連づけられる障害；炎症性筋障害、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、末梢神経の疾患、内分泌異常に起因する筋障害、代謝症候群、ＨＩＶ、ガン、サルコペニア、悪液質、無活動状態または長期のベッド安静、および、他の消耗性状態に関連する筋萎縮および筋肉消耗；心不全；骨粗鬆症；腎不全または腎疾患；肝不全または肝疾患；食欲不振；肥満；糖尿病；および創傷治癒が含まれ得る。

別の代替として、本発明のポリペプチドは、上記で述べられた疾患または治療的適応症を処置することを目指して第２の化合物を送達することによって標的細胞または標的組織に対する治療効果を高めるための別の医薬活性な化合物にコンジュゲート化することができる。これらの組合せにおいて、本発明のミオスタチンアンタゴニストは、独立して、また、連続して投与することができ、または、同時に投与することができる。

本発明はまた、本発明の少なくとも１つのポリペプチドの効果的な量を動物に投与することを含む、動物の筋肉成長を調節する方法を提供する。好ましくは、この方法は、増大した筋肉量を、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽、七面鳥、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ネコ、イヌまたはヒトにおいて生じさせるために使用することができる。

本発明は、下記の図面を参照してさらに記載される。

Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖に対するミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０の（１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌでの）影響を示す。筋芽細胞を４８時間および／または７２時間培養した。 ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０を３つの濃度（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）で使用したときのＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖および回復に対するミオスタチンの阻害作用を示す。 若い（１月齢）野生型マウスに由来する単離された線維に対するＰＣＮＡ陽性核の数を示す。単離された線維を、アンタゴニストの非存在下（コントロール）、または、５μｇのミオスタチンアンタゴニスト３００とともに２４時間または４８時間インキュベーションした。 若い（１月齢）野生型マウスから得られる衛星細胞活性化データを示す。単離された線維を、アンタゴニストの非存在下（コントロール）、または、５μｇのミオスタチンアンタゴニスト３００とともに２４時間または４８時間インキュベーションした。活性化された衛星細胞をＩＣＣによるＰＣＮＡ標識化によって検出した。ＰＣＮＡ陽性核を１００個の筋核（ｍｙｏｎｕｃｌｅｉ）について計数し、生データを、コントロールに対して正規化された増大百分率に変換した。^＊ｐ＝＜０．０５。 老齢（２年齢）野生型マウスから得られる衛星細胞活性化データを示す。単離された線維を、アンタゴニストの非存在下（コントロール）、または、５μｇのミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０もしくはミオスタチンアンタゴニスト３２０とともに２４時間または４８時間インキュベーションした。活性化された衛星細胞をＩＣＣによるＰＣＮＡ標識化によって検出した。ＰＣＮＡ陽性核を１００個の筋核について計数し、生データを、コントロールに対して正規化された増大百分率に変換した。^＊ｐ＝＜０．０５。 ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０またはミオスタチンアンタゴニスト３２０を使用したときの、老齢（２年齢）マウス由来の初代筋芽細胞および回復に対するミオスタチンの化学阻害作用を示す。 ミオスタチンアンタゴニスト３００およびミオスタチンアンタゴニスト３１０を使用したときの、若齢（１月齢）マウス由来の初代筋芽細胞および回復に対するミオスタチンの化学阻害作用を示す。 セイライン（コントロール）またはミオスタチンアンタゴニスト３００（６μｇ／ｇ体重）を６週間にわたって週に３回受けるマウスから得られる衛星細胞活性化データを示す。 セイライン（コントロール）またはミオスタチンアンタゴニスト３００（６μｇ／ｇ体重）を６週間にわたって週に３回受けるマウスに由来する筋芽細胞の遊走能を示す。 セイライン（コントロール）またはミオスタチンアンタゴニスト３００（６μｇ／ｇ体重）を６週間にわたって週に３回受けるマウスから得られる骨髄由来マクロファージの遊走能を示す。 セイライン（コントロール）またはミオスタチンアンタゴニスト３００（６μｇ／ｇ体重）を６週間にわたって週に３回受けるマウスでの握力における平均パーセント変化を示す。 ０日目および４２日目での図１１のコントロールマウスおよび処置マウスの平均握力を示す。 ヒト筋芽細胞の増殖に対する、ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０の（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌでの）影響を示す。筋芽細胞を１４４時間培養した。 ウシ筋芽細胞の増殖に対する、ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０の（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌでの）影響を示す。筋芽細胞を４８時間培養した。 ＭｙｏＤおよびＰａｘ７が、ｍｄｘマウスにおけるミオスタチン３００アンタゴニスト処置の後、大腿二頭筋、前脛骨筋および腓腹筋においてアップレギュレーションされることを示す。 ミオスタチンの、３００による拮抗は、ｍｄｘマウスにおいて、筋肉の再生を高め、壊死を低下させることを示す。 ミオスタチンの、３００による拮抗は、クレアチンキナーゼ活性をｍｄｘマウスにおいて低下させることを示す。 ミオスタチンの、３００による拮抗は、握力をｍｄｘマウスにおいて増大させることを示す。 野生型マウスにおける３００の長期投与の後での握力における増大を示す。 ミオスタチンアンタゴニスト３００により処置されたときの、皮膚生検後のマウスにおける増大した創傷治癒を示す。 皮膚火傷後、３００による処置を伴うマウス、および、３００による処置を伴わないマウスにおける創傷領域でのコラーゲン沈着を示す。 セイラインに対して比較されるように、３００により処置されたときの筋肉火傷後における筋原性マーカー（中心形成核（ＣＦＮ）の総数）の増大した数を示す。 セイラインに対して比較されるように、３００により処置されたときの筋肉火傷後における筋原性マーカー（中心形成核（ＣＦＮ）を有する線維の数）の増大した数を示す。 ミオスタチンの、３００による拮抗は、ミオスタチンによる阻害の後におけるｐ−ＦｏｘＯ１の発現を救済することを示す。 デキサメタゾンによる処置、または、３００との組合せでのデキサメタゾンによる処置の後における２２日間にわたる平均％体重変化を示す。 デキサメタゾンによる処置、または、３００との組合せでのデキサメタゾンによる処置の後における平均後腹膜脂肪パッド重量を示す。 デキサメタゾンによる処置、または、３００との組合せでのデキサメタゾンによる処置の後における平均ＭｙｏＤ発現を示す。 デキサメタゾンによる処置、または、３００との組合せでのデキサメタゾンによる処置の後における平均Ｐａｘ７発現を示す。 陽性コントロールでの３００（１０μｇ／ｍｌ）に加えて、３つの濃度（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）での模倣体２８０および模倣体３２９の筋芽細胞増殖アッセイ結果を４８時間後および７２時間後において示す。 図３０Ａ（コントロール）および図３０Ｂ（３００による処置）は火傷傷害後２１日での筋肉のファン・ギーセン染色を示し、矢印は、筋肉におけるコラーゲン沈着物、すなわち、筋肉おける線維性組織の形成を示す。セイラインにより処置された筋肉（コントロール）は、３００アンタゴニストにより処置された筋肉と比較されたとき、より多くの量のコラーゲン沈着物を示す。図３０Ｃおよび図３０Ｄは筋肉のＨ＆Ｅ染色を示す。セイラインにより処置された筋肉（Ｃ）は、壊死した変性途中の線維を示す。３００アンタゴニストにより処置された筋肉（Ｄ）は、より暗い染色された線維を示し、多くが中心形成核を有しており、このことは新生線維および再生途中の線維を示している。 ミオスタチン配列の種間における配列相同性が大きいことを示す。

（例示的定義）

別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および組成物と類似または同等である任意の方法および組成物を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および組成物が本明細書中に記載される。本発明の目的のために、下記の用語は下記において定義される。

本明細書および請求項を通して使用される「肥大」は、細胞サイズにおける何らかの増大を意味する。

本明細書および請求項を通して使用される「過形成」は、細胞数における何らかの増大を意味する。

本明細書および請求項を通して使用される「筋萎縮」は、使用されないことから生じる筋肉組織の何らかの消耗または喪失を意味する。

本明細書および請求項を通して使用される「サルコペニア」は、筋萎縮および活性化される衛星細胞の能力における低下によって特徴づけられるサルコペニア関連の筋肉障害または他の加齢性の筋肉障害と同様に、老齢によって引き起こされる筋肉量および筋肉活動度における低下を意味する。

本明細書および請求項を通して使用される、ミオスタチンの「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、ミオスタチンの活性を、完全に、または部分的に、そのどちらでも低下させるように作用する任意の化合物を意味する。

「筋肉成長」は、筋肉細胞の分裂および／または分化を意味するとして理解しなければならず、「筋肉成長」には、任意の前駆体細胞の分裂および／または分化、そのような細胞の相互の融合および／または既存の筋肉線維との融合が含まれる。「筋肉成長」にはまた、より大きなタンパク質含有量およびより大きな筋線維体積（筋線維の肥大）をもたらす、筋線維における増大したタンパク質合成が含まれる。

用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のポリマーを意味するとして理解しなければならず、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、天然または人工のヌクレオシドまたはヌクレオチドから調製される核酸分子、および、ポリヌクレオチドのすべての他の知られている形態を含めて、一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーの両方が含まれる。ポリヌクレオチドは、天然に存在する供給源から単離することができ、あるいは、組換え技術もしくは分子生物学的技術を使用して、または、合成によって作製することができる。ポリヌクレオチドは遺伝子全体またはその任意の一部分を含むことができ、オープンリーディングフレームを含む必要はない。本発明によるすべてのポリヌクレオチドの使用では、ありとあらゆるオープンリーディングフレームが含まれる。オープンリーディングフレームは、この技術分野における知られている技術を使用して確定することができる。これらの技術には、知られている開始コドンおよび停止コドンを特定するためのポリヌクレオチド配列の分析が含まれる。この機能を果たすことができる多くのコンピューターソフトウエアプログラムがこの技術分野では知られている。

「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して共有結合により連結される天然に存在するアミノ酸および／または人工アミノ酸のポリマーを意味するとして理解しなければならない。ポリペプチドには、天然に存在する供給源から単離されているポリペプチド、または、組換え技術を使用して作製されているポリペプチドが含まれる。リーダーまたはプロ配列を含むポリペプチド、あるいは、翻訳後修飾を受けるポリペプチドがポリペプチドのこの定義に含まれることが意図されることを理解しなければならない。合成によるポリペプチドは問題となり得るので、この用語には、合成により作製されているポリペプチドは含まれない。具体的には、合成により作製されたポリペプチドは正しく折り畳まれないことがあり、従って、天然に存在するポリペプチドまたは組換えにより作製されたポリペプチドに関連する生物学的活性を有しないことがある。

用語「フラグメントまたは変種」は、１つもしくは複数のヌクレオチドまたは１つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって改変されているが、改変されていない配列または部分配列と実質的に同じ活性または機能を有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの任意の配列または部分配列を意味することを理解しなければならない。

好ましくは、変種は保存的置換を含有する。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似する性質を有する別のアミノ酸に置換され、その結果、ペプチド化学の当業者によって、ペプチドの二次構造およびヒドロパシー性が実質的に変化していないことが予想されるような置換である。アミノ酸置換は一般には、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性に基づいて行うことができる。例えば、負荷電のアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる；正荷電のアミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれる；類似する親水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびに、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。

アミノ酸はその側鎖基の性質に従って分類することができる。非極性のアルキル側鎖基を有するアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。セリンおよびトレオニンはヒドロキシル基をその側鎖に有しており、ヒドロキシル基は極性であり、水素結合することができるので、これらのアミノ酸は親水性である。イオウ基がメチオニンおよびシステインに見出され得る。カルボン酸基がアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖の一部であり、そのため、カルボン酸基の酸性度のために、これらのアミノ酸は極性であるだけでなく、溶液において負の電荷を帯びることができる。グルタミンおよびアスパラギンは、側鎖がアミド基を含有することを除いて、グルタミン酸およびアスパラギン酸と類似している。リシン、アルギニンおよびヒスチジンは、プロトンを受け入れることができる１つまたは複数のアミノ基をその側鎖に有しており、従って、これらアミノ酸は塩基として作用する。芳香族基が、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの側鎖に見出され得る。チロシンはそのヒドロキシル基のために極性であり、しかし、トリプトファンおよびフェニルアラニンは非極性である。あるいは代替として、変種はまた、非保存的変化を含有することができる。

本発明によるポリペプチド変種は、少なくとも１つの置換、付加、挿入または欠失を有することができ、この技術分野で知られている様々な変異誘発法に従って作製することができる。そのような改変を、本発明のポリペプチド変種またはポリペプチド誘導体をコードするポリヌクレオチド配列に対して行うことができ、また、標準的な変異誘発技術を使用して、例えば、オリゴヌクレオチド誘導による部位特異的変異誘発などを使用して導入することができる。変異を、生来的配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位が隣接する変異型配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座において導入することができる。連結後、得られる再構築された配列は、アミノ酸の所望される挿入、置換または欠失を有するアナログをコードする。オリゴヌクレオチド誘導による部位特異的変異誘発手法はまた、所定のコドンが、この技術分野では広く知られている方法による置換、欠失または挿入によって変化させられ得る変化したコードヌクレオチドを提供するために用いることができる。

代替として、様々なコンピューター計算による方法を、本発明の変化型ミオスタチンアンタゴニストタンパク質を作製するために使用することができ、そのような方法には、配列に基づく方法、および、構造に基づく方法が含まれ、例えば、米国特許第６４０３３１２号に記載されるようなタンパク質設計自動化（ＰＤＡ）などが含まれる。

ソフトウエアが、ペプチド配列の三次元構造を非常に正確に予測するために利用可能であることもまた理解しなければならない（Ｂｒａｄｅｌｙ、２００５）。従って、当業者が、ペプチドの構造に対するペプチド配列への様々な変化の影響を予測するために、従って、ペプチドの活性に対する何らかの起こり得る影響を予測するためにそのようなソフトウエアを使用することが可能である。そのような変化もまた本発明の範囲に含まれる。

本発明の「誘導体」ポリペプチドは、アミノ酸配列が、大きく増大した安定性を有するポリペプチドを作製するために何らかの方法で変化させられていることを意味する。例えば、アミノ酸を、異なるキラリティーの同じアミノ酸によって置換することができ、あるいは、天然に存在しないアミノ酸をポリペプチドにおいて挿入または代用することができる。代替として、ポリペプチドを、例えば、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）と架橋することなどによって、薬物動態学を改善するために化学的に改変することができる（米国特許第４６４０８３５号）。そのような誘導体は、医薬組成物を配合することにおいて誘導体を非常に有用にする増大したインビボ血清半減期、生物学的利用能、解離速度および他の特性を有する。

本発明のポリペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体は、ミオスタチン活性に拮抗する生物学的機能を有する。本発明のポリペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体がミオスタチン活性に拮抗し得るかどうかを明らかにするために、そのような活性は、筋芽細胞を本発明の候補ポリペプチドの存在下または非存在下（コントロール）で成長させることによって試験することができる。ミオスタチンを産生し、従って、自分自身の増殖速度を制限する筋芽細胞の成長における増大が、候補ポリペプチドを受けなかったコントロールの筋芽細胞を上回ることにより、そのペプチドがミオスタチンアンタゴニスト活性を有することが示される。好適な細胞株がマウスのＣ_２Ｃ_１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＮＯ：ＣＲＬ−１７７２）であり得る。しかしながら、任意の好適な細胞株を使用することができることが理解される（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタまたはヒトの初代筋芽細胞など）。

本明細書中で使用される用語「単離された」は、分子（例えば、ポリペプチドまたはコードポリヌクレオチドなど）が、その天然の供給源、環境または状況から取り出されていること（例えば、タンパク質が無傷な細胞供給源から取り出されていること）を示し、また、本明細書中で使用される用語「精製された」は、本発明のタンパク質またはポリペプチド、あるいは、そのコードポリヌクレオチドが、例えば、組換え宿主細胞培養の精製産物として、または、非組換え供給源からの精製された産物として、他のポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドとの関連を実質的に有していないことを意味する。従って、「精製された」ポリペプチドは、その元の環境から取り出されるポリペプチドである。好ましくは、そのようなポリペプチドは、例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％または９０％純粋であるか、あるいは、少なくとも約９５％純粋であるか、あるいは、少なくとも約９９％純粋であり、この場合、純度のそのような程度は、調製物に存在する検出可能なミオスタチンアンタゴニストポリペプチドまたはそのコードポリヌクレオチドの、他の検出可能なポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに対する百分率を示す。本明細書中で使用される用語「実質的に精製された」または用語「実質的に単離された」は、従来の方法を使用して、例えば、特異的な抗体またはリガンドによるアフィニティークロマトグラフィーなどによって除くことができる既知タンパク質の存在を除いて、他のポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドとの関連を本質的に有していない分子、例えば、ミオスタチンアンタゴニストポリペプチドまたはそのコードポリヌクレオチドなどを含有する混合物で、そのような実質的に精製された、または、実質的に単離されたミオスタチンアンタゴニストポリペプチドまたはそのコードポリヌクレオチドが、本明細書中に記載されるようなその生物学的特徴を保持するか、または、その検出可能な機能的生物学的活性の少なくとも１つを保持する混合物を意味する。

「遺伝子発現」は、転写の開始、ｍＲＮＡへのＤＮＡの所定区間の転写、および、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を意味するとして理解しなければならない。「遺伝子発現の調節因子」は、遺伝子発現における増大または低下を統計学的に有意な様式で引き起こすことができ、遺伝子発現経路における任意の所で作用し得る任意の化合物として定義される。

本明細書および請求項において使用される用語「含む」は、「から少なくとも部分的になる」ことを意味し、すなわち、その用語を含む独立請求項を解釈するときには、それぞれの請求項においてその用語によって始められる特徴はすべてが存在する必要があり、しかし、他の特徴もまた存在することができる。

本明細書中で使用される用語「に実質的に対応する」、用語「実質的に相同的な」または用語「実質的な同一性」は、選択された核酸配列またはアミノ酸配列が、選択された参照核酸配列または参照アミノ酸配列と比較されたとき、少なくとも約７０パーゼントまたは約７５パーゼントの配列同一性を有する核酸配列またはアミノ酸配列の特徴を示す。より典型的には、選択された配列およびその参照配列は、少なくとも約７６パーセント、７７パーセント、７８パーセント、７９パーセント、８０パーセント、８１パーセント、８２パーセント、８３パーセント、８４パーセント、または、８５パーセントでさえもの配列同一性を有し、より好ましくは、少なくとも約８６パーセント、８７パーセント、８８パーセント、８９パーセント、９０パーセント、９１パーセント、９２パーセント、９３パーセント、９４パーセントまたは９５パーセントの配列同一性を有する。より好ましくはそれでもなお、非常に相同的な配列は多くの場合、少なくとも約９６パーセント、９７パーセント、９８パーセントまたは９９パーセントを越える配列同一性を、選択された配列と、選択された配列が比較された参照配列との間でともに有する。配列同一性の百分率を、比較される配列の全長にわたって計算することができ、あるいは、選ばれた参照配列の合計で約２５パーセント未満前後に達する少ない欠失または付加を除くことによって計算することができる。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、遺伝子の一部分または隣接配列、あるいは、染色体の反復部分などであり得る。しかしながら、２つ以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合には、参照配列は典型的には少なくとも約１８ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドを含み、より典型的には少なくとも約２６ヌクレオチド〜３５ヌクレオチドを含み、一層より典型的には、少なくとも約４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、または、１００個ほどでさえものヌクレオチドを含む。望ましくは、そのような非常に相同的なフラグメントが望まれ、２つの配列の間におけるパーセント同一性の程度は、当業者には広く知られている配列比較アルゴリズムの１つまたは複数によって容易に決定されるように、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）により記載されるＦＡＳＴＡプログラム分析によって容易に決定されるように、少なくとも約８０％であり、好ましくは少なくとも約８５％であり、より好ましくは約９０％または９５％またはそれ以上である。

本明細書中で使用される場合、「％同一性」は、２つ以上のポリペプチドがアラインメントされ、それらの配列が、国立衛星研究所／ＮＣＢＩデータベース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ；インターネット：＞ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔを参照のこと）によって提供される、設定省略時の重みづけに従って配列ギャップおよび配列ミスマッチに重みをつけるギャップドＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２５：３３８９（１９９７））を使用して分析されるとき、配列における対応するアミノ酸残基位置に位置する同一アミノ酸の百分率を示す。

用語「実質的に相補的な」は、アミノ酸配列または核酸配列をそのどちらでも定義するために使用されるとき、特定の対象配列、例えば、オリゴヌクレオチド配列が、選択された配列の全体または一部分に対して実質的に相補的であり、従って、選択された配列をコードするｍＲＮＡの一部分に特異的に結合することを意味する。そのようなものとして、典型的には、配列は、ｍＲＮＡ「標的」配列に対して非常に相補的であり、多くても約１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基または１０塩基のミスマッチを配列の相補的な部分の全体にわたって有する。多くの場合において、配列が正確な一致であること、すなわち、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に対して完全に相補的であり、従って、ゼロ個のミスマッチを相補的な区域に沿って有することが望ましい場合がある。そのようなものとして、非常に相補的な配列は典型的には、ｍＲＮＡの標的配列領域に完全に特異的に結合し、従って、ポリペプチド産物への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を低下させること、および／または、ポリペプチド産物への標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を阻害さえすることにおいて非常に効率的である。

実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約８０パーセントを超えて相補的（または「％完全一致」）であり、より好ましくは、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約８５パーセントを超えて相補的である。特定の局面において、上記で記載されるように、一層さらに実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を本発明の実施における使用のために有することが望ましく、そのような場合において、オリゴヌクレオチド配列は、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約９０パーセントを超えて相補的であり、特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約９５パーセントを超えて相補的である場合があり、また、示されたオリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的ｍＲＮＡの全体または一部分に対して、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％でさえもの完全一致で相補的に至ることさえある場合があり、また、そのような完全一致で相補的であることを含む場合がある。

開示された配列のいずれかのパーセント類似性またはパーセント相補的は、例えば、配列情報を、ＧＡＰコンピュータープログラム（バージョン６．０；これは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能である）を使用して比較することによって求めることができる。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）のアラインメント法を利用する。簡単に記載すると、ＧＡＰプログラムでは、類似性が、２つの配列の短い方における記号の総数によって除された、類似しているアラインメントされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として定義される。ＧＡＰプログラムのための好ましい設定省略時パラメーターには、下記が含まれる：（１）ヌクレオチドについての（同一体についての１の値および非同一体についての０の値を含有する）単項比較行列、および、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６）の加重比較行列、（２）各ギャップについての３．０のペナルティー、および、各ギャップにおける各記号についてのさらなる０．１０のペナルティー；および（３）末端ギャップについてはペナルティーがないこと。
（発明の詳細な説明）

本発明は、ミオスタチンに関連づけられる障害の処置において使用される、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する新規なタンパク質に関する。

具体的には、本発明は、Ｃ末端切断を配列番号２の２８１位および３２９位のアミノ酸位置または２８位〜３２９位のアミノ酸位置の間のどちらかでの位置において有する成熟型ミオスタチン組換えペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体を含む、ミオスタチンの新規な優性ネガティブ体に関する。

ミオスタチンタンパク質は最初、Ｎ末端における分泌シグナル配列、フリンエンドプロテアーゼのタンパク質分解プロセシングシグナル（ＲＳＲＲ）、および、「システインノット」構造の形成を容易にするためのＣ末端領域における９個の保存されたシステイン残基を有する３７５アミノ酸の前駆体分子として翻訳される。ミオスタチンは、Ｎ末端、すなわち、「潜在関連ペプチド」（ＬＡＰ）と、活性なミオスタチン分子を形成するために二量体化する成熟体のＣ末端ドメインとを放出するＡｒｇ２６６でのフリンエンドプロテアーゼ切断によって活性化される。プロセシング後、ＬＡＰペプチドのホモダイマーは、不活性な複合体での成熟型ミオスタチンのホモダイマーに非共有結合的に結合したままである（Ｌｅｅら、２００１）。他のタンパク質、例えば、フォリスタチン、タイチンキャップ、ＧＤＦＰ１、フォリスタチン関連遺伝子およびｈＳＧＴもまた、潜在型ミオスタチン複合体に結合し、潜在型ミオスタチン複合体の分泌および活性化を調節することが知られている（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、２００１；Ｎｉｃｏｌａｓら、２００２；Ｈｉｌｌら、２００２；Ｈｉｌｌら、２００３；Ｗａｎｇら、２００３）。ヒトミオスタチン前駆体タンパク質分子のアミノ酸配列が配列番号２に示される。このミオスタチン前駆体タンパク質をコードする対応するヌクレオチド配列が配列番号１に示される。

３３０位または３５０位のアミノ酸位置でＣ末端切断される成熟型ミオスタチンペプチドを含む以前のミオスタチンアンタゴニストが知られている（国際特許出願公開ＷＯ２００１／５３３５０）。これらのアンタゴニストは、それらの三次元構造、および、他の分子との関連した相互作用を決定することにおいて重要な役割を果たすと考えられる重要なシステインが保持されるような位置で切断される。これらの重要なシステイン残基の喪失は、機能するそれらの能力に対する負の影響を及ぼすことが予想される。例えば、ウシのミオスタチン遺伝子におけるＣ３１３Ｙ置換は機能の喪失を引き起こし、その結果、Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ表現型をもたらす（Ｂｅｒｒｙら、２００２）。

驚くべきことに、システイン残基に近い位置で、または、システイン残基を除外する位置でＣ末端切断される成熟型ミオスタチンペプチドが生物学的に活性であることが初めて示されている。これらの新規なペプチドはミオスタチンアンタゴニスト活性を有しており、ミオスタチンに関連づけられる障害の処置において有用である。１つのシステインを除くすべてのシステインをミオスタチンペプチドから注意深く除いた、２８０位でＣ末端切断されたミオスタチンペプチドは生物学的に活性でなかったことが明らかにされている。本発明者らは、少なくとも２つのシステイン成分が、生物学的活性を保持するために、Ｃ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチドにおいて要求されることを初めて示している。理論によってとらわれることはないが、わずかに１個だけのシステイン成分を有するペプチドは、生物学的活性のために要求される適切な三次元構造を形成することができないと考えられる。本発明の組換え産生されたＣ末端切断型ミオスタチン分子はいくつかの異なる活性型および不活性型の立体配座形態に折り畳まれると思われる。生物学的に活性なペプチドの正確な立体配座形態は不明である。本発明の組換えペプチドの合成型を作製しようとする本発明者らの試みは不活性型形態のみをもたらしただけであった（データは示されず）。生物学的活性のためには、組換え産生されたペプチドが必要であると考えられる。

従って、本発明は、Ｃ末端切断が配列番号２のアミノ酸２８１およびアミノ酸３２９での位置またはアミノ酸２８１〜アミノ酸３２９の間での位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体を含む、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する単離された組換えポリペプチドを提供する。

本発明の単離された組換えポリペプチドは、Ｃ末端切断が、配列番号２の２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位、３０５位、３０６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１３位、３１４位、３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位または３２９位のアミノ酸位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチド、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体からなる群から選択することができる。

好ましくは、本発明の単離された組換えポリペプチドは、Ｃ末端切断が、３２９位、３２０位、３１０位、３００位、２９５位、２８９位、２８４位、２８２位または２８１位のアミノ酸位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンポリペプチド（それぞれ、配列番号３〜配列番号１１）、あるいは、そのフラグメント、変種または誘導体、あるいは、それに対する実質的な配列相同性を有するポリペプチドからなる群から選択される。

より好ましくは、本発明の単離された組換えポリペプチドは、Ｃ末端切断が、３２０位、３１０位または３００位のアミノ酸位置において存在するＣ末端切断された成熟型ミオスタチンポリペプチド（配列番号４、配列番号５または配列番号６）からなる群から選択される。

本発明のポリペプチドは、当業者によって理解されるように、改善された薬物動態学を有する変種または誘導体を作製するために多くの方法で変化させることができる。例えば、極性、および／または、水素結合を形成する能力を変化させる官能基、ポリペプチドの溶解性を変化させるであろう官能基を付加することができる。同様に、官能基は、血清半減期を変化させることによって（Ｗｅｒｌｅら、２００６）、または、標的部位におけるミセルからのポリペプチドの放出を制御することによって安定性を変化させることができる。さらに、官能基は、例えば、患者に対するポリペプチドの副作用を最小限に抑えることによって生体適合性を変化させることができる。標的細胞または標的組織に結合することができるか、あるいは、標的細胞内への輸送を容易にすることができる官能基の付加により、ポリペプチドの送達および標的化が高められる。ペプチドは、薬物動態学を改善するためにＮ末端から切断され得ることもまた理解される。

本発明のポリペプチドにコンジュゲート化される官能基は、特定の生物学的な物質または部位に結合する生物学的標的化分子であり得る。そのような生物学的な物質または部位は、送達の意図された標的、および、意図された標的に結合し、これにより、目的とする組織または細胞への化合物の送達を可能にする標的化分子である。

リガンドは、別の分子と特異的に結合することによって、または、別の分子に対する特異的な親和性を有することによって生物学的標的化分子として機能し得る。リガンドが、特異的な結合性物体または結合性パートナーあるいは受容体によって認識および結合される。標的化のために好適なリガンドの例が、とりわけ、抗原、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、レクチン、ガラクトサミン成分およびフコシルアミン成分、受容体、基質、補酵素および補因子である。送達および標的化のためのリガンドとして機能し得る他の物質が、ある種のステロイド、プロスタグランジン類、炭水化物、脂質、ある種のタンパク質またはタンパク質フラグメント（すなわち、ホルモン、トキシン）、および、細胞親和性を有する合成ポリペプチドまたは天然ポリペプチドである。リガンドにはまた、組換えＤＮＡ、遺伝子工学および分子工学によって作製される連結因子に対する選択的親和性を有する様々な物質が含まれる。

別のタイプの標的化分子が抗体であり、この場合、この用語は、すべてのクラスの抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ画分、それらのフラグメントおよび誘導体を包含するように本明細書中では使用される。他の標的化分子には、酵素、特に細胞表面の酵素（例えば、ノイラミニダーゼなど）、血漿タンパク質、アビジン類、ストレプトアビジン類、カローン、キャビタンド、チログロブリン、内性因子、グロブリン類、キレーター、界面活性剤、有機金属物質、ブドウ球菌プロテインＡ、プロテインＧ、チトクローム、レクチン、ある種の樹脂、および、有機ポリマーが含まれる。標的化分子には、合成によって、または、この技術分野で知られている組換え技術によって作製され得るタンパク質、タンパク質フラグメントまたはポリペプチドを含めて、様々なペプチドが含まれ得る。ペプチドの例には、標的細胞の内部への化合物の輸送、または、核移行のための化合物の輸送を容易にし得る膜輸送タンパク質が含まれる（国際特許出願公開ＷＯ０１／１５５１１を参照のこと）。

本発明のポリペプチドの他の改変体には、生物学的に適合し得るポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および関連したポリマー誘導体など）へのコンジュゲートが含まれる。様々な薬物−ＰＥＧコンジュゲートが、コンジュゲートの加水分解による分解、および、結合した分子のその後の放出の前における循環時間を改善し（血清半減期を延ばし）、従って、薬物の効力を増大させるとして記載されている。例えば、米国特許第６２１４９６６号は、薬物（例えば、タンパク質、酵素および小分子など）にコンジュゲート化して、薬物の溶解性を改善し、また、薬物の制御された放出を容易にするための、ＰＥＧおよび関連したポリマー誘導体の使用を記載する。代替として、欧州特許ＥＰ１０８２１０５（国際特許出願公開ＷＯ９９／５９５４８）は、コンジュゲート化された薬物の制御された放出を容易にするための薬物送達システムとしての生分解性ポリエステルポリマーの使用を記載する。

本発明の新規なポリペプチドはまた、別の異種のポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された新規なポリペプチドを含むキメラな分子を形成するための様式で改変することができる。１つの実施形態において、そのようなキメラな分子は、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供するタグポリペプチドとの本発明のポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは一般には、その遺伝子が、新規なポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に置かれる。また、エピトープタグの提供は、タグ化されたポリペプチドが、抗タグ抗体、または、エピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスを使用するアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。代わりの実施形態において、キメラな分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との本発明の新規なポリペプチドの融合を含むことができる。キメラな分子の二価形態については、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。

様々なタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体がこの技術分野では広く知られている。例には、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、１９８８）；ｃ−ｍｙｃタグ、ならびに、それに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、１９８５）；ならびに、単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、１９９０）が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら、１９８８）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、１９９２）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、１９９１）；および、Ｔ７の遺伝子１０タンパク質のペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、１９９０）が含まれる。

別の代替として、本発明のポリペプチドは、標的細胞または標的組織に対する治療効果を、類似したミオスタチン拮抗作用または異なる活性を一緒に有する第２の化合物を送達することによって高めるために、別の医薬活性な化合物にコンジュゲート化することができる。例えば、米国特許第６，０５１，５７６号は、薬理学的に活性な化合物の薬学的特性および薬理学的特性を改善するために、２つ以上の薬剤を切断されやすい連結によりコンジュゲート化することによる共薬物配合物の使用を記載する。例えば、第２のミオスタチンアンタゴニストを任意の１つまたは複数の知られているミオスタチン阻害剤から選択することができる。例えば、米国特許第６０９６５０６号および米国特許第６４６８５３５号は抗ミオスタチン抗体を開示する。米国特許第６３６９２０１号および国際特許出願公開ＷＯ０１／０５８２０は、免疫応答を誘発し、ミオスタチン活性を阻止することができるミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーおよびミオスタチン免疫コンジュゲートを教示する。ミオスタチンのタンパク質阻害剤が国際特許出願公開ＷＯ０２／０８５３０６に開示され、この場合、そのような阻害剤には、切断されたアクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチンが含まれる。ミオスタチンペプチドに由来する他のミオスタチン阻害剤が知られており、これらには、例えば、ミオスタチンを過剰発現する細胞から培養液に放出されるミオスタチン阻害剤（国際特許出願公開ＷＯ００／４３７８１）；Ｐｉｅｄｍｏｔｅｓｅ対立遺伝子（３１３位のシステインがチロシンにより置換される）、ならびに、Ｃ末端切断を３３０位および３７５位のアミノ酸位置または３３０位〜３７５位のアミノ酸位置の間のどちらかでの位置において有する成熟型ミオスタチンペプチドを含む、ミオスタチンの優性ネガティブ体（国際特許出願公開ＷＯ０１／５３３５０）が含まれる。米国特許出願公開第２００４／０１８１０３３号もまた、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含む小ペプチドで、ミオスタチンに結合し、ミオスタチンを阻害することができる小ペプチドを教示する。

本発明のミオスタチンアンタゴニストポリペプチドに対する異なる活性を有する第２の薬理学的に活性な化合物を、ミオスタチンに関連づけられる障害を処置するために本発明のポリペプチドと連携して使用することができる。例えば、ポリペプチドを、当業者によって理解されるようなポリペプチド増殖因子、ＮＳＡＩＤまたはＣＯＸ−２阻害剤、アルファ遮断剤およびベータ遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、ビスホスホネート系薬剤、エストロゲン受容体調節剤、抗高血圧剤、グルタミン酸アンタゴニスト、インスリン、抗生物質、プロテインキナーゼＣ阻害剤、あるいは、様々な店頭販売物質との併用で投与することができる。

安定性および半減期を改善するための他の改変には、本発明のポリペプチドの内部における感受性アミノ酸のプロテアーゼ切断部位を特定し、そのようなアミノ酸を、血漿中、すなわち、インビボでのポリペプチドのプロテアーゼ分解を防止するために代わりのアミノ酸により置換することが含まれる。当業者は、どのようなタイプの官能基が、ポリペプチドを患者に投与し、それにより、全体的な治療指数を改善することにおける所望される結果を達成するために付加され得るかを理解する。

本発明はさらに、ミオスタチン模倣体活性を有する本発明のポリペプチドのアナログ、誘導体化および変種に関する。

本発明のペプチドのアナログ、誘導体または変種は配列改変または非配列改変を含むことができる。非配列改変には、上記で記載されるようなアセチル化、メチル化、ホスホメチル化、カルボキシル化またはグリコシル化が含まれ得る。

本発明において例示される具体的な組換え産生されたＣ末端切断ポリペプチドは、配列番号２のミオスタチンのＣ末端部分におけるそれらの位置に関して示される。

好ましいアナログには、その配列が、ペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸挿入によって本発明のペプチドとは異なるペプチドが含まれる。保存的置換には、典型的には、１つのアミノ酸を、類似する特徴を有する別のアミノ酸に置換することが含まれ、例えば、下記の群の中での置換、バリン、グリシンの群；グリシン、アラニンの群；バリン、イソロイシン、ロイシンの群；アスパラギン酸、グルタミン酸の群；アスパラギン、グルタミンの群；セリン、トレオニンの群；リシン、アルギニンの群；および、フェニルアラニン、チロシンの群の中での置換が含まれる。保存的置換の様々な例を下記の表１から選ぶことができる。

他のアナログには、ペプチドの安定性に影響を及ぼす改変を有するペプチドが含まれる。そのようなアナログは、例えば、（ペプチド結合に取って代わる）１つまたは複数の非ペプチド結合をペプチド配列に含有することができる。同様に含まれるのが、天然に存在するＬ−アミノ酸とは異なる残基を含むアナログ、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸（例えば、β−アミノ酸またはγ−アミノ酸）を含むアナログ、および、環状アナログである。

本発明ではさらに、本発明のポリペプチドのＮ末端切断が意図される。そのような変種は、Ｎ末端からのアミノ酸が順次除かれ、そのようなＮ末端切断されたペプチドがミオスタチン拮抗活性を保持する本発明のＣ末端切断されたポリペプチドを含む。

本発明ではまた、本発明の新規なポリペプチドをコードする核酸配列が意図される。

近年の研究により、ミオスタチンが細胞周期進行の強力な調節因子であり、また、部分的には筋形成の増殖段階および分化段階の両方を調節することによって機能することが示唆される（Ｌａｎｇｌｅｙら、２００２；Ｔｈｏｍａｓら、２０００）。いくつかの研究では、ミオスタチンについての役割が、胎児の筋形成の期間中だけでなく、出生後の筋肉成長においても明らかにされている。Ｗｅｈｌｉｎｇ他による研究（Ｗｅｈｌｉｎｇら、２０００）およびＣａｒｌｓｏｎらによる研究（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９９）では、マウスにおける後肢懸垂に起因する、萎縮に関連づけられた筋肉喪失が、Ｍ．ｐｌａｎｔａｒｉｓにおいて、増大したミオスタチンレベルに関連したことが示された。増大したミオスタチンレベルはまた、ＨＩＶ患者において見られる重度の筋肉消耗にも関連した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、１９９８）。筋肉の不使用の期間中に認められるミオスタチンの上昇したレベルについての１つの説明は、ミオスタチンが衛星細胞の活性化の阻害剤として機能するかもしれないことである。実際、このことは、ミオスタチンの喪失により、インビボにおける活性化された衛星細胞の増大したプール、および、衛星細胞の高まった自己複製がもたらされることを示す近年の研究によって支持される（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、２００３）。ミオスタチン阻害剤はまた、マクロファージおよび筋芽細胞の遊走を筋肉再生の期間中に増大させ（国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８２）、また、創傷治癒において増大させる（国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８３）だけでなく、衛星細胞の活性化を増大させることが示されている。

本発明のポリペプチドのミオスタチンアンタゴニスト活性についてアッセイするために好適な方法は、知られているインビボ動物モデルまたはインビトロモデルを含む様々な知られている方法論のいずれかに基づくことができる。例えば、本発明の潜在的なミオスタチンアンタゴニストは最初に、下記で記載されるように、インビトロ単線維衛星細胞活性化アッセイ、筋芽細胞増殖アッセイ、バイオアッセイ（国際特許出願公開ＷＯ２００３／００１２０）、あるいは、筋芽細胞および／またはマクロファージの遊走アッセイを使用して試験することができる。衛星細胞の活性化、筋芽細胞の増殖、および／または、筋芽細胞もしくはマクロファージの遊走をインビトロで増大させることができる本発明のミオスタチンアンタゴニストポリペプチドは、次いで、ミオスタチンに関連づけられる障害をインビボでの動物モデルにおいて処置するその能力について試験することができる。そのようなモデルには、サルコペニアの老齢マウスモデル（Ｋｉｒｋ、２０００）；筋ジストロフィー（Ｍｄｘ）のマウスモデル（Ｔａｎａｂｅら、１９８６）；糖尿病のマウスモデル（Ｌｉｋｅら、１９７６）；肥満のマウスモデル（Ｇｉｒｉｄｈａｒａｎら、１９９８）；筋肉障害のノテキシンモデル（Ｋｉｒｋ、２０００）；表層皮膚創傷または深部皮膚創傷のモデル（Ｇｉｌｌｉｔｚｅら、２００１）；火傷のモデル（Ｙａｎｇら、２００５）；デキサメタゾンが、筋肉消耗を誘導するためにマウスに注射されるマウス悪液質モデル（Ｍａら、２００３）、あるいは、結腸腺ガン（Ｃ２６）細胞またはルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞が、ガンに関連する筋肉消耗を誘導するためにマウスに注入されるマウスガンモデルが含まれる。

本発明の単離されたポリペプチドは、好ましくは、その標的に対して１μＭ以下のＫｄにより結合し、より好ましくは、１００ｎＭ以下のＫｄ、１０ｎＭ以下のＫｄ、または、１ｎＭ以下でさえものＫｄにより結合する。

本発明はまた、ミオスタチン拮抗活性を有する本発明の少なくとも１つの新規なポリペプチドを医薬用キャリアまたは生理学的に許容され得るキャリアと一緒に含む医薬組成物に関する。

本発明のポリペプチドまたはその塩は、理想的には、治療効果的な量を、処置されている患者において重篤な毒性作用を引き起こすことなく患者に送達するために十分な量で、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤において含むことができる。組成物における活性なポリペプチドの濃度は、ポリペプチドの吸収速度、分布速度、不活性化速度および排出速度、ならびに、当業者に知られている他の要因に依存する。投薬量の値はまた、緩和される状態の重篤度により変化することに留意しなければならない。任意の特定の対象について、具体的な投薬計画は、個体の必要性、および、組成物投与者または組成物投与管理者の専門的判断に従って時間とともに調節されなければならないことをさらに理解しなければならない。上記で述べられる技術およびプロトコルの様々な例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．（編）、１９８０）に見出され得る。

非経口適用、皮内適用、皮下適用または局所適用のために使用される溶液または懸濁物は下記の成分を含むことができる：無菌の希釈剤、例えば、注射用水、セイライン溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば、酢酸塩系緩衝剤、クエン酸塩系緩衝剤またはリン酸塩系緩衝剤など、および、毒性（toxicity）を調節するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。

非経口適用（例えば、静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射など）のための好適な医薬的に許容され得るキャリアには、無菌水、生理学的セイライン、静菌性セイライン（０．９ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有するセイライン）およびリン酸塩緩衝化セイラインが含まれる。静脈内投与されるならば、好ましいキャリアは生理学的セイラインまたはリン酸塩緩衝化セイラインである。

局所配合物または経皮送達デバイス（例えば、パッチなど）を含む経皮配合物を調製するための様々な方法が当業者には知られている。例えば、Ｂｒｏｗｎ Ｌ．およびＬａｎｇｅｒ Ｒ．、薬物の経皮送達（１９８８）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３９：２２１〜２２９を参照のこと。

本発明のポリペプチドは、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含めて、制御放出配合物などにより、ポリペプチドを身体からの迅速な排除から保護するキャリアとともに調製することができる。生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる（例えば、エチレンビニルアセタート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など）。

リポソーム懸濁物もまた、本発明のポリペプチドのための好適なキャリアである。ポリペプチドを、リポソーム外皮の中に取り込むための知られている方法によって脂質にコンジュゲート化することができ、または、化合物をリポソームの中にカプセル化することができる。リポソームを、例えば、米国特許第４５，５２２，８１１号などに記載されるような当業者に知られている方法に従って調製することができる。例えば、リポソーム配合物を、適切な脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリンおよびコレステロールなど）を無機溶媒に溶解し、その後、その無機溶媒を蒸発させ、これにより、乾燥した脂質の薄い薄膜を容器の表面に残すことによって調製することができる。その後、本発明の活性なポリペプチドあるいはそのモノホスファート誘導体および／またはトリホスファート誘導体の水溶液が容器に導入される。その後、容器は、脂質凝集物を放ち、それにより、リポソーム懸濁物を形成するように手によってゆすられる。

鼻腔投与または肺投与のために、有効成分は、吸入のために好適な細かい粉末あるいは溶液または懸濁物の形態である。代替として、有効成分は、鼻腔粘膜への直接の適用のために好適な形態（例えば、軟膏またはクリーム、鼻腔スプレー剤、点鼻剤またはエアロゾル剤など）にすることができる。
経口組成物は不活性な希釈剤または食用キャリアを含むことができる。経口組成物はゼラチンカプセルに包むことができ、または、錠剤に圧縮することができる。経口での治療的投与のために、活性な化合物は賦形剤と配合され、錠剤、トローチ剤またはカプセルの形態で使用することができる。医薬的に適合し得る結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含むことができる。組成物を経口投与のために（例えば、硬ゼラチンの被覆物などにおいて）カプセル化するための様々な方法がこの技術分野では広く知られている（Ｂａｋｅｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９８６）。粘液層バリア、酵素バリアおよび膜バリアを含めて、様々なバリアを乗り越えるための様々な技術がこの技術分野では広く知られている（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら、２００１）。

錠剤、ピル、カプセルおよびトローチ剤などは、下記の成分のいずれか、または、類似する性質の化合物を含有することができる：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸など、または、トウモロコシデンプン；滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンなど；または、矯味矯臭剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味剤など。投薬単位形態物がカプセルであるとき、カプセルは、上記タイプの物質に加えて、液体キャリア（例えば、脂肪オイルなど）を含有することができる。加えて、投薬単位形態物は、投薬単位物の物理的形態を改変する様々な他の物質を含有することができ、例えば、糖、シェラックまたは他の腸溶性薬剤の被覆物を含有することができる。代替として、本発明のポリペプチドは、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、カシェ剤またはチューインガムなどの成分として投与することができる。シロップは、活性な化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース、ならびに、いくつかの保存剤、色素および着色剤および香料を含有することができる。

本発明は、ミオスタチンに関連づけられる病理学的状態を哺乳動物において処置する方法に関し、この場合、この方法は一般には、その必要性のある哺乳動物に、ミオスタチン拮抗活性を有する本発明の少なくとも１つのポリペプチドの効果的な量を、ミオスタチン関連の前記病理学的状態の症状を防止するか、または処置するか、または改善するために十分な時間にわたって投与する工程を少なくとも含む。好ましい実施形態において、哺乳動物は、１つまたは複数のミオスタチン関連の病理学的状態を有することが疑われるヒトであるか、あるいは、１つまたは複数のミオスタチン関連の病理学的状態と診断されているヒトである。

そのような病理学的状態は、哺乳動物における筋肉組織または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性によって少なくとも部分的には特徴づけられ、そのような病理学的状態には、筋肥大に関連づけられる障害；炎症性筋障害、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、末梢神経の疾患、内分泌異常に起因する筋障害、代謝症候群、ＨＩＶ、ガン、サルコペニア、悪液質および他の消耗性状態に関連する筋萎縮および筋肉消耗；心不全；骨粗鬆症；腎不全または腎疾患；肝不全または肝疾患；食欲不振；肥満；糖尿病；および創傷治癒が含まれ得る。

処置することができる炎症性筋障害には、皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）および多発性筋炎（ＰＭ／ＤＭ）が含まれる。

処置することができる筋ジストロフィーには、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位筋ジストロフィー（ＤＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）、ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）および眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）が含まれる。

処置することができる運動ニューロン疾患には、成人脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、小児進行性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ＳＭＡ１またはＷＨ）、中間脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡまたはＳＭＡ２）、若年性脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ＳＭＡ３またはＫＷ）および脊髄延髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）が含まれる。

処置することができる神経筋接合部の疾患には、先天性筋無力症症候群（ＣＭＳ）、ランバード・イートン症候群（ＬＥＳ）および重症筋無力症（ＭＧ）が含まれる。

処置することができる末梢神経の疾患には、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、デジュリーヌ・ソッタ病（ＤＳ）およびフリードライヒ運動失調症（ＦＡ）が含まれる。

処置することができる、内分泌異常に起因する筋障害には、甲状腺機能亢進性筋障害（ＨＹＰＴＭ）および甲状腺機能低下性筋障害（ＨＹＰＯＴＭ）が含まれる。

処置することができる他の筋障害には、中心コア病（ＣＣＤ）、先天性ミオトニー（ＭＣ）、ネマリンミオパシー（ＮＭ）、筋細管性ミオパシー（ＭＴＭまたはＭＭ）、先天性パラミオトニア（ＰＣ）および周期性麻痺（ＰＰ）が含まれる。

処置することができる筋肉の代謝性疾患には、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、カルニチン欠損症（ＣＤ）、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症（ＣＰＴ）、脱分枝酵素欠損症（ＤＢＤ）、糖尿病、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＤＨＡ）、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症（ＭＡＤ）、ミトコンドリア性筋障害（ＭＩＴＯ）、肥満ホスホリラーゼ欠損症（ＭＰＤまたはＰＹＧＭ）、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（ＰＦＫＭ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症（ＰＧＫ）およびホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症（ＰＧＡＭまたはＰＧＡＭＭ）が含まれる。

本発明のポリペプチドはまた、うっ血性心不全を処置または防止するために；加齢に関連する脆弱さを軽減するために；骨密度を増大させるために（例えば、骨粗鬆症を処置することなどのために）、または、骨折修復を加速させるために；成長遅延を処置するために、また、生理学的低身長の処置のために、また、タンパク質異化応答（例えば、大きな手術の後でのタンパク質異化応答など）を弱めるために；慢性的病気に起因するタンパク質喪失を軽減させるために；創傷治癒を加速させるために；火傷患者の回復、または、大きな手術を受けている患者の回復を加速させるために；皮膚の厚さを維持するために；代謝恒常性を維持するために、また、腎不全／腎疾患および肝不全／肝疾患を処置するために；成長ホルモン不足の成人を処置するために、また、グルココルチコイドの異化性副作用を防止するために；ならびに、ＣＮＳ障害／疾患（例えば、脊髄障害および脳卒中など）およびＰＮＳ障害／疾患を含めて、多くのニューロン系疾患状態を処置するために使用することができる。

これらの障害は、１つまたは複数のミオスタチンアンタゴニストの治療量をその必要性のある対象に投与することによって処置することができる。

さらなる実施形態において、本発明では、付加的または相乗的な効果を処置療法に与えるために本発明の医薬組成物とともに同時投与することができる１つまたは複数の筋肉増殖因子の使用が意図される。そのような増殖因子は、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦ、成長ホルモンなどからなる群から選択することができる。そのような増殖因子は、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物に関して別個に、または連続的に、または同時に、そのいずれでも投与することができる。

さらなる実施形態において、本発明では、ミオスタチンに関連づけられる障害を処置するために本発明のポリペプチドと連携して使用されるための、本発明のミオスタチンアンタゴニストポリペプチドに対する異なる活性を有する第２の薬理学的に活性な化合物の使用が意図される。例えば、ポリペプチドを、当業者によって理解されるようなポリペプチド増殖因子（上記で述べられるような増殖因子）、ＮＳＡＩＤまたはＣＯＸ−２阻害剤、アルファ遮断剤およびベータ遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、ビスホスホネート系薬剤、エストロゲン受容体調節剤、抗高血圧剤、グルタミン酸アンタゴニスト、インスリン、抗生物質、プロテインキナーゼＣ阻害剤、あるいは、様々な店頭販売物質からなる群から選択される活性な化合物との併用で投与することができる。そのような活性な化合物は、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する本発明の少なくとも１つのポリペプチドに関して別個に、または連続的に、または同時に、そのいずれでも投与することができる。

本発明はまた、ミオスタチンに関連づけられる病理学的状態をその必要性のある対象において処置するための医薬品の製造における１つまたは複数のミオスタチン阻害剤の使用に関する。そのような１つまたは複数のミオスタチンアンタゴニストは、上記で記載されるミオスタチンアンタゴニストの群から選択することができる。

医薬品は局所投与または全身投与のために配合することができる。例えば、医薬品を、筋肉内に直接に注射するために配合することができ、または、筋肉消耗性状態を処置するための筋肉への全身送達のための経口投与のために配合することができる。医薬品を、創傷治癒を処置するための局所投与のために配合することができ、また、肥満および糖尿病を処置するための経口投与のために配合することができる。

医薬品は、さらに、付加的または相乗的な効果を筋肉消耗性状態の処置に与えるために、あるいは、筋肉量を増大させるために、１つまたは複数のさらなる筋肉成長促進化合物を含むことができる。医薬品は、１つまたは複数のミオスタチンアンタゴニストおよび１つまたは複数の筋肉成長促進化合物の個別投与、連続投与または同時投与のために配合することができる。

理論によってとらわれることはないが、本発明の新規なポリペプチドは、ミオスタチン拮抗活性を有するので、ミオスタチンに関連づけられる障害を部分的には３つの機構により防止または処置することにおいて効果的であると思われる。第１には、衛星細胞の活性化、増殖および分化を誘導することによって。衛星細胞は筋肉幹細胞であり、従って、筋肉組織の再生に関与する。第２には、筋芽細胞の増殖および再生部位への筋芽細胞の遊走を高めることによって。第３には、マクロファージの動員を高めることによって。マクロファージは、筋芽細胞を引き寄せるように作用し、従って、筋形成を増大させることが知られている。マクロファージの動員に対する影響は、改善された創傷治癒をもたらすことが他のミオスタチンアンタゴニストにより以前に認められている（国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８２）。従って、本発明はまた、創傷治癒を改善することにおいて効果的であるにちがいない。

本発明者らは、Ｃ末端切断がアミノ酸３２９よりも前であるＣ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチドを含む新規なミオスタチン阻害剤が、ミオスタチンに関連づけられる障害を処置することにおいて有用であることを初めて示す。サルコペニアの加齢関連モデルにおいて、本発明のミオスタチンアンタゴニストは、筋肉量および筋力を改善することにおいてだけでなく、サルコペニアに関連づけられる脂肪沈着を軽減することにおいても効果的であった。これらの結果は、これらのペプチドにおけるＣ末端切断が、三次元構造（生物学的活性のためには不可欠であると考えられる特徴）の破壊をもたらすシステイン（Ｊｅａｎｐｌｏｎｇら、２００１）の近くであったか、または、そのようなシステインを除いたことを考えると、驚くべきことであった。

本発明はまた、本出願の明細書において、個々に、または、まとめて参照または示される部分、要素および特徴、ならびに、いずれか２つ以上の前記部分、要素および特徴の任意の組合せまたはすべての組合せにあると大雑把に言うことができ、また、本発明が関連する技術分野における知られている同等物を有する具体的な完全体が本明細書中に述べられる場合、そのような知られている同等物は、個々に示されるかのように本明細書中に組み込まれるものと見なされる。

下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好適な態様を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は、多くの変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において行われ得ること、また、そのような変化は、同様な結果または類似する結果を依然としてもたらし得ることを本開示に照らして理解しなければならない。
実施例１：ミオスタチンアンタゴニストは筋芽細胞の増殖をインビトロで増大させる
方法
ミオスタチンアンタゴニストの発現および精製

ウシのミオスタチン配列の２６７〜３２９、２６７〜３２０、２６７〜３１０、２６７〜３００および２６７〜２８０のアミノ酸（これらは本明細書中下記では、ミオスタチンアンタゴニスト３２９、ミオスタチンアンタゴニスト３２０、ミオスタチンアンタゴニスト３１０、ミオスタチンアンタゴニスト３００およびミオスタチンアンタゴニスト２８０としてそれぞれ示される）に対応するｃＤＮＡを個々にＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ部位を使用してｐＥＴ１６−Ｂベクターにクローン化した。ミオスタチンアンタゴニスト３２９、ミオスタチンアンタゴニスト３２０、ミオスタチンアンタゴニスト３１０、ミオスタチンアンタゴニスト３００およびミオスタチンアンタゴニスト２８０の発現および精製を非変性条件下で製造者（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って行い、これにより、Ｎ末端ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＥＧＲＨＭＬＥＤＰ）およびＣ末端タグ（ＥＤＰＡＡＮＫＡＲＫＥＡＥＬＡＡＡＴＡＥＱ）を有するペプチドを得た。
筋芽細胞アッセイ

ウシのＣ２Ｃ１２筋芽細胞を標準的な技術（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）に従ってダルベッコ改変イーグル培地で成長させた。筋芽細胞増殖アッセイを非被覆の９６ウエルマイクロタイタープレートにおいて行った。Ｃ２Ｃ１２培養物を１０００細胞／ウエルで播種した。１６時間の付着期間の後、組換え野生型ミオスタチンまたは種々のミオスタチンアンタゴニストのいずれかを含有する試験培地を加え、細胞をさらに４８時間または７２時間インキュベーションした。競合アッセイのために、野生型ミオスタチンを、培地への添加に先立って、異なる濃度のミオスタチンアンタゴニストと競合させた。インキュベーション期間後、増殖を、以前の記載（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）のようにメチレンブルーによる光度測定法でのエンドポイントアッセイを使用して評価した。

ヒト骨格筋の筋芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ、米国）または初代ウシ筋芽細胞を、標準的な技術に従って、２０％のＦＢＳ、１０％のウマ血清および０．５％のニワトリ胚抽出物を含有するダルベッコ改変イーグル培地で成長させた。筋芽細胞増殖アッセイを非被覆の９６ウエルマイクロタイタープレートにおいて行った。細胞培養物を２０００細胞／ウエルで播種した。２４時間の付着期間の後、コントロールとしての緩衝液、または、種々のミオスタチンアンタゴニスト（３００、３１０または３２０）のいずれかを含有する、５％ＦＣＳが補充された試験培地を、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで加え、細胞をさらに１４４時間（ヒト細胞について）または４８時間（ウシ細胞について）インキュベーションした。インキュベーション期間後、増殖を、以前の記載（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）のようにメチレンブルーによる光度測定法でのエンドポイントアッセイを使用して評価した。
結果

結果は、ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０、ミオスタチンアンタゴニスト３２０およびミオスタチンアンタゴニスト３２９が、１μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌで４８時間または７２時間にわたって存在するとき、コントロールと比較して、筋芽細胞の増殖能を著しく高めたことを示す（図１および図２９）。最も大きい筋芽細胞増殖速度が、５μｇ／ｍｌの濃度で存在するとき、３２９については１０μｇ／ｍｌの濃度で存在するとき、アンタゴニスト３００、アンタゴニスト３１０およびアンタゴニスト３２０のそれぞれについて４８時間の時点で観測された。ミオスタチンアンタゴニスト２８０は、コントロールを上回る活性を示さなかった。これは、このペプチドが１個だけのシステイン残基を含有するという事実のためであると考えられる。

組換えミオスタチンを２．２５μｇ／ｍｌでコントロール培地に加えることにより、４８時間後における筋芽細胞増殖の２５％の阻害がもたらされた。この数字が７２時間後には約１０％に低下した（図２）。ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０が３つの異なる濃度（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）で加えられたとき、筋芽細胞に対するミオスタチンの増殖阻害作用が、陽性コントロールにおいて認められるレベルと類似するレベルに回復した。このことにより、ミオスタチンアンタゴニス（例えば、３００、３１０および３２０など）が、筋芽細胞の増殖を高めることによって筋肉の再生を効果的に加速し得ることが明らかにされた（図２）。

これらのミオスタチンアンタゴニスが異なる生物種において効果的であるかどうかを明らかにするために、本発明者らはヒトおよびウシの筋芽細胞の増殖アッセイを行った。ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０が３つの異なる濃度（４８時間または１４４時間にわたって、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）で加えられたとき、ヒト筋芽細胞およびウシ筋芽細胞の増殖能が、コントロールと比較されたとき、著しく高められた（図１３および図１４）。

これらの結果は、ミオスタチンアンタゴニストの投与が、筋芽細胞の増殖の増大した速度が有益である筋肉関連の障害または他の任意の障害に苦しむ患者に対する有益な作用を、例えば、筋肉消耗性障害の処置または傷ついた筋肉組織の再生などにおいて有することを示している。
実施例２：ミオスタチンは衛星細胞の活性化を調節する
方法
単一筋線維の単離および培養

単線維を以前の記載のように単離した（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ後、１９９５）。簡単に記載すると、１月齢および２４月齢の野生型マウスを、ＣＯ_２ガス、その後、頸椎脱臼によって安楽死させた。ＴＡを切開し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での０．２％（ｗ／ｗ）１Ａ型コラゲナーゼ（＞２６０ＣＤＵ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）において３７℃で６０分間消化した。筋肉をＤＭＥＭ＋１０％ウマ血清（ＨＳ）＋０．５％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）に移し、線維を穏やかな粉砕によって分離した。単離された線維を、１０％のマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により被覆された４ウエルチャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、３７℃で５％ＣＯ_２において７２時間まで培養した後、１００％の氷冷メタノールにより１０分間固定処理した。

増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）が、休止細胞ではなく、細胞周期を活発に受けている細胞において発現される。筋線維に結合する衛星細胞の大きな割合が休止状態であり、従って、ＰＣＮＡを発現しない。しかしながら、活性化されたとき、衛星細胞は活性化されて、ＰＣＮＡを発現し、また、筋線維を再び満たすことによって筋肉を再生する。従って、ＰＣＮＡは、活性化された衛星細胞についてのマーカーに対する非常に信頼できる抗原である。

衛星細胞の活性化に対するミオスタチンアンタゴニストの影響を明らかにするために、若齢（１月齢）または老齢（２４月齢）の野生型マウスのＴＡ筋肉に由来する単一筋線維を、培養培地において、２４時間、４８時間および７２時間、５μｇ／ｍｌのミオスタチンアンタゴニスト３２０、ミオスタチンアンタゴニスト３１０またはミオスタチンアンタゴニスト３００の存在下で培養し、メタノールにより固定処理し、ＰＢＳで洗浄した。固定処理された線維を、１０分間、ＰＢＳにおける０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００において透過処理し、ＰＢＳにおける１０％の正常ヤギ血清および０．３５％のλ−カラギーナンにおいて室温で３０分間ブロキング処理し、その後、ブロッキング装置において抗ＰＣＮＡ抗体の１：１００希釈物と一晩インキュベーションした。一次抗体を、ヤギ抗マウス−ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５４６を使用して検出し、線維をＤＡＰＩにより対比染色した。ＰＣＮＡ陽性の活性化された衛星細胞を顕微鏡下で計数し、総筋核のパーセントして表した。

衛星細胞の活性化に対する短期間のミオスタチンアンタゴニスト処理の影響を調べるために、単線維を、（下記の実施例４に記載されるような）それぞれの処置群に由来するマウスから単離し、上記で記載されるように培養した。衛星細胞の活性化を、記載されるように抗ＰＣＮＡ抗体を使用して調べた。
結果

ミオスタチンアンタゴニストは衛星細胞を活性化することができる

若齢（１月齢）の野生型マウスに由来する単一筋線維がミオスタチンアンタゴニスト３００とインキュベーションされたとき、活性化された衛星細胞の数における著しい増大が認められた（図３）。類似する結果が、活性化された細胞の数が、コントロールに対して正規化される増大率に変換されたときに見られた（図４）。この実験を、老齢（２年齢）マウスに由来する単筋線維に対して、ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０を使用して繰り返した。活性化された衛星細胞の百分率における著しい増大が、試験されたすべてのミオスタチンアンタゴニストにより認められた。最も大きい増大が４８時間後においてミオスタチンアンタゴニスト３００により見られた（図５）。これらの結果から、ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０が、若齢および老齢の野生型筋肉における衛星細胞の強力な活性化因子であることが確認され、また、これらの結果は、ミオスタチンアンタゴニストの投与により、衛星細胞の活性化における低下に関連する障害（例えば、サルコペニアなど）が処置されるか、または、その発症が防止されることが予想され得ることを示している。さらには、ミオスタチンアンタゴニストは、活性化された衛星細胞の割合が既に低下している場合におけるそのような状態の重篤度を軽減させるために使用され得ることが予想され得る。このデータはまた、これらのアンタゴニストが、筋線維における衛星細胞の活性化を、衛星細胞活性化の正常なレベルを越えて増大させることにおいて効果的であることを示す。従って、ミオスタチンアンタゴニストを、医学的処置に起因する外傷に先立つ処置として、あるいは、低下した筋力をもたらすことが予想される状態（例えば、強制される無活動状態または他の状態など）の開始に先立つ処置として使用することができる。
実施例３：ミオスタチンアンタゴニストは炎症性応答ならびにマクロファージおよび筋芽細胞の走化性を増大させる
方法
走化性アッセイ

初代筋芽細胞を、発表されたプロトコル（Ａｌｌｅｎら、１９９７；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、１９９７）に従って若齢（４週齢〜６週齢）マウスまたは老齢（２４月齢）マウスの後肢筋肉から培養した。簡単に記載すると、筋肉を切り刻み、０．２％コラゲナーゼ１Ａ型において９０分間消化した。培養物を、非被覆のプレートに３時間にわたって予備置床することによって筋芽細胞について濃縮した。筋芽細胞培養物を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０％ＨＳおよび１％ＣＥＥが補充された成長培地（ＧＭ）で、１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートにおいて３７℃／５％ＣＯ_２で維持した。培養物純度の程度を４８時間の培養の後におけるＭｙｏＤ発現のフローサイトメトリー分析によって評価した。細胞を、トリプシンを使用して集め、１０^６細胞／２００μｌの濃度で懸濁し、５ｍｌの７０％エタノールにおいて一晩、−２０℃で固定処理した。染色を、ウサギポリクローナル抗ＭｙｏＤ（１：２００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、その後、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８抗ウサギコンジュゲート（１：５００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して室温で３０分間行った。分析を二連で行い、１０^４個の細胞事象をそれぞれのアッセイにおいて収集した。破片が前方散乱プロフィルおよび側方散乱プロフィルでのゲート通過によって除かれた。細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。マクロファージを腹腔洗浄技術によって単離し、および／または、骨髄から得た。ザイモサン活性化マウス血清（ＺＡＭＳ）を、発表されたプロトコル（ＣｏｌｄｉｔｚおよびＭｏｖａｔ、１９８４）に従って調製した。

筋芽細胞の走化性アッセイのために、最初のアッセイを、２年齢マウスに由来する筋芽細胞に対して下記のように行った。２％ウマ血清（ＨＳ）、５％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）および透析緩衝液を含有するＤＭＥＭを陽性コントロールとして使用した。組換えミオスタチン（２．５μｇ／ｍｌのミオスタチン）、ならびに、ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０（５倍のミオスタチン濃度で、すなわち、１２．５μｇ／ｍｌで）を陽性コントロール培地に加えた。無添加のＤＭＥＭを陰性コントロールとして使用した。２４ウエルプレートにおいて、底部ウエルを試験培地またはコントロール培地で満たした。７５０００個の細胞を、１％Ｍａｔｒｉｇｅｌにより被覆されたポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）の０．８μｍのメンブランを含有する上部ウエルに加えた。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で７時間インキュベーションした。メンブランの上部表面を、事前に湿らした綿棒により洗浄して、遊走しなかった細胞を除いた。その後、メンブランを固定処理し、ギルヘマトキシリンで染色し、スライドに湿ったまま載せた。遊走した細胞をメンブランあたり４つの代表的な視野で計数し、平均数をプロットした。結果が図６（老齢マウスから得られる筋芽細胞遊走）および図７（若齢マウスから得られる筋芽細胞遊走）に示される。

第２の筋芽細胞遊走アッセイにおいて、初代筋芽細胞を（下記の実施例４に記載されるような）セイライン処置（コントロール）マウスおよびミオスタチンアンタゴニスト３００処置マウスの後肢から単離した。３つの化学誘引性培地を使用した。２％ウマ血清（ＨＳ）および５％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）を含有するＤＭＥＭ（最適な化学誘引剤）；５％ＣＥＥのみを含有するＤＭＥＭ、または、２％ＨＳのみを含有するＤＭＥＭ（ともに、最適でない化学誘引剤）。無添加のＤＭＥＭを陰性コントロールとして使用した。２４ウエルプレートにおいて、底部ウエルを試験培地またはコントロール培地で満たした。７５０００個の細胞を上部ウエルに加えた。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で７時間インキュベーションした。メンブランの上部表面を、事前に湿らした綿棒により洗浄して、遊走しなかった細胞を除いた。その後、メンブランを固定処理し、ギルヘマトキシリンで染色し、スライドに湿ったまま載せた。遊走した細胞をメンブランあたり４つの代表的な視野で計数し、平均数をプロットした。結果が図９に示される。

マクロファージの走化性分析のために、骨髄を（下記の実施例４に記載されるような）セイライン処置（コントロール）マウスおよびミオスタチンアンタゴニスト３００処置マウスから単離し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％Ｌ９２９）馴化培地（ＣＳＦ−１含有）において５ｘ１０^６細胞／プレートで置床した。その後、マクロファージを集め、アッセイにおいて使用した。ザイモサン活性化マウス血清（ＺＡＭＳ）を含有するＤＭＥＭの３つの濃度を使用した：３３％（最適な化学誘引剤濃度）、２２％および１１％（最適でない化学誘引剤濃度）。無添加のＤＭＥＭを陰性コントロールとして使用した。２４ウエルプレートにおいて、底部ウエルを試験培地またはコントロール培地で満たした。７５０００個の細胞を、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）の０．８μｍのメンブランを含有する上部ウエルに加えた。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で４時間インキュベーションした。メンブランの上部表面を、事前に湿らした綿棒により洗浄して、遊走しなかった細胞を除いた。その後、メンブランを固定処理し、ギルヘマトキシリンで染色し、スライドに湿ったまま載せた。遊走した細胞をメンブランあたり４つの代表的な視野で計数し、平均数をプロットした。
結果

老齢（２年齢）マウスから単離された初代筋芽細胞がコントロール（ＣＥＥ）培地において２．５μｇ／ｍｌでの組換えミオスタチンとインキュベーションされたとき、およそ７８％の著しい低下が、遊走した筋芽細胞の数において見られた。ミオスタチンアンタゴニスト３００、ミオスタチンアンタゴニスト３１０およびミオスタチンアンタゴニスト３２０が５μｇ／ｍｌで加えられたとき、筋芽細胞の遊走に対するミオスタチンの化学阻害作用が、コントロールにおいて認められるレベルに類似するレベルに戻った（図６）。この実験を、若齢（１月齢）マウスから得られた筋芽細胞を使用して繰り返した。再度ではあるが、ミオスタチン含有培地へのミオスタチンアンタゴニスト３００およびミオスタチンアンタゴニスト３１０の添加により、ミオスタチン細胞（myostatin cell）の遊走がコントロールレベルに戻った（図７）。これらの結果は、ミオスタチンアンタゴニスト（例えば、３００、３１０および３２０など）が、筋芽細胞の遊走を高めることによって筋肉の再生を効果的に促進させ得ることを明らかにする。上記で示されるように、ミオスタチンは、創傷領域への筋芽細胞の付着成長に対する負の影響を有する。筋芽細胞は、その運動を導くための走化性因子による影響を受けることが知られている（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、１９９４；Ｊｏｎｅｓ、２０００）ので、衛星細胞由来の筋芽細胞の遊走能に対するミオスタチンアンタゴニスト３００のインビボ投与の影響を、３つの化学誘引剤を使用して調べた。ミオスタチンアンタゴニスト３００により処置されているマウスから単離された筋芽細胞は、著しく増大した遊走割合を、セイライン処置のコントロールマウスから単離されたマクロファージと比較してそれぞれの化学誘引性培地において有した（図９）。

ミオスタチンが炎症性応答に対する作用を有すること、具体的には、ミオスタチンが筋肉再生時における傷害部位へのマクロファージの遊走を妨害することもまた知られている。ミオスタチンアンタゴニスト３００によるインビボでの処置がマクロファージの遊走に影響を及ぼしたか否かを評価するために、インビトロ遊走アッセイを、セイライン（コントロール）またはアンタゴニスト３００により６週間にわたって処置されたマウスから単離されたマクロファージに対して行った。結果は、アンタゴニスト３００のインビボ処置では、マクロファージの遊走能が、セイライン処置のコントロールから単離されたマクロファージと比較して、化学誘引性培地ＺＡＭＳの３つの異なる濃縮物（１１％、２２％または３３％）において著しく増大させられたたことを示した（図１０）。

ミオスタチンアンタゴニスト３００のインビボ投与により、筋芽細胞およびマクロファージの両方の遊走割合を高めることができることは、ミオスタチンアンタゴニストの投与が、マクロファージおよび筋芽細胞の高まった遊走が利益をもたらし得る創傷治癒および任意の他の病理のために有用であるだけでなく、筋肉消耗性状態および炎症性筋障害を含めて、ミオスタチン活性の阻害が臨床的に有益である状態に苦しむ患者における効果的な処置として使用され得ることを示している。
実施例４：ミオスタチン模倣体３００によるインビボ試験
方法

動物試験を、筋肉機能を改善することにおけるミオスタチンアンタゴニスト３００の影響を評価するために行った。１６月齢のマウスを１０匹の２つの群に分けた。コントロール群はセイラインの皮下（ＳＣ）注射を受けたが、もう一方の群はＳＣでのミオスタチンアンタゴニスト３００を６μｇ／グラムＢＷで６週間にわたって１週間に３回受けた。サルコペニア性筋肉の機能的改善を、マウスの握力を試験終了時に測定することによって評価した。握力をニュートン単位で測定した。
結果

結果は、コントロールマウスの握力における低下（約５％の喪失）がある一方で、３００アンタゴニストにより６週間にわたって処置された老齢マウスの握力における非常に著しい増大があることを示している（図１１）。同じデータが両方の群について試験開始時および試験終了時の握力として表され（図１２）、同じ観測結果が得られ、握力が、ミオスタチンアンタゴニスト３００により処置されたマウスでは著しく増大した。これは部分的には、処置期間終了時にこれらのマウスから単離される細胞および線維において得られる衛星細胞の活性化、ならびに、マクロファージおよび筋芽細胞の遊走において観測される増大のためであった（図９および図１０）。

さらなる重要な観測結果が認められた。１６ヶ月において、老齢の野生型マウスは体脂肪の著しい蓄積を示した。両方の処置群において、すべてのマウスが、セイライン処置のコントロールと比較して、体脂肪における異なった低下を有することが観測された。このことは非常に注目された。従って、ミオスタチンアンタゴニストによる長期間の処置は、コントロールのマウスと比較されたとき、３００により処置されたマウスでは鼠蹊部の脂肪パッドを含めて、皮下脂肪の量を低下させているようであると思われる（結果は示されず）。

胎児段階の期間中におけるミオスタチンの欠失は出生後の脂肪蓄積に影響することが以前に示されている。しかしながら、今回、驚くべき結果が、６週間の期間にわたるマウスの処置は脂肪組織の量を低下させていることである。これは、ミオスタチンアンタゴニストにより、脂肪組織に貯蔵されるトリグリセリドが動員されるか、あるいは、脂肪酸生合成または別の機構が妨害されるかのどちらかのためであり得る。それにもかかわらず、この実験は明らかに、胎児段階からのミオスタチンの完全な非存在（ミオスタチン欠損マウス）に起因する脂肪なし体重とは対照的に、ミオスタチンアンタゴニストによる脂肪組織サイズの抑制を例示する。

従って、ミオスタチンアンタゴニストは、サルコペニアにより誘導される筋肉量および筋力における低下を処置または防止することにおいて有用であるだけでなく、老齢にもまた関連する増大した脂肪沈着を低下させることにおいても有用であると思われる。加えて、本発明のミオスタチンアンタゴニストは、肥満、食欲不振および糖尿病の臨床的状態において脂肪組織の量を抑制／減少させることにおいて有用であることが想定される。
実施例５：Ｍｄｘインビボ試験
方法：

４週齢のｍｄｘマウスに、週に３回、３００（６μｇ／ｇ）またはセイライン（それぞれの処置において１０匹のマウス）を４週間にわたって注射したインビボ試験を行った。体重を定期的に記録し、血液を、筋肉損傷の程度を評価するためのクレアチンキナーゼ活性のために採取した。握力試験を強さの尺度として行った。４週間の処置の後、マウスを選び、個々の後肢筋肉をタンパク質発現分析（Ｐａｘ７＆ＭｙｏＤ（衛星細胞活性化／筋形成））および組織学のために集めた。

タンパク質を、３つの後肢筋肉から、すなわち、大腿二頭筋、前脛骨筋および腓腹筋から抽出した。１５μｇのタンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブランに転写し、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤにより免疫プローブした。

１０ミクロンの横断切片をそれぞれの腓腹筋の中央筋腹領域から切断した。筋肉切片を、壊死領域および再生領域を可視化および測定するためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。これらの領域を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０顕微鏡（オリンパス、東京、日本）、ＳＰＯＴ−ＲＴ４．０１カメラおよびソフトウエア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）を使用して分析した。面積を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用して測定した。
血液を７５ｍｍのヘパリン添加ミクロヘマトクリットチューブに尾採血によって採取した。チューブをＭｉｃｒｏ−ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ遠心分離器（Ａｄａｍｓ）で５分間遠心分離し、その後、血漿を取り出した。取り出した血漿を２５００ｘｇで５分間、再び遠心分離し、その後、分析まで−８０℃で保存した。血漿を、溶血を最小限に抑えるために採血の２時間以内に赤血球から分離した。クレアチンキナーゼ活性を、血漿採取の６週間以内に、ＣＫ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインクレアチンキナーゼキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して求めた。筋力を、試験の開始時、中間時および終了時に握力装置（ＭＫ−３８０Ｓ、室町機械；東京、日本）を使用して評価した。尾によって後側に引っ張られている間にマウスが発揮した最大の力がニュートン単位で記録される。それぞれのマウスについての３回の握力試験の平均値を計算し、群あたり１０匹のマウスの平均最大力を求めた。
結果

ＭｙｏＤおよびＰａｘ７が３００による処置に対する応答においてアップレギュレーションされる。

Ｐａｘ７およびＭｙｏＤはともに、筋形成の強力なマーカーとして確立されている。Ｐａｘ７のレベルは、衛星細胞の自己複製だけでなく、衛星細胞プールの程度を示し、ＭｙｏＤの発現は、筋肉内で生じる筋形成のレベルを示す。ｍｄｘマウスの筋肉におけるＰａｘ７およびＭｙｏＤのタンパク質レベルを調べるために、ウエスタンブロット分析を行った。

図１５に示されるように、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤの両方の実質的なアップレギュレーションが認められた。Ｐａｘ７が休止状態の衛星細胞および増殖中の衛星細胞の両方で発現する。Ｐａｘ７のアップレギュレーションは、増大した衛星細胞の活性化、より多い衛星細胞の数、および、低下した衛星細胞の自己複製を示している。ＭｙｏＤは重要な筋形成遺伝子であり、そのアップレギュレーションは、ｐ２１およびミオゲニンのアップレギュレーションによる筋形成における増大を示している。ミオスタチンの非存在は、増大した衛星細胞の活性化ならびに自己複製および筋形成を引き起こすことが十分に確立されているので、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤの両方のアップレギュレーションは、３００がミオスタチンに効果的に拮抗することを示唆する。

低下した壊死および増大した再生が３００処置の筋肉において認められる。

再生領域および壊死性領域のパーセント面積が図１６に示される。この結果は、ミオスタチンアンタゴニストが、高まったＭｙｏＤ発現およびＰａｘ７発現、ならびに、低下した血中のＣＫ値（図１７）によって同様に示されるように、衛星細胞を活性化し、それにより、新しい筋線維の形成を増大させ、かつ、壊死性組織のレベルを低下させることによって、筋肉の再生および修復を増大させるという仮説と一致している。

クレアチンキナーゼ活性がミオスタチン３００処置のマウスにおいて低下する。

クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は、ｍｄｘマウス（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、２００５）およびヒトにおける筋肉損傷の程度をモニターするための一次マーカーとして一般に使用される細胞内酵素である。試験の開始から終了までのクレアチンキナーゼ活性における変化が図１７に示される。３００により処置されたマウスでのクレアチンキナーゼ活性における低下がより大きいことは、損傷状態たは壊死性状態に対する、再生しつつある筋肉細胞の割合における変化のために、筋肉損傷がこれらの動物ではより少ないことを示唆する。このことは、壊死性領域が３００処置マウスではより少ないことを示す組織学的データを裏付けている。

３００によるミオスタチンの拮抗は握力を増大させる。

それぞれのマウスについての３回の握力試験の平均値を計算した。群あたり１０匹のマウスの平均最大力が図１８に示される。４週間の３００による処置の後での握力における著しい増大は、３００により処置されたマウスにおける機能的改善を示している。本発明者らは主として、これは、ミオスタチンの拮抗が筋肉機能の部分的回復をもたらすことによる、増大した再生作用を介したｍｄｘマウス筋肉の病理の改善の結果であると考えている。これらの知見から、ｍｄｘマウスでのミオスタチンアンタゴニストの有益な作用が、ｍｄｘにおける握力が野生型に戻ることを可能にする、筋肉損傷の効果的な処置に起因すると考えられることが示唆される（Ａｍｔｈｏｒら、２００７）。
実施例６：インビボでの皮膚生検試験
方法：

約１０月齢のＣ５６ｂｌ／６マウスを麻酔し、首の背側の皮膚を剃毛し、２つの傷を４ｍｍの生検用パンチにより皮膚に作製した。マウスに、セイライン、または、６μｇ／ｇ体重での３００ミオスタチンアンタゴニストのどちらかを、傷害後の１日目、３日目、５日目および７日目に皮下注射した。マウスを、５日間、７日間、１４日間、２１日間および２８日間にわたって治癒させ、その後、マウスを選び、皮膚を組織学のために処理した。

組織学のために、皮膚サンプルを１０％ホルマリンにおいて固定処理し、パラフィンに包埋および固定し、マッソン三色染料により染色した。切片を処置後のそれぞれの日について創傷領域のサイズについて分析し、値をプロットした。
結果：

皮膚での創傷治癒におけるミオスタチン拮抗の影響を評価するために、本発明者らはマウスにおける皮膚生検研究を行った。３００により処置された動物は、セイライン対応群と比較されたとき、図２０に示されるように後半の時点では特に、より小さい創傷面積を一貫して示した。このことは、３００アンタゴニストによる処置が生検創傷後のマウスにおける皮膚治癒の速度に正の影響を及ぼし得ることを示している。この結果は、ミオスタチンの拮抗が非筋肉組織（例えば、皮膚など）における治癒の改善された速度をもたらし得ることを示し、また、ミオスタチンアンタゴニストの使用が、創傷、火傷、手術切開部および他の皮膚外傷に由来する損傷の後における皮膚の治癒を改善することにおいて様々な適用を有することを示している。
実施例７：インビボでの皮膚火傷試験
方法：

約１２月齢のＣ５６ｂｌ／６マウスを麻酔し、首の背側の皮膚を剃毛し、赤熱の金属棒（１．５ｍｍの幅、７ｍｍの長さ）をマウスの露出皮膚に５秒間当てた。マウスに、セイライン、または、６μｇ／ｇ体重での３００ミオスタチンアンタゴニストのどちらかを、傷害後の１日目、３日目、５日目、７日および１０日目に皮下注射した。マウスを、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間および４６日間にわたって治癒させ、その後、マウスを選び、皮膚をヒドロキシプロリン分析のために液体窒素で凍結した。
結果：

皮膚における火傷傷害の後、ヒドロキシプロリンアッセイを、創傷領域でのコラーゲン沈着物の量を求めるために行った。ヒドロキシプロリンはコラーゲンに存在しており、安定したらせん状立体形態をコラーゲンに与える。従って、所与の組織に存在するヒドロキシプロリンの量を測定することにより、その組織に存在するコラーゲンの量が求められる。３００による処置群は、図２１に示されるように、コントロール群と比較されたとき、創傷領域でのコラーゲンのレベルがより低い傾向を示した。このことから、ミオスタチンアンタゴニストが、所望される結果が創傷治癒後の低下した線維形成である非筋肉組織の処置において有用であり得ることが示唆される。
実施例８：インビボでの筋肉火傷試験
方法：

約１２月齢のＣ５６ｂｌ／６マウスを麻酔し、赤熱の金属棒（１．５ｍｍの幅、７ｍｍの長さ）をＴＡ筋肉に５秒間当てた。マウスに、セイライン、または、６μｇ／ｇ体重での３００ミオスタチンアンタゴニストを、傷害後の１日目、３日目、５日目、７日目および１０日目に皮下注射した。マウスを、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間および４６日間にわたって治癒させ、その後、マウスを選び、筋肉を組織学のために処理した。

組織学のための皮膚サンプルをＯＣＴで覆い、液体窒素で冷却されたイソペンタンにおいて凍結した。切片をクライオスタットにおいて１０μｍの厚さで切断し、Ｈ＆Ｅおよびファン・ギーソンにより染色した。代表的なマーカー、例えば、中心形成核（ＣＦＮ）の総数およびＣＮＦ線維の数などを、異なる処置の後のそれぞれの日について分析し、値をプロットした。
結果：

成熟した骨格筋線維は、線維の周縁部に位置する核を有する。しかしながら、骨格筋再生の期間中において、筋芽細胞が傷害部位に遊走し、既に存在する線維に融合するか、または、それぞれに対して融合して、新生筋線維を形成する。このプロセスの期間中、これらの細胞の核は線維の中心に位置する。従って、本発明者らは、中心形成核（ＣＮＦ）の数およびＣＮＦ線維の数を筋肉再生のマーカーとして使用した。筋肉に存在する損傷は、試験の最初の時点については広範囲に広がりすぎており、また、陽性の再生マーカーはどれも、処置群またはコントロールのどちらについても検出されなかった（図２２および図２３）。しかしながら、２１日目までには、処置群におけるＣＦＮの数がコントロール群における数よりも著しく大きくなっており、このことは、処置された動物における増大した筋肉再生を示している。この違いが傷害後４６日に至るまで維持される。興味深いことに、損傷筋肉領域の百分率における違いが、２８日目以降、処置群と、コントロール群との間において認められない（データは示されず）。このことは、ＣＮＦの増大した数において示されるような、３００により処置された群での再生における増大が、火傷後の筋肉再生における改善をもたらしたことを示している。さらには、視覚的には、処置群と、コントロール群との間における筋線維の一体性における違いを処置群において２１日目以降に見ることができる。また、ファン・ギーソン染色では、傷害後２１日目での処置群と比較されたときのコントロール群でのより大きな程度の線維形成（図３０）（これは傷害領域のより早期のリモデリングを意味する）、および、従って、処置群と、コントロール群との間における２８日目以降に見られるＣＦＮにおける増大を引き起こす、筋原性前駆体のより早期の流入が明らかにされた。低下した線維形成はそれ自体、傷づいた組織の修復の期間中に生じる線維形成の程度に対するミオスタチンアンタゴニストの影響に起因することもまた考えられる。
実施例９：インビトロでのガン悪液質試験
方法：

Ｃ２Ｃ１２細胞を分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ＨＳ）で７２時間分化させた。この分化期間の後、筋管を、３００がミオスタチン媒介の筋肉消耗をインビトロで救済し得るかを明らかにするために、６μｇ／ｍＬでの組換えミオスタチンにより、あるいは、３０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬまたは１２０μｇ／ｍＬでのミオスタチンおよび３００組換えタンパク質の両方の組合せによりさらに２４時間試験した。ミオスタチン媒介の悪液質において非常に重要な中間のシグナル伝達分子の遺伝子発現変化を分析した。従って、タンパク質を細胞から単離し、ウエスタンブロット分析を、ミオスタチン媒介の悪液質における非常に重要なシグナル伝達中間体であることが本発明者らによって示されているｐ−ＦｏｘＯ１（ＭｃＦａｒｌａｎｅら、２００６）についてのタンパク質発現レベルを測定するために行った。
結果：

ｐ−ＦｏｘＯ１は、ミオスタチン媒介の悪液質における非常に重要な中間のシグナル伝達分子である。実験では、ｐ−ＦｏｘＯ１の発現レベルをＦｏｘＯ１の総レベルに対して正規化した。図２４に示されるように、６μｇ／ｍＬの組換えミオスタチンタンパク質による処置は２４時間の処置の後でｐ−ＦｏｘＯ１発現のダウンレギュレーションをもたらす。この結果は、ミオスタチンにより媒介される悪液質の背後にある機構を記載する本発明者らの以前に発表されたデータ（ＭｃＦａｒｌａｎｅら、２００６）と一致している。ｐ−ＦｏｘＯ１発現の最大の救済が９０μｇ／ｍＬの３００により得られる（図２４）。このことは、３００ミオスタチンアンタゴニストの適用により、一部の悪液質性消耗性状態において非常に重要であるＦｏｘＯ１シグナルの大きさを低下させることができることを示す。
実施例１０：インビボでのガン悪液質試験
方法：

慢性悪液質の研究を設計し、それにより、Ｃ５７Ｂマウス（４週齢）に、グルココルチコイド薬物のデキサメタゾンが１ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で毎日注射された。３つの処置群が設計された：５匹のマウスがセイラインの毎日の注射を受け、５匹のマウスがデキサメタゾンの毎日の注射を受け、５匹のマウスが、デキサメタゾンと、６μｇ／ｇ体重の濃度での３００アンタゴニストとの毎日の注射を受けた。マウスの体重を毎日記録し、悪液質の徴候について綿密にモニターした。食物および水の消費を、体重の減少が食欲または渇きの喪失のためではなかったことを保証するために記録した。体重、脂肪パッド重量、ならびに、ＭｙｏＤおよびＰａｘ７の発現を評価した。
結果：
体重

デキサメタゾンの毎日の注射は、セイラインが注射されたコントロールと比較されたとき、平均体重における減少をもたらした（図２５）。デキサメタゾンおよび３００アンタゴニストによる同時処置は、コントロールと比較されたとき、より小さい平均体重減少をもたらした（図２５）。このことは、アンタゴニストが、マウスにおいて、悪液質に関連づけられる筋肉喪失を防止し、従って、体重を防止し得ることを示している。このことはまた、ミオスタチンアンタゴニスト（例えば、３００など）の使用が、ヒト患者でのデキサメタゾンの使用の負の影響を軽減することにおいて様々な適用を有することを示している。
脂肪パッド重量

クッシング症候群（グルココルチコイドの過剰産生）に苦しむ患者の臨床的特徴の１つが、増大した脂肪沈着であり、従って、脂肪パッド重量を試験完了後に分析した。

デキサメタゾンによる処置は、セイラインにより処置されたマウスと比較されたとき、後腹膜脂肪パッド重量における増大（左、６２．９％；右、６０．４％）をもたらし、統計学的に有意な増大が左右の後腹膜脂肪パッドおよび鼠蹊部脂肪パッドの両方で認められた（ｐ＜０．０５）（図２６）。後腹膜脂肪パッド重量における増大（左、２３．３％；右、３９．２％）および鼠蹊部脂肪パッド重量における増大（左、３３．２％；右、３９％）もまた、３００による処置の後で観測され、だが、これは、デキサメタゾンのみによる処置の後で観測された程度よりも小さい程度であった。従って、３００による処置は、脂肪パッド重量におけるデキサメタゾン媒介の増大を部分的に救済した。このことは、本発明者らのアンタゴニストが、悪液質を処置することにおいて有用であり得るだけでなく、脂肪沈着を低下させることが好都合である状況において、例えば、肥満の処置などにおいて使用され得ることを示している。
ＭｙｏＤおよびＰａｘ７の発現

タンパク質をすべてのマウスからの右側の腓腹筋から単離し、ウエスタンブロットをＭｙｏＤおよびＰａｘ７について行った。デキサメタゾンによる処置の後におけるＭｙｏＤ発現の著しいダウンレギュレーション（ｐ＜０．０５）（図２７）およびＰａｘ７発現の著しいダウンレギュレーション（ｐ＜０．０５）（図２７）が認められた。加えて、本発明者らは、デキサメタゾンおよび３００ｍｓｔｎアンタゴニストにより処置されたマウスにおけるＭｙｏＤ（ｐ＜０．０５）およびＰａｘ７（ｐ＜０．０１）の両方の著しいアップレギュレーション（救済）を観測した。従って、３００アンタゴニストによる処置は、デキサメタゾン誘導の悪液質の期間中におけるＭｙｏＤおよびＰａｘ７の発現を調節するようである。ＭｙｏＤおよびＰａｘ７のアップレギュレーションは筋肉再生のマーカーであることが広く認識されている。

若い野生型マウスおよびミオスタチン欠損マウスにおける筋肉再生の期間中、ＭｙｏＤは、ミオスタチン欠損の筋肉では、野生型の筋肉と比較されたとき、より早い時期において、また、より大きいレベルで発現されることが示されている（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙ、２００５）。ＭｙｏＤの発現は、遊走している筋芽細胞を筋肉再生の期間中において非常に早期に検出するためのマーカー（Ｇｒｏｕｎｄｓ、１９９２）として使用することができるので、ＭｙｏＤのこの早期発現は、傷害部位への筋原性細胞の促進された遊走として解釈された（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙ、２００５）。

Ｐａｘ７は衛星細胞の自己複製についてのマーカー（Ｏｕｓｔａｎｉｎａ、２００４；Ｚａｍｍｉｔ、２００４）であるので、Ｐａｘ７のレベルがより大きいことにより、３００がこの自己複製プロセスを高めたことが示唆される。このことは、ミオスタチンが衛星細胞の自己複製を阻害することを示唆する、より初期の知見（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙ、２００５）と一致している。

まとめると、３００の投与から生じるＰａｘ７およびＭｙｏＤのより大きいレベルは、３００による処置が、筋肉消耗のこのモデルにおける筋肉再生を、活性化された衛星細胞の増大したレベル、ならびに、その後の筋形成および衛星細胞の自己複製により促進させたという観測結果を裏付けている。
実施例１１：インビボでのサルコペニア試験
方法：

野生型マウス（３２匹のマウス、およそ４月齢〜５月齢）に、２週間に１回または１ヶ月に１回、３００（６μｇ／ｇ体重）またはセイラインを１０ヶ月間にわたって皮下注射した。筋力を、試験終了時に握力装置（Ｍｋ−３８０Ｓ、室町機械；東京、日本）を使用して評価した。尾によって後側に引っ張られている間にマウスが発揮した最大の力がニュートン単位で記録される。それぞれのマウスについての３回の握力試験の平均値を計算し、群あたりの平均最大力を求めた。
結果：

握力が筋肉機能についての目安として使用される（Ｗａｇｎｅｒら、２００２）。１０ヶ月の動物試験が、筋肉機能を改善することにおけるミオスタチンアンタゴニストの影響を、若齢状態から老齢状態に進行している期間中にマウスにおいて評価するために行われた。図１９に示されるように、試験終了時のセイラインコントロールを上回る、３００により１ヶ月に１回処置されたマウスでの握力における著しい増大は、３００により処置されたマウスにおける機能的改善を示している（^＊＊ｐ＜０．０１）。本発明者らは、両方の適用様式、すなわち、１ヶ月に１回のアンタゴニスト適用（図１９）、ならびに、２週間に１回のアンタゴニスト適用（データは示されず）が、筋肉機能を増大させることにおいて等しく効果的であったことを示している。これは、増大した衛星細胞の活性化およびその後の筋形成のためである可能性が最も高い。

筋力を老齢マウスにおいて増大させるためにアンタゴニストを使用することの有益な作用に加えて、この試験期間中において、マウスが若いとき（４月齢〜５月齢）、１ヶ月の処置の後での初期応答が筋力における著しい増大を示したことが認められた。このことは、アンタゴニストが、正常なレベルの衛星細胞活性化および筋肉機能の他の決定因子を伴って筋肉おける筋肉機能を増大させることにおいて効果的であることを示す。この結果は、医学的処置に起因する外傷に先立つか、または、低下した筋力をもたらすことが予想される状態（例えば、強制された無活動状態または他の状態など）の開始に先立つミオスタチンアンタゴニストによる処置を示している。
考察

ミオスタチンは、ミオスタチンの喪失が筋肉の成長を引き起こし、一方で、高レベルのミオスタチンが筋肉の消耗を誘導するので、筋肉成長の負の調節因子である。ミオスタチンは、その生物学的機能を、部分的には筋芽細胞の増殖速度を抑制することによって誘発することが立証されている（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）。ミオスタチンは、細胞周期進行の強力の調節因子であるようであり、また、増大したレベルのミオスタチンが筋芽細胞のＳ期への進入を阻止し、それにより、筋芽細胞の増殖を阻害することが示されている（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）。ミオスタチンは、アクチビンＩＩＢ型受容体に結合し、Ｓｍａｄ２／３経路を介してシグナル伝達することが示されている。ミオスタチンを含めて、様々なＴＧＦβメンバーが、三次元構造を決定するために非常に重要であり、また、受容体結合のために不可欠である保存されたシステイン残基を含有することが示されている（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、２００１）。

ミオスタチン活性の阻害がいくつかの様式で現れることがある：例えば、体重における増大（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７）、肥大および過形成に起因する高まった筋肉量（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、１９９７、および、Ｚｈｕら、２０００）、体脂肪含有量における低下（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、２００２）、筋力における増大（国際特許出願公開ＷＯ２００６／０８３１８３）、ならびに、骨質における増大（Ｈａｍｒｉｃｋら、２００２）など。

本研究では、いくつかの組換え分子が、ミオスタチン機能に拮抗するそれらの能力について試験された。アンタゴニストが機能的であるためには、保存されたシステイン残基が、タンパク質の三次元構造を決定することにおいて、従って、生物学的活性を与えることにおいて非常に重要であることが予想される。３００位、３１０位、３２０位および３２９位のアミノ酸位置でのＣ末端切断はすべてが、三次元構造の破壊をもたらす、不可欠なシステイン残基の喪失をもたらすことを考えると、３００、３１０、３２０および３２９が、ミオスタチン活性をインビトロおよびインビボの両方で中和することにおいて効果的であり得ることは非常に驚くべきことであった。従って、これらの結果は今までに例がなく、また、驚くべきこと、これらのアンタゴニストが新規な化合物であることだけでなく、正確な三次元タンパク質構造およびそれらの作用機構が予測できないこともまた示している。２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位、３０５位、３０６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１３位、３１４位、３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位または３２９位でＣ末端切断されるペプチドはすべてが、上記の実施例によって明らかにされるような活性を与えるための十分な数のシステインを含有するので、すべてのこれらのペプチドが機能的であることが予想される。機能を与えることにおけるこれらのシステイン残基の役割が、２８０（これは、さらなるシステイン残基が欠失されており、従って、１個のシステイン残基を含有するだけである）は不活性であるようであるという観測結果（実施例１）によって裏付けられる。

本発明の結果は、新規なミオスタチンアンタゴニストが、重要なシステイン残基および関連する予測された構造的立体配座の喪失にもかかわらず、ミオスタチンに拮抗し得ることを明瞭に示す。この作用は、下記の状態において利益を提供することが本明細書に記載されるインビトロ試験およびインビボ試験において示されている：下記で記載されるように、増大したレベルのミオスタチンに関連する様々な消耗性状態および外傷を含めて、影響または病理が、増大したミオスタチンレベルによるシグナル伝達に起因する状態で、ミオスタチンに拮抗する能力が有益な結果を直接的にもたらすと考えられる状態；および、ミオスタチンに拮抗する能力が、様々な生理学的プロセス（例えば、筋芽細胞の増殖、衛星細胞の活性化および自己複製、ならびに、筋芽細胞およびマクロファージの遊走など）の強化をもたらす状態で、これらの作用の強化が、利益を、ミオスタチンのレベルが、健康な組織に存在するレベルを越えて増大しない組織においてもたらす状態。

本発明は、哺乳動物における筋肉組織または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性によって少なくとも部分的には特徴づけられ、かつ、筋肥大に関連づけられる障害；炎症性筋障害、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、末梢神経の疾患、内分泌異常に起因する筋障害、代謝症候群、ＨＩＶ、ガン、サルコペニア、悪液質および他の消耗性状態に関連する筋萎縮および筋肉消耗；心不全；骨粗鬆症；腎不全または腎疾患；肝不全または肝疾患；食欲不振；肥満；糖尿病；および創傷治癒を含み得る数多くの疾患および障害の処置または防止において有用であると考えられる。例えば、悪液質がミオスタチンの全身的投与によってマウスにおいて誘導され得ることが示されている（Ｚｉｍｍｅｒｓら、２００２）。ミオスタチンのレベルはまた、火傷傷害を有する動物において上昇すること（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｈ．Ｌａｎｇ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｓｉｌｖｉｓ、Ｇｅｒａｌｄ ＮｙｓｔｒｏｍおよびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｆｒｏｓｔ、熱傷害後のグルココルチコイド類によるミオスタチンの調節、ＦＡＳＥＢ、１５、１８０７〜１８０９、２００１）、および、ＨＩＶ患者において上昇すること（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、１９９８）が示されており、また、血漿中のミオスタチン免疫反応性タンパク質が長期のベッド安静の後で増大することが見出された（Ｚａｃｋｗｉｅｊａら、１９９９）。本発明者らは、アンタゴニストの投与がミオスタチン媒介による悪液質のシグナル伝達分子を救済すること（実施例９）、また、悪液質マウスモデルにおいて体重減少を緩和し、筋肉再生を高めること（実施例１０）をもたらすことを明らかにしている。従って、本発明者らのアンタゴニストは、火傷傷害、長期のベッド安静、ＨＩＶまたはガンから生じる悪液質に苦しむ個体を処置するために有益であり得ることを示している。

様々な状態の処置、例えば、増大したミオスタチンレベルが、有害な影響を誘導するための重要なシグナルであると考えられる状態の処置などは、例えば、本明細書に記載されるようなアンタゴニストを使用してミオスタチンのシグナルに拮抗する能力によって明白に支援される。シグナル伝達および病理の誘導におけるミオスタチンの役割が存在し、しかし、そのような役割が今までのところ発見されていない数多くの病理学的状態があることが理解される。

本発明のミオスタチンアンタゴニストの使用は、増大したレベルのミオスタチンが存在するか、または、筋肉機能もしくは他の組織機能における低下に関わっているかが明らかではないいくつかの状態において利益をもたらすことが示されている。ミオスタチンの阻害が、異常なレベルのミオスタチンが何ら示されない野生型筋芽細胞（実施例１）、若い野生型衛星細胞（実施例２）、および、若い５月齢マウス（実施例例１１）において、筋芽細胞の増殖を増大させることで利益をもたらし得ることは明らかである。有益な作用が、本発明のアンタゴニストの作用に直接に起因する高まった筋芽細胞増殖、衛星細胞の活性化および自己複製、筋芽細胞およびマクロファージの遊走の全身的な作用に主として起因すると考えられる２つの有害な状態（サルコペニアおよび筋ジストロフィー）における本発明のミオスタチンアンタゴニストの利益を示すデータもまた示される。

サルコペニアまたは加齢性悪液質は、衛星細胞の活性および筋形成における低下に起因する不十分なレベルの筋肉再生および低下した筋力によって特徴づけられる（Ｃｏｎｂｏｙら、２００５；Ｂｏｃｋｈｏｌｄら、１９９８）。

本発明のアンタゴニストを使用するとき、筋肉再生が、２つの主要な機能によって、すなわち、筋芽細胞の増殖を増大させること（実施例１）、および、衛星細胞の活性化を増大させること（実施例２）によって増大することが明らかにされている。筋肉再生における増大には、本発明のアンタゴニストの短期投与（実施例４）および長期投与（実施例１１）の両方を使用して示されるように、筋力における増大が伴う。本明細書中に明らかにされるこれらの結果はまた、本発明のアンタゴニストが、筋肉量および筋力を、数多くの状態において、例えば、筋ジストロフィー（実施例５）、筋肉傷害（実施例８）、サルコペニア（実施例１１）およびガン悪液質（実施例９および実施例１４）などにおいて改善するために使用され得るという証拠を提供する。

作用機構が他の状態について類似しているので、アンタゴニストが、火傷傷害、長期のベッド安静、ＨＩＶまたはガンから生じる悪液質、および、サルコペニアに苦しむ個体を処置するために有用であることが予測される。さらに、衛星細胞の活性化および筋力を若い野生型筋肉において増大させること（実施例２および実施例１１）はまた、アンタゴニストが、患者を手術前に処置するために、従って、手術後の強制されるベッド安静に起因する筋肉喪失を防止するために有用であることを示している。

ジストロフィーの状態では、筋肉の変性およびその後の再生のサイクルが繰り返されることに起因する衛星細胞の絶え間のない活性化が存在する。本発明の結果は、本発明のアンタゴニストが、筋肉の再生、衛星細胞の活性化および筋力を筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて増大させ得ることを明らかにする（実施例５）。このマウスモデルはヒトのジストロフィーについての標準モデルであるので、ジストロフィーに苦しむ個体が本発明のミオスタチンアンタゴニストにより首尾良く処置され得ることが予測される。

上記の２つの例により、握力に対するアンタゴニストの処置の影響が若齢マウスおよび老齢マウスにおいて示され（実施例４）、また、ｍｄｘマウスでの症状を低下させることにおいて示され（実施例５）、この場合、これらの有益な作用は、ミオスタチンのレベルを正常な野生型よりも低く低下させることにおける本発明者らのアンタゴニストの作用に起因する高まった筋芽細胞の増殖、衛星細胞の活性化および自己複製、筋芽細胞およびマクロファージの遊走のためであると考えられる。これらの例に加えて、本発明のミオスタチンアンタゴニストによる処置は、筋肉機能が、高まった筋芽細胞の増殖、衛星細胞の活性化および自己複製、筋芽細胞およびマクロファージの遊走の作用によって改善される任意の医学的状態において有益な効果をもたらすことが予想される。そのような状態には、手術後の筋肉喪失、成長遅延、生理学的低身長、慢性的な病気に起因する筋肉喪失、火傷患者の回復を加速させること、または、筋肉機能を改善することが有益である他の障害が含まれる。

インスリンにより刺激されるグルコース取り込みに対して抵抗性である骨格筋は、２型糖尿病の最も初期の知られている症状発現である（Ｃｏｒｒｅｇａｎら、１９９１）。ミオスタチンの欠乏は２つのマウスモデル（アグーチ致死性イエローモデル（Ｙｅｎら、１９９４）および肥満モデル）の肥満表現型および糖尿病表現型を部分的に弱めることが示されている。加えて、ミオスタチン変異のアグーチ致死性イエローマウスへの導入は脂肪蓄積を５倍抑制することが示されている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、２００２）。このことは、本発明のアンタゴニストが脂肪沈着を低下させ得ることを示す本発明の結果（実施例４および実施例１１）とともに、糖尿病、肥満および高血糖状態に苦しむ個体が本発明の１つまたは複数のミオスタチンアンタゴニストの治療効果的な用量により首尾良く処置され得ることを示している。

本発明の結果はまた、本発明のミオスタチンアンタゴニストが創傷治癒において有用であることを示す。どの創傷も、創傷治癒の３つの異なった段階を受ける。最初に、劣化した組織を剥離させ、傷を清浄化するための炎症期；二番目に、肉芽組織を発達させるための増殖期；三番目に、成熟化および瘢痕形成のための分化期または再生期（Ｓｅｄｌａｒｉｋ、１９９４）。炎症期は、損傷を受けた部位への炎症性細胞（例えば、マクロファージなど）の浸潤によって特徴づけられる。本発明の結果は、本発明のアンタゴニストの使用がマクロファージの遊走能を増大させることを明らかにする（実施例３）。このことは、皮膚における低下した創傷サイズ（実施例６）、皮膚における低下したコラーゲン沈着（実施例７）、および、増大した筋原性マーカーによって示されるような増大した筋肉再生（実施例８）と一緒に、本発明のアンタゴニストが創傷治癒の処置において有用であることを示唆する。これらの結果は、これらの有益な効果が、マクロファージおよび筋芽細胞の増大した遊走、筋肉組織の加速された再生、ならびに、低下した線維形成が有用な結果である様々な組織の創傷において予想され得ることを示す。

本発明のミオスタチンアンタゴニストは、損傷を受けた心筋の処置において有用であることもまた予想される。ミオスタチンのレベルが心筋梗塞後の心筋細胞においてアップレギュレーションされる（Ｓｈａｒｍａら、１９９９）。このことは、ミオスタチンの阻害により、梗塞後の心筋の回復が改善され得ることを示している。

加えて、ミオスタチン欠損マウスは、増大した筋肉量だけでなく、増大した骨ミネラル含有量および骨密度を有する（Ｈａｍｒｉｃｋら、２００２）。従って、ミオスタチンのレベルを低下させることは骨強度を改善し、骨粗鬆症および他の変性骨疾患を軽減することが予想される。
横紋筋肉腫（ＲＭＳ）は、小児の最も一般的な固形腫瘍の１つであり、高レベルのミオスタチンを発現する。ミオスタチンの阻害は、ＲＭＳが筋原性の最終分化に進行することを可能にすることが明らかにされており（Ｒｉｃａｕｄら、２００３）、従って、本発明者らのアンタゴニストはガンの処置のために有用であり得る。

上記で議論されたように、本発明のアンタゴニストは、ヒトを処置するために有用であることが予想される。本発明のアンタゴニストはまた、ミオスタチンの配列が種間において非常に相同的であることを考えると、他の生物種を処置するために有用である。実際、ヒト配列およびウシ配列は同一であり（図３１）、また、本発明のアンタゴニストは、ヒツジ細胞、マウス細胞およびヒト細胞の増殖をインビトロで増大させることが明らかにされている。本発明の結果はまた、本発明のミオスタチンアンタゴニストが筋芽細胞の増殖を増大させ得ることを明瞭に明らかにする（実施例１）。
参考文献

下記の参考文献は、本明細書中に示される細部に対して補足的である例示的細部、手順の細部および他の細部を提供する程度に、参考として本明細書中に特に組み込まれる。本明細書の本文を通して参照される特許明細書もまた、参考として本明細書中に特に組み込まれる。
Allen, RE, Temm-Grove, CJ, Sheehan, SM, and Rice, G. (1997). Skeletal muscle satellite cell cultures. Methods Cel Biol 52, 155-76.
Bernkop-Schnurch A and Walker G (2001) Multifunctional matrices for oral peptide delivery. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 18(5): 459-501
Berry C, Thomas M, Langley B, Sharma, M and Kambadur R (2000). Single cysteine to tyrosine transition inactivates the growth inhibitory function in Piedmontese myostatin. Am J Physiol Cel Physiol 283, C135-C141.
Bischoff, R. (1994). Myology, vol. 1 (eds AG. Engel and C. Franzini-Armstrong), pp. 97-118: McGraw-Hill Professional
Bockhold, K. J., Rosenblatt, J. D. and Partridge, T. A. (1998). Aging normal and dystrophic mouse muscle: analysis of myogenicity in cultures of living single fibers. Muscle Nerve 21, 173-83
Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS, Khurana TS. (2002) Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420: 418-21
Bradley, P., Misura, K.M.S. and Baker, D. (2005) Toward High-Resolution de Novo Structure Prediction for Small Proteins. Science 309, 1868 -1871
Carlson, CJ, Booth, FW and Gordon, SE. (1999). Skeletal muscle myostatin mRNA expression is fibre-type specific and increases during hind-limb unloading. Am J Physiol 277, R601-6
Colditz, IG and Movat HZ (1984). Kinetics of neutrophil accumulation in acute inflammatory lesions induced by chemotaxis and chemotaxinigens. J Immunol 133, 2167-73.
Conboy, I. M., Conboy, M. J., Wagers, A. J., Girma, E. R., Weissman, I. L. and Rando, T. A. (2005). Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. Nature 433, 760-4;
Corrigan AZ, Bilezikjian LM, Carroll RS, Bald LN, Schmelzer CH, Fendly BM, Mason AJ, Chin WW, Schwall RH, and Vale W (1991) Evidence for an autocrine role of activin B within rat anterior pituitary cultures. Endocrin 128: 1682-1684
Evan GI, Lewis GK, Ramsey G and Bishop JM (1985). Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cel Biol 5, 3610-16.
Field J, Nikawa D, Broek B, MacDonald B, Rodgers L, Wilson IA, Lerner RA and Wigler M (1988). Purification of a RAS-responsive adenylyl cyclase complex from Saccharomyces cerevisiae by use of an epitope addition method. Mol Cel Biol 8, 2159-65.
Giridharan NV (1998). Animal models of obesity and their usefulness in molecular approach to obesity. Indian J Med Res 108, 225-42.
Gonzalez-Cadavid NF, Taylor WE, Yarasheski K, Sinha-Hikim I, Ma K, Ezzat S, Shen R, Lalani R, Asa S, Mamita M, Nair G, Arver S, Bhasin S. (1998) Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14938-43.
Gribskov, M., and Burgess, R.R.. (1986). Sigma factors from E. coli, B. subtilis, phage SPO1, and phage T4 are homologous proteins.", Nucleic Acids Research 14, 6745-6763.
Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, et al. (1997) A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17:71-74.
Hamrick MW, McPherron AC, Lovejoy CO. (2002) Bone mineral content and density in the humerus of adult myostatin-deficient mice. Calcif Tissue Int 71(1):63-8.
Hamrick MW (2003) Increased bone mineral density in the femora of GDF8 knockout mice. Anat Rec 272A(1): 388-91.
Hill JJ, Davies MV, Pearson AA, et al. (2002) The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J Biol Chem 277: 40735-40741.
Hill JJ, Qiu Y, Hewick RM. (2003) Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1: a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Mol Endocrinol 17: 1144-1154.
Hopp, P., Prickett, KS, Price, VL, Libby, RT, Ceretti, DP, March, CJ, Urdal, DL. and Conlon, P.J. 1988. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Bio/Technology 8: 1204−1210.
Jeanplong F, Sharma M, Somers WG, Bass JJ and Kambadur R (2001) Genomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene. Mol Cell Biochem 220:31-37.
Jones, GE. (2000). Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. J Leukoc Biol 68, 593-602.
Kambadur R., Sharma M., Smith T. and Bass J.J. (1997) Mutations in myostatin (GDF-8) in double muscled Belgian Blue and Piedmontese Cattle. Genome Res 7: 910-916.
Kirk S, Oldham J, Kambadur R, Sharma M, Dobbie P, and Bass J. (2000). Myostatin regulation during skeletal muscle regeneration. J Cel Physiol 184(3), 356-63.
Langley B, Thomas M, McFarlane C, Gilmour S, Sharma M, Kambadur R. (2004) Myostatin inhibits rhabdomyosarcoma cell proliferation through an Rb-independent pathway. Oncogene 23: 524-34.
Lee SJ, McPherron AC. (2001) Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA 98: 9306-9311.
Like AA, Rossini AA (1976). Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new model of diabetes mellitus. Science 193, 415-7.
Lutz-Freyermuth C, Query CC and Keene JD (1990). Quantitative Determination that One of Two Potential RNA-Binding Domains of the A Protein Component of the U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein Complex Binds with High Affinity to Stem-Loop II of U1 RNA Proc Natl Acad Sci USA 87, 6393-97.
Ma K, Mallidis C, Bhasin S, Mahabadi V, Artaza J, Gonzalez-Cadavid N, Arias J, Salehian B. (2003) Glucocorticoid-induced skeletal muscle atrophy is associated with upregulation of myostatin gene expression. Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E363-E371.
Martin GA, Yatani R, Clark R, Conroy L, Polakis P, Brown AM and McCormick F (1992). GAP domains responsible for ras p21-dependent inhibition of muscarinic atrial K+ channel currents. Science 255, 192-4.
McCroskery S, Thomas M, Maxwell L, Sharma M, and Kambadur R. (2003). Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cel Biol 162.
McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. (1997a) Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 387: 83-90.
McPherron AC, Lee SJ. (1997b) Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA 94:12457-12461.
McPherron AC, Lee SJ (2002) Suppression of body fat accumulation in myostatin-deficient mice. J Clin Invest 109: 595-601.
Needleman SB and Wunsch CD (1970). A General method applicable to the search for similarities in the amin acid sequence of two proteins. J Mol Biol 48(3), 443-53.
Nicholas G, Thomas M, Langley B, et al. (2002) Titin-cap associates with, and regulates secretion of, myostatin. J Cell Physiol 193: 120-131.
Paborsky LR, Fendly BM, Fisher KL, Lawn RM, Marks BJ, McCray G, Tate, KM, Vehar GA and Gorman CM (1990). Mammalian cell transient expression of tissue factor for the production of antigen . Protein Engineering 3(6), 547-53.
Partridge TA. (1997). Tissue culture of skeletal muscle. Methods Mol Biol 75, 131-44.
Pearson WR and Lipman DJ (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci USA 85(8), 2444-8.
Rebbapragada A, Benchabane H, Wrana JL, Celeste AJ, Attisano L. (2003) Myostatin signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathway to block adipogenesis. Mol Cell Biol 23: 7230-42.
Ricaud S, Vernus B, Duclos M, Bernardi H, Ritvos O, Carnac G, Bonnieu A. (2003) Inhibition of autocrine secretion of myostatin enhances terminal differentiation in human rhabdomyosarcoma cells. Oncogene. 22(51):8221-32
Rios R, Carneiro I, Arce VM, Devesa J. (2001) Myostatin regulates cell survival during C₂C₁₂ myogenesis. Biochem Biophys Res Commun 280: 561-566.
Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J. and Partridge, T. A. (1995). Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cel Dev Biol Anim 31, 773-9.
Sharma M, Kambadur R, Matthews KG, Somers WG, Devlin GP, Conaglen JV, Fowke PJ, Bass JJ. (1999) Myostatin, a transforming growth factor-beta superfamily member, is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocytes after infarct. J Cell Physiol 180:1-9.
Schuelke M, Wagner KR, Stolz LE, Hubner C, Riebel T, Komen W, Braun T, Tobin JF, Lee SJ. (2004) Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child.
N Engl J Med. 350(26):2682-8.
Sedlarik K.M; The Process of Wound Healing. Wung Forum. Published on-line: hartmann_online, 1994
Skinner RH, Bradley S, Brown AL, Johnson NJ, Rhodes, S Stammers DK, and Lowe PN (1991) Use of the Glu-Glu-Phe C-terminal epitope for rapid purification of the catalytic domain of normal and mutant ras GTPase-activating proteins J. Biol. Chem. 266:14163 - 14166
Spiller MP, Kambadur R, Jeanplong F, Thomas M, Martyn JK, Bass JJ, Sharma M. (2002) The myostatin gene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transcription factor MyoD. Mol Cell Biol 22: 7066-82.
Tanabe Y, Esaki K, Nomura T (1986). Skeletal muscle pathology in X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) mouse. Acta Neuropathol (Berl) 69(1-2), 91-5.
Taylor WE, Bashin S, Artaza J, et al. (2001) Myostatin inhibits cell proliferation and protein synthesis in C₂C₁₂ muscle cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 280: E221-E228.
Thomas M, Langley B, Berry C, et al. (2000) Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J Biol Chem 275: 40235-40243.
Wang H, Zhang Q, Zhu D. (2003) hSGT interacts with tha N-terminal region of myostatin. Biochem Biophys Res Commun 311: 877-883.
Wehling M, Cai B, and Tidball JG (2000). Modulation of myostatin expression during modified muscle use. Faseb J 14, 103-10.
Werle M. and Bernkop-Schnurch A. (2006) Strategies to improve plasma half life of peptide and protein drugs. Amino Acids 30: 351-367.
Yang L, Scott PG, Dodd C, Medina A, Jiao H, Shankowsky HA, Ghahry A and Tredget EE. (2005). Identification of fibrocytes in postburn hypertrophic scar. Wound Repair and Regeneration 13(4), 398-404.
Yen TT, Gill AM, Frigeri LG, Barsh GS and Wolff GL (1994) Obesity, diabetes, and neoplasia in yellow Avy /-mice: ectopic expression of the agouti gene, FASEB J. 8:479-488.
Zachwieja JJ, Smith SR, Sinha-Hikim I, Gonzalez-Cadavid N, Bhasin S (1999) Plasma myostatin-immunoreactive protein is increased after prolonged bed rest with low-dose T3 administration. J Gravit Physiol 6: 11-5.
Zhu X, Hadhazy M, Wehling M, Tidbal JGl, McNally EM, (2000) Dominant negative myostatin produces hypertrophy without hyperplasia in muscle. FEBS Letters
474(1): 71-75
Zimmers TA, Davies MV, Koniaris LG, Haynes P, Esquela AF, Tomkinson KN, McPherron AC, Wolfman NM, Lee SJ. (2002) Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin. Science 296:1486-s8.

産業上の利用

本発明は、ミオスタチンに関連づけられる障害の処置において有用である、ミオスタチン拮抗活性を有する新規なタンパク質を提供する。そのような障害は、哺乳動物における筋肉組織または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性によって少なくとも部分的には特徴づけられ、これらには、筋肥大に関連づけられる障害；炎症性筋障害、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、末梢神経の疾患、内分泌異常に起因する筋障害、代謝症候群、ＨＩＶ、ガン、サルコペニア、悪液質および他の消耗性状態に関連する筋萎縮および筋肉消耗；心不全；骨粗鬆症；腎不全または腎疾患；肝不全または肝疾患；食欲不振；肥満；糖尿病；および創傷治癒が含まれ得る。

Claims (32)

1. Ｃ末端切断が、３２０位、３１０位または３００位のアミノ酸位置において存在する、Ｃ末端切断された成熟型ミオスタチンペプチド（それぞれ、配列番号４、５または６）、あるいは、前記ペプチドに少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドからなる、ミオスタチンアンタゴニスト活性を有する単離された組換えポリペプチド。
2. 請求項１に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその相補的な配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
3. アミノ酸配列が、選択的に変化させられた結合特性を有するミオスタチンアンタゴニスト、あるいは、改善された生体分布、または、インビボもしくは棚での改善された半減期を有するミオスタチンアンタゴニストを作製するために改変されており、改変されたアミノ酸残基が、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質成分にコンジュゲート化されたアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、有機誘導体化剤にコンジュゲート化されたアミノ酸からなる群から選択される、請求項１記載の単離された組換えポリペプチド。
4. 請求項１に記載される１つまたは複数の組換えポリペプチドを、精製、タンパク質複合体の形成、組織局在化もしくは組織分布、取り込み／投与、インビボ安定性および／またはインビボ半減期からなる群から選択される１つまたは複数の機能を高める１つまたは複数のさらなるポリペプチドと一緒に含む融合タンパク質。
5. １つまたは複数のさらなるポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項４記載の融合タンパク質。
6. 免疫グロブリンのＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃフラグメントである、請求項５記載の融合タンパク質。
7. １つまたは複数のさらなるポリペプチドが、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列またはＧＳＴ融合物からなる群から選択される精製配列を含む、請求項４記載の融合タンパク質。
8. 請求項１に記載される組換えポリペプチドと、ポリヒスチジン配列と、タグ配列とを含む、請求項７記載の融合タンパク質。
9. ポリヒスチジン配列が組換えポリペプチドのＮ末端に位置し、かつ、前記タグ配列がＣ末端に位置する、請求項８記載の融合タンパク質。
10. ポリヒスチジン配列が配列番号１３に記載された配列からなる、請求項９記載の融合タンパク質。
11. Ｃ末端タグ配列が配列番号１４に記載された配列からなる、請求項９記載の融合タンパク質。
12. 請求項１に記載される少なくとも１つの単離されたポリペプチドを医薬的に許容され得るキャリアとともに含む医薬組成物。
13. 請求項４に記載される少なくとも１つの融合タンパク質を含む医薬組成物。
14. 単離されたポリペプチドまたは融合タンパク質が、標的細胞または標的組織に対する治療効果を高めるための第２の医薬的に活性な化合物にコンジュゲート化され、かつ、組成物が、前記単離されたポリペプチドまたは融合タンパク質および前記第２の化合物の個別投与、連続投与または同時投与のために配合される、請求項１２または１３記載の医薬組成物。
15. その必要性のある動物において筋肉成長を調節し、脂肪生成分化を促進させ、かつ／または、骨の成長もしくは無機化を促進させるための医薬品の製造における、請求項１に記載される少なくとも１つのポリペプチドの使用。
16. その必要性のある動物において筋肉成長を調節し、脂肪生成分化を促進させ、かつ／または、骨の成長もしくは無機化を促進させるための医薬品の製造における、請求項４に記載される少なくとも１つの融合タンパク質の使用。
17. 増大した筋肉量、低下した脂肪沈着、および／または、改善された骨成長を、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽、七面鳥、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ネコ、イヌまたはヒトにおいて生じさせるための、請求項１５または１６記載の使用。
18. その必要性のある患者における筋肉組織または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性によって少なくとも部分的には特徴づけられるミオスタチン関連の病理学的状態を防止するか、または、そのような病理学的状態を処置するか、または、そのような病理学的状態の重篤度を軽減するための医薬品の製造における、請求項１に記載される少なくとも１つのポリペプチドの使用。
19. その必要性のある患者における筋肉組織または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性によって少なくとも部分的には特徴づけられるミオスタチン関連の病理学的状態を防止するか、または、そのような病理学的状態を処置するか、または、そのような病理学的状態の重篤度を軽減するための医薬品の製造における、請求項４に記載される少なくとも１つの融合タンパク質の使用。
20. 病理学的状態が、筋肥大に関連づけられる障害；炎症性筋障害、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、末梢神経の疾患、内分泌異常に起因する筋障害、代謝症候群、ＨＩＶ、ガン、サルコペニア、悪液質および他の消耗性状態に関連する筋萎縮および筋肉消耗；心不全；骨粗鬆症；腎不全または腎疾患；肝不全または肝疾患；食欲不振；肥満；糖尿病；および創傷治癒からなる群から選択される、請求項１８または１９記載の使用。
21. 請求項１に記載される少なくとも１つのポリペプチドの効果的な量をその必要性のある患者に投与するための医薬品であって、増大したサテライト細胞活性化、筋芽細胞増殖、マクロファージおよび筋芽細胞の遊走、ならびに／または、低下した線維形成から部分的に利益を受ける状態である状態の防止、処置または改善のための医薬品の製造における、請求項１に記載される少なくとも１つのポリペプチドの使用。
22. 請求項１に記載される少なくとも１つのポリペプチドの効果的な量をその必要性のある患者に投与するための医薬品であって、増大したサテライト細胞活性化、筋芽細胞増殖、マクロファージおよび筋芽細胞の遊走、ならびに／または、低下した線維形成から部分的に利益を受ける状態である状態の防止、処置または改善のための医薬品の製造における、請求項４に記載される少なくとも１つの融合タンパク質の使用。
23. 状態が、外傷に起因する筋損傷；薬剤、放射線治療、またはデキサメタゾンの投与に起因する筋損傷；長期のベッド安静に起因する筋肉消耗；創傷治癒；筋肥大に関連づけられる障害；炎症性筋障害、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、末梢神経の疾患、内分泌異常に起因する筋障害、代謝症候群、ＨＩＶ、ガン、サルコペニア、悪液質および他の消耗性状態に関連する筋萎縮および筋損傷；心不全；骨粗鬆症；腎不全または腎疾患；肝不全または肝疾患；食欲不振；肥満および糖尿病からなる群から選択される、請求項２１または２２記載の使用。
24. 薬剤が化学療法剤を含む、請求項２３記載の使用。
25. 長期のベッド安静が手術後に要求されるものである、請求項２３記載の使用。
26. 請求項１に記載される単離された組換えポリペプチドを作製する方法であって、下記の工程：
    ａ．成熟型ミオスタチンペプチドを、３２０位、３１０位、または３００位においてＣ末端切断する工程；
    ｂ．前記切断ペプチドをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅する工程；
    ｃ．前記ＤＮＡをＣ末端タグ配列およびＮ末端タグ配列とともに好適なベクターにクローン化する工程；
    ｄ．前記ベクターを好適な宿主にトランスフェクションする工程；
    ｅ．前記ペプチドを発現させ、前記タグ配列を使用して精製する工程；
    ｆ．前記タグ配列の一方または両方を必要に応じて除く工程
    を含む方法。
27. 請求項２６に記載される方法によって作製される単離された組換えポリペプチド。
28. 処置または防止される状態がサルコペニアである場合に、請求項１に記載される少なくとも１つのポリペプチドまたは請求項４に記載される少なくとも１つの融合タンパク質の効果的な量を投与するための、請求項２０または２３記載の使用。
29. 投与が毎日である、請求項２８記載の使用。
30. 投与が週に３回である、請求項２８記載の使用。
31. 投与が２週間に１回である、請求項２８記載の使用。
32. 投与が１ヶ月に１回である、請求項２８記載の使用。

Images