KR20090029190A - 인간화 ｃ-ｋｉｔ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 섬유증과 같은 c-Kit 관련 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법, 보다 특히 인간화 c-Kit 항체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

인간화 Ｃ-ＫＩＴ 항체{HUMANIZED C-KIT ANTIBODY}
본 발명은 c-Kit 관련 염증, 섬유증, 자가면역 및 암 질환을 치료하기 위한 조성물 및 인간화 c-Kit 항체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본원은 본원에 참고로 인용된, 2006년 4월 24일자로 출원된 미국 가출원 제 60/794,771 호의 이점을 주장한다.
비만 세포는 천식, 류마티스성 관절염 및 염증성 장 질환과 같은 염증 질환의 매개에 관련되었으며, 알레르기성 염증에서의 역할이 널리 인식되어 있다. 비만 세포는 중증의 천식환자로부터의 폐 외식편에서 수적으로 증가되며, 임상적으로 관련된 염증 매개체, 예를 들면, 류코트리엔스, 히스타민 및 Th2 사이토카인의 주요 공급원이다. 비만 세포는 질환 조직에서 미리-형성된 TNF의 주요 공급원이다.
줄기 세포 인자(SCF)는 이하에서 c-Kit로 정의되는 세포 및 막 결합 티로신 키나제 수용체를 통해 신호를 전달하는 당단백질이며, 상기 신호전달 경로는, 종종 다른 사이토카인과 함께 상승적으로 양성 및 음성 조절제 둘 다로 작용하는 조혈작용에서 핵심 역할을 한다. 가용성 쉐드(shed) c-Kit 수용체는 SCF를 조절하는데 역할을 할 수 있다. c-Kit는 림포이드(lymphoid) 및 에리트로이드 계통에 속하는 성숙 세포에 대한 전구체인 다능성 조혈모세포 상에서 발현된다. 다른 조혈 세포와 달리, 비만 세포 전구체 및 성숙 비만 세포는 높은 수준의 c-Kit 발현을 유지한다. 그러므로, c-Kit를 통한 SCF 신호전달은 비만 세포 발달, 기능, 교환(trafficking) 및 생존에 결정적이다. 비만 세포는 또한 배우자형성 및 멜라닌형성에 한 역할을 한다. W 유전자좌에서 불활성화 c-Kit 돌연변이를 갖는 마우스는 사실상 비만 세포를 갖지 않는다. 인간에서 활성화 c-Kit 돌연변이는 비만세포증과 관련된다.
c-Kit 양성 다능성 조혈모세포는 중간엽 세포, 섬유아세포 및 비만 세포를 포함한 다양한 세포 유형에 대한 전구체이다. 섬유증 질환은 부분적으로, 세포외 기질 침착을 야기하는 과도한 섬유아세포 활성 및 증식을 특징으로 한다. c-Kit 양성 골수 다능성 조혈모세포는 섬유성 조직에서 섬유아세포 및 비만 세포의 공급원인 것으로 보고되었다.
비만 세포는 염증, 혈관신생, 분열촉진 및 섬유생성 매개체의 지속적인 공급원을 제공할 수 있다. 비만 세포는 기능적으로 및 해부학적으로 섬유아세포에 연결되며, 섬유아세포를 활성화시키는데 직접적 역할을 한다. 비만 세포는 섬유아세포 매개된 콜라겐 수축, 세포외 기질 침착의 동역학 및 정도를 증가시키며, 섬유아세포를 근섬유아세포로 전환시킬 수 있다. 섬유아세포는 이어서 SCF를 분비하여 비만 세포를 더 활성화시키고 팽창시키며, 두 세포 유형 모두 섬유생성 망상조직의 성분들이다.
비만 세포수 및 비만 세포 매개체는 특발성 폐섬유증(IPF) 및 경피증을 포함한 대부분의 인간 섬유증 질환에서 상당히 증가된다. 분화 비만세포 표현형이 일부 경피증 환자 및 경피증의 Tsk 마우스 모델에서 검출된다. 침윤성 전신적 형태의 비만세포증은 비만 세포가 섬유증에서 작동체 세포일 수 있음을 보여주는 골수섬유증을 특징으로 할 수 있다.
글리벡(Gleevec, 등록상표), 및 수텐트(Sutent, 등록상표)와 같은 부류의 다른 약제들은 c-Kit 신호전달 활성을 표적으로 할 수 있지만 많은 다른 키나제는 억제하는 다중-표적 티로신 키나제 수용체 억제제이다. 이들 키나제 억제제는 종양학 환경에 필요하다. 골수억제, 빈혈, 및 심장독성 및 말초 부종을 포함한 많은 부작용이 글리벡에 대해 보고되었다. 그러므로, 이들 분자는 c-Kit 신호전달과 관련된 질환의 만성 치료에 대한 위험 특성에 대해 최선의 이점을 갖지 않을 수도 있다. 따라서, 새로운 치료법 및 시약, 특히 보다 유효하고 선택적이며, c-Kit 관련 염증 및 섬유증 질환의 치료에 보다 우수한 안전성 프로필을 갖는 새로운 치료법 및 시약이 요구된다. 상기 화합물은 또한, 골수 유래 백혈병, c-Kit 돌연변이와 관련된 질환, 예를 들어, GIST 및 비만세포증, 흑색종 및 다양한 SCLS에서와 같이 c-Kit의 과-발현 및/또는 과도한 SCF 자가분비 활성과 관련된 질환과 같은 종양성 질환에서 훨씬 더 우수한 효능 및 안전성 프로필을 나타낼 수 있다. 인간 c-Kit를 표적으로 하고 상당한 부작용없이 치료 이점을 미칠 수 있는 치료법 및 시약이 현재 없다.
도 1은 SR-1이 상처 활성화 모델에서 비만 세포를 억제함을 나타낸다.
도 2는 상처 치유 모델에서의 비만 세포 수를 나타낸다.
도 3은 인간화 SR-1 아이소폼이 줄기 세포 인자(SCF) 유도된 c-Kit의 활성화 및 c-Kit에 의한 후속 포스포릴화를 억제함을 나타낸다.
본 발명은 세포-결합 및 막 c-Kit 수용체에서 SCF의 길항물질 및 중성 길항물질인 약제, 예를 들면, 단클론성 항체를 제공한다. 보다 특정 태양에서, c-Kit에 결합하는 인간화(비-뮤린) 단클론성 항체가 제공된다. 보다 더 특정한 태양에서, 본 발명의 인간화 항체는 서열번호 2, 4 및 6에 나타낸 서열들 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 임의의 전술한 항체들 또는 특이적 결합제를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 관련 태양에서, 임의의 전술한 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다. 또 다른 태양에서, 임의의 전술한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
한 태양에서, c-Kit 결합제 및 중성 길항물질은 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 태양에서, 임의의 전술한 약제는 서열번호: 2, 4 또는 6에 나타낸 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 태양에서, 서열번호: 2, 4 또는 6 각각에 대한 서열 변이는, 예를 들면, 그 위치에서 대체 인간 아미노산을 이용하여 IgG의 상응하는 골격 영역의 보존적 치환을 나타낼 수 있다.
예시적인 태양에서, c-Kit에 결합하는 항체 또는 특이적 결합제는 서열번호: 2, 4 또는 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 본 발명의 항체는 IgG 항체 아이소타이프(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형의 혼합물)의 혼합물일 수 있는 것으로 생각된다.
임의의 전술한 항체는, 예를 들면, 천연 또는 돌연변이 IgG 항체(예를 들면, IgG1 또는 IgG3 아형, 또는 임의의 다른 IgG 아형)일 수 있다. 전술한 항체는 표면 플라스몬 공명(비아코어(BIAcore) 분석)으로 측정할 때, 1 x 10-2 미만, 또는 1 x 10-3, 또는 1 x 10-4, 1 x 10-5, 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8 또는 1 x 10-9 미만의 kd를 특징으로 하는 결합력(avidity)을 나타낼 수 있다.
전술한 항체는 세포 분석으로 측정할 때, 1 x 10-2 미만, 또는 1 x 10-3, 또는 1 x 10-4, 1 x 10-5, 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8 또는 1 x 10-9 미만의 중성 길항물질 IC50을 나타낼 수 있다. 특정 태양에서, 인간화 항체의 친화도 및 작용 효능은 적어도 모(parent) 뮤린 항체의 친화도 및 효능에 적어도 필적한다. 바람직한 태양에서, 인간화 항체는 c-Kit 수용체의 작용물질이 아니며 아나필락토이드(anaphylactoid) 반응을 야기할 수 있고, 적어도 모 뮤린 항체에 필적하는 PD/PK 및 면역원성 프로필을 나타내야 하는 비만 세포를 활성화시키지 않는다.
본 발명에는 많은 방법들이 고려된다. 예를 들면, 핵산이 발현되어 항체 또는 약제를 생성하도록 전술한 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 전술한 항체 또는 특이적 결합제의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 또한 숙주 세포 배양액으로부터 항체 또는 약제를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 관련 태양으로, 전술한 방법에 의해 생성된, 분리된 항체 또는 약제가 제공된다.
본 발명은 또한 효과량의 전술한 항체 또는 특이적 결합제를 투여함으로써, 임의의 전술한 항체 또는 특이적 결합제를 사용하여 c-Kit 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 치료될 상기 질환의 한 예는 섬유증 질환이다.
뮤린 항-인간 c-Kit 항체 SR-1은 각각 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,919,911 및 5,489,516 호에 기술되어 있다. SR-1은 c-Kit에 적합한 결합 특성을 나타내고 SCF-매개 수용체 신호전달을 차단하였지만, 상기 분자는 명백한 면역원성 문제 이외에 인간 치료에서 바람직한 모든 특성들을 갖지 않았다. 브라우디(Broudy)는 SR-1이 수용체 내재화 및 포스포릴화를 야기할 수 있는 일부 작용물질-유사 활성을 갖는다고 보고하였다[J. Cell Physiol., 158(3):545-554, 1994 Mar]. 이들 작용 활성은 분자를 덜 효과적이고 덜 안전하게 만든다. 단일클론의 인간화는 확증된 방법이고 그 생물 활성은 일반적으로 적절히 번역될 것으로 예상되긴 하지만, 인간화 SR-1 항체의 형태는 인간 골격에 따라 c-Kit에서 상이한 고유 활성 및 따라서 생물 기능을 야기할 수 있다. 상기 특정 예에서, 바람직하지 않은 "작동성" 성질은 제외하고, 바람직한 약리학적 성질을 얻고자 하지만, 이를 달성하기 위한 방법은 발표된 바가 없다. SR-1 항체의 상보성 결정 영역은, 놀랍게도 c-Kit에 대해 유사한 친화도를 유지하면서, 구조적으로 상이한 IgG1 및 IgG2 및 IgG4의 인간 중쇄 및 경쇄의 단일 조합내에 삽입되었다. 그러나, 이러한 골격 영역은 각각 단점을 갖는 것으로 입증되었다.
IgG2 배경에서 인간화 SR-1은 c-Kit에 대해 고 친화도를 갖는 것으로 입증되었지만, 다중 세포 유형에서는 SCF-매개 수용체 내재화를 완전히 차단할 수 없었고, 배양된 비만 세포 분석에서 c-Kit 포스포릴화, 생존 신호를 유도하였으며 세포의 비정상적 응집(clumping)을 매개하였다. 이러한 성질들은, 치료 방법의 목적이 생존 SCF 신호를 차단하여 비만 세포 및 전구체를 세포사멸적으로 고갈시키고 생체내에서 아나필락토이드 반응을 야기할 수 있는 비만 세포 활성화를 배제하는 것이기 때문에, 잠재적으로 바람직하지 않다. 마우스의 SR-1 CDR 영역이 인간 IgG1 골격에 삽입될 때, 친화도 및 작용 효능은 또한 유지되지만, 이러한 배경은 항체의 상기 아이소타입에서 종종 발견되는 보체 활성화 및 세포 매개 세포독성으로 인해 덜 바람직하다. 마우스 SR-1 CDR 영역이 인간 IgG4 골격에 삽입될 때, 또한 친화도 및 작용 효능은 유지되지만, 예기치 않게 상기 분자는 정제 및 스케일업 중에 상당한 응집을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 보체 활성화를 갖지 않고, 막 c-Kit 수용체에 대해 바람직한 친화도, 중성 길항물질 효능을 보유하면서 c-Kit 및 비만 세포를 활성화시키지 않고 가용성 c-Kit 수용체가 아닌 항체를 제조함으로써 상기 분자들 각각에서의 결함을 해결하고자 하였다. 상기 항체는 또한 적절한 PD/PK를 나타내야 하며, 생체내에서 비만 세포 작동성을 나타내지 않고 비만 세포를 고갈시키는데 효과적이다.
인간화 SR-1 카파 경쇄
서열번호: 1은 SR-1 인간화 카파 경쇄를 암호화하는 핵산을 나타낸다.
Figure 112008080316943-PCT00001
서열번호: 2는 다음과 같으며, 여기서 굵은 활자 유형은 CDR을 나타낸다(예를 들면, CDR1은 서열번호: 2의 43 내지 58번 아미노산이고, CDR2는 서열번호: 2의 74 내지 80번 아미노산이고, CDR3은 서열번호: 2의 113 내지 121번 아미노산이다):
Figure 112008080316943-PCT00002
성숙한 인간화 카파 경쇄는 서열번호: 2의 20 내지 248번 아미노산이다.
인간화 SR-1 비-글라이코-IgG1 중쇄
Figure 112008080316943-PCT00003
CDR은 굵은 활자 유형으로 나타내었다(예를 들면, CDR1은 서열번호: 4의 50 내지 54번 아미노산이고, CDR2는 서열번호: 4의 69 내지 85번 아미노산이고, CDR3은 서열번호: 4의 118 내지 125번 아미노산이다).
Figure 112008080316943-PCT00004
인간화 SR-1 IgG2 중쇄
Figure 112008080316943-PCT00005
다음은 SR-1 IgG2 중쇄의 전장(full length) 아미노산 서열이며, CDR은 굵은 활자 유형으로 나타내었다:
Figure 112008080316943-PCT00006
SR-1 MULC
Figure 112008080316943-PCT00007
CDR은 굵은 활자 유형으로 나타내었다:
Figure 112008080316943-PCT00008
SR-1 muIgG2a 중쇄
Figure 112008080316943-PCT00009
Figure 112008080316943-PCT00010
SR-1의 경쇄 CDR1은 RASESVDIYGNSFMH(서열번호: 8의 44 내지 58번 아미노산)이고, CDR2는 LASNLES(서열번호: 8의 74 내지 80번 아미노산)이고, CDR3은 QQNNEDPYT(서열번호: 8의 111 내지 121번 아미노산)이다. 중쇄 CDR1은 SYNMH(서열번호: 10의 50 내지 54번 아미노산)이고, CDR2는 VIYSGNGDTSYNQKFKG(서열번호: 10의 69 내지 85번 아미노산)이고, CDR3은 RDTRFGN(서열번호: 10의 118 내지 125번 아미노산)이다.
본원에 나타낸 중쇄 및 경쇄는 각각 세포에서 성숙 형태로 진행됨은 물론이다. 따라서, 신호 펩티드가 절단되고, 항체의 중쇄의 경우, C-말단 라이신이 절단된다. 따라서, 성숙 형태는 단백질분해적으로 진행되고, 또한 포유동물 세포에서 발현되는 경우 글라이코실화와 같은 다른 번역후 변형을 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 신호 펩티드는 서열번호: 2 및 10의 1 내지 20번 아미노산, 및 서열번호: 4, 6 및 10의 1 내지 19번 아미노산이다.
뮤린 SR-1의 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열번호:7 및 서열번호: 8로 나타내었다. 뮤린 SR-1의 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열번호: 9 및 서열번호: 10에 나타내었다. 추가의 치환(예를 들면, 뮤린 아미노산의 보존적 치환)을 갖는 변이체도 또한 높은 결합 친화도를 가질 수 있다. CDR 및 골격내의 위치에서 치환, 결실 또는 삽입은 친화도에 영향을 미치지 않고 이루어질 수 있다.
한 태양에서, 인간화 항체는 뮤린 SR-1의 원래 뮤린 CDR, 예를 들면, 서열번호: 8의 대략 44 내지 58번, 대략 74 내지 80번 및 대략 113 내지 121번 위치를 보유하는 경쇄를 포함한다. 다른 태양에서, 인간화 항체는 뮤린 SR-1의 뮤린 CDR, 예를 들면, 서열번호: 10의 대략 50 내지 54번, 대략 68 내지 85번 및 대략 118 내지 125번 위치를 보유하는 중쇄를 포함하고, 인간 유래 골격 영역을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 c-Kit에 대한 친화도가 유지되는 한 2 내지 5개의 아미노산 위치 변화를 포함하는 것이다.
한 태양에서, 상기 약제는 서열번호: 2, 4 또는 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 태양에서, 임의의 상기 약제는 서열번호: 2, 4 또는 6에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 태양에서, 서열번호: 2, 4 또는 6 각각에 대한 서열 변이는, 예를 들면, 그 위치에서 대체 인간 아미노산을 사용하여 IgG의 상응하는 골격 영역의 보존적 치환을 나타낼 수 있다.
한 태양에서, 상기 항체는 표면 플라스몬 공명(비아코어 분석)으로 측정할 때, 10-2 미만, 또는 10-3 미만, 또는 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 미만의 kd를 특징으로 하는 결합력을 나타낸다. 또 다른 태양에서, 전술한 항체는 세포 분석으로 측정할 때, 1 x 10-2 미만, 또는 1 x 10-3 미만, 또는 1 x 10-4, 1 x 10-5, 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8 또는 1 x 10-9 미만의 중성 길항물질 효능 IC50을 나타낸다.
본 발명은, 뮤린 SR-1으로부터 유래되고, 1 x 10-2 이하 범위, 또는 1 x 10-9 이하(예를 들면, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하) 범위의 c-Kit에 대한 Kd(해리율 상수); 및/또는 1 x 10-2 이하 범위, 또는 1 x 10-9 이하(예를 들면, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하) 범위의 c-Kit에 대한 중성 길항물질 IC50; 및/또는 c-Kit 관련 질환의 증상을 경감시키는 능력과 같은 바람직한 특성을 보유하는 인간 또는 인간화 c-Kit 특이적 항체를 포함하는(이로 한정되지는 않음), 다양한 특이적 결합제 및 중성 길항물질 약제를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 특이적 결합제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 재조합 숙주 세포, 상기 특이적 결합제의 제조 방법, 상기 특이적 결합제를 포함하는 약학 제형, 상기 약학 제형의 제조 방법, 및 상기 약학 제형 및 화합물로 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 변형된 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산을 제작하고, CDR-그래프트되거나 인간화된 중쇄를 암호화하는 핵산과 동시-발현시켰으며, 그 반대도 가능하고, 불변 영역에 결합시키거나 결합시키지 않을 수 있다. 적당한 결합 친화도가 유지되는 한 임의의 인간화 또는 키메라 중쇄 및 경쇄를 결합시킬 수 있다. 목적 유전자를 포유동물 세포에 도입하고, 생성된 재조합 면역글로불린 생성물을 발현시키고 정제하고 특성화하였다.
용어 "항체"는 광의로 사용되며, 목적하는 생물 활성을 나타내는 한 상기 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 완전한 항체, 단클론성 항체(인간, 인간화 또는 키메라 항체를 포함함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들면, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일 쇄 항체, 디아바디(diabody))을 포함한다. 용어 "항체"는 명백히 상기 용어의 범위로부터 뮤린 항체(즉, 뮤린 하이브리도마에 의해 생성되거나, 또는 뮤린 하이브리도마에 의해 생성된 항체와 동일 서열을 갖는 항체)를 배제한다.
용어 "특이적 결합제"는 상기 정의한 바와 같은 항체, 및 목적하는 항원-결합 성질을 갖는 CDR로부터 유도된 서열을 함유하는 재조합 펩티드 또는 기타 화합물을 포함한다. 상기 용어에는 특히, 바람직하게는 중쇄 CDR3를 포함하여 뮤린 SR-1의 하나 이상의 CDR과 적어도 80%, 90% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 펩티드가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중성 길항물질"은 작용물질 활성을 억제할 수 있는 특이적 결합제를 의미하는 것이다. 이들 약제로는 상기 정의한 바와 같은 항체, 및 목적하는 항원-결합성을 갖는 CDR로부터 유도된 서열을 함유하는 재조합 펩티드 또는 다른 화합물이 포함된다. 상기 용어에는 특히, 바람직하게는 중쇄 CDR3을 포함하여 뮤린 SR-1의 하나 이상의 CDR과 적어도 80%, 90% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 펩티드가 포함된다.
상기 용어에는 또한, 하나 이상의 항원-결합 펩티드에 부착된 "비히클"로서 항체 Fc 도메인을 포함하는 분자인 "펩티바디(peptibody)"가 포함된다. SR-1 항체로부터의 항체 CDR은, 특히 중쇄의 CDR3을 포함하여 펩티바디에 혼입되기에 적합할 수 있다. 펩티바디의 생성은 일반적으로 2000년 5월 4일자로 공개된 국제특허출원 공개 제 WO 00/24782 호에 기술되어 있다. 펩티드는 링커의 존재 또는 부재하에 세로로 일렬로(즉, 순차적으로) 결합될 수 있다. 시스테이닐 잔기를 함유하는 펩티드는 또 다른 Cys-함유 펩티드와 가교-결합될 수 있으며, 이들중 하나 또는 둘 다는 비히클에 결합될 수 있다. 하나보다 많은 Cys 잔기를 갖는 임의의 펩티드는 또한 펩티드내 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 임의의 상기 펩티드는 유도체화될 수 있다, 예를 들면, 카복실 말단이 아미노기로 캡핑될 수 있거나, 시스테인이 캡핑될 수 있거나, 또는 아미노산 잔기가 아미노산 잔기가 아닌 다른 잔기로 캡핑될 수 있다(예를 들면, 본원에 그대로 참고로 인용된 문헌 [Bhatnagar et al., J. Med. Chem., 39:3814-3819, 1996; and Cuthbertson et al., J. Med. Chem., 40:2876-2882, 1997] 참조). 펩티드 서열은 항체에 대한 친화도 증진과 유사하게 최적화되거나, 또는 알라닌 스캐닝 또는 무작위 또는 지정 돌연변이에 의해 변형된 후 가장 우수한 결합제를 확인하기 위해 선별될 수 있다[Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26:401-424, 1997].
특이적 결합제의 바람직한 활성을 유지하면서, 다양한 분자가, 예를 들면, 펩티드 위치 자체내에서 또는 특이적 결합제의 펩티드와 비히클 위치 사이에서 특이적 결합제 구조내에 삽입될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인 또는 그의 단편과 같은 분자, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 다른 관련 분자, 예를 들면, 덱스트란, 지방산, 지질, 콜레스테롤기, 소(small) 탄수화물, 펩티드, 세포독성제, 화학치료제, 본원에 기술된 바와 같은 검출가능한 잔기(형광제, 방사성표지, 예를 들면, 방사성동위원소 포함), 올리고사카라이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 간섭(또는 기타) RNA, 효소, 호르몬 등을 용이하게 삽입할 수 있다. 상기 방식으로 삽입하기에 적당한 다른 분자는 당해 분야에 숙련된 자에게 인식될 것이며, 본 발명의 범위에 포함된다. 여기에는, 예를 들면, 적당한 링커에 의해 결합되거나 결합되지 않은 두 개의 보존성 아미노산 사이에 바람직한 분자의 삽입이 포함된다.
"분리된" 항체는 확인되고 상기 항체를 발현한 세포의 성분으로부터 분리된 항체이다. 세포의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 태양에서, 항체는 (1) 항체의 95 중량% 이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상으로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는, 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 동질한 정도까지 정제될 것이다. 분리된 천연 항체는, 항체의 천연 환경중 하나 이상의 요소가 존재하지 않을 것이므로 재조합 세포내의 원위치에 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 분리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체 개체군으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 개체군을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 매우 특이적으로, 전형적으로, 상이한 에피토프에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 개개 항원 부위 또는 에피토프에 대해 유도된다.
인간 면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5 가지 주 부류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개는 아형 또는 아이소타입, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 형태는 공지되어 있다. 상이한 아이소타입은 상이한 작동체 기능을 갖는다; 예를 들면, IgG1 및 IgG3 아이소타입은 ADCC 활성을 갖는다.
용어 "초가변성" 영역은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변성 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로부터의 아미노산 잔기를 포함한다(즉, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md., 1991]에 기술된 바와 같이, 경쇄 가변 영역중 잔기 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3) 및 중쇄 가변 영역중 31 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3)). CDR 전체를 함유하는 전체 항원 결합 부위보다 낮은 친화도를 갖긴 하지만, 단일 CDR도 항원을 인식하고 결합할 수 있다. 항체의 CDR은, 항체가 표적 분자에 결합하는 능력을 보유하는 한, 상기 언급한 한계 밖의 추가의 또는 보다 소수의 서열을 포함할 수 있다.
초가변성 "루프"로부터의 잔기의 대안적 정의는 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987]에 경쇄 가변 영역의 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3) 및 중쇄 가변 영역의 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3)로서 기술되어 있다.
"골격" 또는 FR 잔기는 초가변성 영역 잔기 이외의 다른 가변 영역 잔기이다.
"항체 단편"은 완전한 전장 항체의 일부분, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체[Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062, 1995]; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이적 항체가 포함된다.
항체의 파파인 절단은 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 불변 영역을 함유하는 나머지 "Fc" 단편을 생성한다. Fab 단편은 가변 영역 전체, 및 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제 1 불변 영역(CH1)을 함유한다. Fc 단편은 탄수화물을 발현하며, 항체의 부류를 구별하는 많은 항체 작동체 기능(예를 들면, 결합 보체 및 세포 수용체)을 담당한다.
펩신 처리는 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는 2개의 "단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 생성하며, 이때 상기 영역은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역(hinge region)으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 영역의 카복시 말단에서 소수의 추가 잔기의 혼입에 의해 Fab' 단편과 상이하다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는, Fv가 항원 결합에 바람직한 구조를 생성하도록 할 수 있는, VH 및 VL 영역 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 고찰은 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.1 13, Resenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994]을 참조하시오.
"Fv"는 완전 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 견고한 비-공유 결합으로 하나의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 이량체로 이루어진다. 상기 형태에서 각 가변 영역의 3개의 CDR은 상호작용하여 VHVL 이량체의 표면상에 항원 결합 부위를 한정한다. 망라하여, 6개의 CDR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 제공한다. 그러나, 단일 가변 영역(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소 항체 단편을 말하며, 상기 단편은 동일 폴리펩티드 쇄(VHVL)중 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 동일 쇄 상의 두 영역 사이에 짝을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 상기 영역들을 또 다른 쇄의 상보성 영역과 짝을 이루게하고 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들면, 유럽 특허 제 404,097 호; 국제특허출원 공개 제 WO 93/11161 호; 및 문헌 [30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, 1993]에 보다 상세히 기술되어 있다.
항체 단편의 제조를 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 완전한 항체의 단백질분해 절단에 의해 유도되었으나, 또한 재조합 숙주 세포에 의해서 직접 생성될 수도 있다(예를 들면, 문헌 [Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988; Skerra et al., Science, 240:1038-1041, 1988; Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167, 1992] 참조).
본원에 나타낸 바와 같이, 염증, 자가면역, 종양 및 섬유증 질환을 치료하는 조성물 및 방법은 단독으로 또는 목적 효과를 달성하기 위한 다른 치료제와 함께 사용되는 하나 이상의 항-c-Kit 치료제를 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 적당한 전형적인 항-섬유성 약제로는 사이토카인이 포함되며, 이때 사이토카인은 형질전환 성장 인자 β(TGF-β), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨-13(IL-13), 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-1 베타(IL-1β), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 인터류킨-6(IL-6), 온코스타틴 M(OSM), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 단핵구 주화성 단백질 1(CCL2/MCP-1), 및 폐 및 활성화-조절 케모카인(CCL18/PARC)으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 SR-1으로부터 유도된 항체는 바람직하게는 당해 분야에 공지된 항체 발현 시스템 중 하나를 이용하는 재조합 DNA 방법에 의해 제조된다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 상기 항체는 또한 바람직하게는 면역글로불린 유래 가변 서열 및 인간 불변 영역을 갖는 키메라 융합 단백질이거나, 또는 보다 바람직하게는 인간 항체 잔기를 포함하지만 바람직하게는 적어도 뮤린 SR-1의 CDR을 보유하는 보다 인간-유사 단클론성 항체(예를 들면, 인간 또는 인간화 항체)이다. 완전한 전장 분자 이외에, 용어 "항체"는 또한 그의 단편, 또는 완전한 분자 및/또는 c-Kit에 결합하는 단편의 다량체 또는 응집체를 말한다.
"인간화 항체"란 어구는 비-인간 항체, 전형적으로는 마우스 단클론성 항체로부터 유도된 항체를 말한다. 또는, 인간화 항체는, 비-인간 모 항체의 항원 결합성을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만 인간에 투여할 때 모 항체에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 키메라 항체로부터 유도될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체"란 어구는 전형적으로 상이한 종으로부터 유래된 2개의 상이한 항체(예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567 호 참조)로부터 유도된 서열을 함유하는 항체를 말한다. 보다 전형적으로, 키메라 항체는 인간 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 영역 및 마우스 가변 영역을 포함한다.
항체의 재조합 생성
문제의 면역글로불린의 아미노산 서열은 직접 단백질 서열화에 의해 결정될 수 있으며, 적당한 암호화 뉴클레오티드 서열은 일반 코돈 표에 따라 설계될 수 있다.
또는, 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 하이브리도마 세포로부터 분리되고 서열화될 수 있다. 서열 결정은 일반적으로 문제의 유전자 또는 cDNA의 적어도 일부분의 분리를 요할 것이다. 통상적으로, 이것은 단클론성 항체를 암호화하는 DNA, 또는 바람직하게는 mRNA(즉, cDNA)의 클로닝을 요한다. 클로닝은 표준 기술(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 1989] 참조)을 이용하여 수행된다. 예를 들면, 폴리A + mRNA, 바람직하게는 막-결합 mRNA의 역 전사에 의해 cDNA 라이브러리를 구축할 수 있으며, 상기 라이브러리는 인간 면역글로불린 폴리펩티드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 이용하여 검색한다. 그러나, 바람직한 태양에서, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 문제의 면역글로불린 유전자 절편(예를 들면, 경쇄 가변 절편)을 암호화하는 cDNA(또는 전장 cDNA의 일부)를 증폭시킨다. 증폭된 서열은 임의의 적당한 벡터, 예를 들면, 발현 벡터, 미니유전자 벡터 또는 파아지 디스플레이 벡터내에 용이하게 클로닝될 수 있다. 문제의 면역글로불린 폴리펩티드의 일부분의 서열을 결정할 수 있는 한, 사용된 특정 클로닝 방법은 중요하지 않음을 인식할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "분리된" 핵산 분자 또는 "분리된" 핵산 서열은, (1) 동정되고 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 그와 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 분리되거나, 또는 (2) 클로닝되거나 증폭되거나 표지화되거나, 또는 문제의 핵산의 서열이 결정될 수 있도록 배경 핵산과 구별된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경으로 존재하는 것이 아닌 것이다. 그러나, 분리된 핵산 분자는, 예를 들면, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 항체를 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
클로닝 및 서열화에 사용되는 RNA의 한 공급원은 유전자전이 마우스로부터 B 세포를 수득하고 B 세포를 불멸 세포에 융합함으로써 생성된 하이브리도마이다. 하이브리도마를 이용하는 이점은 이들을 용이하게 선별할 수 있으며, 문제의 인간 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택할 수 있다는 것이다. 또는, RNA는 면역화된 동물의 B 세포(또는 전체 비장)로부터 분리할 수 있다. 하이브리도마 이외의 공급원을 이용하는 경우, 특이적 결합 특성을 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 선별하는 한가지 방법은 파아지 디스플레이 기술을 사용하는 것이다. 파아지 디스플레이는, 예를 들면, 각각 본원에 참고로 인용된 다우어(Dower) 등의 국제특허출원 공개 제 WO 91/17271 호, 맥카퍼티(McCafferty) 등의 국제특허출원 공개 제 WO 92/01047 호, 및 문헌 [Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454, 1990]에 기술되어 있다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하는 한 태양에서, 면역화된 유전자전이 마우스(예를 들면, 전체 비장 cDNA)로부터 cDNA를 분리하고, 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 면역글로불린 폴리펩티드의 일부, 예를 들면, CDR 영역을 암호화하는 cDNA 서열을 증폭시키고, 증폭된 서열을 파아지 벡터에 삽입시킨다. 문제의 펩티드, 예를 들면, 목적하는 결합 특성을 갖는 가변 영역 펩티드를 암호화하는 cDNA를 패닝(panning)과 같은 표준 기술에 의해 동정한다.
이어서, 증폭되거나 클로닝된 핵산의 서열을 결정한다. 전형적으로, 면역글로불린 폴리펩티드의 전체 가변 영역을 암호화하는 서열을 결정하지만, 때때로 가변 영역의 일부, 예를 들면, CDR-암호화 부분만을 서열화하는 것이 적절하다. 전형적으로, 서열화된 부분은 길이가 30개 이상의 염기이고, 보다 흔히는 가변 영역 길이의 약 1/3 이상 또는 약 1/2 이상을 암호화하는 염기를 서열화한다.
서열화는 cDNA 라이브러리로부터 분리된 클론상에서 수행될 수 있거나, 또는 PCR을 이용하는 경우, 증폭 서열을 서브클로닝한 후 또는 증폭된 절편의 직접 PCR 서열화에 의해 수행될 수 있다. 서열화는 표준 기술(예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 1989; and Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, 1977] 참조)을 이용하여 수행된다. 클로닝된 핵산의 서열을 인간 면역글로불린 유전자 및 cDNA의 공개된 서열과 비교함으로써, 전문가라면 서열화된 영역에 따라서, (i) 하이브리도마 면역글로불린 폴리펩티드(중쇄의 아이소타입을 포함함)의 생식선 절편 사용, 및 (ii) N-영역 부가 및 체세포 돌연변이 과정으로부터 생성된 서열을 포함하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 면역글로불린 유전자 서열 정보의 한 공급원은 미국 메릴랜드주 베데스다의 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information), 국립 의학 도서관(National Library of Medicine), 국립 보건원(National Institutes of Health)이다.
일단 분리되면, DNA는 발현 조절 서열에 작용가능하게 연결되거나 발현 벡터내에 배치될 수 있으며, 이어서 이. 콜라이(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(COH) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 유도한다. 항체의 재조합 생성은 당해 분야에 공지되어 있다.
발현 조절 서열은 특정 숙주 유기체에서 작용가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 말한다. 원핵세포에 적당한 조절 서열로는, 예를 들면, 프로모터, 선택적으로 작동체 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증진제를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능성 관계로 배치될 때 작용가능하게 결합된다. 예를 들면, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작용가능하게 결합되거나; 프로모터 또는 증진제는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 결합되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작용가능하게 결합된다. 일반적으로, 작용가능하게 결합된다는 것은 결합되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우 인접해 있고 판독 단계에 있음을 의미한다. 결합은 통상적인 제한효소 부위에서의 접합에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
세포, 세포주 및 세포 배양액은 흔히 상호교환적으로 사용되며, 본원에서 상기 표현은 모두 자손을 포함한다. 형질전환체 및 형질전환된 세포는 1차 대상 세포, 및 전이 횟수에 무관하게 그로부터 유도된 배양액을 포함한다. 또한, 모든 자손은 계획되거나 우연적인 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정밀하게 동일하지 않을 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
본 발명은 또한 숙주 세포에 의해 인식되는 대조 서열에 작용가능하게 결합되거나 결합되지 않은, 본 발명의 특이적 결합제 또는 항체를 암호화하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 배양액 또는 배양 배지로부터 특이적 결합제 또는 항체를 회수하거나 회수하지 않는 것을 포함할 수 있는, 특이적 결합제 또는 항체의 재조합 제조 기술을 제공한다.
많은 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 벡터 성분은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 단일 서열(예를 들면, 특이적 결합제 또는 항체의 직접 분비일 수 있다), 복제기점, 하나 이상의 선택적 마커 유전자(예를 들면, 항생물질 또는 다른 약물 내성, 보체 영양 결핍을 제공하거나 또는 배지에서 이용될 수 없는 필수 영양소를 공급할 수 있다), 증진제 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열(이들은 모두 당해 분야에 공지되어 있다).
적당한 숙주 세포로는 원핵세포, 효모 또는 전술한 고등 진핵세포가 포함된다. 이에 적합한 원핵세포로는 진정세균(eubacteria), 예를 들면, 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬젤라(Shigella), 및 바실러스(Bacillus), 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. subilis) 및 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 원핵세포 이외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 특이적 결합제-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 보편적인 제빵용 효모가 하등한 원핵세포 숙주 미생물중에서 가장 보편적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들면, 피치아(Pichia), 예를 들어, 피치아 파스토리스(P. pastoris), 쉬조사카로마이세스 폼(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia); 캔디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들면, 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(S. occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 아스퍼질러스 니듈란스(A. nidulans) 및 아스퍼질러스 니거(A. niger)도 통상적으로 사용가능하고 본 발명에서 유용하다.
글라이코실화 특이적 결합제 또는 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(모충), 이집트 숲모기(Aedes aegypti)(모기), 흰줄 숲모기(Aedes albopictus)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(과실파리) 및 누에나방(Bombyx mori)과 같은 숙주로부터 많은 배큘로바이러스(baculovirus) 균주 및 변이주 및 상응하는 증식허용(permissive) 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 상기 세포의 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) NPV 및 누에나방 NPV의 Bm-5 균주가 공공연히 이용가능하다.
그러나, 척추동물 세포에서 관심이 가장 많았으며, 배양(조직 배양)시 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 CHOK1 세포(ATCC CCL61), DXB-11, DG-44 및 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR을 포함한 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]); SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양시 성장을 위해 서브클로닝된 인간 배아 신장 세포주 293 또는 293 세포[Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59, 1977]; 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(TM4, [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 초록원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68, 1982]; MRC 5 세포 또는 FS4 세포이다.
숙주 세포는 특이적 결합제 또는 항체 생성을 위해 전술한 핵산 또는 벡터로 형질전환되거나 형질감염되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 또한, 선택적 마커에 의해 분리된 전사 단위의 다중 복사체를 갖는 신규 벡터 및 형질감염 세포주가 특이적 결합제 또는 항체의 발현에 특히 유용하며 바람직하다.
본 발명의 특이적 결합제 또는 항체를 생성하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄(Ham's) F10(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM)(시그마), RPMI-1640(시그마) 및 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)(시그마)와 같은 상업적으로 시판하는 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58:44, 1979; Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255, 1980], 미국 특허 제 4,767,704 호, 제 4,657,866 호, 제 4,927,762 호, 제 4,560,655 호 또는 제 5,122,469 호; 국제특허출원 공개 제 WO 90103430 호 또는 제 WO 87/00195 호; 또는 미국 특허 등록 제 30,985 호에 기술된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 이들 배지중 임의의 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장인자), 염(예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예를 들면, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생물질(예를 들면, 젠타마이신(Gentamycin, 등록상표) 약물), 미량 원소(최종 농축물에 마이크로몰 농도 범위로 통상적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의된다), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충제도 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이미 사용된 것이며 통상적인 전문가에게 명백할 것이다. 적절한 각각의 경쇄 및 중쇄 쌍을 함유하는, 미국 특허출원 제 20030082735 호에 기술된 바와 같은 발현 벡터 pDC323 및 pDC324를 CS9 숙주 세포주내로 형질감염시켰다.
숙주 세포를 배양시, 특이적 결합제 또는 항체는 세포내로, 세포질주변 공간에서 생성되거나, 또는 배지내로 직접 분비될 수 있다. 특이적 결합제 또는 항체가 세포내로 생성되는 경우, 제 1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편들의 미립상 잔사를, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다.
특이적 결합제 또는 항체 조성물은, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는 친화성 리간드로서 문제의 항원 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기본으로 하는 특이적 결합제 또는 항체를 정제할 수 있다[Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13, 1983]. 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입 및 인간 γ3에 권장된다[Guss et al., EMBO J., 5:1567-1571, 1986]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이나, 다른 매트릭스도 이용할 수 있다. 조절 공극 유리 또는 폴리(스타이렌다이비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 빠른 유량 및 짧은 처리 시간을 가능케 한다. 특이적 결합제 또는 항체가 CH3 영역을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX(등록상표) 수지(제이.티. 베이커(J.T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들면, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전도 회수될 특이적 결합제 또는 항체에 따라 또한 가능하다.
키메라 및 인간화 항체
설치류 단클론성 항체의 가변 Ig 영역이 인간 불변 Ig 영역에 융합된 키메라 단클론성 항체는 당해 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 생성할 수 있다(문헌 [Morrison, S.L., et al., Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6841-6855, 1984; and Boulianne, G.L., et al., Nature 312, 643-646, 1984] 참조). 일부 키메라성 단클론성 항체는 인간에서 덜 면역성인 것으로 입증되었지만, 설치류 가변 Ig 영역은 여전히 상당한 인간 항-설치류 반응을 유도할 수 있다.
인간화 항체는, 예를 들면, 다음을 포함하여 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다: (1) 인간 골격 및 불변 영역상에 비-인간 상보성 결정 영역(CDR)의 그래프팅(당해 분야에서 "CDR 그래프팅"을 통한 인간화로 지칭되는 방법), 또는 (2) 표면 잔사의 치환에 의해 인간-유사 표면으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것이 아닌, 전체 비-인간 가변 영역의 이식(당해 분야에서 "버니어링(veneering)"으로 불리는 방법). 이들 방법은, 예를 들면, 각각 본원에 참고로 인용된 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; Padlan, Molec. Immunol., 31(3):169-217, 1994; and Kettleborough, C.A., et al., Protein Eng., 4(7):773-783, 1991]에 기술되어 있다.
특히, 인간에서 단독으로 또는 결합체로서 반복적 생체내 투여시 설치류 항체는 설치류 항체에 대한 수용체에서의 면역 반응, 소위 HAMA 반응(인간 항 마우스 항체)을 야기할 것이다. HAMA 반응은 반복 투여가 필요한 경우 약제의 효과를 제한할 수 있다. 항체의 면역원성은 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜로 항체를 화학적으로 변형시킴으로써, 또는 항체 결합 구조를 보다 인간과 유사하게 만들기 위한 유전공학적 방법을 이용하여 감소시킬 수 있다.
CDR 그래프팅은 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 Ig 영역으로부터 6개의 CDR중 하나 이상을 인간 가변 Ig 영역의 적절한 골격 영역내로 도입하는 것을 포함한다. 상기 기술[Riechmann, L., et al., Nature, 332, 323, 1988]은 항원과 1차 접촉하는 CDR 루프를 지지하기 위한 뼈대로서 보존된 골격 영역(FR1-FR4)을 이용한다. 그러나, CDR 그래프팅의 심각한 단점은, 골격 영역의 아미노산이 항원 결합에 기여할 수 있고 CDR 루프의 아미노산이 2개의 가변 Ig 영역의 결합에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 원래 마우스 항체보다 실질적으로 낮은 결합 친화도를 갖는 인간화 항체를 야기할 수 있다는 것이다. 키메라 SR-1 항체는 세포 기준 분석에서 적절한 작용 효능을 나타내지 않았다.
인간화 단클론성 항체의 친화도를 유지하기 위해, 원래 마우스 항체의 골격 영역과 가장 근접하게 유사한 인간 골격 영역을 선택함으로써, 및 항원 결합 부위의 컴퓨터 모델링에 의해 골격 또는 CDR 내의 단일 아미노산의 부위-지향 돌연변이유발에 의해 CDR 그래프팅 기술을 개선할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Co, M.S., et al., J. Immunol., 152, 2968-2976, 1994] 참조).
항체를 인간화시키는 한 방법은 비-인간 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 서열로 정렬시키고, 비-인간 골격을 상기 정렬을 기준으로 인간 골격으로 대체하고, 인간화 서열의 구조를 예상하기 위한 분자 모델링을 행하고, 모 항체의 구조와 비교하는 것을 포함한다. 상기 공정 이후에 인간화 서열 모델의 예상된 구조가 비-인간 모 항체의 비-인간 CDR의 구조와 근사하게 근접할 때까지 CDR의 구조를 파괴하는 CDR 영역내 잔기의 반복된 역 돌연변이가 이어진다. 상기 인간화 항체는, 예를 들면, 애쉬웰(Ashwell) 수용체를 거쳐, 흡수 및 제거를 촉진하기 위해 더 유도체화될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 5,530,101 및 5,585,089 호 참조).
합리적 설계에 의한 마우스 단클론성 항체의 많은 인간화가 보고되었다(예를 들면, 2002년 7월 11일자로 공개된 특허출원 공개 제20020091240 호, 국제특허출원 공개 제 WO 92/11018 호, 및 미국 특허 제 5,693,762 호 및 제 5,766,866 호 참조). 항체의 인간 공학은 또한 스터드니카(Studnicka) 등의 미국 특허 제 5,766,886 호; 문헌 [Studincka et al., Protein Engineering 7:805-814, 1994]에 기술되어 있다.
항체 변이체의 생성
목적하는 특이적 결합제 또는 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 암호화 DNA에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변이체로는, 예를 들면, 특이적 결합제 또는 항체의 아미노산 서열내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구조물을 달성하도록 이루어질 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특징을 갖는다. 아미노산 변화는 또한, 예를 들면, 글라이코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 등 특이적 결합제 또는 인간화 또는 변이 항체의 번역후 과정을 변화시킬 수 있다.
특이적 결합제 또는 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법으로는 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-지향) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 특이적 결합제 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체의 카세트 돌연변이유발이 포함된다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 특이적 결합제 또는 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085, 1989]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기를 확인하고(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미치는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 페닐알라닌)으로 치환시킨다. 이어서, 치환 부위에서 또는 치환 부위를 향해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 치환에 대해 작용적 민감성을 나타내는 아미노산 위치들을 처리한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이의 성질 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 알라닌 스캐닝 또는 불규칙 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 변이체를 목적하는 활성에 대해 선별한다.
통상적으로, 특이적 결합제 또는 항체의 아미노산 서열 변이체는 중쇄 또는 경쇄의 원래 특이적 결합제 또는 항체(뮤린 또는 인간화) 아미노산 서열과, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함하여, 60% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 65% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 본원에서, 서열을 정렬하고, 경우에 따라 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위한 간극을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환(하기 표 1에 정의된 바와 같이)을 고려하지 않고, 원래 서열과 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 특이적 결합제 또는 항체 서열내로 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 간주되지 않아야 한다. 따라서, 서열 동일성은 두 폴리펩티드의 아미노산들의 위치에서의 유사성을 비교하기 위해 통상적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 블라스트(BLAST) 또는 파스타(FASTA)와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 그 각각의 아미노산의 최적 정합을 위해 두 폴리펩티드를 정렬한다(하나 또는 두 서열 모두의 전체 길이를 따라서 또는 하나 또는 두 서열 모두의 미리 결정된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디폴트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디폴트 갭 패널티(default gap penalty)를 제공하며, PAM 250(표준 점수 행렬; 문헌 [Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3, 1978] 참조)과 같은 점수 행렬을 컴퓨터 프로그램과 함께 이용할 수 있다. 예를 들면, 이어서, 동일성 퍼센트를, 동일한 짝의 총 수에 100을 곱한 후 짝을 이룬 거리내의 더 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 더 긴 서열내에 도입된 간극의 수의 합으로 나누는 것으로 계산할 수 있다.
삽입
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 특이적 결합제 또는 항체, 또는 에피토프 표지 또는 재생(salvage) 수용체 에피토프에 융합된 특이적 결합제 또는 항체(항체 단편 포함)가 포함된다. 특이적 결합제 또는 항체 분자의 다른 삽입 변이체로는, 예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서 특이적 결합제 또는 항체의 혈청내 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합이 포함된다.
에피토프 표지의 예로는 flu HA 표지 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165, 1988]; c-myc 표지 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10 항체[Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5(12), 3610-3616, 1985]; 및 단순포진 바이러스 당단백질 D(gD) 표지 및 그의 항체[Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553, 1990]가 포함된다. 다른 예시적인 표지는 니켈 킬레이트화를 이용하여 표지된 화합물의 분리를 허용하는, 일반적으로 6개 히스티딘 잔기 주위의 폴리-히스티딘 서열이다. 다른 표식 및 표지, 예를 들어, 플래그(FLAG, 등록상표) 표지(이스트만 코닥(Eastman Kodak), 뉴욕주 로체스터)도 공지되어 있으며, 당해 분야에서 통상적으로 사용된다.
용어 "재생 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 도메인의 에피토프를 말한다.
치환
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 제거되는 특정 결합제 또는 항체 분자중 하나 이상의 아미노산 잔기 및 그 자리에서 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 임의의 초가변 또는 CDR 영역 또는 골격 영역내의 치환성 돌연변이유발도 고려된다. 보존적 치환은 표 1에 나타내었다. 가장 보존적인 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 나타내었다. 상기 치환이 생물 활성의 어떤 변화도 야기하지 않는다면, 표 1에서 "전형적 치환"으로 나타내거나, 또는 아미노산 부류와 관련하여 하기에 더 기술되는 바와 같은 보다 많은 변화가 도입될 수 있고 생성물을 선별할 수 있다.
원래 잔기 전형적 바람직한 잔기 치환
Ala(A) val; leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; asp; lys; gln arg
Asp(D) glu; asn glu
Cys(C) ser; ala ser
Gln(Q) asn; glu asn
Glu(E) asp; glu asp
Gly(G) ala
His(H) asn; gln; lys; arg
Ile(I) leu; val; met; ala; phe leu norleucine
Leu(L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr
Pro(P) ala
Ser(S) thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu
특이적 결합제 또는 항체의 생물학적 성질의 실질적인 변화는, (a) 예를 들면, 시트 또는 나선 구조로서, 치환 영역내 폴리펩티드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 데 있어 그의 효과와 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기준으로 군으로 나뉜다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기; gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
보존적 치환은 아미노산을 그 부류의 또 다른 구성원으로 치환시킴을 포함한다. 비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 치환시킴을 포함한다.
특이적 결합제, 또는 인간화 또는 변이체 항체의 적절한 구조를 유지하는데 포함되지 않는 임의의 시스테인 잔기도 또한 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화적 안정성을 개선하고 비정상적 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 특이적 결합제 또는 항체에 부가되어 그의 안정성을 개선할 수 있다(특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
친화도 증진
친화도 증진은 모 특이적 결합제 또는 항체의 CDR 내에 돌연변이(결실, 삽입 또는 치환)를 갖는 특이적 결합제 또는 항체를 제조하고 선별하고, 모 특이적 결합제 또는 항체에 비해 결합 친화도와 같은 개선된 생물학적 성질을 갖는 변이체를 선택함을 포함한다. 상기 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파아지 디스플레이를 이용한 친화도 증진이다. 간략하게, 여러 초변이 영역 부위(예를 들면, 6 내지 7 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 상기와 같이 생성된 특이적 결합제 또는 항체 변이체는 각 입자내에 포장된 M13의 유전자 III 생성물에 융합체로서 필라멘트성 파아지 입자로부터 1가의 방식으로 발현될 수 있다. 이어서, 파아지-디스플레이 변이체를 그의 생물 활성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 선별한다.
알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 결정적으로 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 대안적으로, 또는 그 외에, 특이적 결합제 또는 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 일단 상기 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기술된 바와 같이 선별에 적용하고, 하나 이상의 적절한 분석에서 우수한 성질을 갖는 특이적 결합제 또는 항체를 추가의 개발을 위해 선별할 수 있다.
목적 활성을 갖는 특이적 결합제 또는 항체 변이체를 제조하고 선별하기 위해 유전자 혼합(gene shuffling) 및 유도 진화(directed evolution)를 이용하는 기술도 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Jermutus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UAS, 98(1):75-80, 2001 Jan 2]은 리보솜 디스플레이를 기초로 하는 개량된 시험관내 선별 방법을 DNA 혼합에 의해 시험관내 다양화와 결부시켜 단일쇄 Fv 항체 단편(scFv)의 소멸률(off-rate) 또는 열역학적 안정성을 개선시켰음을 보고하고 있으며; 문헌 [Fermer et al., Tumour Biol. 25(1-2):7-13, 2004 Jan-Apr, 25]은 DNA 혼합과 함께 파아지 디스플레이를 이용하여 친화도를 거의 3배 상승시켰음을 보고하고 있다.
변형된 글라이코실화
예를 들면, 특이적 결합제 또는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고/시키거나 특이적 결합제 또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글라이코실화 부위를 부가하여, 모 특이적 결합제 또는 항체에 비해 변형된 글라이코실화 패턴을 갖는 특이적 결합제 또는 항체 변이체도 또한 생성될 수 있다.
항체를 포함한 폴리펩티드의 글라이코실화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합된다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기의 부착을 말한다. 트라이펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소 부착에 대한 인식 서열이다. 폴리펩티드중 상기 트라이펩티드 서열의 존재는 잠재적 글라이코실화 부위를 생성한다. 따라서, 하나 이상의 상기 트라이펩티드 서열을 함유하도록 아미노산을 변화시킴으로써 N-결합된 글라이코실화 부위를 특이적 결합제 또는 항체에 부가시킬 수 있다. O-결합 글라이코실화는 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌(5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 또한 사용할 수 있다)에 당인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스중 하나의 부착을 말한다. 원래의 특이적 결합제 또는 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 삽입하거나 치환함으로써 O-결합 글라이코실화 부위를 특이적 결합제 또는 항체에 부가할 수 있다.
다른 변형
시스테인 잔기(들)을 Fc 도메인에서 제거하거나 도입하여, 상기 영역에서 쇄간 다이설파이드 결합 형성을 제거하거나 증가시킬 수 있다. 상기와 같이 생성된 동종이량체(homodimeric) 특이적 결합제 또는 항체는 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 개선시켰을 수도 있다(문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195, 1192; and Shopes, B.J., Immunol., 148:2918-2922, 1992] 참조). 동종이량체 특이적 결합제 또는 항체는 또한 문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565, 1993]에 기술된 바와 같이 헤테로이작용성 가교결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 또는, 이중 Fc 도메인을 갖는 특이적 결합제 또는 항체를 처리하여, 보체 라이신 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있었다(문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230, 1989] 참조).
CDR내 서열은 항체가 MHC 부류 II에 결합되게 할 수 있고 원치 않는 헬퍼 T-세포 반응을 유발할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 보존적 치환은 특이적 결합제 또는 항체가 결합 활성을 보유하도록 할 수 있지만, 원치 않는 T-세포 반응을 유발하는 능력을 감소시킬 수 있다.
중쇄 또는 경쇄의 N-말단 20개 아미노산중 하나 이상을 제거하는 것도 또한 고려된다.
예를 들면, 재생 수용체 결합 에피토프의 혼입 또는 부가(예를 들면, 적절한 영역의 돌연변이에 의해, 또는 에피토프를 펩티드 표지내에 혼입한 후 상기 표지를 특이적 결합제 또는 항체에 어느 한 쪽 말단에서 또는 중앙에서, 예를 들면, DNA 또는 펩티드 합성에 의해 융합시킴으로써)(예를 들면, 국제특허출원 공개 제 WO 96/32478 호 참조)에 의해, 또는 PEG와 같은 분자 또는 폴리사카라이드 중합체를 포함하여 다른 수용성 중합체를 부가함으로써 혈청 반감기를 증가시키기 위한 변형도 또한 바람직할 수 있다.
재생 수용체 결합 에피토프는 바람직하게는 Fc 도메인의 1 또는 2개의 루프로부터 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기가 특이적 결합제 또는 항체 또는 단편의 유사한 위치로 전이되는 영역을 구성한다. 훨씬 더 바람직하게는, Fc 도메인의 1 또는 2개의 루프로부터 3개 이상의 잔기가 전이된다. 보다 더 바람직하게는, 에피토프는 Fc 도메인(예를 들면, IgG의)의 CH2 영역으로부터 취해지며, 특이적 결합제 또는 항체의 CH1, CH3 또는 VH 영역 또는 하나보다 많은 상기 영역으로 전이된다. 또는, 에피토프는 Fc 도메인의 CH2 영역으로부터 취해져서 특이적 결합제 또는 항체 단편의 CL 영역 또는 VL 영역으로 전이된다. 또한, Fc 변이체 및 재생 수용체와 그의 상호작용을 기술하고 있는 국제특허출원 공개 제 WO 97/34631 호 및 제 WO 96/32478 호를 참조한다.
생체내에서 IgG 항상성의 조절은 FcRn에 대한 그의 결합에 의존한다. IgG의 Fc 도메인과 FcRn 사이의 상호작용의 변형은 단클론성 항체의 혈청 반감기를 개선시키는 것으로 보고되었다. 신생아 Fc 수용체 FcRn에 대한 보다 고 친화도 결합 및 분해 지연 및 PK 프로필 개선을 야기하는 Fc에서의 돌연변이가 바람직하다. IgG 상에서의 FcRn 결합 부위는 CH2-CH3 영역 계면에 위치한다. 상기 영역에서 잔기의 돌연변이(M428L 및 T250Q/M428L, T250Q/M428L, P257I/Q311I, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F/Y436H, 또는 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H)는 pH 6.0 및 pH 7.3에서 인간 FcRn에 대한 IgG1의 증가된 친화도를 야기한다. 또한, 이들 돌연변이의 일부는 원숭이에게 정맥내 투여시 증대된 약물동력학적 성질(보다 느린 제거율, 보다 긴 반감기)을 야기하였다.
보체 의존성 세포독성(CDC), 예를 들면, C1q 결합 부위 및/또는 항체-의존성 세포독성(ADCC)의 원인이 되는 불변 영역의 다른 부위가 확인되었다(예를 들면, 본원에 그대로 참고로 인용된 문헌 [Molec. Immunol., 29(5):633-639, 1992; Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604, 2001] 참조). Fc 수용체 결합 부위내 잔기의 돌연변이는 변화된(즉, 증가되거나 감소된) 작동체 기능, 예를 들면, 변화된 ADCC 또는 CDC 활성, 또는 변화된 반감기를 야기할 수 있다. 전술한 바와 같이, 잠재적 돌연변이로는 알라닌으로의 치환, 보존적 치환, 비-보존적 치환 또는 상이한 아형으로부터 동일 위치에서 상응하는 아미노산 잔기로의 치환(예를 들면, IgG1 잔기를 그 위치에서 상응하는 IgG2 잔기로 치환)을 포함하는, 하나 이상의 잔기의 삽입, 결실 또는 치환이 포함된다.
다른 공유적 변형
특이적 결합제 또는 항체의 공유적 변형도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 이들은, 경우에 따라, 화학 합성에 의해, 또는 특이적 결합제 또는 항체의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 수행될 수 있다. 표적화 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 다른 유형의 공유적 변형도 특이적 결합제 또는 항체내에 도입될 수 있다.
시스테이닐 잔기가 가장 통상적으로 α-할로아세테이트(및 상응하는 아마이드), 예를 들면, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아마이드와 반응하여 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 생성한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트라이플루오로아세톤, 알파-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-나이트로-2-피리딜 다이설파이드, 메틸 2-피리딜 다이설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-나이트로페놀 또는 클로로-7-나이트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문에 pH 5.5 내지 7.0에서 다이에틸피로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화한다. 파라-브로모페나실 브로마이드도 또한 유용하며; 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트에서 수행한다.
라이시닐 및 아미노-말단 잔기는 석신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응시킨다. 상기 물질에 의한 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도체화하기에 적당한 다른 시약으로는 이미도에스터, 예를 들면, 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트라이나이트로벤젠설폰산, O-메틸아이소유레아, 2,4-펜테인다이온, 및 글라이옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매화 반응이 포함된다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 여러개의 통상적인 시약, 특히 페닐글리옥살, 2,3-뷰테인다이온, 1,2-사이클로헥세인다이온 및 닌하이드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 반응이 구아니딘 작용기의 높은 pKa로 인해 알칼리 조건에서 수행되어야 한다. 또한, 이들 시약은 라이신 기 및 아르기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특정 변형은 방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라나이트로메테인과의 반응에 의해 티로실 잔기내에 스펙트럼 표지를 도입하는데 특별한 관심하에 수행될 수 있다. 가장 통상적으로, N-아세틸이미다졸 및 테트라나이트로메테인을 사용하여 O-아세틸 티로실 종 및 3-나이트로 유도체를 각각 생성한다. 티로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화되어 방사성면역분석에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조한다.
카복실 측쇄기(아스파틸 또는 글루타밀)는 카보다이이미드(R-N.dbd.C.dbd.N-R')(여기서, R 및 R'는 상이한 알킬기이다), 예를 들면, 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리닐-4-에틸) 카보다이이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-다이메틸펜틸)카보다이이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 또한, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 흔히 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기 각각으로 탈아미드화된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화 형태는 본 발명의 범위에 속한다.
다른 변형으로는 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 포스포릴화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86, 1983], N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카복실기의 아마이드화가 포함된다.
또 다른 유형의 공유적 변형은 특이적 결합제 또는 항체에 글라이코사이드를 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것을 포함한다. 이들 절차는, 이들이 N- 또는 O-결합 글라이코실화에 대한 글라이코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 특이적 결합제 또는 항체의 생성을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용된 커플링 방식에 따라, 당(들)을 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 유리 설프하이드릴기, 예를 들어, 시스테인의 유리 설프하이드릴기, (d) 유리 하이드록실기, 예를 들면, 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 유리 하이드록실기, (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아마이드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일자로 공개된 국제특허출원 공개 제 WO 87/05330 호, 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306, 1981]에 기술되어 있다.
특이적 결합제 또는 항체에 존재하는 임의의 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글라이코실화는 화합물 트라이플루오로메테인설폰산 또는 등가의 화합물에 특이적 결합제 또는 항체의 노출을 필요로 한다. 상기 처리는 특이적 결합제 또는 항체를 손상되지 않게 유지하면서, 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토스아민)을 연결시키는 것을 제외하고 대부분 또는 모든 당의 절단을 야기한다. 화학적 탈글라이코실화는 문헌 [Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52, 1987; and Edge et al., Anal. Biochem., 118:131, 1981]에 기술되어 있다. 특이적 결합제 또는 항체상의 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350, 1987]에 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글라이코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.
특이적 결합제 또는 항체의 또 다른 유형의 공유적 변형은 특이적 결합제 또는 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리옥시에틸화 솔비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스, 폴리옥시에틸화 글리세롤, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리사카라이드 중합체, 예를 들어, 덱스트란 중 하나에 결합시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337; 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 4,609,546 호 또는 유럽 특허 제 315 456 호 참조).
치료 용도
"치료"는 질환의 병상의 진행을 방지하거나 변화시키기 위해 수행되는 조정이다. 따라서, "치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 방지적 수단 둘 다를 말한다. 치료가 필요한 사람들로는 이미 질환을 갖고 있는 사람 뿐 아니라, 질환이 예방되어야 할 사람들이 포함된다.
치료를 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 양식 동물(farm animal), 및 동물원, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하여, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 말한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 효과량"이란 어구는 비만 세포 또는 원조 세포 수 및/또는 활성의 감소, 유섬유종 요소 또는 그의 전구체의 감소를 제공하거나, 또는 c-Kit 관련 질환과 연관된 증상의 중증도 또는 진행의 감소를 제공(즉, "치료 효과"를 제공)하는 치료 또는 예방적 인간화 c-Kit 항체의 양을 말한다. 비만 세포 및 원조 다능성 조혈모세포가 c-Kit를 발현하는 1차 세포 유형이므로, 비만 세포와 같은 HSC로부터 유래되고 질환에 포함되는 세포를 본 발명의 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 것으로 생각된다.
"섬유성-감소 활성"이란 어구는 면역계 활성화 및 섬유증으로부터 비롯되는 염증을 완전히 또는 부분적으로 억제하고 역전시키는 능력을 말하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "섬유증 질환 또는 질병"은 하나 이상의 조직에서 섬유증을 수반하는 상태를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "섬유증"은 정상 구성요소로서 섬유질 조직의 생성 또는 장기 또는 조직의 치료와 대조적으로, 반응성 과정으로서 장기 또는 조직에서 과잉의 섬유성 결합 조직의 비정상 생성 또는 발달을 말한다. 섬유증은 임의의 특정 조직에서 정상적 침착을 초과하는 섬유아세포 축적 및 콜라겐 침착을 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "섬유증"은 "콜라겐 및 다른 세포외 간질 단백질의 중간엽-섬유아세포 형질전환, 과도한 섬유아세포 증식, 활성 및 침착을 수반하는 비정상적 치료"와 동의로 사용된다.
섬유아세포는 신체 전체의 결합 조직에 분산되어 있는 결합 조직 세포이다. 섬유아세포는 I형 및/또는 III형 콜라겐을 함유하는 연질 세포외 간질을 분비한다. 조직에 대한 손상에 대해, 순환중인 가까운 섬유아세포 또는 중간엽 전구 세포가 상처로 이동하고, 비만 세포 및 그의 매개체와 같은 다른 세포의 영향하에서 대안적으로 활성화되고, 증식하고, 다량의 콜라겐성 세포외 간질을 생성할 수 있다. 콜라겐은 세포외 간질 및 결합 조직, 연골 및 뼈의 주성분인, 글라이신 및 프롤린에 풍부한 섬유성 단백질이다. 콜라겐 분자는 로프유사 나선형으로 서로 휘감기는, α-쇄로 불리는 3겹-표준 나선 구조이다. 콜라겐은 여러 형태 또는 유형으로 존재하며; 이들 중에서, 가장 보편적인 I형은 피부, 힘줄 및 뼈에서 발견되고; III형은 피부, 혈관 및 내부 장기에서 발견된다.
비만 세포 관련 섬유증 질환으로는 병리학적 섬유증 또는 흉터(심장내막 경화증 포함), 특발성 세포간질 섬유증, 세포간질 폐 섬유증, 근육주변 섬유증, 간염, 피부섬유종, 담즙성 간경화, 알콜성 간경화, 급성 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 급성 호흡 장애 증후군, 신장 섬유증/사구체신염, 신장 섬유증/당뇨병성 신증, 경피증/전신성, 경피증/국소성, 켈로이드, 비후성 반흔, 중증 관절 유착/관절염, 골수섬유증, 각막 상흔, 낭포성 섬유증, 근이영양증(뒤센형), 심장 섬유증, 근섬유증/망막 분리, 식도 협착 및 페이론레스(payronles) 질환이 포함된다. 또 다른 섬유증 질환은, 흉터 교정/성형술을 포함한 수술, 녹내장, 백내장 섬유증, 각막 손상, 관절 유착, 이식편 대 숙주 질환, 힘줄 수술, 신경 포착, 듀프트렌 구축증, OB/GYN 유착/섬유증, 골반 유착, 경막외 섬유증, 재협착에 의해 유도되거나 개시될 수 있다. 피브로넥틴의 침착이 원인성 요인인 섬유증 질환을 본 발명에 따라 치료할 수 있는 것으로 또한 생각된다. 특발성 폐 섬유증, 블레오마이신 폐, 낭포성 섬유증, 및 궁극적으로 신부전을 유발하는, 신장에서 Fn 침착을 특징으로 하는 질환을 포함하여 사구체 신염이 본 발명에 따라 또한 치료될 수 있는 질환의 예이다. 면역계의 활성화를 포함하고 비만 세포가 TNF와 같은 염증성 사이토카인을 분비하고 림프구를 활성화시키고 그와 직접 상호작용할 수 있는 염증도 또한 본 발명에 따라 치료될 수 있다.
경피증은, 피부 및 다른 장기에서 섬유아세포에 의한 새로운 콜라겐의 과잉생성에 의해 야기된 피부의 비후 및 경화를 특징으로 하는 섬유증 질환을 야기하는, 결합 조직의 자가면역 질환일 것으로 생각된다. 경피증은 많은 장기를 포함하는 국소성 또는 전신성 질환으로 일어날 수 있다. 경피증은 또한 전신 경화증으로도 지칭된다. 경피증 병상의 진전은 병에 걸린 조직/장기에서 증가된 비만 세포 수와 관련된다.
전신성 경화증은 피부의 비후 및 하부 조직, 특히 손과 안면의 하부 조직에 유착하에, 유리질화되고 비후된 콜라겐성 섬유 조직의 생성을 특징으로 한다. 상기 질환은 또한 식도의 연동운동 상실 및 점막하 섬유증으로 인한 연하곤란, 폐 섬유증으로 인한 호흡곤란, 심근 섬유증 및 심혈관 변화를 특징으로 할 수 있다[Stedman's Medical Dictionary, 26th Edition, Williams & Wilkins, 1995]. vP 섬유증은 경피증 환자의 30 내지 70%에 영향을 미쳐, 흔히 제한성 간 질환을 야기한다[Atamas et al., Cytokine and Growth Factor Rev. 14:537-550, 2003]. 일부 환자는 경피증과 다른 결합 조직 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루프스 및 다발성근염과의 중복을 갖는다. 경피증의 특징이 다발성근염 및 전신성 홍반성 루프스의 특징과 함께 존재하는 경우, 상기 상태는 혼합 결합 조직 질환(MCTD)로 칭한다.
피부염의 일부 형태에 존재하는 증상은 무엇보다 히스타민 방출을 야기하는 피하 비만 세포의 탈과립화에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치료에 적당한 또 다른 비만 세포 관련 질환은 색소성 두드러기이다. 상기 질환은 마찰시 두드러기가 나고 많은 수의 비만 세포를 함유하는 단일 또는 다중 착색 반점 또는 단괴인 특징적인 피부 병변을 나타낸다. 홍반, 부종, 구진 발진과 같은 다양한 형태의 관련 피부염(피부의 염증)이 존재하며, 소양증은 인간 및 동물 피부염 모두에 존재할 수 있고, 이들 모두는 본 발명에 따라 치료가능하다.
비만세포증은 많은 경우에서 종양성 질환이며 새롭거나 비정상적 비만 세포 성장을 수반하고 상승된 SCF 자동분비 신호전달 및 c-Kit 돌연변이 활성화의 결과일 수 있다. 비만세포증은 골수와 같은 다중 장기를 수반하는 제한성 또는 전신성일 수 있다. 비만 세포는 특정 사건에 반응하여 특정 매개체, 또는 화학물질(그중 하나가 히스타민이다)을 체내로 방출한다. 전신성 비만세포증을 갖는 사람은 비만세포 수의 증가를 나타내거나, 또는 적절히 작용하지 못할 수 있는 비정상적 형태의 비만 세포를 나타낸다. 또한, 비만 세포는 총 비만세포 존재량이 더 증가하는 것으로 추정할 때 자연 사멸되지 못한다. 비만 세포가 탈과립되고 그 내용물을 방출할 때, 많은 급성 및 잠재적으로 심각한 상태 또는 질환을 야기할 수 있다. 비만 세포 질환에는 또한 단독 피하 비만세포증에서 비만 세포 백혈병의 보다 심한 질환까지를 야기하는 증식성 질환이 포함된다. 예로는 피하 비만세포증, 응집성 비만세포증, 침윤성 질환, 무통성 비만세포증, 관련된 혈액 질환을 갖는 비만세포증, 색소성 두드러기, 지속성 발진성 반성 모세혈관확장증(tmep), 전신성 비만세포 질환, 비만세포 백혈병, 골수성 백혈병, 전신성 비만세포증(색소성 두드러기와 같은 피하 발현이 있거나 없거나), 비만세포 활성화 증후군/질환, 및 보다 보편적인 소아과 비만세포 질환, 예를 들면, 단독 비만세포증 및 미만성 피하 비만세포증이 포함된다.
비만 세포 활성화 증후군 또는 질환은 정상 또는 거의 정상 수의 비만 세포를 특징으로 한다. 그러나, 비만 세포는 그의 내용물 방출을 용이하게 유발하여, 많은 동일한 증상을 야기한다. 아나필락시스 및 쇼크의 위험이 상기 질환에 존재하지만, 비만 세포의 증식성 질환과 달리 상기 증후군은 보다 침윤성 또는 악성 단계로 진행될 가능성을 갖지 않을 수 있다. 비만 세포 탈과립과 관련된 상기 질환의 예로는 복통, 두드러기 및 발진, 아나필락시스, 식도염증, 혈압 변화 및 쇼크, 장 경련 및 팽만감, 뼈 통증(중등도 내지 중증/쇠약), 발진이 있거나 없는 가려움증, 흉통, 간, 비장 및 기타 장기 병발, 인식 곤란/브레인 포그(brain fog), 흡수불량, 퇴행성 디스크 질환, 편두통, 설사, 근육통, 어지러움증/현기증/어찔어찔함, 구역질, 실신, 골다공증/골감소증(osteoporosis/osteopenia), 피로, 말초신경장애 및 자각이상, 홍조, 심박동수 증가, 위식도 역류 및 구토가 포함될 수 있다.
알레르기 질환에서 비만 세포의 역할은 그 활성이 비만 세포 아포토시스(apoptosis)를 야기하는 히스타민 및 코르티코스테로이드와 같은 비만 세포 특이적 매개체를 차단하는 약물에 의해 임상적으로 확인되었다. 추가의 비만 세포 관련 질환으로는 케모카인-유도성 비만 세포 및 호염기구 탈과립화 및 히스타민의 방출을 억제함으로써 치료될 수 있는 히스타민-매개 알레르기 반응이 포함된다. 본 발명의 방법 및 조성물로 효과적으로 치료될 수 있는 비만 세포 관련 질환 또는 질병의 예로는 또한 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 습진성 피부염, 및 벌레 물림 또는 독침에 의해 야기된 피부염이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의한 치료에 적합한 다른 비만 세포 관련 적응증으로는 간질성 폐 질환에서의 폐 염증성 상태, 예를 들면, 유육종증, 신생아 호흡 장애 증후군(RDS), 기관지폐 형성장애(BPD), 및 혈청 PLA2 활성, 예를 들어, 성인 RDS(ARDS)의 상승을 특징으로 하는 상태가 포함된다.
비만 세포는 또한 관절염에서도 역할을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 비만 세포는 RA 또는 OA 환자의 활액 조직에서 증가되었으며, 글리벡(Gleevec)은 활액 절편체에서 비만 세포 아포토시스를 야기하는 것으로 나타났으며, 인간 경우의 연구는 RA 환자에서 효능을 나타낸다. 비만 세포는 패혈성 쇼크, 췌장염, 콜라겐 혈관 질환, 급성 신부전, 복막염 및 자가면역성 포도막염에서 역할을 갖는다.
연구는 또한 비만 세포가 다발성 경화증의 병리생리학에 관여한다고 제시한다. 뇌에서의 비만 세포는 탈수초화를 야기할 수 있는 혈관활성 아민을 방출하는 것으로 생각된다. 비만 세포로부터 방출된 히스타민은 혈관 통합성을 변형시킬 수 있으며, 다발성 경화증의 병인론에 관련되는 혈액-뇌 장벽의 부분적 파괴를 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 다발성 경화증과 관련된 병적상태의 치료 또는 개선에 적당한 것으로 생각된다.
c-Kit는 또한 멜라닌세포 및 장 세포, 및 정모세포와 같은 특정 비-면역 세포상에서 발현된다. 본 발명은 흑색종 및 GIST의 치료에 유용성을 가질 수 있으며 남성 피임약으로서 유용성을 가질 수 있다.
약학 제형의 투여 및 제조
본 발명 방법의 실시에 사용되는 항-c-Kit 특이적 결합제 또는 항체는 바람직한 전달 방법에 적당한 담체를 포함하는 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 적당한 담체로는 항-c-Kit 특이적 결합제 및 중성 길항물질 또는 항체와 혼합되는 경우 c-Kit에서 고-친화성 결합 및 효능을 보유하고 대상(subject)의 면역계에 대한 반응성을 보이지 않는 임의의 물질이 포함된다. 예로는 임의의 많은 표준 약학적 담체, 예를 들면, 멸균 포스페이트 완충 식염수 용액, 정균수 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다양한 수성 담체, 예를 들면, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신 등을 사용할 수 있으며, 증대된 안정성을 위한 다른 단백질, 예를 들면, 약한 화학적 변형 등에 적용된 알부민, 지질단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다.
제형중 예시적인 항체 농도는 약 0.1 내지 약 180 mg/㎖ 또는 약 0.1 내지 약 50 mg/㎖, 또는 약 0.5 내지 약 25 mg/㎖, 또는 약 2 내지 약 10 mg/㎖의 범위일 수 있다. 항체의 수성 제형은, 예를 들면, 약 4.5 내지 약 6.5, 또는 약 4.8 내지 약 5.5, 또는 약 5.0 범위의 pH에서 pH-완충액중에서 제조될 수 있다. 상기 범위내의 pH에 적당한 완충제의 예로는 아세테이트(예를 들면, 나트륨 아세테이트), 석시네이트(예를 들면, 나트륨 석시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 기타 유기산 완충제가 포함된다. 완충제 농도는, 예를 들면, 완충제 및 제형의 목적하는 등장성에 따라 약 1 내지 약 200 mM, 또는 약 10 내지 약 60 mM일 수 있다.
또한 항체를 안정화시킬 수 있는 등장화제가 제형에 포함될 수 있다. 예시적인 등장화제로는 폴리올, 예를 들면, 만니톨, 슈크로스 또는 트레할로스가 포함된다. 바람직하게, 수성 제형은 등장성이지만, 고장성 또는 저장성 용액이 적합할 수도 있다. 제형중 폴리올의 예시적인 농도는 약 1 내지 약 15%(w/v)의 범위일 수 있다.
제형화된 항체의 응집을 감소시키고/시키거나 제형중 입자의 생성을 최소화하고/하거나 흡착을 감소시키기 위해 계면활성제를 또한 항체 제형에 첨가할 수 있다. 예시적인 계면활성제로는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리솔베이트(예, 폴리솔베이트 20 또는 폴리솔베이트 80) 또는 폴록사머(예, 폴록사머 188)가 포함된다. 계면활성제의 예시적인 농도는 약 0.001 내지 약 0.5%, 또는 약 0.005 내지 약 0.2%, 또는 약 0.004 내지 약 0.01%(w/v)의 범위일 수 있다.
한 태양에서, 제형은 상기-정의한 약제(즉, 항체, 완충제, 폴리올 및 계면활성제)를 함유하며, 필수적으로 하나 이상의 방부제, 예를 들면, 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로뷰탄올 및 벤즈에토늄 CI가 없다. 또 다른 태양에서, 방부제는 제형중에, 예를 들면, 약 0.1 내지 약 2%, 또는 약 0.5 내지 약 1% 범위의 농도로 포함될 수 있다. 하나 이상의 다른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제, 예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 기술된 것들이 제형에 포함될 수 있으나, 단, 이들은 제형의 바람직한 특성에 불리하게 영향을 미치지 않아야 한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 무독성이며, 추가의 완충제; 공-용매; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 생분해성 중합체, 예를 들면, 폴리에스터; 및/또는 염-생성 상대이온, 예를 들면, 나트륨이 포함된다.
항체의 치료 제형은 저장을 위해, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제[Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 말토스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 트윈(TWEEN, 등록상표), 플루로닉스(PLURONICS, 등록상표) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이 포함된다.
한 태양에서, 청구된 본 발명의 적당한 제형은 등장성 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 아세테이트 또는 트리스 완충제를 등장화 및 안정화시키는 등장화제, 예를 들어, 폴리올, 솔비톨, 슈크로스 또는 나트륨 클로라이드와 함께 함유한다. 상기 등장화제의 한 예는 5% 솔비톨 또는 슈크로스이다. 또한, 제형은 응집을 방지하고 안정화를 위해 계면활성제를 0.01 내지 0.02%(w/v) 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 제형의 pH는 4.5 내지 6.5 또는 4.5 내지 5.5의 범위일 수 있다. 항체에 대한 약학 제형의 다른 예시적 설명은 각각 본원에 참고로 인용된 미국 특허출원 공개 제 2003/0113316 호 및 미국 특허 제 6,171,586 호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들면, 추가로 면역억제제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 분자들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)중에 또는 거대유화액에 유폐될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 개시되어 있다.
항체의 현탁액 및 결정 형태도 또한 포함된다. 현탁액 및 결정 형태를 제조하기 위한 방법은 당해 분야의 전문가에게 공지되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 멸균성이어야 한다. 본 발명의 조성물은 통상적인 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들면, 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 생성 용액은 사용하기 위해 포장되거나, 또는 무균 조건하에서 여과되고 동결건조될 수 있으며, 동결건조 제제는 투여하기 전에 멸균 용액과 혼합된다.
동결건조 과정은, 특히 폴리펩티드가 액체 조성물에서 비교적 불안정할 때 장기 저장을 위해 폴리펩티드를 안정화하기 위해 흔히 이용된다. 동결건조 주기는 통상적으로 3 단계로 이루어진다: 동결, 1차 건조 및 2차 건조[Williams and Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volume 38, Number 2, pages 48-59, 1984]. 동결 단계에서, 용액이 적절히 동결될 때까지 용액을 냉각시킨다. 용액중 대부분의 물은 이 단계에서 얼음을 형성한다. 얼음은 1차 건조 단계에서 승화되는데, 이것은 진공을 이용하여 얼음의 증기압 미만으로 챔버 압력을 감소시킴으로써 수행된다. 최종적으로, 흡착 또는 결합된 물은 감소되는 챔버 압력 및 상승되는 선반 온도하에 2차 건조 단계에서 제거된다. 상기 공정은 동결건조 케이크로 알려진 물질을 생성한다. 그 다음, 상기 케이크는 사용전에 복원될 수 있다.
동결건조 물질에 대한 표준 복원 관행은 일정 부피의 순수한 물(전형적으로는 동결건조시 제거된 부피와 동등함)을 다시 가하는 것이지만, 항균제의 묽은 용액을 때때로 비경구 투여용 약제의 제조에 사용한다[Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 18, Number 11 and 12, pages 1311-1354, 1992].
부형제는 일부 경우에 동결건조 제품용 안정화제로 작용하는 것으로 언급되었다[Carpenter et al., Development in Biological Standardization, Volume 74, pages 225-239, 1991]. 예를 들면, 공지된 부형제로는 폴리올(만니톨, 솔비톨 및 글리세롤); 당(글루코스 및 슈크로스 포함); 및 아미노산(알라닌, 글라이신 및 글루탐산 포함)이 포함된다.
또한, 폴리올 및 당도 또한 폴리펩티드를 동결 및 건조-유도성 손상으로부터 보호하고 건조 상태에서 저장시 안정성을 증대시키기 위해 흔히 사용된다. 일반적으로, 당, 특히 다이사카라이드는 동결-건조 공정 및 저장시 둘 다에서 효과적이다. 모노- 및 다이-사카라이드, 및 PVP와 같은 중합체를 포함하여, 다른 부류의 분자들도 또한 동결건조 제품의 안정화제로서 보고되었다.
주사의 경우, 약학 제형 및/또는 약제는 전술한 바와 같은 적절한 용액으로 복원되기에 적당한 분말일 수 있다. 이들의 예로는 동결 건조되거나, 회전 건조되거나 분무 건조된 분말, 무정형 분말, 과립, 침전물 또는 미립자가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 주사의 경우, 제형은 안정화제, pH 조절제, 계면활성제, 생체이용률 조절제 및 그의 혼합물을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국 특허 제 3,773,919 호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체, 예를 들면, 루프론 데포(Lupron Depot, 등록상표)(락트산-글라이콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜산과 같은 중합체는 100일 넘는동안 분자들의 방출을 가능케 하지만, 특정 하이드로겔은 보다 단기간동안 단백질을 방출한다. 캡슐화 항체가 체내에 장기간동안 남아 있는 경우, 이들은 37 ℃에서 수분에 노출의 결과로 변성되거나 응집되어, 생물 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화를 야기할 수 있다. 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적 방법이 고안될 수 있다. 예를 들면, 응집 메카니즘이 티오다이설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 전개시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 제형은 본원에서 기술된 바와 같이, 단시간-작용, 신속-방출, 장기-작용 또는 서방성이도록 고안될 수 있다. 따라서, 약학 제형은 또한 조절된 방출 또는 지연 방출을 위해 제형화될 수 있다.
질환의 상태, 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이요법, 투여 간격, 투여 경로, 분비율 및 약물의 혼합물에 따라 특정 투여량이 조정될 수 있다. 효과량을 함유하는 임의의 상기 투여형은 통상적인 실험의 경계내에서 적절하므로, 본 발명의 범위내에서 적절하다.
특이적 결합제 또는 항체는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내, 및 경우에 따라 국소 치료를 위해 병소내 투여를 포함하여 임의의 적당한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입으로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 특히 결합제 또는 항체는, 특히 특이적 결합제 또는 항체의 용량을 감소시키면서 적용량 주입에 의해 적절히 투여된다. 바람직하게, 투여는, 부분적으로 투여가 단기인식 또는 장기인식 여부에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 국소, 특히 경피, 경점막, 직장, 경구 또는, 예를 들면, 목적 부위에 근접하게 위치한 카테터를 통한 국소 투여를 포함하여 다른 투여 방법도 고려된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 특이적 결합제 또는 항체는 매일 내지 매주 내지 매월(예를 들면, 매일, 2일마다, 3일마다 또는 주당 2, 3, 4, 5 또는 6회) 범위의 빈도로 0.01 내지 100 mg/kg 범위의 용량, 바람직하게는 주당 2 또는 3회의 빈도로 0.1 내지 45 mg/kg, 0.1 내지 15 mg/kg, 또는 0.1 내지 10 mg/kg 범위의 용량으로, 또는 1개월에 1번 한달에 45 mg/kg으로 생리학적 용액중에서 정맥내 투여된다.
다른 약제의 투여
본 발명의 항체는 또한 다른 소염성 치료제와 동시에 투여될 수 있다. 동시 투여는 약제가 그 치료 효과를 나타내는 동안 시간에 있어 다소 중복되는 한, 상이한 시간 및 상이한 경로에서 2개의 상이한 치료제의 투여를 포함한다. 당해 분야에 공지된 예시적인 항-c-Kit 약제는 이마티니브 메실레이트(Imatinib Mesylate)(글리벡, 등록상표)를 포함한다. 이마티니브 메실레이트는 또한 Ab1 티로신 키나제로부터 신호전달에 길항작용을 하므로 특이적 c-Kit 억제제가 아님을 주지해야 한다.
SR-1의 인간화
SR-1을 직접 CDR 그래프트에 의해 인간화하였는데, 놀랍게도 바람직한 작용 활성이 입증되지 않은 채로 남았긴 하지만, 친화도를 유지하기 위해 역 돌연변이가 필요하지 않았다. 가장 표준적인 잔기를 유지하고 추가의 프롤린 잔기를 도입하지 않은 인간 골격을 수용체 서열로 선택하였다. 이러한 기준을 근거로, 중쇄 수용체 서열은 골격 I 및 II에 대해 VH1 1-46 및 골격 III에 대해 가장 근접한 J 영역으로 JH4(골격 IV로도 알려져 있다)를 갖는, VH1 1-e였다. 경쇄 수용체 서열은 가장 근접한 J 영역으로 JK2를 갖는 VK4 B3 생식선 서열이었다.
아이소타입 전환을 수행하여 인간 IgG2, IgG1, IgG4P 및 인간화 항체의 비-글라이코실화 IgG1 형태를 생성하였다. 297번(카밧(Kabat) 번호) 위치에서 아스파라긴으로부터 글루탐산으로 단일 잔기의 돌연변이에 의해 N-결합 비-글라이코실화 공통 부위를 인간 IgG1 불변 영역 서열로부터 제거하였다.
비-글라이코실화 IgG1 형태의 인간화 SR-1(hSR-1 aIgG1)은 바람직한 방식으 로 가용성 c-Kit에 비해 더 높은 친화도하에 막 c-Kit에 결합하며, SCF의 매우 효능성인 중성 길항물질이고, c-Kit 신호전달의 근위부 및 원위부 판독물을 이용하여 시험한 모든 세포 기준 분석에서 직접 c-Kit의 작동성을 매개하지 않는다. 작동체 기능 및 방관자 효과를 통한 세포 사멸을 배제하기 위해 비-글라이코실화 IgG1 아이소타입을 선택하였다. 상기 항체는 원숭이에서 예기치 못하고 바람직한 반감기, 비선형 PK 및 포화성 표적-매개 항체 제거를 나타내었다. 상기 항체는 또한 예상한 바와 같이 생체내에서 비만 세포를 고갈시킨다.
c-Kit 이량체에 대한 결합
줄기 세포 인자(SCF)에 의한 결합시 c-Kit의 활성화는, 아마도 클라트린-의존성 경로를 통해, 이량체화/올리고머화, 자가포스포릴화 및 수용체 내재화를 유도한다. SR-1 단클론성 항체는 비아코어(Biacore)로 측정할 때 가용성 c-Kit 세포외 영역 단량체에 비해 1000배 더 높은 친화도하에 c-Kit 이량체에 결합한다. 역학 모델링은 SR-1이 ng/㎖의 가용성 쉐드 수용체 단량체의 존재하에서조차 천연 막-결합 수용체에 우선적으로 결합함을 시사한다.
당단백질에 존재하는 탄수화물은 생물 및 기능성에 영향을 미칠 수 있다. 비-글라이코실화 IgG1 형태로의 SR-1의 인간화는 결합 파라미터가 보존되었음을 나타내었다. 인간화 SR-1 aIgG1은 1.0 pM의 키넥스(KinEx)A 평형 결합 Kd를 갖는 재조합 c-Kit 수용체-Fc에 결합하였으며, 비아코어 분석을 이용하여, hSR-1 aIgG1은 Ki = 70 pM하에 줄기 세포 인자(SCF) 결합을 차단하였다. hSR-1 aIgG1은 단량체에 비해 고 친화도하에 수용체 이량체에 결합한다. 이것은, 가용성 c-Kit 단량체가 생체내에서 항체에 대한 싱크로서 작용할 가능성이 적기 때문에 인간화에 따라 확실하게 번역될 것으로 예상되지 못한 중요한 특징이다.
c-Kit 의존성 세포 생존 및 수용체 신호전달의 억제
인간 거핵아구성(megakaryoblastic) 세포주 UT-7은 생존을 위해 SCF에 의존하며, SCF의 제거 또는 그의 억제는 생존능력의 급속한 손실 및 감소된 증식을 야기한다. 상기 분석은 SCF 길항물질의 IC50 효능 결정에 적합하다. hSR-I aIgG1은 35 pM의 평균 IC50을 나타내었다.
hSR-1 aIgG1은 MO7e 세포에서 SCF-매개 c-Kit 포스포릴화 및 내재화를 유효하게 억제하여, 상기 항체가 SCF-매개 c-Kit 신호전달을 차단할 수 있음을 나타낸다. 본래 c-Kit 내재화 및 포스포릴화를 매개할 수 있는 SR-1의 연구결과와 대조적으로, 놀랍게도, hSR-1 aIgG1에 대해 MO7e c-Kit 수용체 근위부 포스포릴화 판독물에서 작동성의 어떤 증거도 검출되지 않았다. 특히, hSR-1 IgG2, IgG2 항체는 효능이 약간 덜하였고 SCF-매개 c-Kit 수용체 내재화를 완전히 억제하지 않았다.
hSR-1 aIgG1은 1차 분리된 인간 CD34+, CD117+(c-Kit) 골수 세포를 이용한 GM-CSF 유래 콜로니 생성시 SCF의 1.0 ㎍/㎖의 상승 효과에서 중성화를 나타낸다. hSR-1 aIgG1이 c-Kit 내재화 또는 포스포릴화를 매개하지 않았다는 본 발명의 새로운 발견과 일치하게, hSR-1 aIgG1의 고유한 작동성 생존 활성이 상기 분석에서 10 ㎍/㎖ 이하 농도의 항체에 대해 관찰되지 않았다. 사실상, 상기 항체는 생존을 기준선 이하로 억제할 수 있었다.
비만세포 응집, CDC 및 FcR 활성의 결여
골수 CD34+ 세포로부터 유래된 배양된 인간 비만세포를 이용하여 화합물의 겉보기 효능 및 등급 순서를 평가하였다. hSR-1 aIgG1은 SCF-의존성 비만세포 생존을 억제하였고, 비만세포에 생존 신호를 제공하지 않았고, c-Kit 수용체 포스포릴화를 매개하지 않았고(도 3), 동형(homotypic) 비만세포 응집을 매개하는 능력을 나타내지 않았다. 대조적으로, hSR-1 IgG2는 SCF-비만세포 생존을 차단할 수 있었지만, 자체로는 부분적인 작용물질 활성을 나타내어 생존 신호를 제공하고 c-Kit 수용체 포스포릴화를 매개하였고 비만 세포 응집에 대해 재생 효과를 야기하였다. hSR-1 aIGg1에 대해, 상기 항체가 비-인간 영장류에서 생체내에서 30 mg/kg 이하로 4 주동안 매주 1회씩 투여되거나, 또는 2 주간 매주 1회 피하로 150 mg/kg 이하로 투여되었을 때, hSR-1 aIgG1에 대해 예상치 못한 이상은 관찰되지 않았다.
hSR-1 aIgG은 Fcγ 수용체 I = CD64, Fcγ 수용체 II = CD32 및 Fcγ 수용체 III = CD16을 발현하는 U-937 세포에 대한 검출가능한 비-특이적 FcR 결합을 나타내지 않는다. 대조적으로, SR-1 IgG1 및 IgG4P 아이소타입의 결합이 아마 고친화도 FcγRI에 대해 검출되었다. 그러므로, ADCC 활성은 hSR-1 aIgG1에 대해 예상되지 않으며, 현재까지 실험 데이터는 보체 의존성 세포독성 세포 사멸을 나타내지 않는다. 비-글라이코실화 키메라 마우스/인간 IgG1 항체는 약간의 작동체 기능[Hybridoma. 10(2):211-217, 1991 Apr.]을 보유하는 것으로 보고되었고, 따라서 hSR-1 aIgG1의 상기 바람직한 활성들은 예상되지 않는다. 데이터는 표준 방법의 적용 및 따라서 전형적인 IgG2 또는 IgG1 또는 IgG4 아이소타입의 선택은, 고친화 도 결합제, c-Kit에서 작용성 중성 길항물질이고 비만 세포를 활성화시키지 않는, 적절한 특징을 갖는 분자를 생성하지 않았음을 보여준다.
약물동력학
예비 PK 연구를 수행하여 3 mg/kg으로 단일 IV 또는 SC 투여후에 수컷 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이에서 hSR-1 IgG2 및 hSR-1 aIgG1 PK를 비교하였다. 시간 프로필은 상기 둘 다에 대해 비-선형 PK를 나타낸다. 농도는 보다 저농도에서 더 신속히 감소하였다. 두 항체는, 사이노몰거스 원숭이에서 단일 IV 또는 SC 투여후, CO/Cmax 및 AUC0-tlast로 측정할 때, 동일한 노출을 나타내었다. AUC0-tlast를 기준으로, 혈청 제거율은 두 인간화 항체 모두에 대해 약 0.3 ㎖/hr/kg 이하였다. 생체이용률은 SC 투여후, hSR-1 aIgG1 및 hSR-1 IgG2 인간화 SR-1 변이체 각각에 대해 약 82% 및 69%이었다.
아프리카 초록 원숭이에서 매주 1회 반복 투여후에 SR-1 및 인간화 항체의 예비 노출 데이터를 기준으로, 인간화 항체는 SR-1에 비해 더 높은 노출을 달성하였다. 특히, hSR1-aIgG1은 PK 군에서 동등한 최상을 나타내었으며, 분자의 글라이코실화 정도는 그의 약물동력학적 성질을 변형시킬 수 있으며, 항체의 경우 그의 대사 및 다른 생물학적 성질을 변화시킬 수 있음이 이미 입증되었다[Cancer Immunol Immunother., 35(3):165-174, 1992].
수컷 사이노몰거스 원숭이에게 3 mg/kg의 hSR-1 IgG2 또는 hSR-1 aIgG1의 단일 IV 또는 SC 투여후 약물동력학적 파라미터 평가
시험 제품 투여 경로 C0/Cmax (㎍/㎖) Tmax (hr) AUC0-tlast (hr*㎍/㎖) CL 또는 CL/Fa (㎖/hr/kg) F(%)
hSR-1 aIgG1 IV 103 - 9710 ≤0.309 -
hSR-1 IgG2 IV 107 - 10600 ≤0.283 -
hSR-1 aIgG1 SC 36.4 72 7970 ≤0.376 82.1
hSR-1 IgG2 SC 36.7 60 7290 ≤0.412 68.8
C0 = IV 투여후 평가된 초기 농도 Cmax = SC 투여후 최대 농도 Tmax = Cmax 시간 AUC0-tlast = 정량화가능한 농도하에 0 시간으로부터 마지막 시점까지 농도-시간 곡선하 영역 CL = IV 투여후 제거율; CL/F = SC 투여후 겉보기 제거율 F% = 생체이용률% aAUC0-tlast를 기준으로 계산된 제거율 -적용할 수 없음 C0, Cmax, AUC0-tlast, CL, CL/F 및 F%는 3개의 유효 숫자로 기록하였다.
인간 투여 설계
비만세포 팽창의 부상한 PD 모델에서 최소 효과 용량은 원숭이에서 2 주동안 매주 1회 투여된 0.3 mg/kg 미만이다. 체표면적-기준 용량 전환을 기준으로, 인간에서 최소 효과 용량은 등가의 투여 방법하에 0.1 mg/kg 미만으로 예측된다. 그러나, 이것은 PK로서 예비 평가이며, hSR-1 aIgG1에 의한 인간에서의 c-Kit 억제 정도 및 기간 사이의 약력학적 관계, 및 임상 종료점은 이때에는 알 수 없다. 보다 정확한 설계는 보다 많은 약물동력학적 및 약력학적 데이터를 이용할 수 있는 경우에 이루어질 것이다.
생체내 효능: SR-1 및 hSR-1 aIgG1에 의한 원숭이에서 기저 폐 및 결장 비만세포의 고갈
인간에서, 트립타제를 발현하고 키마제가 결여된 비만세포 MCt는 폐 및 결장과 같은 점막조직에 주로 편재화되어 있으며, 상기 아형은 일부 경피증 환자의 피부에서 보다 높은 수준으로 검출되어 상기 질환에서 비만세포의 가능한 대안적 활성화를 시사하였다. 트립타제와 키마제를 둘 다 발현하는 비만세포 MCtc도 또한 상기 조직의 일부에서 공동편재화되고 유사하게 경피증 및 다른 섬유증 질환과 관련되었다. 따라서, 두 아형 모두 점막 및 결합 조직을 수반하는 질환(예를 들면, IPF, SSc, 천식, RA 및 IBD)에서 c-Kit 억제제에 1차 표적을 나타낸다. 치료는 또한 매우 효능적, 효과적이어야 하며, 비만세포는 일반적으로 장기-생존하고 조직-내재성이므로, 충분한 부피의 분포 및 PK를 가져야 한다. 더욱, 비만세포는 활성화되어 탈과립화되고 염증반응에서 핵심 역할을 하는 매개체를 새로 합성할 때까지 주로 무활동성이다.
생체내 연구의 목적은 폐 및 결장에 존재하는 바와 같은 기저 점막 및 결합조직의 소실을 입증하고, 조혈작용에 대한 효과 및 전구체 세포에 대한 효과 뿐 아니라 c-Kit의 지속적이고 고비율의 억제후에 적혈구생성, 멜라닌형성 및 정자형성(그러므로 남성 피임에서의 유용성)에 대한 영향을 결정하는 것이었다. SR-1 단클론성 항체는 CD34+ 골수 세포 CFU 분석에서 인간 및 원숭이 c-Kit에서 그의 등가의 작용 효능(1.0 ㎍/㎖에서의 억제) 및 그의 원숭이 PK를 기준으로 선택하였다.
SR-1은 3 내지 30 mg/kg 범위의 용량으로 4 주간 매주 1회 투여하였다. 시간 경과 연구에서, 기저 결장 비만 세포는 14 일동안 2회 투여후 최대로 고갈된 것으로 나타났으며(Ctrough > 세포 IC50의 800배), 따라서 제 14 일을 기저 결장 비만세포에 대한 c-Kit 길항물질의 약리학적 활성을 측정하는 시점으로 선택하였다. 실질적인 이유로, 기저 폐 비만세포는 부검 및 연구 종료시에 제 28 일에 평가하였다.
1주일에 1회 투여된 SR-1의 3.0 mg/kg 용량에서, 기저 폐 비만세포의 고갈은 UT-7 세포 IC50의 200배보다 큰 Ctrough PK 수준에서 관찰되었다. 기저 결장 및 폐 비만세포, 멜라닌형성 및 정자형성에 대한 보다 낮은 용량의 SR-1의 효과는 평가하지 않았다.
그러나, hSR-1 aIgG1을 사용한 저용량 연구를 0.3, 1.0 및 3.0 mg/kg에서 수행하였다. 제 14 일의 Ctrough 수준은 세포 IC50의 >200배, >2000배 및 >8000배이었고, 상기 Ctrough 수준은 기저 결장 비만 세포의 무 효능, 거의 절반-고갈(69%) 및 거의 전체 고갈(96%)에 상응하였다(표 2에 요약). hSR-1 aIgG1에 대한 노출, 세포 효능 및 효과 관계는 보고된 SR-1 연구결과와 상통한다.
원숭이에서 비만세포 팽창의 상처 약력학적 모델에서 SR-1 및 hSR-1 aIgG1의 생체내 효능
피부에 대한 손상에 이어 강한 염증 반응이 이어지는데, 이때 먼저 호중구 및 이어서 대식세포 및 비만세포가 근접한 조직으로부터 및 조직의 순환, 과립화 및 재-표피화, 및 하부 상처 결합 조직의 섬유아세포 관련 수축으로부터 이동한다[Diegelmann RF, et al., Front. Biosci., 9:283-289, 2004, Jan 1]. 피하 상처 손상은 수반되는 세포 유형의 대부분이 섬유증과 관련되기 때문에 섬유증에서 적절할 수 있는 연구 메카니즘에 대한 모델이다. 또한, 인간에서 섬유아세포 유래 SCF의 상승 및 비만세포의 활성화 및 증가된 밀도와 결부되는 것으로 보고되었다[Trautmann A., et al., J. Pathol., 190(1):100-106, 2000, Jan]. 원숭이에서 피하 상처 손상후에, 비만세포 수는 상처후 14일에 도달하는 안정기하에 시간-의존성 방식으로 증가하며, 이것은 인간의 전형에 필적한다.
매주 1회 투여된 SR-1의 0.3, 1 또는 3 mg/kg의 용량은 제 14 일에 비만세포의 상처 활성화된 팽창의 거의 최대 억제를 유도하였다(도 1). 최대 억제는 상처후 제 14 일에 기준 수에 대해 비만세포의 증가를 100% 차단하는 능력으로 정의된다. 0.3 mpk 용량에 대한 Ctrough 수준은 제 14 일에 UT-7 IC50의 7배를 초과하였다(표 3). 3 주후, 혈청 수준은 UT-7 IC50의 약 2 배이었고, 상기 노출에서는 단지 부분적 억제만이 관찰되었다(도 1). 3 주때에, 1 및 3 mg/kg 일단 모두에 대해 최대 효능이 여전히 관찰되었으며, 이때 혈청 Ctrough 수준은 IC50의 200배보다 높게 유지되었다. 상기 연구들은 IC50 농도의 7배보다 높은, 지속된 Ctrough 노출이 상처-팽창된 비만세포의 최대 억제에 필요할 것임을 시사한다.
0.3, 1.0 및 3.0 mg/kg의 hSR-1 aIgG1의 용량을 상기 모델에서 SR-1에서 나타난 최대 효능을 기준으로 평가하였다. 시험한 최저 용량(0.3 mg/kg)에서, 비만세포의 상처-유도된 팽창의 최대 억제가 2 주이내에 관찰되었다. 이 때 혈청 Ctrough 수준은 UT-7 IC50의 200 배보다 높았다(표 3).
하기 표 3은 상처 PD 모델에서 SR-1 및 hSR-1 aIgG1의 PD/PK 효과를 요약한 것이다.
Figure 112008080316943-PCT00011
절개 상처를 낸 후 인간(좌측) 및 비-인간 영장류(우측)에서 제 21 일까지 펀치 생검을 수행하였다(도 2). 비만 세포 및/또는 SCF 발현 섬유아세포를 발색성 염색 또는 IHC에 의해 각각 확인했다. 인간에서, SCF의 발현이 상승되고 기준선으로 복귀되며, 일시적으로 정상적 상처 치유 시 비만세포 수에 일시적 상승이 뒤따른다. 상처에 대한 유사한 비만세포 반응이 원숭이에서 관찰된다. 섬유증 및 비정상적 상처 치유 시, SCF 발현 및 비만세포 수가 상승되었다(도 2).
조혈작용 및 멜라닌형성
마우스 유전학은 c-Kit가 배아 발달동안 조혈작용에 역할을 함을 보이지만, 인간에서는 혼혈 대상에서 이형 불활성화 및/또는 기능결실 돌연변이가 혈액학적 비정상과 연결되지 않았다. SCF 및 c-Kit는, SCF가 조혈모세포 고정화에 G-CSF와 함께 사용되기 때문에 인간 조혈작용에서 중요하다. 또한, 주로 BCR-ABL, PDGFR 및 c-Kit를 표적으로 하는 다중-키나제 억제제 글리벡은 그의 주된 약리학적 효과로서 골수억제를 가지며, 중증의 3 내지 4 등급의 빈혈 및 혈소판감소증이 GIST 환자에서 보고되었다[Hensley ML, et al., Semin. Hematol., 40(2 Suppl 2):21-25, 2003, Apr.].
마우스 유전학은 c-Kit가 배형성시 신경능으로부터 멜라닌아세포의 이동에 한 역할을 하며, 상기 역할은 인간 부분백색증에서 지지됨을 나타낸다. 글리벡은 소수의 GIST 환자에서 모발에 "밴딩" 탈색소를 야기하는 것으로 보고되었지만, 이것은 일치하는 결과가 아니었으며 과색소침착도 또한 보고되었다. PDGF와 같은 다른 키나제의 기여는 배제될 수 없다. 다중-키나제 억제제 및 c-Kit 항체를 사용한 마우스에서의 연구는 모발 착색의 억제가 완전히 역전되어 c-Kit 억제가 멜라닌세포 기능에 영향을 미치고 출생후 환경에서 생존할 수 없음을 시사한다[Moss et al., 2003].
SR-1을 4 주동안 매주 1회 3 내지 30 mg/kg으로 투여된 용량 탐색 연구에 사용하여 조혈작용, 정자생성 및 활성 멜라닌형성을 억제하는데 필요한 노출을 결정하였다. 세포 분화를 포함하는 순혈통 패널을 기준선, 연구 시작후 4, 7, 14, 21 및 28 일에 취한 혈액 샘플에 수행하였다. 새로 분리한 혈액 샘플의 분석은 퀸 엘리자베스 병원 임상 혈액 실험실(Queen Elizabeth Hospital Clinical Hematology lab, 바베이도스)에서 수행하였다.
투여 시작한지 4 주후 약물 치료된 동물에서 RBC의 비-유의적 감소가 나타났지만, 대조군 대상 및 기준선 값과 비교하여 분석된 임의의 혈액학적 파라미터에 대해 SR-1의 의미있는 영향이 검출되지 않았다. 시험한 최고 용량에서, 4 주간 매주 1회 30 mg/kg, UT-7 IC50 효능의 70,000배보다 높은 노출 수준이 달성되었다. 혈액학적 파라미터에 대한 유효한 영향의 결여는 약물 치료된 무리와 대조군 무리사이에 차이가 없고 CD117 양성 조혈모세포의 고갈을 나타내지 않는 골수 조직병리학적 분석에 의해 확인되어, 아프리카 초록원숭이 NHP 종에서 조혈작용에 대한 잠재적인 중복 경로를 시사하였다. 흑색종에서도 유용성이 있을 수 있기 때문에, 멜라닌형성에 대해 4 주간 매주 1회 투여된 3 내지 30 mpk의 효과도 또한 시험하였다. 질환 상태를 보다 잘 반영할 수 있는 활성화된 멜라닌세포에 대한 효과를 평가하기 위해, 모발을 뽑아 멜라닌형성을 활성화시켰다. 모발의 정상적 모발 색은 어떤 무리에서도 가시적으로 영향을 받지 않았다. 그러나, 변화가능한 정도로 모발 착색의 억제가 30 mg/kg 용량을 투여받은 원숭이에서 새로 다시자란 모발에서 관찰되었다. 10 mg/kg 무리에서는 효과가 관찰되지 않아서, 무효과 용량이 10 내지 30 mg/kg임을 시사한다. 10 mg/kg 무리에서, SR-1 노출은 UT-7 IC50의 8000배 미만이었다. 비만세포 고갈에 대한 최대 효능은 UT-7 IC50의 7배 미만에서 달성되었다. 상기 데이터는 c-Kit 억제가 멜라닌세포 기능에 영향을 미치며, 더 높은 용량/노출은 과잉 멜라닌세포 활성을 특징으로 하는 질환에서 차단되어야 할 수도 있음을 시사한다.
정자생성
마우스 연구에서 c-Kit가 분화된 c-Kit 수용체-양성 정원세포의 유지 및 증식에 중요하지만 정원세포 세포 분화의 초기 단계에는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 불활성 c-Kit 수용체 대립유전자에 대한 이형접합체인 남성 및 여성 혼혈 대상 모두 수정되어, 상기 c-Kit 불활성화 정도가 근본 생식 세포 발달, 정자생성 또는 난자형성에는 영향을 미치는 것으로 보이지 않음을 시사한다.
SR-1은 0.3 내지 30 mg/kg으로 정자생성의 용량-의존성 억제를 나타내었다. 1 주일에 1회 0.3 mg/kg의 용량은 보다 높은 용량에서 관찰된 최대 효과보다 작으며, ED50을 결정하기 위해 저용량 탐색 연구가 필요하다. 달성된 노출은 UT-7 IC50의 7배로, 이것은 비만세포 팽창의 상처 모델에서 최대 효능에 필요한 노출이다. PK 추정은 항체가 최종 투여 1 개월후에 제거될 수 있을 것임을 시사하지만, 회복을 평가하기 위한 보존적 시점으로 9 개월을 선택하였다. 정상적 정자생성이 9 개월에서 모든 투약 동물에서 나타나, hSR-1 aIgG1-유사 분자의 사용이 남성 피임에 유용함을 입증한다.
요약
인간화 항 c-Kit 비-글라이코실화 IgG1(hSR-1 aIgG1) 항체는 c-Kit 신호전달의 근위부 및 원위부 판독물을 이용하여 시험한 모든 세포 기준 분석에서 무력하게 하는 매우 유효하고 특이적인 항체이다. 원래 상기 항체는 모(parent) 뮤린 단클론성 SR-1 항체에 대해 보고된 바와 같이 c-Kit 수용체 내재화 또는 포스포릴화를 매개하지 않는다. 인간화 IgG1, IgG2 및 IgG4 아이소타입에 대한 비-글라이코실화 IgG1 아이소타입의 선택은 표준 접근방법을 기초로 예상된 바가 없었다. hSR-1 aIgG1은, 막 c-Kit 수용체에서 적절한 약리학적 특성을 나타냄을 보이고, c-Kit 및 비만 세포에 대한 작용물질 활성을 배제하여 작동체 기능 및 방관자 효과를 통한 세포 사멸이 결여되게 하는 새로운 실험을 통해 실험적으로 선택되었다. 상기 항체는 원숭이에서 우수한 피하 생체이용률 및 반감기, 비선형 PK 및 포화성 표적-매개 항체 제거 및 비만세포 결실을 나타내었다. 이들 데이터는 적당한, 인간에 유효한 비만세포 결실 용량을 예상케 한다.
원숭이 상처 PD 모델에서 모체 마우스 SR-1 단클론성 항체의 최소 유효 용량은 0.3 mg/kg 미만(세포 IC50의 7 배보다 큰 Ctrough)이며, 약간 높은 노출(세포 IC50의 800 배보다 큰 Ctrough)이 또한 기저 피부, 결장 및 폐 비만세포를 고갈시키는데 효과적이었다. 유사하게, 새로 다시자란 모발에서 모발 착색에 대한 정량적 영향이 관찰될 수 있기 전에 세포 IC50의 8000 배보다 큰 노출 수준이 필요하다. 설치류에서 다중-키나제 억제제 및 c-Kit 항체를 사용하여 새로 자란 털에서 털 착색의 억제가 보고되었으며, hSR-1 aIgG1은 과도한 멜라닌세포 활성과 관련된 질환에서 유용성을 가질 수 있다. 상기 효과는 치료 중단시 역전가능하다. 정자생성의 억제에 대한 최대하(submaximal) 효과가 세포 IC50의 7 배 미만의 수준, 상처 PD 모델에서 최대 효능을 제공한 노출에서 나타났다.
본 명세서에 언급되고/되거나 출원서에 열거된 상기 미국 특허, 미국 특허출원 공개공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 출판물은 모두 본원에 그대로 참고로 인용된다.
상기 설명으로부터 본 발명의 특정 태양들은 본원에서 예시를 위해 기술하였으며, 본 발명의 진의 및 범주에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. <120> HUMANIZED C-KIT ANTIBODY <130> A-1126-WO-PCT <150> 60794771 <151> 2006-04-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 717 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg tgcctacggg 60 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120 atcaactgca gagccagtga aagtgttgat atttatggca atagttttat gcactggtac 180 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacc ttgcatccaa cctagaatct 240 ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 300 agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtac 360 acgttcggag gtgggaccaa ggtggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc 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aagagcttca acaggaatga gtgttga 717 <210> 8 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Leu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 Val Asp Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 9 <211> 1401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgggatgga gttgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180 ggacagggcc tggaatggat tggagttatt tattcaggaa atggtgatac ttcctacaat 240 cagaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caaatcaaca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag agagagggat 360 actcgttttg gtaactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacaaca 420 gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc ctcggtgact 480 ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct gagccagtga ccttgacctg gaactctgga 540 tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacaccctc 600 agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc tggcccagcc agtccatcac ctgcaatgtg 660 gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg gcccacaatc 720 aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc 780 atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt 840 gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac 900 gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg 960 gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc 1020 aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg 1080 tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa 1140 caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg 1200 accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat 1260 ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat 1320 agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc 1380 tcccggactc cgggtaaatg a 1401 <210> 10 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Ile Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Thr Arg Phe Gly Asn Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser 195 200 205 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 225 230 235 240 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 260 265 270 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 275 280 285 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 290 295 300 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 325 330 335 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 370 375 380 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 385 390 395 400 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 420 425 430 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 435 440 445 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 450 455 460 Gly Lys 465

Claims (32)

  1. c-Kit에 특이적으로 결합하고 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호: 2에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열번호: 2에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    서열번호: 4의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 결합제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상보성 결정 영역에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 이때 c-Kit에 대한 결합제 친화도가 유지되는, 결합제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 결합제.
  7. c-Kit에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4에 나타낸 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  8. 제 7 항에 있어서,
    서열번호: 4에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  9. 제 7 항에 있어서,
    서열번호: 4에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  10. 제 7 항에 있어서,
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 결합제.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상보성 결정 영역에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 이때 c-Kit에 대한 결합제 친화도가 유지되는, 결합제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 결합제.
  13. c-Kit에 특이적으로 결합하고 서열번호: 6에 나타낸 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    서열번호: 6에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  15. 제 13 항에 있어서,
    서열번호: 6에 나타낸 가변 영역 아미노산 서열과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 결합제.
  16. 제 13 항에 있어서,
    서열번호: 2의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 결합제.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상보성 결정 영역에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖고, 이때 c-Kit 에 대한 결합제 친화도가 유지되는, 결합제.
  18. 제 17 항에 있어서,
    하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 결합제.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 때, 10-2 미만의 c-Kit에 대한 결합력 kd를 나타내는 결합제.
  20. 서열번호: 2, 4 또는 6에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, c-Kit에 결합하는 특이적 결합제를 암호화하는 핵산.
  21. 서열번호: 1, 3 또는 5에 나타낸 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 핵산과 90% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  23. 제 22 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 핵산이 발현되어 특이적 결합제를 생성하도록 제 23 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 특이적 c-Kit 결합제의 제조 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    숙주 세포 배양액으로부터 특이적 결합제를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 대상(subject)에게 치료 효과량의 c-Kit 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 섬유증, 염증, 자가면역 또는 암 관련 c-Kit 질환 또는 질병을 경감시키거나 치료하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    질환 또는 질병이 섬유증인, 방법.
  28. 제 26 항에 있어서,
    길항물질 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    펩티드 또는 폴리펩티드 결합제, 가용성 수용체 또는 가용성 이종이량체 수용체가 Fc 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제 27 항에 있어서,
    섬유증 질환이 경피증, 간질성 폐질환, 특발성 폐 섬유증, 만성 B형 또는 C형 간염으로부터 야기된 섬유증, 방사선-유도된 섬유증 및 상처 치유로부터 야기된 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    섬유형성(profibrotic) 사이토카인에 대한 제 2 길항물질을 투여하는 것을 추가로 포함하고, 이때 상기 사이토카인이 형질전환 성장 인자 β(TGF-β), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨-13(IL-13), 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨-1 베타(IL-1β), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 인터류킨-6(IL-6), 온코스타틴 M(OSM), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 단핵구 주화성 단백질 1(CCL2/MCP-1), 및 폐 및 활성화-조절 케모카인(CCL18/PARC)으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  32. 치료 효과량의 제 1 항에 따른 조성물을 포함하는, 섬유증을 앓고 있는 대상에서 섬유증 질환을 경감하거나 예방하기 위한 약학 조성물.
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