MX2008013640A - Anticuerpo de c-kit humanizado. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con composiciones y métodos para tratar afecciones asociadas con c-Kit tales como fibrosis, y más particularmente, con composiciones que contienen anticuerpos c-Kit humanizados.

Description

ANTICUERPO DE C-KIT HUMANIZADO CAMPO TECNICO Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisoria Estadounidense No .60 /794 , 771 , presen-tada en Abril 24, 2006, la cual se incorpora en la presente para referencia.

Esta invención se relaciona con compuestos usados en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, fibróticas, autoinmunes y cancerosas asociadas con el c-Kit y con com-puestos que contienen anticuerpos c-K.it. humanizados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los mastocitos han estado implicados como mediadores de procesos inflamatorios tales como el asma, la artritis reumatoidea y la enfermedad inflamatoria intestinal y su par-ticipación en la inflamación alérgica está ampliamente reconocido. Los mastocitos se incrementan en número en explantos pulmonares de asmáticos severos y son la mayor fuente de mediadores inflamatorios clínicamente relevantes tales como leucotrienos , histamina y citoquinas Th2.Los mastocitos son la mayor fuente de TNF pre-formado en tejidos enfermos.

El Factor de Células Madre (SCF)es una glicoproteí-na que señaliza a través del receptor de tirosina kinasa asociado a la membrana celular de ahora en más definido como c- Kit, y este camino de señalización juega un papel clave en la hematopoyesis al actuar tanto en forma sinérgica como antagónica con otras citoquinas . Un receptor soluble de c-Kit puede jugar un rol en la regulación del SCF.E1 c-Kit se expresa en células madre hematopoyét icas pluropotenciales las cuales son precursoras de las células maduras pertenecientes a los linajes linfoideos y eritroideos. A diferencia de otras células hematopoyét icas , las precursoras de los mastocitos y los mastocitos maduros retienen altos niveles de expresión de c-Kit. Por lo tanto la señalización del SCF via c-Kit es vital para el desarrollo de los mastocitos , para su funcionamiento, tráfico y supervivencia . La misma juega un rol en la game-togénesis y melanogénesis . Los ratones con mutaciones de c-Kit inactivantes en el locus W prácticamente no poseen mastoci-tos. Las mutaciones de c-Kit activantes en humanos se asocian con la mastocitosis .

Las células madre hematopoyéticas pluripotenciales c-Kit positivas son precursoras de múltiples tipos de células que incluyen a las células mesenquimales , los fibroblastos y a los mastocitos. La enfermedad fibrótica se caracteriza en parte por una excesiva actividad y proliferación fibroblásti-ca que resultan en el depósito de matriz extracelular . Se ha reportado que las células madre hematopoyéticas pluripotenciales de médula ósea c- Kit positivas son la fuente de los fibroblastos y de los mastocitos que se encuentran en los tejidos fibróticos.

Los mastocitos pueden proveer una fuente sostenida de mediadores inflamatorios, angiogénicos , mitogénicos y fi-brogénicos. Los mastocitos se acoplan funcional y anatómicamente a los fibroblastos y tienen un papel directo en la activación de éstos. Los mastocitos aumentan la cinética y la magnitud de la contracción de los fibroblastos mediados por colágeno, el depósito de matriz extracelular y pueden transformar a los fibroblastos en miofibroblastos . Los fibroblastos a su vez secretan SCF para activar aún más y expandir a los mastocitos, y ambos tipos de células componen la red fi-brogénica .

El número de mastocitos y sus mediadores son significativamente elevados en la mayoría de las enfermedades fibróticas humanas incluyendo fibrosis pulmonar idiopática (IPF)y escleroderma . enotipos diferenciales de mastocitos se detectan en algunos pacientes con escleroderma y en el modelo de escleroderma Tsk de ratón. Una forma sistémica agresiva de mastocitosis puede caracterizarse por mielofibrosis indicando que los mastocitos pueden ser células efectoras en la fibrosis.

Gleevec TM y otros de la clase como Sutent TM son inhibidores de receptores tirosina quinasa de múltiples blan- eos que pueden actuar sobre la actividad de señalización de c-kit pero que inhiben a varias otras quinasas. Estos inhibidores de quinasa son indicados para tratamiento oncológico.

Se han reportado para Gleevec mielosupresión, anemia y un número de efectos colaterales que incluyen cardio-toxicidad y edema periferal. Por lo tanto estas moléculas pueden no poseer el mejor perfil riesgo-beneficio para el tratamiento crónico de enfermedades asociadas a la señalización de c-kit. Es asi que se necesitan nuevas terapias y reactivos, particularmente aquellos que sean más potentes y selectivos, y que posean mejores perfiles de seguridad para el tratamiento de enfermedades fibróticas e inflamatorias asociadas al c-kit. Tal compuesto también podría demostrar una eficacia y seguridad significativamente mayor en enfermedades oncológicas tales como la leucemia mieloide derivada , enfermedades asociadas a mutaciones de c-kit tales como GIST y mastocitosis , enfermedades asociadas a la sobreexpre-sión de c-kit y/o excesiva actividad autócrina de SCF como en el melanoma y en varios SCLCs . Actualmente faltan terapias y reactivos que se dirijan al c-kit humano y que sean capaces de otorgar un beneficio terapéutico sin efectos adversos significativos .

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención provee agentes que son antagonistas y antagonistas neutrales de SCF al receptor c-kit asociado a la célula, tales como los anticuerpos monoclonales.

En una realización más especifica, se proveen anti-cuerpos monoclonales humanizados (no murinos) que se unen al c-kit. En realizaciones aún mas especificas, los anticuerpos humanizados de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionados entre los expuestos en SEQ ID Nos 2,4 y 6. La invención también provee ácidos nucléicos que codifi-can a cualquiera de los anticuerpos precedentes o a los agentes de unión específicos. En una realización relacionada de la invención se provee un vector que comprende a cualquiera de las secuencias de ácido nucléico antes mencionadas.

En una realización, los agentes ligantes del c-kit y los antagonistas neutrales pueden comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,4 ó 6. En otra realización, cualquiera de los agentes ya mencionados comprenden una secuencia de aminoácido que es idéntica en por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a una o más de las secuencias de aminoácidos establecidos en SEQ ID NO:2,4 ó 6. En tales realizaciones, la variación de secuencia relativa a la SEQ ID NO: 2,4 ó 6, respectivamente, puede representar una sustitución conservativa de la secuencia marco correspondien- te de una IgG usando un aminoácido humano alternativo en esa posición .

En realizaciones ejemplares, el anticuerpo o el agente de unión especifico que une al c-kit comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2,4 ó 6. Sin embargo, se contempla que los anticuerpos de la invención puedan ser una mezcla de isotipos de anticuerpos de IgG (por ejemplo, una mezcla de subtipos IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4) Cualquiera de los anticuerpos antes mencionados pueden ser, por ej , un anticuerpo de IgG salvaje o mutado (por ejemplo del subtipo IgGl o IgG3 o de cualquier otro subtipo de IgG) Los anticuerpos ya mencionados pueden exhibir una avidez caracterizada por una kd menor que 1x10-2 o menor que 1 x 10"3, or 1 x 10"4, 1 x 10"5, 1 x 10"6, 1 x 10~7, 1 x 10" 8, or 1 x 10~9, determinada por resonancia de plasmon de superficie, (análisis por BIAcore) Los anticuerpos antedichos pueden exhibir un antagonista neutral con un IC50 de menos del x 10-2 , o menor que 1 x 10~3, or 1 x 1 x 10"5, 1 x 10~6, 1 x 10"7, 1 x 10~8, or 1 x 10"9, determinado por ensayos celulares. En una realización particular, la afinidad y la potencia funcional del anticuerpo humanizado es por lo menos comparable a la afinidad y potencia de un anticuerpo murino parental. En una realización preferida, el anticuerpo humanizado no es agonista del receptor c-kit y no activa mastocitos lo cual podría llevar a reacciones anafilácticas y debería exhibir un PD/PK y un perfil de inmunogenicidad que fuera al menos comparable al del anticuerpo murino parental.

En la presente invención se contemplan numerosos métodos. Por ejemplo, se provee un método de producir uno de los anticuerpos antedichos o un agentede unión específico que comprende el cultivo de la célula huésped antedicha de manera que el ácido nucléico se exprese para producir el anticuerpo o agente. Tales métodos también pueden comprender el paso de la recuperación del anticuerpo o agente del cultivo de la célula huésped. En una realización relacionada, se provee un anticuerpo o agente aislado producido por el método en cuestión .

La invención también provee métodos de utilización de cualquiera de los anticuerpos precedentes o agentes de unión específicos, por ejemplo, para tratar o para prevenir algún desorden asociado al c-kit por medio de la administración de una cantidad efectiva del mismo. Un ejemplo de desorden a tratar es la enfermedad fibrótica.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: SR-1 inhibe a los mastocitos activados en modelo de herida.

Figura 2 : Recuento de mastocitos en un modelo de cicatrización de herida.

Figura 3: Las isoformas humanizadas SR-1 inhiben la activación del c-kit inducida por el factor de célula madre (SCF) y la subsiguiente fosforilación via c-kit.

DESCRIPCION DETALLADA El anticuerpo SR-1 del c-kit antihumano murino está descripto en la Patente estadounidense No.5.919.911 y en la Patente estadounidense No .5.489.516, las cuales se incorporan en la presente para referencia. SR-1 demostró poseer propiedades adecuadas para unirse al c-kit y bloqueó la señalización del receptor mediada por el factor SCF, sin embargo esta molécula demostró no poseer todas las características que serían deseables en una terapéutica humana más allá de los aspectos obvios de inmunogenicidad . Broudy reporta que el SR-1 posee algún tipo de actividad agonista que podría conducir a la internalización y fosforili zación del receptor. (J Cell Physiol, 1994 Mar; 158(3) : 545-54.) Estas actividades funcionales hacen que la molécula sea menos eficaz y menos segura. Aunque la humanización de los anticuerpos monoclonales sea una metodología establecida y generalmente se espera que las actividades biológicas sean transferidas apropiadamente, la conformación del anticuerpo humanizado SR-1 que depende de la secuencia marco humana puede acarrear diferentes actividades intrínsecas al c-kit y de ese modo las funciones biológicas. En este ejemplo en particular, se buscarían las propiedades farmacológicas deseadas pero no las propiedades "agonistas" no deseadas, pero la metodología para lograr esto no ha sido publicada. Las regiones determinantes complementarias del anticuerpo SR-1 se insértaron en una combinación única de las cadenas pesadas y livianas humanas con diferente estructura de IgGl eIgG2 e IgG4, y sorprendentemente, mantuvieron una afinidad similar al c-kit. Sin embargo, cada una de estas regiones de secuencia marco demostró poseer desventajas.

El SR-1 humanizado en la estructura de IgG2 demostró tener una alta afinidad al c-kit, pero en múltiples tipos de células no demostró poseer capacidad de bloquear por completo la internali zación del receptor mediado por SCF y en ensayos de mastocitos en cultivo provocó fosforilación del c-kit, una señal de supervivencia, y medió una acumulación (clumpling) inusual de las células. Estas propiedades son potencialmente indeseables ya que el objetivo de una estrategia terapéutica es el de eliminar apoptóticamente a los mastocitos y precursores bloqueando la señal de supervivencia del SCF y el de evitar la activación de los mastocitos lo cual podría conducir a reacciones anafilácticas in vivo. Cuando las regiones CDR del anticuerpo SR-1 de ratón se insertaron en la secuencia marco de IgG 1 humana, se mantuvieron la afinidad y la potencia funcional, pero esta estructura es menos deseable debido a la activación del complemento y a la citotoxicidad mediada por células que se encuentra comúnmente en este isotipo de anticuerpo. Cuando las regiones CDR del anticuerpo SR-1 fueron insertadas en la secuencia marco de IgG4 humana, también se mantuvieron la afinidad y potencia funcional pero, inesperadamente, esta molécula demostró una agiregación significativa luego de la purificación y realización a escala mayor.

Por lo tanto los inventores buscaron superar las deficiencias en cada una de estas moléculas creando un anticuerpo que no tuviera activación del complemento, y que no activara el c-kit y los mastocitos a la vez que retuviera la afinidad deseada, la potencia antagonista pura del receptor c-kit de membrana, y no del receptor c-kit soluble. Este anticuerpo debería asimismo demostrar un PD/PK apropiado y ser eficaz en la eliminación de los mastocitos y no dejar evidencia de estimulación de mastocitos in vivo.

Cadena liviana kappa del SR-1 humanizado Seq Id No:l representa el ácido nucléico que codifica la cadena liviana kappa del SR-1 humanizado.

ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGG ACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCAT CAACTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATATTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAG CAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGG TCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCT GCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGTACACGTTC GGAGGTGGGACCAAGGTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA (SEQ ID NO:l) Seq Id No : 2 es la siguiente en donde el tipo de letra resaltado (negrita) representa los CDRs (por ejemplo, CDR1 es aminoácidos 43 al 58 de la SEQID NO:2,CDR2 es aminoácidos 74 AL 80 de la SEQ ID NO : 2 y CDR3 es aminoácidos 113 al 121 de la SEQ ID NO:2) 1 MVLQTQVFIS LLL ISGAYG DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD 51 IYGNSFMHWY QQKPGQPPKL LIYLASNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS 101 SLQAEDVAVY YCQQNNEDPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF I FPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO : 2 ) .

Una cadena liviana kappa humanizada madura está formada por aminoácidos 20 al 248 de la SEQ ID NO : 2 Cadena pesada aglico-IgGl del SR-1 humanizado Seq Id No : 3 ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCAGTGGCCCCAGGTGCCCACTCCCAGG TGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTG CA7GGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGA CAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGA AGTTCAAAGGCAGGGTCACCATTACCGCTGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCT GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGATACTCGT TTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAA AACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGT GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGA GAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 3) .

Los CDRs se representan resaltados ( e : CDR1 es aminoácidos 50 al 54 de la SEQ ID NO:4,CDR2 es aminoácidos 69 al 85 de la SEQ ID NO:4,y el CDR3 es aminoácidos 118 al 125 de la SEQ ID NO : ) 1 MDWT RVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS 51 YNMHWVRQAP GQGLE GVI YSGNGDTSYN QKFKGRVTIT ADKSTSTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARERD TRFGNWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS 151 SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 201 LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTCPPCPA 251 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 301 VEVHNAKTKP REEQYQSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 351 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 401 ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 451 LHNHYTQKSL SLSPGK (Seq Id No: 4) Cadena pesada de IgG2 SR-1 humanizado ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCAGTGGCCCCAGGTGCCCACTCCCAGG TGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTG CAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTACAATATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGA CAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGA AGTTCAAAGGCAGGGTCACCATTACCGCTGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCT GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGATACTCGT TTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG TGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACC AGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (Seq Id No: 5) La siguiente es la secuencia completa de aminoácidos de la cadena pesada de IgG2 del SR-1,Y LOS CDRs están resaltados : 1 MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS 51 YNMH VRQAP GQGLEWMGVI YSGNGDTSYN QKFKGRVTIT ADKSTSTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARERD TRFGNWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPC 151 SRSTSESTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 201 LSSVVTVPSS NFGTQTYTCN VDHKPSNTKV DKTVERKCCV ECPPCPAPPV 251 AGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVQF NWYVDGVEVH 301 NAKTKPREEQ FNSTFRVVSV LTVVHQD LN GKEYKCKVSN KGLPAPIEKT 351 ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 401 QPENNYKTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH 451 YTQKSLSLSP GK (Seq Id No: 6) SR-1 MULC ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTA ACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCTGAGGGCCACCAT ATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATATTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAG CAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGG TCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGT GGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGTACACGTTC GGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCC CACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTT CTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTC CTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCA CGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGAC ATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGA (SEQ ID NO: 7) Los CDRs se representan resaltados: 1 METDTLLL V LLLWVPGSTG NIVLTQSPAS LAVSLGLRAT ISCRASESVD 51 IYGNSFMHWY QQKPGQPPKL LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID 101 PVEADDAATY YCQQ EDPY TFGGGTKLEI K RADAAPTVS IFPPSSEQLT 151 SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKI DGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (Seq Id No: 8) Cadena pesada mu!gG2a del SR-1 ATGGGATGGAGTTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGG TGCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGA CAGGGCCTGGAATGGATTGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGA AGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAAAT CAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAGAGGGATACTCGT TTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCAT CGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATG CCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCC AGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAG TGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGC AAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCT CCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAA AGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGT GAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACA GCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCC CCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGA CCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAG GTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCA TGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGA GCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGC AAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCctgttcagtggtcc acgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaatgA (Seq Id No: 9) 1 MGWSCIILFL VATATGVHSQ VQLQQPGAEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YNMHWVKQTP 61 GQGLEWIGVI YSGNGDTSY QKFKGKATLT ADKSSSTAYM QINSLTSEDS AVYYCARERD 121 TRFGNWGQGT LVTVSAAKTT APSVYPLAPV CGDTTGSSVT LGCLVKGYFP EPVTLTWNSG 181 SLSSGVHTFP AVLQSDLYTL SSSVTVTSST WPSQSITCNV AHPASSTKVD KKIEPRGPTI 241 KPCPPCKCPA PNLLGGPSVF IFPPKIKDVL MISLSPIVTC VVVDVSEDDP DVQISWFVNN 301 VEVHTAQTQT HREDYNSTLR VVSALPIQHQ DWMSGKEFKC KVNNKDLPAP IERTISKPKG 361 SVRAPQVYVL PPPEEEMTKK QVTLTCMVTD FMPEDI YVEW TNNGKTELNY KNTEPVLDSD 421GSYFMYSKLR VEKKNWVERN SYSCSVVHEG LHNHHTTKSF SRTPGK (Seq Id No: 10) La cadena liviana CDR1 del SR-1 es RASESVDIYGNS FMH (aminoácidos 44 al 58 de la SEQ ID NO:8),CDR2 es LASNLES ( aminoácidos 74 al 80 de la SEQ ID NO:8) ,y CDR3 es QQNNED-PYT (aminoácidos 111 al 121 de la SEQ ID NO:8) .La cadena pesa-da CDR1 es SYNMH, (aminoácidos 50 al 54 de la SEQ ID NO:10),CDR3 es RDTRFGN, (aminoácidos 118 al 125 de la SEQ ID NO: 10) Se entiende que cada una de las cadenas pesadas y livianas ilustradas en la presente solicitud son procesadas en la célula a la forma madura. De acuerdo con ello, los pépti-dos señales son escindidos y en el caso de cadenas pesadas de anticuerpos , la Usina C-terminal es escindida. De la misma manera, la forma madura es procesada proteoiit icamente y también se incluyen otras modificaciones post traduccionales ta-les como la glicosilación si está expresada en células de mamíferos. El péptido señal para cada una de las cadenas pesadas y livianas son los aminoácidos 1 al 20 de las SEQ ID Nos: 2 y 10, y los aminoácidos 1 al 19 de las SEQ ID Nos:4,6 y 10.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena liviana de SR-1 murino están indicadas en la SEQ ID N0:7 y en la SEQ ID N0:8.Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de SR-1 murino están indicadas en la SEQ ID NO : 9 y en la SEQ ID NO : 10. Variantes con otras substituciones (ej : substituciones conservativas de los aminoácidos murinos) pueden también retener el alto grado de afinidad de unión. Las substituciones , supresiones o inserciones en posiciones dentro de las CDRs y la secuencia marco pueden efectuarse sin tener que afectar la afinidad.

En una realización, el anticuerpo humanizado comprende una cadena liviana que retiene los CDRs murinos originales del SR-1 murino, por e , las posiciones aprox.44-58, aprox 74-80 y aprox 113-121 de la SEQ ID NO:8.En otras reali-zaciones el anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada que retiene los CDRs murinos delSR-1 murino, por ej , las posiciones aprox 50-54, aprox 68-85 y aprox 118-125 de la SEQ ID NO: 10, y posee una región de secuencia derivada humana. Se entiende que el término "aprox" aquí usado contempla de dos a cinco cambios de posición de aminoácidos en tanto la afinidad al c-kit se mantenga.

En una realización, tales agentes pueden comprender una secuencia de aminoácidos indicada en las SEQs ID NO: 2, ó 6. En otra realización, cualquiera de los agentes antes mencio- nados comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6. En dichas realizaciones , la variación de secuencia relativa a la SEQ ID NO : 2 , 4 , ó 6 , respectivamente , puede representar, por ejemplo, una sustitución conservativa de la correspondiente región de secuencia marco de una IgG que utiliza un aminoácido humano alternativo en esa posición.

En una realización, los mencionados anticuerpos exhiben una avidez caracterizada por una kd de menos de 10~2, or lower than 10"3, or 10"\ 10"5, 10"6, 10~7, 10"8, 10"9' determinada por resonancia de plasmon de superficie (análisis de BIAco-re)En otra realización los anticuerpos exhiben una potencia antagonista pura con un IC50 menor al x 10~2, o menor que 1 x 10~'3, or 1 x 10~4, 1 x 10"5, 1 x 10"6, 1 x 10"7, 1 x 10~8, 1 x 10~9, determinada por ensayos celulares.

La presente invención provee una variedad de agentes antagonistas neutros y de unión especifica, que incluyen pero no se limitan a los anticuerpos específicos de c-kit humanos o humanizados , que se derivan del SR-1 murino y retienen características deseables tales como Kd (constante de disociación) para el c-kit en el rango del x 10~2 o menor, o que descienda a 1 x 10"9 o menor, (e.g., 10"2, 10"3, 10"4, 10"5, 10~6, 10~7, 10 8, 10 9 o menor) y/o antagonista IC50 neutral para c-Kit en el rango de 1 x 10~2 o menor, o que descienda a 1 x 10~ 9 o menor, (e.g., 10"2, 10"3, 10~4, 10"5, 10"6, 10~7, 10"8, 10~9 o menor ) y/o la abilidad de reducir los síntomas de un desor-den asociado al c-kit.La invención también provee ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de unión específica, vectores y células huésped recombinantes las cuales comprenden dichos ácidos nucléicos , los métodos de producción de dichos agentes de unión especí fieos , fórmulas terapéuticas incluyendo dichos agentes de unión especí fieos , métodos de preparación de las fórmulas farmacéuticas , y los métodos de tratamiento de pacientes con las fórmulas farmacéuticas y los compuestos.

Los ácidos nucléicos que codifican a estas regiones modificadas de cadena liviana variable fueron construidos y co-expresados con ácidos nucléicos que codifican una CDR-injertada o una cadena pesada humanizada y viceversa, y opcio-nalmente pueden estar vinculados a regiones constantes. Cualquier cadena pesada y liviana humanizada o quimérica puede ser combinada en tanto se mantenga una afinidad de unión ade-cuada . Los genes deseados se introdujeron en células de mamíferos y los productos resultantes de inmunoglobulina recombi-nante fueron expresados , purificados y caracterizados.

El término "anticuerpo"es usado en su sentido mas amplio e incluye a los anticuerpos totalmente ensambla- dos , anticuerpos monoclonales ( incluyendo anticuerpos humanos , humani zados o quiméricos ), anticuerpos policlona-les , anticuerpos multiespecificos (e : anticuerpos biespecífi-cos),y fragmentos de anticuerpos que puedan unirse al antigeno (ej:Fab',F' (ab)2,Fv, anticuerpos de cadena simple , diacuerpos ), que comprendan regiones determinantes de com-plementariedad (CDRs)de los ya mencionados en tanto estos exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo" excluye explícitamente del alcance del término a los anticuerpos murinos (o sea el anticuerpo producido por un hibri-doma murino o que posea la misma secuencia que un anticuerpo producido por un hibridoma murino) .

El término "agente de unión especifico" incluye a los anticuerpos definidos anteriormente y a los péptidos re-combinantes u otros compuestos que contengan secuencias derivadas de las CDRs que posean las propiedades deseadas de unión al antigeno.

Se incluyen específicamente dentro del término a los péptidos que contienen secuencias de aminoácidos que sean idénticas en al menos un 80%, 90% o un 100% a una o más CDRs de SR-1 murino, preferentemente que incluyan la cadena pesada CDR3.

El término "antagonista neutralizante" se entiende como un agente de unión específico capaz de inhibir la acti- vidad de un agonista . Estos agentes incluyen a los anticuerpos definidos anteriormente y a los péptidos recombinantes u otros compuestos que contengan secuencias derivadas de las CDRs con propiedades de unión al antigeno deseadas.

Incluidos específicamente en el término están los péptidos con secuencias de aminoácidos idénticas al menos en un 80%, 90% o 100% a una o más CDRs del SR-1 muri-no, preferentemente que incluyan CDR3 de cadena pesada.

También están incluidos en el término los "pepti-cuerpos" que son moléculas que comprenden un dominio Fe del anticuerpo como "vehículo" unido a por lo menos un péptido de unión al antígeno.Las CDRs del anticuerpo SR-1 pueden ser adecuadas para su incorporación a un pepticuerpo, que incluya particularmente la CDR3 de la cadena pesada. La producción de pepticuerpos está descripta en forma general en la publicación PTC WO 00/24782, publicada el 4 de mayo, 2000. Los péptidos pueden estar conectados en tándem (o sea, secuencialmente) , con o sin conectores . Los péptidos que contienen un residuo de cisteína pueden ser reticulados con otro péptido que contenga cisteína , pudiendo cualquiera de los dos o ambos ser unidos a un vehículo . Cualquier péptido que tenga más de un residuo de cisteína puede también formar un puente disulfuro intrapéptido .

Cualquiera de estos péptidos puede ser derivatiza-do,por ejemplo el extremo carboxilo terminal puede ser finalizado con un grupo amino,las cisteinas pueden ser finalizadas, o los residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos por fracciones que no sean residuos de aminoácidos (ver por ej,Bhatnagar et al., J . Med . Chem .39 : 3814 - 9 ( 1996 ) , y Cuthbert-son et al., J . Med . Chem . 0 : 2876-8281997 ) , los cuales se incorporan para referencia en su totalidad) . Las secuencias de péptidos pueden ser optimizadas de forma análoga a la maduración de afinidad para los anticuerpos , o bien alteradas por scan-ning de alanina o por mutagénesis aleatoria o dirigida seguida de tamizado para identificar a los que posean mejor capacidad de unión. Lowman, Ann . Rev . Biophys . Biomol . Struct .26 : 401-24 (1997) Varias moléculas pueden insertarse en la estructura del agente de unión especifico , por ej, dentro de la porción misma del péptido o entre el péptido y las porciones vehículo de los agentes de unión específicos.

Se pueden fácilmente insertar, por ejemplo, moléculas tales como un dominio Fe o fragmento del mismo, polieti-nelglicol u otras moléculas relacionadas como el dextrano, un ácido graso, un lípido, un grupo de colesterol, un carbohidrato pequeño, un péptido, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, una fracción detectable como la ya des- cripta (incluyendo agentes fluorescentes, marcas radioactivas tales como radioisótopos), un oligosacárido, oligonucleótido, polinucleótido, ARN de interferencia (u otro) , enzimas, hormonas, o semejantes. Otras moléculas apropiadas para este ti-po de inserción serán apreciadas por los expertos en la técnica, y dichas moléculas se hallan dentro del alcance de la presente invención. Esto incluye la inserción de, por ejemplo, una molécula deseada en el medio de dos aminoácidos consecutivos, unidos opcionalmente por un conector apropiado.

Anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado de un componente de la célula que lo expresa. Los componentes contaminantes de la célula son materiales que; podrían interferir con los usos diagnósticos y terapéuticos del anticuerpo, y pueden ser éstos enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no-proteináceos . En realizaciones preferidas , el anticuerpo será purificado ( 1 ) a más del 95% por peso de anticuerpo, y preferentemente aún a mas del 99% por peso, (2) a un grado suficiente como para obtener al menos 15 residuos de secuencia aminoacídica interna o N-terminal , o ( 3 ) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones re-ductoras o no-reductoras usando Coomassie azul o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo que se halla aislado naturalmente incluye al anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambien- te natural del mismo no se hallará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por medio de por lo menos un paso de purificación.

El término "anticuerpo monoclonal" incluido en este escrito refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden dicha población son idénticos excepto por posibles mutaciones que pueden ocurrir de forma natural que pueden estar presentes en cantidades meno-res. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos en contra de un sitio antigénico individual o epítope, al contrario de las preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos en contra de diferentes epítopes.

Las inmunoglobulinas humanas pueden asignarse a distintas clases dependiendo de la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas. Existen cinco grandes clases, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y muchas de éstas pueden a su vez dividirse en subclases o isotipos, por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamadas alfa, delta, epsilon, gama y mu respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmu- noglobulinas son ampliamente conocidas. Diferentes isotipos poseen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos de IgGl y de IgG3 poseen actividad de ADCC.

El término región "hipervariable" se refiere a los residuos aminoacidicos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antigeno. La región hipervariable comprende residuos de una región determinante complementaria o de CDR [o sea, residuos 24-34 (Ll ) , 50-56 (L2 ) y 89-9 (L3)en el dominio variable de cadena liviana y 31-35 (Hl ), 50-65 (H2 ) y 95-102(H3)en el dominio variable de cadena pesada según lo describe Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service , ational Institutes of Health, Bethesda, d (1991)] . Hasta una CDR simple puede reconocer y ligar antigeno , aunque con una afinidad menor que la del sitio de unión al antigeno entero que contiene la totalidad de las CDRs . Se entiende que la CDR de un anticuerpo puede incluir secuencias adicionales o menores por fuera de los limites especificados más arriba en tanto el anticuerpo retenga su capacidad de unión con la molécula objetivo ( tar-get.) Una definición alternativa de residuos de "lazo" (loop) hipervariable está dada por Chothia et al., J. ol.Biol 196:901-917(1987) como los residuos 26-32 (Ll ), 50-52 (L2 ) y 91-96(L3)en el dominio variable de cadena liviana y 26-32 ( Hl ) , 53-55 ( H2 ) , Y 93-101(H3)en el dominio variable de cadena pesada .

"Estructura" o residuos de FR son aquellos residuos de región variable distintos de los residuos de región hiper-variable .

Los "Fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo completo intacto preferentemente la región variable o de unión al antigeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab' , F(ab')2, y fragmentos de Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al.,Protein Eng., 8 ( 10) : 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespe-cíficos formados por fragmentos de anticuerpo.

La digestión por Papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antigeno llamados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales tiene un único sitio de unión al antigeno , y un fragmento residual de "Fe" que contiene la región constante. El fragmento Fab contiene a todo el dominio variable asi como al dominio constante de la cadena liviana y al primer dominio constante (CHl)de la cadena pesada. El fragmento Fe exhibe carbohidratos y es responsable de varias funciones efectoras del anticuerpo (tales como unión de complemento y receptores celulares), que distinguen una clase de anticuerpo de la otra.

El tratamiento con Pepsina produce un fragmento F(ab' )2 que posee dos "Fv de cadena simple" o fragmento de anticuerpo "sFv" que comprenden a los dominios VH Y VL en donde estos dominios están presentes en una cadena polipépti-da simple. Los fragmentos de Fab difieren de los fragmentos Fab' en la inclusión de unos cuantos residuos adicionales en la terminal carboxil del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteinas de la región bisagra del anticuerpo. Preferentemente, el polipéptido Fv además comprende un conector polipéptido entre los dominios VH Y VL que permite que el Fv forme la estructura deseada para la unión al antigeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The Pharma-cology of Monoclonal Antibodies, vol.l 13 Rosemburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, PP. 269-315 (1994) .

El "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión al antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de una región variable de una cadena pesada y una cadena liviana en ajustada asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antigeno en la superficie del dímero VH VL . Colectivamente, las seis CDRs confieren al anticuerpo una especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicas para un antigeno) posee la capacidad de reconocer y unir al antígeno, pero con una afinidad menor que el sitio entero de unión.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños frag-mentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) en la misma cadena polipéptida (VH VL) . Al usar un co-nector que es demasiado corto como para permitir el aparéamiento entre dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear así dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos están descriptos en mayor profundidad en, por ejemplo, EP 404,097;WO 93/11161; y 30Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).

Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente estos fragmentos eran derivados vía digestión proteolitica de anticuerpos intactos, pero también pueden ser producidos directa-mente por células hospedantes recombinantes . Ver por ejemplo, Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988); Cárter et al., Bio/Technology 10 : 163-167 (1992) .

Como se provee en este escrito, las composiciones y métodos de tratamiento de desórdenes inflamatorios, autoinmu-nes, oncológicos y fibróticos pueden utilizar una o más terapéuticas anti-c-Kit individualmente o en combinación con otras terapéuticas para lograr los efectos deseados. Los agentes antifibróticos ejemplares adecuados para su uso de acuerdo a la invención incluyen a las citoquinas en donde la citoquina es seleccionada del factor de crecimiento ß transformante (TGF-ß), interleuquina-4 (IL-4) , interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-9 (IL-9), interleuquina-13 (IL-13), factor de estimulación de colonia granulocito/macrófago (GM-CSF) , factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) , interleuquina-1 beta(IL-l ß), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) , interluquina-6 (IL-6), oncostatina M (OSM) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), proteina 1 monocito quimiotáct ica (CCL2/MCP-1) y quimiocina pulmonar de activación regulada (CCL18/PARC) .

Los anticuerpos derivados de la SR-1 de acuerdo a la presente invención son producidos preferentemente por me-todologia de ADN recombinante usando uno de los bien conocidos sistemas de expresión de anticuerpos, (ver, e , Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La-boratory (1998) ) . Tales anticuerpos son también preferentemente proteínas de fusión quimérica que poseen secuencias va- riables de inmunoglobulina derivada y regiones constantes humanas, o más preferentemente aún son anticuerpos monoclona-les más parecidos a los de los humanos (tales como los anticuerpos humanos o humanizados) que comprenden los residuos de anticuerpo humano pero preferentemente retienen por lo menos las CDRs del SR1 murino. Además de referirse a las moléculas intactas completas, el término "anticuerpo" hace referencia a fragmentos de las mismas o multimeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos que se unen al c-Kit.

La frase "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo monoclonal de ratón. Alternativamente, un anticuerpo humanizado puede derivarse de un anticuerpo quimérico que retiene o retiene sustancialmente las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo parental no humano pero el cual exhibe una inmunogenicidad disminuida en comparación con el anticuerpo parental cuando es administrado a los humanos. La frase "anticuerpo quimérico", usada en el presente escrito, refiere a un anticuerpo que contiene una sustancia deri-vada de dos diferentes anticuerpos (ver, por ejemplo, U.S. Patent No. 4,816,567) que típicamente tiene su origen en diferentes especies. Mas típicamente los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpos humanos y murinos, generalmente regiones humanas constantes y variables de ratón.

Producción Recombinante de Anticuerpos La secuencia aminoacidica de una inmunoglobulina de interés puede ser determinada por secuenciación de proteína directa, y se pueden designar secuencias nucleotídicas codi-ficantes apropiadas de acuerdo a una tabla de codones universal.

Alternativamente, el ADN que codifica a los anticuerpos monoclonales puede ser aislado y secuenciado de las células de hibridoma usando procedimientos convencionales (ejemplo, usando sondas oligonucleót icas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos monoclonales) . La determinación de la secuencia generalmente requerirá aislar por lo menos una porción del gen o ADNc de interés. Esto usualmente re-quiere la clonación de ADN o preferentemente, ARNm (osea, CDNA) que codifique los anticuerpos monoclonales. La clonación se lleva a cabo usando técnicas estándar (ver ejemplo Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, incorporado aquí como re-ferencia) . Por ejemplo una biblioteca de ADNc puede construirse por transcripción inversa de polyA+ARNm, preferentemente ARNm asociado a la membrana, y dicha biblioteca puede ser tamizada usando sondas específicas para secuencias de genes polipéptidos de inmunoglobulina humana. En una realiza- ción preferida, sin embargo, la reacción en cadena de la po-limerasa (PCR) se usa para amplificar ADNsc (o porciones de ADNsc completas) que codifiquen un segmento de gen de inmuno-globulina de interés (ej . , un segmento variable de cadena li-viana) . Las secuencias amplificadas pueden ser fácilmente clonadas en cualquier vector apropiado, ej . vectores de expresión, vectores de minigen, o vectores de representación de fagos. Se apreciará que el método particular de clonación usado no posee relevancia critica en tanto que sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés.

En este escrito una molécula de ácido nucleico "aislada" o una secuencia ácidonucleica "aislada" es una molécula de ácido nucleico que ha sido ya sea (1) identificada y separada de al menos una molécula ácidonucleica contaminante con la cual está generalmente asociada en la fuente natural de ácido nucleico o (2) clonada, amplificada, marcada o distinguida de alguna otra manera de los ácidos nucleicos acompañantes de tal manera que la secuencia del ácido nuclei-co de interés pueda ser determinada. Una molécula de ácido nucleico aislada reviste una forma diferente de aquella que se encuentra en la naturaleza. Sin embargo una molécula ácidonucleica aislada incluye a una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo dicha molécula está en una ubicación cro-mosómica diferente de la de las células naturales.

Una fuente de ARN usado para clonación y secuencia-ción es un hibridoma producido de la obtención de una célula B de ratón transgénico y de la fusión de la célula B con una célula inmortal. La ventaja de usar hibridomas consiste en que éstos pueden ser fácilmente tamizados y que puede seleccionarse un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal humano de interés.

Alternativamente, el ARN puede ser aislado de células B (o bazo completo) de animal inmunizado. Cuando se usan fuentes distintas de hibridomas, puede ser deseable tamizar secuencias que codifiquen inmunoglobulinas o polipéptidos de inmunoglobulina con características de unión específica. Un método de tamizado es el uso de tecnología de representación de fagos. La representación de fagos está descripta en, ej . , Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047 y Catón y Koprowski, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 87:6450-6454 (1990), cada uno de los cuales está incorporado en el presen-te escrito para referencia . En una realización en la que se use tecnología de representación de fagos, se aisla ADNc de un ratón transgénico ( ej,ADNc de bazo), la reacción en cadena de polimerasa se usa para amplificar secuencias de ADNc que codifican una porción de polipéptido de inmunoglobuli- na , ej , regiones CDR , y las secuencias amplificadas se insertan en un vector fago. Los péptidos de interés que codifican ADNsc, ej, péptidos de región variable con las características de unión deseadas, se identifican por medio de técnicas están-dar como el paneo ( panning) .

La secuencia del ácido nucleico amplificado o clonado es luego determinada . Típicamente se determina la secuencia que codifica una región variable entera de polipéptido de inmunoglobulina , sin embargo, a veces será adecuado secuenciar una porción de región variable, por ejemplo, la porción que codifica CDR. En general la porción secuenciada será de al menos 30 bases de largo, con mayor frecuencia se secuenciarán las bases que codifiquen al menos cerca de un tercio o al menos la mitad del largo de la región variable.

La secuenciación puede ser efectuada sobre clones aislados de una boblioteca de ADNc , o cuando se use PCR, luego del subclonado de la secuencia amplificada o por secuenciación directa de PCR del segmento amplificado . La secuenciación se lleva a cabo usando técnicas estándar (ver , ej , Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide,Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press y Sanger,F.et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, que se incorpora aquí para referencia) . Al comparar la secuencia del ácido nucléico clonado con las secuencias de genes de inmunoglobulina humana y ADNsc publicadas quien maneje el arte será fácilmente capaz de determinar, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso del segmento de linea germinal del hibridoma inmunoglobulino po-lipéptido (que incluye al isotipo de la cadena pesada) y (ii)la secuencia de las regiones variables de cadena liviana y pesada, incluyendo a las secuencias que resultan de la adición de la región-N y del proceso de mutación somática. Una fuente de información de la secuencia del gen de inmunoglobu-lina es el National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health Bethesda, Md.

Una vez aislado, el ADN puede ser unido operablemente a secuencias de control de expresión o ubicado dentro de vectores de expresión, los cuales son luego transferidos a células hospedantes como las de E.Coli, células COS de simio, células de ovario de hámster de China (CHO) , o células de mieloma que de otro modo no producen la proteina inmunoglobu-lina, para dirigir la síntesis de los anticuerpos monoclona-les en las células hospedantes recombinantes . El método de producción recombinante de anticuerpos es bien conocido.

Las secuencias de control de expresión refieren a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operablemente a un organismo hospedante particular. Las secuencias de control que son adecuadas para las procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, op-cionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosomas . Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y ampliadores.

El ácido nucléico se halla unido operablemente cuando se ubica en una relación funcional con otra secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder secretorio se halla unido operablemente al ADN para po-lipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido ; un promotor o ampliador se encuentra unido operablemente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de dicha secuencia; o un sitio de unión de ribosomas se halla unido operablemente a una secuencia codificante si se encuentra posicionado de manera tal de facilitar la traducción. Por lo general , "unido operablemente" significa que las secuencias de ADN a unir son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, significa contiguo y en fase de lectura.

Sin embargo, los ampliadores no son necesariamente contiguos. La unión se logra por fijación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o eslabones de acuerdo a los métodos convencionales.

Célula, línea celular, y cultivo de células se usan a menudo de modo intercambiable y la totalidad de dichas designaciones incluye a la progenie. Las células transformadas y las transformantes incluyen a la célula sujeto primaria y a los cultivos derivados de la misma sin importar el número de transferencias. Asimismo se entiende que no toda la progenie puede ser exactamente idéntica en cuanto a contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluyen progenies mutantes que poseen la misma función o actividad biológica que la examinada en la célula transformada originalmente .

La invención también provee ácidos nucléicos aislados que codifican agentes de unión específicos o anticuerpos de la invención, opcionalmente unidos de manera operable a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedante, vectores y células hospedantes que comprenden a los ácidos nucléicos, y las técnicas recombinantes para la producción de los agentes de unión específica o anticuerpos, lo cual puede comprender el cultivo de la célula hospedantes con el fin de lograr la expresión del ácido nucléico y, opcionalmente , recuperar el agente de unión específico o anticuerpo del cultivo de célula hospedante o del medio de cultivo.

Se conocen varios vectores en esta técnica. Los componentes de vectores pueden incluir uno o más de los si- guientes elementos: una señal de secuencia (que puede, por ejemplo, dirigir la secreción directa del agente de unión especifico o anticuerpo ), un origen de replicación, uno o más genes de marcación selectiva ( que pueden, por ejemplo, conferir resistencia a los antibióticos u otras drogas, complementar deficiencias auxotróficas , o proveer nutrientes críticos no disponibles en los medios), un elemento ampliador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, todos los cuales son bien conocidos.

Las células hospedantes adecuadas incluyen a las procariotas, la levadura, o a las células eucariotas mayores descriptas anteriormente. Para este fin se considera procariotas adecuadas a las eubacterias, tales como los organismos Gram negativos o Gram positivos , ej emplo Enterobacteriaceae como la Escherichia ,ej , E.Coli, Enterobacter, Erwinia, Kleb-siella, Proteus, Salmonella , ej , Sal onella typhimurium, Se-rratia, ej Serratia marcescans y Shigella , asi como Bacilos tales como B.subtilis y B . licheniformis , Pseudomonas , y Strep-tomyces. Además de las procariotas, los microbios eucarióti-eos tales como hongos filamentosos o levadura son adecuados hospedantes de clonación o expresión para los vectores de codificación de agentes de unión específica. La Saccharomyces cerevisiae o levadura común de panadería , es la más comúnmente usada entre los microorganismos hospedante eucarióticos menores. Sin embargo, un sinnúmero de otros géneros, especies,;/ cepas están por lo común disponibles y son de utilidad aquí, tales como Pichia, ej , P.pastoris, Schizosaccharomyces pombe;Kluyveromyces , Yarrowia ; Candida ; Trichoderma reesia; Neu-rospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentales; y hongos filamentosos tales como, ej , Neurospora, Penicillium , Tolypocladium , y hospedantes Aspergillus tales corno A. nidulans y A. Niger.

Las células hospedantes adecuadas para la expresión del agente de unión especifico glicosilado se derivan de organismos multicelulares . Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y las correspondientes células hospedantes de insectos permisivos de hospedantes tales como la Spodóptera frugiperda (oruga) , Ae-des aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito ) , Drosóp-hila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para transfección de dichas células están disponibles al público, ej , la varianteL-1 de la Auto-grapha californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en las células de vertebrados , y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha transformado en un procedimiento de rutina. Ejemplos de lineas de células hospe- dantes de mamífero de utilidad son las de ovario de hámster de China, incluyendo las células CH0K1 (ATCC CCL61 ) , DXB-11 , DG-44, y las de ovario de hámster de China DHFR (CHO, Urlaub et al: , Proc. ati. Acad.Sci. USA 77 : 4216 ( 1980) ) ; línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7,ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo de suspensión, [Graham et al., J.Gen Virol .36 : 59 ( 1977 ) ] , células renales de cría de hamster(BHK, ATCC CCL 10) /células sertoli de ratón. (TM4, Mather, Biol . Re-prod. 23:243-251(1980) ) , células renales de mono(CVl ATCC CCL70 ) ; células renales de mono verde africano ( VERO-76 , ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma humano cervical ( HELA, ATCC CCL2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3a, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138 , ATCC CCL 75); células de hepatoma humano (Hep G2,HB 8065) ,-tumor mamario de ratón (MMT060562 , ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y.A cad. SCI .383: 44-68 (1982) ) ,-células MRC5 o FS4.

Las células hospedantes son transformadas o trans-fectadas con los ácidos nucleicos o vectores ya mencionados para agente de unión específico o producción de anticuerpos y cultivadas en medios nutrientes convencionales que son modificados apropiadamente con el fin de inducir a los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican a las secuencias deseadas. Más aún, los vectores noveles y las líneas celulares transíectadas con copias múltiples de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles y preferidas para la ex-presión de agentes de unión específicos o anticuerpos.

Las células hospedantes usadas en la producción del agente de unión específico de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios disponibles co-mercialmente como en el caso del FIO de Ham ( Sigma ) , Minimal Essential Médium ( (DMEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) ,y Modified Eagle's Médium de Dulbecco ( (DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de las células hospedantes. Además, cualquiera de los medios descriptos en Ham et al., Meth. Enz .58 : ( 1979 ) , Barnes et al., Anal. Biochem. 102 : 255 ( 1980 ) , en las patentes norteamericanas Nos: 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; O90103430; WO87/00195; o en la patente norteamericana Re. NO.30.985 puede ser utilizado como medio de cultivo para células hospedantes.

Cualquiera de estos medios puede ser suplementa-do, de ser necesario, con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferina o factor de crecimiento epidérmico ), sales ( como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amoriguadoras "buffers" ( como los HEPES), nucleót idos ( adenosina y timidina) , antibióticos (como la dro- ga Gentamicina tm) , elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente en concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario pue-de también ser incluido en concentraciones apropiadas conocidas por quienes están familiarizados con los métodos. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, etc, son las que han sido utilizadas previamente con la célula hospedante, seleccionada para su expresión, y serán evidentes pa-ra quien esté calificado en estos métodos. Los vectores de expresión Pdc323 y Pdc324 según está descripto en la solicitud de patente norteamericana No .20030082735, que contienen el par respectivo de cadena liviana y cadena pesada adecuado fueron transíectados a la línea de célula hospedante CS9.

Luego del cultivo de las células hospedantes , el agente de unión específico o anticuerpo puede ser producido intracelularmente , en el espacio periplásmico, o ser directamente secretado al medio. Si el agente de unión específico o anticuerpo es producido intracelularmente, como primer paso, el detrito de partículas, ya sea células hospedantes o fragmentos lisados, es removido, por ejemplo, por medio de centrifugación o ultrafiltración .

La composición del anticuerpo o del agente de unión específico puede ser purificada usando, por ejemplo, cromato- grafía de hidroxilapatita, cromatografía de intercambio de aniones y cationes, o, preferentemente, cromatografía de afinidad usando el antígeno de interés o proteína A o proteína G como ligante de afinidad. La proteína A puede usarse para pu-rificar agentes de unión específicos o anticuerpos basados en cadenas pesadas humanas yl, y2 ó y 4 (Lindmark et al., J . Inmunol . Meth . 62:1-13(1983) ) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y 3 humano (Guss et al.,EMBO J.5: 15671575 (1986) ) . La matriz a la cual se une el ligante de afinidad es la mayoría de las veces agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como el vidrio de poro controlado o el poli (estirenodivinilo) benceno permiten flujos mas rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los obtenidos con la agarosa. Donde el agente de unión específico o anticuerpo comprende un dominio CH 3,1a resina ABX ™ de Bakerbond (J.T. Baker, Phillisburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas tales como la precipitación con etanol, HPLC de fase revertida, la cromato-focalización, SDS-PAGE, y la precipitación de sulfato de amonio también son posibles dependiendo del agente de unión específico o anticuerpo a recuperar.

Anticuerpos quiméricos y humanizados Los anticuerpos monoclonales quiméricos , en los cuales se fusionan los dominios de Ig variables de un anticuerpo monoclonal de roedor con los dominios de Ig constantes de humanos, pueden generarse usando procedimientos estándar co-nocidos, (ver Morrison ,S.L.,et al. (1984) Chimeric Human An-tibody Molecules; ouse Antigen Binding Domains with Human Constant Región Domains, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81,6841-6855; y Boulianne ,G.L.,et al , Nature312 , 6 3-6 6. ( 198 ) ) . A pesar de que algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han demostrado ser menos inmunogénicos en humanos, los dominios de Ig variables de roedores pueden igualmente generar una respuesta antiroedor humana significativa.

Los anticuerpos humanizados pueden lograrse por medio de una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo (1) injerto de las regiones determinantes de complementariedad no-humanas (CDRs) en una estructura humana y región constante (proceso conocido como humanización por "injerto de CDR"), o, alternativamente, ( 2 ) transplantando completamente los dominios variables no humanos, pero "cubriéndolos" con una superficie parecida a la humana por reemplazo de residuos de superficie (proceso conocido en el medio como "venee-ring'Vrevestimiento) . Estos métodos son divulgados en, ej, Jones et al.,Nature 321:522 525 ( 1986 ); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. ,81:6851 6855(1984) ; Morrison y Oi, Adv. Immunol. , 44:65 92 ( 1988 ) ; Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, olec. Immun. 28:489 498(1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3) :169 217(1994); y Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991) cada uno de los cuales se incorpora aquí para referencia.

En particular, un anticuerpo de roedor luego de una repetida administración in vivo en humanos tanto individual corno con ugadamente acarreará una respuesta inmune en el recipiente contraria al anticuerpo de roedor; la asi llamada respuesta HAMA (anticuerpo de ratón antihumano) . La respuesta HAMA puede limitar la efectividad del fármaco usado si se requieren dosis repetidas de éste. La inmunogenicidad del anticuerpo puede ser reducida por modificación química del anticuerpo con un polímero hidrofílico como el polietilen glicol o usando métodos de ingeniería genética para lograr que la estructura de unión del anticuerpo sea más parecida a la humana .

El injerto de CDR implica introducir una o más de las seis CDRs de los dominios de Ig variables de cadena liviana y pesada de ratón dentro de las secuencias marco adecuadas de un dominio de Ig variable humano. Esta técnica (Riechmann, L., et al., Nature 332,323 (1988)), utiliza las secuencias conservadas (FR1-FR4) como andamiaje de soporte de los loops de CDR que son los contactos primarios con el antígeno. Una desventaja significativa del injerto de CDR, sin embargo, es que puede resultar en un anticuerpo humanizado que posea una afinidad de unión substancialmente menor que la del anticuerpo de ratón original, ya que los aminoácidos de las secuencias marco pueden contribuir a la unión al antigeno, y porque los aminoácidos de los lazos de CDR pueden influir en la asociación de los dos dominios de IG variables. Los anticuerpos SR-1 quiméricos no mostraron una adecuada potencia funcional en ensayos de base celular.

Para mantener la afinidad del anticuerpo monoclonal humanizado, la técnica de injerto de CDR puede mejorarse con la selección de secuencias marco humanas que guarden una mayor similitud con las secuencias marco del anticuerpo murino original, y con mutagenésis dirigida al sitio de aminoácidos simples dentro de la estructura o CDRs asistidos por modelado por computadora del sitio de unión al antigeno (ej ,Co, .S., et al. (1994), J. Immunol .152 , 2968-2976 ) .

Un método de humanizar anticuerpos consiste en alinear las secuencias de cadena pesadas y livianas no-humanas con las secuencias de cadena livianas y pesadas humanas, seleccionando y reemplazando la estructura no-humana por una estructura humana basada en dicha alineación, realizando un modelado molecular para predecir la conformación de la secuencia humanizada y comparándola con la conformación del an- ticuerpo parental. Este proceso se continúa con repetida re-tromutación de los residuos en la región CDR que perturban la estructura de las CDRs hasta que la conformación predicha del modelo de secuencia humanizado se aproxime fielmente a la conformación de las CDRs no-humanas del anticuerpo parental no-humano. Tales anticuerpos humanizados pueden ser aún más derivatizados para facilitar la captación y la evacuación, e , vía receptores Ashwell (ver, ej , Patentes de los EUA No.5.530.101 y 5.585.089) .

Un número de humanizaciones de anticuerpos monoclo-nales de ratón por diseño racional se han reportado (ver, por ej, 20020091240 publicado en julio 11, 2002, WO 92/11018 y las patentes de los EUA No .5.693.762. y No. 5.766.866). La ingeniería humana de los anticuerpos también ha sido descripta en, ej , Studnicka et al., Patente de los EUA No: 5.766.886; Studnicka et al., Protein Engineering 7:805-814 (1994) .

Producción de variantes de anticuerpos Las variantes de secuencia aminoacídica del agente de unión específico deseado o anticuerpo pueden ser preparadas introduciendo cambios nucleóticos apropiados al ADN codificante, o por medio de síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones y/o inserciones y/o substituciones de residuos dentro de las secuencias aminoacídicas de los agentes de unión específicos o anticuerpos. Se realiza cualquier combinación de supresión, inserción y substitución con el fin de arribar al diseño final, a condición de que el diseño final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos pueden incluso alterar los procesos post-traduccionales del agente de unión específico o anticuerpo humanizado o variante, por ejemplo al cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación .

Las moléculas de ácido nucléico que codifican las variantes de secuencias aminoacídicas del agente de unión específico o anticuerpo son preparadas por una variedad de métodos conocidos. Dichos métodos incluyen mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR, y mutagénesis de cassette de una variante preparada con anterioridad o una versión no-variante del agente de unión específico o anticuerpo.

Un método útil de identificación de ciertos residuos o regiones del agente de unión específico o anticuerpo que son las ubicaciones preferidas para la mutagénesis es llamado "mutagénesis de escaneo de alanina", descripto por Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085(1989). Aquí, un residuo o un grupo de residuos target son identificados (ej, residuos cargados como los arg, asp, his, lys, y glu)y reemplazados por un aminoácido neutral o cargado negativamen- te (preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antigeno. Aquellos emplazamientos de aminoácidos que muestran una sensibilidad funcional a las substituciones son luego refinados introduciendo más cantidad o distintas variantes en , o para los sitios de substitución. Por lo tanto, mientras que el sitio de introducción de una variedad de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no lo está necesariamente. Por ejemplo, para analizar la performance de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo un escaneo de alanina o mutagénesis aleatoria en el codon objetivo o región y las variantes expresadas son tamizadas para buscar la actividad deseada.

Normalmente , 1 as variantes de secuencias de aminoá-cidos de agente de unión especifico o anticuerpo tendrán una secuencia aminoacidica que comparta al menos un 60% de identidad con la secuencia aminoacidica del agente de unión especifico o anticuerpo (murino o humanizado) original ya sea de la cadena pesada o liviana, o al menos un 65% ,o al menos un 70%, o, al menos un 75%, o, al menos un 80% de identidad, o, con mayor preferencia, por lo menos un 85%, o, con mayor preferencia, por lo menos un 90% y aún mejor, al menos un 95% de identidad, incluyendo, por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a la secuencia original, luego de alinearlas y de intro-ducir los espaciami entos , en caso necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna substitución conservativa (según lo definido en la tabla 1 a continuación ) como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones N-terminal, C-terminal o in-ternas, supresiones o inserciones dentro del agente de unión específico o secuencia de anticuerpo será considerada como responsable de afectar la identidad de la secuencia u homología. Por lo tanto, la identidad de la secuencia puede ser determinada por métodos estándar que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos . Usando un programa por computadora como el BLAST o el FASTA, dos polipéptidos son alineados para una com-plementación óptima de sus respectivos aminoácidos ( ya sea al largo completo de una o ambas secuencias, o de una porción predeterminada de una o ambas) . Los programas proveen una penalidad de apertura por defecto y una penalidad de espacia-miento por defecto, y se puede usar en conjunción con el programa de computación una matriz de recuento como la PAM 250 (matriz de scoring estándar; ver Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol .5, supp .3 ( 1978 ) ) . Por ejemplo, el porcentaje de identidad puede entonces calcularse como: el número total de complementos idénticos multiplicado por 100 y luego dividido por la suma del largo de la secuencia mas larga dentro del tramo igualado y del número de espacios introducidas en las secuencias de mayor longitud para alinear las dos secuencias.

Inserciones Las inserciones de secuencias aminoacidicas incluyen a las fusiones de terminal de amino y/o carboxil que abarcan un rango de un residuo a polipéptidos de cien o más residuos, asi como inserciones de intrasecuencia de residuos aminoacidicos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen a un agente de unión especifico o anticuerpo que posee un residuo metionil de terminal-N o al agente de unión especifico o anticuerpo (incluido un fragmento de anticuerpo ) fusionado a una marca epitope o a un epitope de receptor de rescate. Otras variantes de inserción del agente de unión especifico o molécula de anticuerpo incluyen la fusión a un polipéptido que incrementa el periodo medio del suero del agente de unión especifico o anticuerpo, ej : a la terminal-N o a la terminal-C.

Ejemplos de marcas epitope incluyen al polipéptido de marca HA de la influenza y a su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8 : 2159-2165 ( 1988 ) ) ; a la marca c-myc y a los anticuerpos 8 F9 , 3C7 , 6E10 , G4 , B7 y 9E10 (Evan ET AL., Mol. Cell. Biol.5(12) : 3610_3616 ( 1985) ) ; y la marca de glicopro-teina D del virus Herpes Simplex (Gd)y su anticuerpo (Pabors-ky et al., Protein Engineering 3 (6) :547-553 (1990) ) . Otras marcas ejemplares son una secuencia de poli-hist idina , generalmente cerca de seis residuos poli-histidinicos , que permiten la aislación de un compuesto asi rotulado usando quelaci-on de níquel. Otros rótulos y marcas, tales como la marca FLAG® (Eastman Kodak, Rochester , Y) son bien conocidos y usados en forma rutinaria en este arte.

El término "epítope de unión al receptor de rescate" refiere a un epítope de la región Fe de una molécula de IgG (ej : IgGl , IgG2 ,IgG3, IgG4 ) responsable de aumentar la vida media del suero in vivo de la molécula de IgG.

Substituciones Otro tipo de variante es una variante de substitu¬ ción aminoacídica . Estas variantes poseen al menos un residuo aminoacídico en la molécula del agente de unión específico o en la molécula de anticuerpo removida y un residuo diferente insertado en su lugar. Está contemplada la mutagénesis subs- titucional dentro de cualquier región CDR o hipervariable o de las secuencias marco. En la tabla 1 se muestran substitu¬ ciones conservativas . La substitución mas conservativa se en- cuentra bajo el título "substituciones preferidas". Si dichas substituciones no provocan cambio alguno en la actividad biológica, entonces, pueden introducirse cambios mas substanciales, denominados "substituciones ejemplares" en la tabla 1 o, como se detalla a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y los productos pueden examinarse.

TABLA 1 Original Ejemplar Sustituciones Ala (A) val ; leu; ile val Arg(R) lys;gln;asn lys Asn(N) gln;his;asp, lys;gln arg Asp(D) glu;asn glu Cys(C) ser;ala ser Gln(Q) asn;glu asn Glu(E) asp;gln asp Gly(G) ala His(H) asn;gln; lys;arg Ile(I) leu; val ; met ; ala ; leu phe; norleucine Leu(L) norleucine ; ile ; val ; ile met ; ala ; phe Lys(K) arg ; gln ; asn arg Met ( ) leu; phe; ile leu Phe(F) leu; val; ile;ala;tyr Pro(P) ala Ser(S) thr Thr(T) ser ser Trp( ) tyr;phe tyr Tyr (Y) t rp; phe ; thr ; ser phe Val (V) ile ; leu ; met ; phe ; leu ala;norleucine Se logran modificaciones substanciales en las propiedades biológicas del agente de unión especifico o anticuerpo seleccionando substituciones que difieren significati-vamente en cuanto su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la parte principal del polipéptido en el área de substitución, ej : conformación laminar o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio target, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos que resultan en forma natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de cadena lateral: (1) hidrofóbicos : norleucine, met, ala, val, leu, ile (2) hidrofí lieos neutrales: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cade-na: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe .

Las substituciones conservativas implican el reemplazo de un aminoácido por otro miembro de su clase. Las substituciones no conservativas implican el reemplazo de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.

Cualquier residuo cisteinico que no esté ligado al mantenimiento de la conformación apropiada del agente de unión especifico o anticuerpo humanizado o variante también puede ser substituido, en general por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para evitar reticulado aberrante. A la inversa, eslabón (es) de cisteina pueden agregarse al agente de unión especifico o anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como, por ejemplo, un fragmento Fv) .

Maduración de afinidad La maduración de afinidad implica preparar y examinar variantes del agente de unión especifico o anticuerpo que posean mutaciones (supresiones, inserciones o substituciones) dentro de las CDRs de un agente de unión especifico o anticuerpo parental y seleccionar las variantes que posean propiedades biológicas mejoradas tales como afinidad de unión relativa al agente de unión especifico parental. Una manera conveniente de generar dichas variantes de substitución es la maduración de afinidad usando representación de fagos. Brevemente, numerosos sitios de región hipervariable (ej: sitios 6-7) son mutados para generar todas las substituciones aminoa-cídicas posibles en cada sitio. Las variantes del agente de unión especifico o anticuerpo asi generadas puden exhibirse de manera monovalente de partículas fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de 13 envuelto dentro de cada partícula . Las variantes de representación de fagos son luego tamizadas en busca de actividad biológica. (ej: afinidad de unión) Se puede efectuar mutagénesis por escaneo de alani-na para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen en gran medida con la unión al antígeno. Alternativamente, o, además, puede resultar beneficioso analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el agente de unión espe- cifico o anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos aledaños son candidatos a la substitución de acuerdo a las técnicas elaboradas en el presente escrito. Una vez que se generan dichas variantes, se sujeta el panel de variantes a tamizado como ya descripto y los agentes de unión específicos o anticuerpos de propiedades superiores de uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para mayor desarrollo .

Las técnicas que utilizan entremezclado (shuf-fling) de genes y evolución dirigida también pueden ser usadas para preparar y examinar variantes del agente de unión específico o anticuerpo en busca de la actividad deseada. Por ejemplo, Jermutus et al., Proc . ati . Acad . Sci . USA 2001 Jan 2 ; 98 ( 1 ) : 5-80 informa que las estrategias de selección hechas a medida in vitro basadas en representación de ribosomas se combinaron con diversificación in vitro por shuffling de ADN para desarrollar tanto el exceso de rango como la estabilidad termodinámica de los fragmentos de anticuerpo Fv de cadena simple (scFvs) ; Ferraer et al., Tumor Biol.2004 Jan-Apr; 25(1-2):7-13 informa que el uso del display fago en combinación con shuffling de ADN elevó la afinidad en casi tres órdenes de magnitud.

Glicosilación alterada También se pueden producir variantes de agente de unión especifico o anticuerpo que tengan un patrón de glico-silación modificada relativo al agente de unión especifico o anticuerpo parental, por ejemplo, suprimiendo una o más fracciones de carbohidratos encontradas en el agente de unión especifico o anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de gli-cosilación que no se encuentren presentes en el agente de unión específico o anticuerpo.

La glicosilación de polipéptidos que incluyen anticuerpos se realiza típicamente por medio de enlaces-N o de enlaces-O.El enlace-N refiere a la fijación de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-x-serina y asparagi-na-x-treonina , donde x es cualquier aminoácido excepto la prolina, son secuencias de reconocimiento para fijación enzi-mática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral as-paragínica. La presencia de cualquiera de estas dos secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación . Por lo tanto, los sitios de glicosilación de enlace-N pueden ser añadidos a un agente de unión específico o anticuerpo alterando la secuencia de aminoácido de manera que contenga una o más de estas secuencias tripeptídicas . La glicosilación por enlace -O refiere a la fijación de uno de los azúcares aceylgalactosamina-N, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente, serina o treonina , aunque también puden usarse hidroxiprolina-5 o hidroxilisina-5. Los sitios de glicosilación con O-link pueden añadirse a un agente de unión específico o anticuerpo insertando o substituyendo uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del agente de unión específico o anticuerpo original.

Otras modificaciones El/los residuo (s) cisteínico ( s ) puede (n) ser removido (s) o introducido ( s ) en la región Fe, de esa forma elimi-nar o aumentar la formación del enlace disulfuro intracatenu-lar. El agente de unión específico o anticuerpo homodimérico así generado puede poseer una capacidad de internalización mejorada y/o de destrucción de células mediada por complemento y de citotoxicidad celular dependiente del anticuer-po(ADCC) . Ver Carón et al. ,J.Exp. ed. 176:1191-1195(1992) y Shopes, B.J.Immunol. 1 8:2918-2922(1992) . Los agentes de unión específico o anticuerpos homodiméricos también pueden ser preparados usando reticuladores ( cross-linkers ) heterobi-funcionales como lo describe Wolff et al., Cáncer Re-search53 : 2560-2565 (1993) . Alternativamente, puede diseñarse un agente de unión específico o anticuerpo que posea regiones Fe duales y que de ese modo posea capacidades ampliadas de lisis de complemento y ADCC.Ver Stevenson et al.,Anti Cáncer Drug Design 3:219-230(1989) .

Se ha demostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden ocasionar que un anticuerpo se fije al MHC de clase II y disparar una respuesta de célula-T asistente no deseada. Una substitución conservativa puede permitir que el agente de unión especifico o anticuerpo retenga capacidad de unión aún reduciendo su abilidad para disparar una respuesta de célula-T no deseada.

También se contempla que uno o más de los 20 aminoácidos de terminal-N de la cadena liviana o pesada sean removidos .

Asimismo, pueden ser deseables modificaciones efectuadas para aumentar la vida media del suero, por ejemplo, por incorporación o añadido de un epitope de fijación al receptor de rescate (ej : por mutación de la región apropiada o incorporando el epitope dentro de una marca pép-tida que luego se fusiona al agente de unión especifico o anticuerpo ya sea en su extremo o en el medio, ej:por síntesis de ADN o péptido) (ver, ej : W096/32478 ) o agregando moléculas tales como PEG u otros polímeros hidrosolubles , incluyendo los polímeros polisacáridos.

El epitope de fijación al receptor de rescate constituye de preferencia una región en donde uno o más residuos de aminoácidos de uno o dos loops del dominio Fe son transferidos. Aún más preferentemente, el epitope es sepa- rado del dominio CH2 de la región Fe (ej : de una IgG) y transferido a las regiones CHl,CH3,o VH, o más de una de dichas regiones, del agente de unión especifico o anticuerpo. Alternativamente, el epitope es removido del dominio CH2 de la región Fe y transferido a la región CL o VL o a ambas, del fragmento de agente de unión especifico o anticuerpo. Ver asimismo, International applications WO 97/34631 y WO 96/32478 las cuales describen variantes de Fe y su interacción con el receptor de rescate.

La regulación de homeostasis de IgG in vivo depende de su fijación al FcRn. Se ha informado que la modificación de la interacción entre el dominio Fe de IgG y FcRn mejora la vida media del suero de los anticuerpos mono-clonales. Serian preferibles las mutaciones en el Fe que re-sultán en la unión de mayor afinidad al receptor Fe neonatal FcRn y la disminución del régimen de degradación y el mejoramiento del perfil PK. El sitio de fijación FcRn en IgG está emplazado en la inferíase de dominio CH2-CH3. Las mutaciones de residuos en esta área ( 428L y T250Q/M428L, T250Q/ 428L, P2571/Q311I, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F/Y436H, o M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H) resultan en una afinidad incrementada de IgGl para FcRn humano en pH 6.0 y pH 7.3. Adicionalmente algunas de estas mutaciones resultaron en propiedades farmacocinét icas ampliadas (evacuación más lenta y vida media más larga) cuando fueron administradas a monos de forma intravenosa.

Se han identificado otros sitios de la región constante que son responsables de la citotoxicidad complemento dependiente (CDC) , tales como el sitio de fijación Clq y/o la citotoxicidad celular anticuerpo dependiente (ADCC) [ver, e : Molec. Immunol. 29 (5) : 633-9 (1992); Shields et al., J. Biol. Chem., 276 (9) : 6591-6604 (2001), incorporado para referencia en su totalidad] . La mutación de residuos dentro de los sitios de fijación del receptor Fe puede resultar en una función efectora alterada (aumentada o reducida), tal como la actividad alterada del ADCC o CDC, o vida media alterada. Según lo ya descripto, las mutaciones potenciales incluyen inserción, supresión o sustitución de uno o mas residuos, in-cluyendo sustitución con alanina, una sustitución conservativa, sustitución no conservativa, o reemplazo con el correspondiente residuo aminoacidico en la misma posición de una diferente subclase (ej : reemplazando un residuo de IgGl con un residuo correspondiente IgG2 en esa posición) .

Otras modificaciones covalen es También se incluyen dentro del alcance de esta invención las modificaciones covalentes del agente de unión especifico o anticuerpo. Estas pueden ser efectuadas por síntesis química o escición enzimática química del agente de unión específico o anticuerpo, si es aplicable. Se pueden introducir otros tipos de modificaciones covalentes al agente de unión específico o anticuerpo haciendo reaccionar residuos aminoacídicos objetivo con un agente derivat i zante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos terminales N o C.

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar mas comúnmente con haloacetatos- (y sus correspondientes aminas), tales como acido cloroacético o cloroacetamida , para producir derivativos de carboximetilon o carboxiamidomet ilo . Los residuos de cisteinilo también son derivati zados por reacción con bromotrifluoracetona , alpha-bromo- ß ( 5-imidozoyl ) ácido propionico, fosfato cloroacetil, alquilmaleimidos-N, 3-nitro-2-piridilo disulfuro, metil 2-piridilo disulfuro, clo-romercuribenzoato-p, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l , 3-diazole.

Los residuos de histidil se derivatizan por reacción con diet ilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histi-dil. El parabromofenacil es también útil; la reacción se efectúa preferiblemente en sodio cacodilato 0.1 M a pH 6.0.

Los residuos de lisinil y aminoterminales se reaccionan con anídricos de ácidosuccinico u otros anídricos car-boxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efec- to de revertir la carga de los residuos lisinil. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen ami-noalfa incluyen imidoesters tales como picolinimidato de me-til, fosfato de pirixodal, pirixodal, cloroborohidrido, ácido trinitrobenzenosulfonico, metilisourea-O, pentanedion-2 , , y reacción catalizada por medio de transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginil son modificados por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos el fenilglioxal , butanedion-2 , 3 , ciclohexanedion-1 , 2 , y nini-drina. La derivati zación de los residuos de arginina requiere que la reacción sea efectuada en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Más aun, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina tanto como el grupo de aminos argininoepsilon .

La modificación especifica de los residuos de tirosil puede ser realizada con particular interés en la introducción de rótulos espectrales dentro de los residuos de tirosil por reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. Más comúnmente, se usan el acetilimidi-zol-N y el tetranitrometano para formar especies de tirocila-cetil-0 y derivativos 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosil son iodinados usando 1251 o 1311 para preparar proteínas rotuladas para uso en radioinmunoensayo .

Los grupos laterales de carboxil (aspartil o gluta-mil)se modifican selectivamente por reacción con carbodiími-dos (R-N . dbd. R-N' ), donde R y R' son diferentes grupos alquil, como carbodiimida l-ciclohexil-3- ( 2-morfolinil- -etil ) o carbodiimida l-etil-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentil) Además, los residuos de aspartil y glutamil son convertidos en residuos de aspariginil y glutaminil por reacción con iones de amonio.

Los residuos de glutaminil y aspariginil son frecuentemente desamidados a residuos correspondientes de glutamil y aspartil , respectivamente . Estos residuos son desamidados bajo condiciones neutrales o básicas. La forma desamida-da de esos residuos caben dentro del alcance de esta invención .

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxil de los residuos seril o treonil, metilación de los grupos alfa amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidi-na. (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Pro-perties, .H.Freeman & Co., San Francisco, pp .79-86 ( 1983 ) ) , acetilación del amino N-terminal, y amidación de cualquier grupo de carboxil C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos con el agente de unión específico o anticuerpo . Estos procedimien- tos revisten la ventaja de no requerir la producción del agente de unión especifico o anticuerpo en una célula huésped que posea capacidades de glicosilación para la glicosilación de unión N u 0. Dependiendo del modo de acoplamiento utiliza-do, el/los azúcar (es) pueden fijarse a (a) arginina e histidi-na, (b) grupos de carboxil libre, (c) grupos de sulfidril libre como los de la cisteina, (d) grupos de hidroxil libre como los de la serina , treonina , o hidroxiprolina , (e) residuos aromáticos como los de fenilalanina , tirosina , o triptopan , o ( f ) el grupo amídico de glutamina . Estos métodos se describen en WO 87/05330 publicado 11 sep.1987, y en Aplin y Wriston,CRC Crit . Rev. Biochem. , pp259-306 (1981) .

La remosión de cualquier porción de carbohidrato presente en el agente de unión especifico o an-ticuerpo puede ser efectuada química o enzimát icamente . La glicosilación química requiere la exposición del agente de unión específico o anticuerpo al compuesto ácido trifluorome-tanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (acetilglucosamina-N o acetilga-lactosamina-N) , a la vez que deja al agente de unión específico o anticuerpo intacto. La deglicosilación química está decrípta por Hakimuddin, et al., Arch . Biochem. Biophys .259 : 52 ( 1987 ) y por Edge et al., Anal . Biochem . , 118:131(1981) . La escisión enzimática de las moléculas de carbohidrato en un agente de unión especifico o anticuerpo puede lograrse con el uso de una variedad de endo-y exo-glicosidasas como lo describe Thotakura et al., eth. Enzimol. 138:350(1987) Otro tipo de modificación covalente del agente de unión especifico o anticuerpo involucra la unión de éste con uno de una variedad de polímeros no-proteináceos , e : polietinel glicol, polipropilen glicol, po-lióles polioxiet ilados , sorbitol polioxietilado, glucosa po-lioxiet ilada , glicerol polioxietilado, polioxialcalinos , o polímeros polisacáridos como el dextrano. Dichos métodos son bien conocidos , ver , por e : Patente de los E.U.A No: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; 4.179.337; 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; 4.609.146 o EP 315456.

Usos terapéuticos El " tratamiento"es una intervención realizada con el fin de prevenir el desarrollo o de alterar la patología de un desorden. De acuerdo a esto, "tratamiento"se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas de profilaxis o prevención. Los sujetos con necesidad de tratamiento incluyen tanto a quienes ya padecen el desorden como a quienes se busca prevenir del mismo. " amí fero"para el propósito del tratamiento refiere a todo animal clasificado como mamífero, in-cluyendo a humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportes o mascotas como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente el mamífero es humano.

La frase "cantidad de efectividad terapéutica" está aquí usada para referirse a una cantidad de an-ticuerpo c-kit humanizado terapéutico o profiláctico que causa una reducción en el número y/o actividad de los mastocitos o células progenitoras , reducción de los fibroelementos o sus precursores, o que causa la reducción de la seriedad o progresión de síntomas asociados con enfermedades asociadas al c-kit (o sea que provee "eficacia terapéutica" ) . Los mastocitos y las células madre hematopoyét icas pluoripotenciales son los tipos de células primarias que expresan c-kit y por lo tanto se contempla que las células derivadas de las HSC tales como los mastocitos y que estén involucradas en enfermedades pue- dan ser tratadas con las composiciones y métodos de la invención .

La frase "actividad de reducción fibrótica" se refiere a la habilidad de inhibir, total o parcialmente y revertir la inflamación resultante de la activación del sistema inmune y la fibrosis.

El término "enfermedad o desorden fibrótico" refiere a condiciones que involucran fibrosis en uno o más tejidos. El término "fibrosis" usado aquí refiere a la formación aberrante o al desarrollo de tejido conectivo fibroso en exceso en un órgano o tejido como un proceso reactivo, diferente de la formación de tejido fibroso que constituye la normal cicatrización de un órgano o tejido. La fibrosis se caracteriza por acumulación de fibroblastos y depósito de colágeno en exceso diferente del depósito normal en cualquier tejido particular. El término "fibrosis" en la presente es usado como sinónimo de "cicatrización aberrante, que implica transformación de células fibroblastos mesenquimales , proliferación excesiva de fibroblastos, actividad y depósito de colágenos y otras proteínas de matriz extracelular . " Los fibroblastos son células de tejido conectivo, que se hallan dispersas en tejido conectivo en todo el cuerpo. Los fibroblastos secretan una matriz extracelular no rígida que contiene colágeno de tipo I y/o III. En respuesta a una herida en un tejido, los fibroblastos mas próximos o loas células precursoras mesenquimales en circulación migran a la herida, pueden alternativamente activarse bajo la influencia de otras células como los mastocitos y sus mediadores, proli-ferar y producir grandes cantidades de matriz extracelular colaginosa. El colágeno es una proteina fibrosa rica en glicina y prolina que es un componente importante de la matriz extracelular y del tejido conectivo, cartílago y hueso. Las moléculas de colágeno son estructuras helicoidales de cordón triple llamadas cadenas-a, que estás envueltas entre sí formando una hélice de tipo soga. El colágeno existe de varias formas o tipos;de éstos, el tipo l,el más común, se encuentra en la piel, tendón y hueso; y el tipo III se halla en piel, vasos sanguíneos y órganos internos.

Las enfermedades fibróticas asociadas a los mastocitos incluyen fibrosis patológica, o scarring ( incluyendo la esclerosis endocardial ) , fibrosis intersticial idiopática, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis perimuscular, fibrosis de Symmers, fibrosis pericentral, hepatitis, dermato.fi-broma, cirrosis biliar, cirrosis alcohólica, fibrosis pulmonar aguda, fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de insuficiencia respiratoria agudo, fibrosis renal/glomérulonefritis, fibrosis renal/nefropatía diabética, escleroderma/sistémico, escleroderma/local , queloides, heridas hipertróficas, ad- hesiones articulares severas/artritis, mielof ibrosis , heridas de córnea, fibrosis cistica, distrofia muscular (de Duchenne) , fibrosis cardiaca, fibrosis muscular/ separación retinal, contracción esofágea y enfermedad de payronles. Otros desór-denes fibróticos pueden ser inducidos o iniciados por cirugía, incluyendo revisión de cicatriz/cirugías plásticas, glaucoma, fibrosis de cataratas, herida de córnea, adherencias articulares, injerto vs enfermedad hospedante, cirugía de tendón, entrampado de nervio, contractura de dupuytren, adherencias de OB/GYN/fibrosis , adherencias pélvicas, fibrosis peridural, restenosis. Está asimismo contemplado que las condiciones fibróticas donde el depósito de fibronectina es factor causante puedan ser tratadas mediante la invención. La fibrosis pulmonar idiopática, pulmón bleomicín, fibrosis cís-tica y la nefropatía glomerular, incluyendo la enfermedad caracterizada por depósitos de Fn en los riñoñes que termina en falla renal, son ejemplos de condiciones que también pueden ser tratadas mediante la presente invención. La inflamación que implica activación del sistema inmune y donde los masto-citos secretan citoquinas inflamatorias como el TNF, y son capaces de activar y directamente interactuar con los linfo-citos, también pueden tratarse de acuerdo a la presente invención .

El escleroderma es considerado como una enfermedad autoinmune del tejido conectivo que resulta en un desorden fibrótico caracterizado por el engrosamiento y endurecimiento de la piel causado por la sobreproducción de nuevo colágeno de los fibroblastos en piel y otros órganos. El escleroderma puede ocurrir como enfermedad local o sistémica involucrando a varios órganos. El escleroderma también es denominado esclerosis sistémica. El desarrollo de patologías esclerodérmi-cas se asocia a un incremento en el número de los mastocitos en los tejidos/órganos afectados por la enfermedad.

La esclerosis sistémica se caracteriza por la formación de tejido fibroso de colágeno hialinizado y engrosado, con engrosamiento de la piel y adherencias en tejidos subyacentes, especialmente de manos y rostro. La enfermedad puede también caracterizarse por disfagia debida a la pérdida de peristalsis y fibrosis submucosa del esófago, dispnea, debida a fibrosis pulmonar, fibrosis de miocardio, y alteraciones vasculorenales . (Diccionario Médico de Stedman, edición 26, Williams & Wilkins , ( 1995 ) ) . La fibrosis pulmonar afecta entre un 30% y un 70% de pacientes de escleroderma, resultando a menudo en enfermedad pulmonar restrictiva. (Afamas et al., Citokine and Growth Factor Rev 14:537-550(2003)). Algunos pacientes sufren una superposición de escleroderma y otras enfermedades del tejido conectivo, tales como la artri- tis reumatoidea , lupus eritematoso sistémico y polimiositis . Cuando las características del escleroderma se presentan junto con las características de la polimiositis y del lupus eritematoso sistémico, esta condición es denominada enferme-dad mixta del tejido conectivo (MCTD) Se conoce que los síntomas presentes en algunas formas de dermatitis son causados por degranulación de mastocitos cutáneos , resultando en la liberación de histamina inter alia. Por lo tanto, otro desorden asociado a los mastocitos adecuado para ser tratado mediante la presente invención es la urticaria pigmentosa. Este desorden presenta lesiones características en la piel que aparecen como máculas pigmentadas simples o múltiples o nodulos urticantes con fricción y que contienen un gran número de mastocitos . Existen distintas formas de dermatitis (inflamación de la dermis) asociadas tales como eritema, edema, erupciones papulares y el prurito puede estar presente tanto en la dermatitis humana como la animal, todas son tratables por medio de esta invención.

La mastocitosis es, en muchos casos, una enfermedad neoplástica e implica crecimiento de mastocitos nuevos o anormales y puede ser consecuencia de una elevada señalización autócrina SCF o de mutación de c-kit activante. La mastocitosis puede ser limitada o sistémica involucrando múltiples órganos como la médula ósea. Los mastocitos liberan de- ntro del organismo determinados mediadores, o químicos, de los cuales uno es la histamina, en respuesta a ciertos eventos. Los individuos con mastocitosis sistémica desarrollan un incremento en el número de mastocitos, o desarrollan mastoci-tos de forma anormal, que pueden no funcionar apropiadamente. Además los mastocitos no se extinguen cuando se supone que debieran hacerlo incrementando aún mas la carga total de mastocitos. Cuando los mastocitos desgranulan y vierten sus contenidos esto puede causar varias enfermedades o condiciones agudas y potencialmente serias. Los desórdenes de mastocitos también incluyen desórdenes proliferativos que resultan en enfermedades localizadas que van desde el mastocitoma cutáneo solitario hasta la enfermedad más severa de leucemia mastoci-tosica. Ejemplos de estos son mastocitoma cutáneo, mastocito-sis agresiva, mastocitosis indolente, mastocitosis con desorden hematológico asociado, urticaria pigmentosa, telangiecta-sia macularis eruptiva perstans (temp) , enfermedad sistémica de los mastocitos, leucemia mastocitosica , leucemia mieloide, mastocitosis sistémica (con o sin manifestaciones cutáneas tales como la urticaria pigmentosa) , síndrome de activación de mastocitos y desórdenes pediátricos mas comunes tales como el mastocitoma solitario y mastocitosis cutánea difusa.

El síndrome de activación de los mastocitos se caracteriza por un número normal o casi normal de mastocitos.

Sin embargo los mastocitos se disparan fácilmente para liberar sus contenidos, lo cual resulta en varios de los mismos síntomas. En este desorden está presente el riesgo de shock anafiláctico, pero al contrario de los desórdenes prolifera-tivos de mastocitos, este síndrome puede no poseer el potencial para avanzar a un estadio mas agresivo o maligno. Ejemplo de tales desórdenes asociados con desgranulación de mastocitos pueden ser el dolor abdominal, sarpullido y erupciones, anfilaxis, inflamación del esófago, alteración de la presión sanguínea y shock, calambres intestinales y hinchazón, dolor óseo (de leve a severo/debilitante), picazón con y sin erupción, dolor de pecho, hígado, bazo y otro involucra-miento de órganos, dificultades cognitivas /confusión cerebral malaabsorción, enfermedad degenerativa del disco, migrañas, diarrea, dolor muscular, mareos/vértigo/aturdimiento, náuseas, desmayo, osteoporosis/osteopenia, fátiga, neuropatía periferal y parestesias, enro ecimiento, taquicardia, reflujo gastroesofágeo y vómitos.

El papel de los mastocitos en enfermedades alérgicas ha sido validado clínicamente por las drogas que bloquean a los mediadores específicos de mastocitos tales como la his-tamina y los corticoesteroides que entre sus actividades provocan apoptosis mastocitósi ca . Otras enfermedades relacionadas con mastocitos incluyen las reacciones alérgicas mediadas por histamina que pueden ser tratadas inhibiendo al mastocito inducido por quimioquina y por desgranulación basófila y liberación de histamina. Ejemplos de desórdenes o enfermedades asociadas con los mastocitos y que pueden ser tratadas efec-tivamente con los métodos y composiciones que son sujeto de la presente también incluyen, pero no se limitan a, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis eczematosa y dermatitis causada por picaduras de insectos .

Otras indicaciones relacionadas con los mastocitos que son adecuadas para el tratamiento por los métodos y composiciones de la invención incluyen condiciones inflamatorias pulmonares en enfermedades pulmonares intersticiales por ejemplo sarcoidosis, síndrome de insuficiencia respiratoria neonatal (RDS), displasia broncopulmonar (BPD) , y condiciones caracterizadas por una elevación en la actividad PLA2 en el seronímica, tales como el RDS en adultos (ARDS) .

Asimismo se ha publicado que los mastocitos juegan un papel en la artritis. Los mastocitos se incrementan en los tejidos sinoviales inflamados en pacientes con RA y OA, y el Gleevec ha demostrado causar apoptosis mastocitosica en explantos sinoviales y los modelos de estudio humanos muestran una eficacia en pacientes de RA. Los mastocitos tienen un rol en el shock séptico, la pancreatitis, enfermedades vasculares de colágeno, falla renal aguda, peritonitis, y uveitis auto-inmune .

Otros estudios también sugieren que los mastocitos participan en la patofisiologia de la esclerosis múltiple. Se considera que los mastocitos cerebrales liberan aminos va-soactivos que pueden causar demielini zación . La histamina liberada por los mastocitos puede alterar la integridad de los vasos sanguíneos y causar destrucción parcial de la barrera sanguíneo cerebral también involucrada en la etiología de la esclerosis múltiple. Por lo tanto se contempla que los métodos y composiciones de la invención sean adecuados para el tratamiento o mejoramiento de la morbilidad asociada a la esclerosis múltiple.

El C-kit se expresa también en ciertas células no inmunes tales como los melanocitos y células intestinales y también en los espermatocitos . La invención puede ser de utilidad en el tratamiento del melanoma y GIST y pueden ser útiles como método anticonceptivo masculino.

Administración y preparación de las fórmulas farmacéuticas Los agentes de unión específicos anti C-kit o anticuerpos usados en la práctica de un método de la invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el método deseado de ejecu- ción. Los portadores adecuados incluyen cualquier material que, al ser combinado con el agente de unión especifico o anticuerpo anti C-kit y antagonista neutral, retiene una alta afinidad ligante y potencia para el C-kit y no es reactiva con los sistemas inmunes del sujeto. Ejemplos de esto incluyen, pero no se limitan a, cualquier número de portadores farmacéuticos estándar tal como soluciones salinas amortiguadas de fosfato estéril, agua bacterioestát ica y semejantes. Una variedad de transportes acuosos pueden ser usadas, ejem-pío: agua, agua amortiguada, salina al 0.4%, glicina al 0.3% y semejantes, y se pueden incluir otras proteínas para una estabilidad ampliada, tal como la albúmina, lipoproteína , globulina, etc., sometidas a leves modificaciones químicas o semej ante .

Las concentraciones de anticuerpos ejemplares en la fórmula pueden abarcar un rango de cerca de 0.1 mg/ml a cerca de 180 mg/ml o de cerca de 0.1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, o de cerca de 0.5 mg/mL a cerca de 25 mg/mL o alternativamente de cerca de 2 mg/mL a cerca de 10 mg/mL. Se puede preparar una formulación acuosa del anticuerpo en una solución de pH amortiguado, por ejemplo con el pH abarcando de cerca de 4.5 a cerca de 6.5, o de cerca de 4.8 a cerca de 5.5 o alternativamente cerca de 5.0. Ejemplos de amortiguadores (buffers) apropiados para un pH dentro de este rango incluyen acetato (ejemplo acetato de sodio), succinato (tal como el succinato de sodio) , gluconato, histidina, citrato y otros amortiguadores acidicos orgánicos. La concentración del buffer puede ser de alrededor de 1 mM a cerca de 200 mM, o de cerca de 10 mM a cerca de 60 mM dependiendo por ejemplo del buffer y de la isotonicidad deseada de la fórmula.

Se puede incluir en la fórmula un agente de tonicidad, que también sea capaz de estabilizar al anticuerpo. Los agentes de tonicidad ejemplares incluyen a los polioles, tales como mannitol, sucrosa o trehalosa. Preferiblemente la fórmula acuosa será isotónica, aunque las soluciones hipertónicas o hipotónicas también pueden ser adecuadas. Las concentraciones ejemplares del poliol en la fórmula pueden variar de cerca del 1% a cerca del 15%w/v.

También se puede añadir un surfactante a la formulación del anticuerpo para reducir la agregación del anticuerpo formulado y/o minimizar la formación de partículas en la formulación y/o reducir la adsorción. Ejemplos de surfac-tantes incluyen surfactantes no iónicos tales como los poli-sorbatos (ej polisorbato 20 o polisorbato 80) o poloxameros (ej poloxamero 188). Las concentraciones de surfactante pueden abarcar de cerca de 0.001% a cerca de 0.5%, o de cerca de 0.005% a cerca de 0.2%, o alternativamente de cerca de 0.004% a cerca de 0.01%w/v.

En una realización, la fórmula contiene los agentes arriba identificados (ejemplo anticuerpo, buffer, poliol y surfactante) y está esencialmente libre de uno o más preservantes, tales como alcohol benzilico, fenol, cresol-m, cloro-butanol y benzetonioCL . En otra realización un preservante puede ser incluido en la fórmula, ejemplo en concentraciones que van de cerca de 0.1% a cerca del 2%, o alternativamente de cerca de 0.5% a cerca del 1%. Se pueden incluir en la formulación uno o mas portadores alternativos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores tales como los des-criptos en Remington*s Pharmaceutical Sciences 16th editio, Osol, A. Ed. (1980) con la condición de que no provoquen un efecto adverso sobre las características deseadas de la formulación. Se consideran portadores, excipientes o estabiliza-dores aceptables aquellos que no sean tóxicos para el recipiente en las dosis y concentraciones empleadas. En este grupo se incluyen: agentes de amortiguación adicionales; cosol-ventes; antioxidantes como el ácido ascórbico y la metionin; agentes quelantes como el EDTA; complejos de metales (ejemplo complejos de proteína Zn) polímeros biodegradables como los poliésteres ; y/o contra iones de formación de sales como el sodio .

Las fórmulas terapéuticas del anticuerpo son preparadas para almacenamiento mezclando el anticuerpo que posee el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Reming-ton's Pharmaceut ical Sciences 16th editio, Osol, A. Ed . (1980) ), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los recipientes en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen buffers tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico y metionina; preservantes (como cloruro de amonio octadesildimetilbencilo; cloruro hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butil o alco-holbenzilo; alquilparabens como metil o propi lparabens ; cate-col; resorcinol; ciclohexanol ; pentanol-3; y cresol-m) ; poli-peptidos de bajo peso molecular (menos de cerca de 10 resi-dúos); proteínas como albúmina de suero, gelatina o inmuno-globulinas; polímeros hidrofílicos tales como el polivinilpi-rrolidon; aminoácidos como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o licina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidrátos que incluyen glucosa, mannosa, maltosa, o dextrinas; agentes quelat inantes como el EDTA; azúcares tales como la sucrosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contra iones de formación de sales tales como el sodio; complejos de metal (ejemplo, complejos de proteína Zn) ; y/o surfactantes no iónicos como el TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) .

En una realización, una formulación adecuada de la invención reivindicada contiene un amortiguador isotónico como un fosfato, acetato, o amortiguador TRIS in combinación con un agente de tonicidad como el poliol, Sorbitol, sucrosa o cluoruro de sodio que otorga tonicidad y estabilidad . Un ejemplo de dicho agente de tonicidad es Sorbitol al 5% o sucrosa. Además, la formulación podría de manera opcional incluir un surfactante tal que prevenga la agregación y para una estabilización del 0.01 al 0.02% wt/vol. El pH de la for-mulación puede estar en un rango que vaya del 4.5-6.5 ó 4.5-5.5. Otros ejemplos de formulaciones farmacéuticas para anticuerpos pueden hallarse en US 2003/0113316 y la patente de los EUA No. 6.171.586, ambas incorporadas aquí para referencia en su totalidad.

La formulación mencionada puede a su vez contener más de un compuesto activo según sea necesario para cada indicación en particular en tratamiento, preferentemente las que posean actividad complementaria que no se afecten mutuamente de forma adversa. Por ejemplo, puede ser deseable pro-veer otro agente inmunosupresor . Dichas moléculas están adecuadamente presentes en las combinaciones en cantidades efectivas para el fin previsto.

Los ingredientes activos pueden también ser contenidos en microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsu-la poli- (met ilmetacilato ) , respectivamente, en sistemas coloidales de distribución de la droga (por ej : liposo-mas , microesferas de albúmina , microemulsiones , nanopart iculas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Dichas técnicas están divulgadas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edi-tion,Osol,A.Ed(1980) Las suspensiones y formas cristalizadas de anti-cuerpos también están contempladas. Los métodos para realizar suspensiones y formas cristalizadas son conocidos por los expertos en la materia.

Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Las composiciones de la invención pueden ser esterilizadas con técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas. Por ejemplo, la esterilización se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las soluciones resultantes pueden ser envasadas para su uso o filtradas bajo condiciones de asepsia y liofilizadas , siendo esta última preparación combinada con una solución estéril previa a ser administrada.

El proceso de secado por congelamiento se usa a menudo para estabilizar polipéptidos para almacenamiento a largo plazo, particularmente cuando el polipéptido es relati- vamente inestable en composiciones liquidas. Un ciclo de lio-filización está en general compuesto de tres pasos: congelamiento, secado primario y secado secundario.; Williams & Po-lli, Journal of Parenteral Science & Technology, Volume 38, Number 2, pp48-59 (1984) . En el paso de congelamiento, la solución es refrigerada hasta que se congela adecuadamente. El agua en volumen la solución forma hielo en este estadio. El hielo sublima en la etapa de secado primario, el cual es conducido reduciendo presión de cámara por debajo de la pre-sión de vapor del hielo, usando método de vacio. Finalmente, el agua absorbida o ligada es removida en la etapa de secado secundario bajo presión de cámara reducida y una elevada temperatura de almacenamiento. El proceso produce un material conocido como "pastel liofilizado" . De ahí en más el pastel puede ser recontituido previo al uso.

La práctica de reconstitución estándar para material liofilizado es la de añadir nuevamente un volumen de agua pura (típicamente equivalente al volumen removido durante la liofilización) . Aunque las soluciones diluidas de agen-tes antibacteriales son usadas a veces en la producción de fármacos para administración parenteral; Chen, Drug Develop-ment &Industrial Pharmacy, Volumen 18, Nos.11 y 12, pp 1311-1354 (1992) .

Se ha notado que en algunos casos los excipientes actúan como estabilizadores de productos secados por congelamiento; Carpenter et . al , Developments in Biological Standardi-zation, Volumen 74, pp 225-239(1991) . Por ejemplo, excipien-tes conocidos son los polioles (ej : mannitol, sorbitol y gli-cerol) ; azúcares (ej : glucosa y sucrosa) ; y aminoácidos (ej : alanina, glicina y ácido glutámico.) Además, los polioles y los azúcares también son a menudo utilizados para proteger a los polipéptidos del dete-rioro provocado por el proceso de secado y congelamiento y para aumentar la estabilidad durante el almacenamiento en estado seco. En general los azúcares, en particular los disacáridos, son efectivos tanto en el proceso de secado- congelado como durante el almacenado. Otras clases de moléculas inclu-yendo las mono- y las di-sacáridas y los polímeros como PVP, también han sido reportados como estabilizadores de productos liofilizados .

Para inyección, la fórmula farmacéutica y/o medicamento puede ser un polvo apropiado para reconstitución con una adecuada solución como la descrita anteriormente. Ejemplos de de éstos son, pero no se limitan a, polvos de secado/congelado, de secado rotatorio, de secado por rocío, polvos amorfos, gránulos, precipitados, o particulados. Para inyección, las formulaciones pueden opcionalmente contener es- tabilizadores , modificadores de pH, surfactantes , modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de éstos.

Se pueden realizar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de las antedichas son: ma-trices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, las cuales se hallan en forma de artículos moldeados, ejemplo: films o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida son: poliés-ters , hidrogeles , (ej : poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o po-li ( inilalcohol ) ) , poliláctidos ( Patente de EUA No. 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutámico y etil-L gluta-mato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico/ácido glicólico degradables, como el Lupron Depot ™ (microesferas inyectables compuestas de un copolímero ácido de ácido láctico/ácido glicólico y acetato leuproluro) , y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico . Mientras que los polímeros tales como acetato etilen-vinilo y ácido láctico/ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo menores.

Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un período largo de tiempo, ellos pueden desnaturalizarse o sufrir agregación como como resultado de la exposición a la humedad a 37 C , resultando en pérdida de acti- vidad biológica y posibles cambios en la inmunogeneicidad . Se pueden diseñar estrategias racionales de estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de eslabón S—S intermolecular mediante intercambio thio-disulfuro, se puede lograr estabilización modificando residuos de sulfi-dril, liofilizando a partir de soluciones acidicas, controlando contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica especificas.

Las formulaciones de la invención pueden ser diseñadas para ser de corta acción, de rápida liberación, de acción prolongada, o de liberación sostenida como lo ya descrito. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas también pueden ser formuladas para liberación controlada o lenta.

Dosificaciones especificas pueden ser adaptadas dependiendo de las condiciones de enfermedad, edad, peso corporal, condiciones generales de salud, sexo y dieta del sujeto, intervalos de las dosis, rutas de administración, tipo de excreción, y combinación de drogas. Cualquiera de las formas de dosificación ya mencionadas que contengan cantidades efectivas se encuentra dentro de los limites de la experimentación de rutina y, por lo tanto, caben dentro del alcance de la invención.

El agente de unión específico o anticuerpo es administrado por los medios adecuados, incluyendo medios parenterales , subcutáneos, intraperitoneales , intrapulmonares e intranasales , y, si se desea, para tratamiento lo-calizado, administración intralesión. Las infusiones parenterales pueden ser: administraciones intravenosas, intraarte-riales, intraperitoneales, intramusculares, intradermales o subcutáneas. Asimismo, el agente de unión específico o anticuerpo se administra adecuadamente como infusión de púlsación, particularmente con dosis declinantes del agente de unión específico o anticuerpo. Preferentemente la dosis es aplicada por inyecciones, preferentemente intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Otros métodos de administración se contem-plan, como la administración tópica, particularmente trans-dermica, transmucósica , rectal, oral, o local, por e : mediante un catéter ubicado cerca del sitio deseado. Lo más preferible es que el agente de unión específico o anticuerpo de la invención sea administrado de forma intravenosa en una so-lución fisiológica en una dosis que abarque entre O.Olmg/kg y 100 mg/kg con una frecuencia que sea desde diaria a semanal o mensual (ej : todos los días, cada dos días, cada tres días, o 2, 3, 4, 5 ó 6 veces por semana), preferiblemente una dosis que abarque desde 0.1 a 45 mg/kg, de 0.1 a 15 mg/kg ó de 0.1 a 10mg/kg con una frecuencia de dos o tres veces semanales, o hasta 45 mg/kg una vez al mes.

Administración con otros agentes Los anticuerpos de la invención pueden ser también concurrentemente administrados junto con otros agentes terapéuticos antiinflamatorios . La administración concurrente incluye la administración de los dos diferentes agentes terapéuticos en distintos tiempos y rutas diferentes, siempre y cuando haya halla alguna superposición en el tiempo en que los agentes se encuentran ejerciendo sus efectos terapéuticos. Ejemplos de agentes anti c-kit conocidos por los expertos en el tema incluyen al Imatinib Mesylate (Gleevec ™) . Debe tenerse en cuenta que el Imatinib Mesylate también antago-niza la señalización de Abl tirosina quinasa y, por lo tanto, no es un inhibidor especifico de c-kit.

EJEMPLOS Humanización de SR-1 El SR-1 fue humanizado por un injerto de CDR directo, que sorprendentemente no requirió de retromuta-ciones para mantener la afinidad pero la actividad funcional deseada no llegó a demostrarse. Las estructuras humanas que mantuvieron la mayoría de los residuos canónicos, y que no introdujeron residuos de prolina adicionales, se seleccionaron como secuencias aceptoras. Basados en este criterio, la secuencia aceptora de cadena pesada fue la VH1 1-46 para las estructuras I y II y V H 1 1-e para la estructura III, con JH4 como la regiónJ más cercana (también conocida como estructura IV) . La secuencia aceptora de cadena liviana fue la secuencia de linea germinal VK4 B3 con la JK2 como la región J más cercana.

Se realizó substitución de isotipos para producir IgG2, IgGl, IgG4P humana y formas de IgG 1 aglicosiladas del ant icuerpohumani zado . El sitio de consenso de glicosilación de enlace-N fue removido de la secuencia de región constante de IgGl humana por mutación de un único residuo de asparagi-na a ácido glutámico en la posición 297 (numeración de Ka-bat) .

El SR-1 humanizado en la forma de IgGl (HSR-1 algGl) aglicosilada se une de la manera deseada con mayor afinidad al c-kit asociado a la membrana comparado con el c-kit soluble, y es un antagonista de SCF neutro de alta potencia y no provoca agonismo de c-kit directamente en ninguno de los ensayos de base celular testeados usando lecturas proximales y distales de señalización de c-kit. Se seleccionó el isotipo de IgGl aglicosilado para evitar la función efectora y la destrucción de células por efecto de cercanía (bystander) . Este anticuerpo demostró poseer una vida media deseada e inesperada, PK no linear y eliminación de anticuerpos mediados por objetivos en monos. También suprime los mastocitos in vivo, como es de esperar.

Unión al dimero c-kit La activación de c-kit luego de la unión por factor de célula madre (SCF) conduce a la dimeriza-ción/oligomerización, autofosforilación e internali zación del receptor, más probablemente mediante un camino dependiente del clathrin. El anticuerpo monoclonal SR-1 se une al dimero de c-kit con una afinidad 1000 veces mayor en comparación con el monómero de dominio extracelular de c-kit soluble determinado por Biacore.El modelado cinético sugiere que el SR-1 se uniría preferentemente al receptor nativo asociado a la membranaaún en presencia de ng/mL del monómero de receptor de shed soluble.

Los carbohidratos presentes en una glicoproteína pueden influir en las propiedades biológicas y funcionales . La humanización de SR-1 hacia una forma de IgGl aglicosilada demostró que los parámetros de unión se conservaron . La algGl de SR-1 humanizado se unió al receptor-Fc de c-kit recombinante con KinExA Equilibrium Binding Kd de 1.0 pM y usando el ensayo de Biacore, la algGl de hSR-1 bloqueó el factor de células madres (SCF) uniéndose con un Ki=70 Pm .La algGl de hSR-1 se une con gran afinidad al receptor dimero versus mo-nómero. Esta es una característica importante la cual no se esperaba se tradujera con certeza con la humanización ya que el monómero de c-kit soluble es menos probable que actúe como pileta para el anticuerpo in vivo.

Inhibición de la supervivencia de la célula dependiente del c-kit y señalización de receptores La línea celular UT-7megacarioblástica humana depende del SCF para su supervivencia y la remoción del SCF o su inhibición resulta en una pérdida rápida de viabilidad y reducida proliferación. Este ensayo adecuado para la determinación de potencia IC50 de los antagonistas del SCF. La algGl de hSR-1 exhibió un promedio de IC50 de 35 pM.

La algGl de hSR-1 inhibió fuertemente la fosforilación de c-kit mediada por SCF y la internalización en células M07e indicando que el anticuerpo es capaz de bloquear eventos de señalización de c-kit mediados por SCF . Contrastando con el descubrimiento de que el SR-1 es capaz de mediar intrínsecamente la internalización y fosforilación del c-kit, sorprendentemente , no se ha detectado evidencia alguna de agonismo en la lectura de fosforilación proxi-mal del receptor de c-kit M07e para la algGl de hSR-1. otablemente, la a!gG2 de hSR-1 , el anticuerpo de IgG2, fue levemente menos potente y no inhibió completamente la in-ternalización del receptor de c-kit mediado por SCF.

La algGl de hSR-1 muestra neutralización a 1.0 ug/mL del efecto sinergistico del SCF sobre la forma-ción de colonias derivadas de GM-CSF usando células de médula ósea (de c-kit) CD34+, CD117+ humano primarias aisladas. Consistente con nuestro descubrimiento acerca de que la algGl de hSR-1 no mediaba la internali zación o la fosforilación del c-kit, y en cuanto a que no se observaba actividad de super-vivencia agonista intrínseca de algGl de hSR-1 hasta una concentración del anticuerpo de 10 ug/mL en este ensayo. De hecho, el anticuerpo fue capaz de inhibir la supervivencia por debajo de la línea de base.

Ausencia de agregación de los mastocitos, actividad CDC y FcR Se usaron mastocitos humanos cultivados derivados de médula ósea CD34+ para evaluar la potencia aparente y el orden de rango de los compuestos . La algGl de hSR-1 inhibió la supervivencia de los mastocitos dependientes de SCF, no confirió signo de supervivencia alguno a los mastocitos, no actuó como mediadora de la fosforilación del receptor c-kit (figura 3) y no mostró capacidad de mediación en la agregación homotípica de los mismos. Por el contrario, la IgG2 de hSR fue capaz de bloquear la supervivencia de los mastocitos SCF pero en sí misma mostró una actividad agonista parcial confiriendo una señal de supervivencia, mediando fosforilación del receptor c-kit y resultó en un efecto reproducible en el agrupamiento (clustering) de los mastocitos. No se observaron anormalidades inesperadas para la algGl de hSR-1 cuando este anticuerpo fue administrado in vivo hasta 30 mg/kg una vez por semana durante 4 semanas o hasta 150 mg/kg subcutáneamente una vez por semana durante 2 semanas en primates no humanos.

La algGl de hSR-1 muestra no poseer ca-pacidad detectable de unión de FcrR no especifico a las células U-937 que expresan receptor de Fcy I=CD64, receptor de Fcy II=CD32 y receptor de Fcy 111= CD16. Por el contrario, se detectó unión de IgGl de SR-le isotipos de IgG4P presumiblemente al FcyRI de alta afinidad. Por lo tanto no se predice actividad ADCC para la algGl de hSR-1, y datos experimentales hasta la fecha no demuestran muerte celular citotóxica dependiente del complento.

Se ha reportado que los anticuerpos de IgGl huma-na/murina quimérica aglicosilada retienen alguna función efectora. (Hybridoma .1991 April 10 (2) :211-7) y por lo tanto estas actividades deseadas de la algGl de hSR-1 no son esperadas. Los datos muestran que la aplicación de metodologías estándar y por lo tanto la selección de isotipos de IgG2 o IgGl o IgG 4 típicos no habrían producido una molécula con carácter! sticas apropiadas, o sea, un enlace de alta afinidad, antagonista funcional puro de c-kit y que a su vez no activara mastocitos.

Farmacocinética Se llevó a cabo un estudio preliminar de PK con el fin de comparar PK de la IgG2 de hSRl y la algGl de hSRl en monos Cynomolgus luego de administración de IV o SC a 3 mg/kg. Perfiles de tiempo indican una PK no lineal para ambos casos. Las concentraciones se redujeron más rápidamente a niveles más bajos de concentración. Los dos anticuerpos mostraron una exposición similar medidas por Co/C max y AUC o -tlast, luego de una única administración de IV o SC en monos Cynomolgus . Basados en AUC o -tlast, la evacuación de suero fue de aproximadamente = 0.3 mL /hr/kg para ambos anticuerpos humani zados . La biodisponibilidad fue de aproximadamente 82% y 69% para las versiones humanizadas SR-1 de algGl de hSRl y la IgG2 de hSRl, respectivamente, luego de administración de SC.

Basados en datos preliminares de exposición de anticuerpos de SR-1 y humanizados en monos verdes africanos luego de dosis repetida una vez por semana, los anticuerpos humanizados lograron exposiciones más altas comparadas con SR-1. Notablemente, algGl de hSRl demostró un mejor igual en el grupo PK y ha sido previamente demostrado que el grado de glicolisación de una molécula puede alterar sus propiedades farmacocinéticas y, en el caso de un anticuerpo, su metabolismo y otras propiedades biológicas . Cáncer Immu-nol . Immuneother, 1992 ;35 (3) :165-74 Tabla 1: Estimados de parámetros farmacocinéticos luego de dosis única de IV o SC de IgG2 de hSRl o algGl de hSRl a 3mg/kg a monos machos Cynomolgus.

Ruta CL or Articulo de ^0 / Cmax Tmax AUCo-tlast CL/Fa ensayado dosis (mL/hr/kg) F% hSR-1 algGl IV 103 - 9710 < 0.309 hSR-1 IgG2 IV 107 - 10600 < 0.283 hSR-1 algGl SC 36.4 72 7970 < 0.376 82.1 hSR-1 IgG2 SC 36.7 60 7290 ( 0.412 68.8 C0 = Concentración inicial estimada luego de dosis de IV Cmax = máxima concentration luego de dosis de SC Tmax = tiempo de Cmax AUCO-tlast = área bajo la curva de tiempo de concentración desde tiempo 0 al último punto de tiempo con una concentración cuantificable CL = evacuación luego de dosis de IV; CL/F = evacuación aparente luego de dosis de SC F% = % de biodisponibilidad a Evacuación calculada basada en AUCO-tlast - no aplicable CO, Cmax, AUC0- { last } , CL, CL/F, y % de F reportado en 3 figuras significativas.

Proyecciones de dosis en humanos La dosis efectiva mínima en el modelo de herida PD de expansión de mastocitos es < a 0.3 mg/kg administrada una vez por semana durante 2 semanas en monos. Basa-dos en una conversión de dosis por superficie corporal, la dosis mínima efectiva en humanos está proyectada en < O.lmg/Kg con un régimen de administración equivalente. Sin embargo, ésta es una estimación preliminar ya que no se conocen por el momento la PK y la relación farmacodinámica entre el grado y la duración de la inhibición del c-kit en humanos por algG 1 de hSR-1 ni los límites clínicos.

Se realizará una proyección más precisa cuando más datos farmacocinéticos y farmacodinámicos estén disponibles .

Potencia in Vivo: Supresión de mastocitos básales de pulmón y colon en monos con IgG 1 SR-1 y hSR-1 En humanos los mastocitos MCt que expresan trypta-sa y ausencia de quimasa se localizan primariamente en tejidos mucosos como los de pulmón y de colon, y este subtipo ha sido detectado en piel y en niveles superiores en pacientes con escleroderma lo cual sugiere una posible activación alternativa de los mastocitos en esta condición . Los mastocitos MCtc que expresan tanto triptasa como quimasa también se colocalizan en algunos de estos tejidos y fueron asociados si-milarmente con el escleroderma y otros procesos fibróticos. Se deriva que ambos subtipos representarían los blancos primarios para un inhibidor de c-kit en enfermedades que involucran tejidos mucosos y conectivos (ej : IPF. SSc, asma, RA y IBD) . La terapéutica también debería ser altamente potente, eficaz y poseer un buen volumen de distribución y PK ya que los mastocitos son en general de larga vida y tej idoresiden-tes. Más aún, los mastocitos son mayormente quiescentes hasta su activación para desgranulación y de novo sintetización de mediadores donde ellos entonces participan activamente en la respuesta antiinflamatoria.

Los objetivos de los estudios in vivo fueron demostrar la supresión de los mastocitos básales de mucosa y tejido conectivo como los presentes en el pulmón y el colon y determinar su efecto en la hematopoyesis y en células precursoras asi como el impacto en la eritropoyesis , melanogénesis y espermatogénesis (y su utilidad como anticonceptivo masculino) siguiendo inhibición de c-kit sostenida y de alta fracción. El anticuerpo monoclonal SR-1 se seleccionó en base a su potencia funcional equivalente en el c-kit humano y de mono en el ensayo CFU de células de médula ósea CD34+ (inhibición al 1.0ug/mL),y su PK de mono.

Se administró SR-1 en dosis de 3mg/Kg a 30 mg/KG una vez por semana durante 4 semanas. En estudios de tiempos, se demostró que los mastocitos básales de colon fueron suprimidos al máximo luego de 2 dosis al día 14 (Ctrough 800 veces> que las células con IC50),y asi el dia 14 fue seleccionado como punto de tiempc para determinar la actividad farmacológica de los antagonistas de c-kit en los mastocitos básales de colon .Por razones prácticas , los mastocitos básales de pulmón fueron evaluados en el dia 28 en el momento de la necropsia y la finalización del estudio.

Administrada una vez por semana una dosis de SR-1 de 3.0mg/kg, se observó supresión de mastocitos básales de pulmón a un nivel de Ctrough PK de > 200 veces que UT-7 celular con IC50.Los efectos en dosis más bajas de SR-1 en mastocitos básales de pulmón y de colon, melanogéne-sis y espermatogénesis no fueron evaluados.

Sin embargo, un estudio de dosis menor con algG 1 de hSR-1 se realizó a 0.3, 1.0 y 3.0 mg/kg. Los niveles de Ctrough del día 14 fueron > 200, > 2000 y > 8000 veces que las células con IC50 y estos niveles de Ctrough no se correspondían con la eficacia, supresión de casi la mitad (69%), y de casi la totalidad (96%) de los mastocitos básales de colon (resumido en la tabla 1) .La exposición, potencia celular y relación de efecto para la algG 1 de h-SR-1 se halla en correspondencia con los hallazgos reportados para SR-1.

Eficacia in vivo de SR-1 y de la algG 1 de h-SR-1 en modelo farmacodinámico de herida y de expansión de mastocitos en monos Una lesión en piel provoca una respuesta antiniflamatoria robusta , en la cual primero migran células neutrófilas y luego células macrófagas y mastocitos de tejidos aledaños y de la circulación,- granulación y re-epiteli zación de tejidos y de la contracción asociada a fibroblastos de los tejidos conectivos de la herida (Diegel-mann RF et al., Front Biosci .2004, Jan 1; 9:283-9). El modelo de herida cutánea es un modelo de estudio de mecanismos que pueden ser relevantes en la fibrosis dado que varios de los tipos de células involucrados se asocian con esta enfermedad. Además, se ha reportado que en humanos se asocia con una elevación del SCF derivado de fibroblastos y activación y aumentada densidad de los mastocitos (Trautmann et al., J.Pathol. 2000, Jan; 190(1) .100-6) . A partir de una herida cutánea en monos, el número de mastocitos se incrementa de manera diferente de acuerdo al tiempo transcurrido con un periodo de meseta que se alcanza a los 14 días posteriores a la herida, lo cual es comparable al paradigma humano.

Las dosis de 0.3, 1.0, ó 3.0 mg/kg de SR-1 administradas una vez por semana llevaron a una casi máxima inhibición de la expansión de mastocitos activados por la herida en el día 14 (figura 1) .

La inhibición máxima se define como la habilidad de bloquear en un 100% el incremento de mastocitos por encima de los números de linea base al día 14 post herida. Los niveles de Ctrough para la dosis de 0.3 mpk fueron >7 veces la UT-7 IC50 al día 14 (tabla 2) . A la tercera semana, los niveles de suero eran de cerca de 2 veces mayores que UT-7 >200, y en esta exposición se observó sólo una inhibición parcial (figura 1) . A las 3 semanas, todavía se observaba una eficacia máxima tanto para el grupo de 1 mg/kg como la de 3 mg/kg. Donde los niveles de suero Ctrough se sostuvieron en >200 veces los de IC50. Estos estudios sugieren que una soste- nida exposición al Ctrough en una concentración >7 veces la de IC50 se requiera probablemente para provocar máxima inhibición de mastocitos expandidos por lesiones.

Las dosis de 0.3, 1.0, ó 3.0 mg/kg de SR-1 de IgG 1 se evaluaron en basea la máxima eficacia demostrada para SR-1 en este modelo. En la dosis más baja evaluada (0.3mg/kg), se observó una máxima inhibición de la expansión de mastocitos en la herida dentro de las 2 semanas. Los niveles de suero Ctrough en ese momento fueron >200 veces los de UT-7 IC50 (tabla 2).

La tabla 2 resume los efectos PD/ PK de SR-1 y algGl de hSR-1 en el modelo de herida PD Una herida incisional fue realizada seguida de biopsia de punzado hasta el dia 21 en primates humanos (izquierda) o no humanos (derecha) (figura 2) . Los mastocitos y/o los fibroblastos que expresan SCF se revelaron por tin-ción cromogénica o IHC respectivamente. En humanos, la expresión de SCF se eleva y retorna a la linea basal y es seguida temporariamente por una elevación transitoria del número de mastocitos durante cicatrización normal. Una respuesta mas-tocitósica a la herida similar se observó en monos. Durante la cicatrización aberrante y fibrosis se mantienen elevados la expresión SCF y el número de mastocitos (figura 2) .

HEMATOPOYESIS Y MELA OGENESIS La genética de ratón muestra que el c-Kit juega un papel importante en la hematopoyesis durante el desarrollo embriónico, pero en mutaciones en Piebald de c-Kit humanas heterozigotas inactivantes y/o de pérdida de función los sujetos no se han ligado a anormalidades hematológicas . El SCF y el c-Kit son importantes en la hematopoyesis humana dado que el SCF se usa en combinación con G-CSF para movilización de célula madre hematopoyécica . Además, el inhibidor de mul-tiquinasa Gleevec que se dirige primariamente a BCR-ABL, PDGFR y c-Kit tiene como efecto farmacológico primario la mielosupresión, y se han reportado en pacientes con GIST ane- mias severas de grado 3-4 y trombositopenias (Hensley ML, et al.; Semin. Hematil. 2003, apr; 40 (2 Suppl 2) : 21-5) .

La genética de ratón indica que el c-Kit participa en la migración de melanoblastos de la cresta neural durante la embriogénesis , y este rol está apoyado en el piebaldismo humano. Se ha reportado que el Gleevec causa despigmentación por bandas en el cabello de un número menor de pacientes con GIST pero este no ha sido un hallazgo consistente y se ha reportado igualmente hiperpigmentación . La contribución de otras quinasas tales como PDGF no puede excluirse. Estudios en ratón con inhibidores de multiquinasa y un anticuerpo c-Kit muestran que la inhibición de la pigmentación del cabello es completamente reversible sugiriendo que la inhibición del c-Kit afecta la función melanocitica y no la supervivencia en un escenario post-natal. (Moss et al., 2003).

El SR-1 fue usado en estudios de rango de dosificación en cantidades de 3 a 30 mg/kg administrado una vez por semana durante 4 semanas para determinar las exposiciones requeridas para inhibir hematopoyesis, espermatogénesis y mela-nogenesis activa. Un panel sanguíneo completo que incluye diferenciales celulares se realizó en muestras de sangre tomadas en la línes de base los días 4, 7, 14, 21 y 28 con posterioridad al comienzo del estudio. Un análisis de muestras de sangre recientemente aisladas fue realizado en el Laboratorio de Hematología Clínica del Hospital Queen Elizabeth, Barbados .

No se detectó un impacto significativo del SR-1 comparado con los sujetos de control y con los valores base en ninguno de los parámetros hematológicos analizados aunque se hallaron reducciones no significativas en RBCs en animales tratados con la droga 4 semanas después de iniciada la dosificación. En la dosis más alta testeada, 30 mg/kg una vez por semana durante 4 semanas, se lograron niveles de exposición de potencia > 70,000 veces que UT-7IC50. Se confirmó ausencia de efectos significativos sobre parámetros hematológicos por medio de análisis histopatolcgicos de médula ósea demostrando no haber diferencia entre los grupos tratados con la droga y los de control y no hubo supresión de células madre hematopoyéticas CD117 positivas lo cual sugiere caminos potenciales redundantes para la hematopoyesis en la especie NHP de mono verde Africano. El efecto de 3-30 mpk administrada una vez por semana durante 4 semanas en la melanogénesis . también fue examinado dado que puede ser de utilidad en el mela-noraa. Para evaluar los efectos en los melanocitos activados que pueden mejor reflejar el estado de enfermedad, se extrajeron pelos con el fin de activar la melanogénesis. El color normal del pelo de la piel no fue visiblemente afectado en grupo alguno. Sin embargo, se observó inhinibión de pigenta- ción capilar en grados variables en el crecimiento nuevo del pelo en monos que recibieron la dosis de 30 mg/kg. No se observó efecto alguno en el grupo de 10 mg/kg lo cual sugiere que la dosis que no provoca efecto se encontraría entre los 10-30 mg/kg. En el grupo de 10 mg/kg, las exposiciones al SR-1 fueron de potencia > 8,000 veces la del UT-7. La eficacia máxima de supresión de los mastocitos se logró a una potencia > 7 veces que la UT-7. Estos datos sugieren que la inhibición de c-Kit afecta la función melanótica, y que mayores dosis/exposiciones pueden ser necesarias para bloqueos en enfermedades caracterizadas por una excesiva actividad melano-cítica .

Espermatogénesis Estudios con ratones han demostrado que el c-Kit es importante para el mantenimiento y la proliferación de la espermatogenia diferenciada de receptor c-Kit positivo, pero no para el estadio inicial de diferenciación de células esperma-togoneales. Tanto el paciente con Piebald masculino como femenino heterozigotas para un alelo de receptor de c-Kit inactivo son fértiles lo cual sugiere que este grado de inactivación de c-Kit no parece afectar el desarrollo de la célula germinal primordial, espermatogénesis u ovogénesis.

El SR-1 demostró inhibición de espermatogénesis do-sisdependiente de 0.3-30 mg/kg. La dosis de una vez por sema- na de 0.3 mg/kg es menor que el efecto máximo observado en dosis mayores, y se requieren estudios de rango mas bajo para definir el ED50. Las exposiciones logradas son 7 veces las de UT-7 IC50 que es la exposición requerida para máxima eficacia en el modelo de herida en la expansión de mastocitos . La extrapolación de PK sugirió que el anticuerpo puede evacuarse probablemente un mes después de la última dosis, pero se eligió el periodo de 9 meses como punto de tiempo conservador para evaluarla recuperación. Se encontró espermatogénesis normal en todos los animales administrados a los 9 meses demostrando que el uso de una molécula parecida a la Hsr-1 algGl es útil como método anticonceptivo masculino.

SUMARIO El anticuerpo humanizado anti-c-Kit aglycosylado IgGl (hSR-1 algGl) es un anticuerpo especifico altamente potente que es neutralizante en todos los ensayos celulares testeados usando lecturas de señalización de c-Kit proximales y distales. Este no media intrínsecamente la internali zación del receptor c-Kit o la fosforilación como se reporta para el anticuerpo SR-1 monoclonal murinoparental . La elección del isotipo IgGl aglisocilado sobre los humanizados IgGl IgG2 IgG4 no habrían sido predecidos en base a aproximaciones estándar. Se eligió empíricamente Hsr-1 algGl via experimentación novel para demostrar que inhibía las características farmacológicas apropiadas del receptor c-Kit de membrana, evitar actividad agonista en el c-Kit y en los mastocitos, no poseyendo una función efectora y de destrucción de células mediante efectos bystander. Este anticuerpo demostró buena biodisponibilidad s.c y vida media, PK no lineal y eliminación saturable de anticuerpos mediados por blancos y supresión de mastocitos en monos. Estos datos predecirían una adecuada y eficaz dosis de supresión de mastocitos.

La dosis de eficacia mínima del monoclonal SR-1 mu-rinoparental en el modelo PD de herida de mono es < 0.3 mg/Kg (Ctrough > 7-veces la célula IC50), y en una exposición levemente mayor (Ctrough > 800-veces la célula IC50) fue también eficaz en la supresión de mastocitos básales de piel, colon y pulmón. Similarmente , se requieren niveles de exposición mayores que >8,000 veces la célula IC50 antes de que se observen impactos cualitativos en la pigmentación del capilar en el crecimiento nuevo del pelo. Se ha reportado inhibición de la pigmentación capilar con inhibidores de multiquinasa y un anticuerpo de c-Kit en roedores y la Hsr-1 algGl puede ser de utilidad en enfermedades asociadas con excesiva actividad me-lanocítica. El efecto es reversible luego del cese del tratamiento. Se ha mostrado un efecto submaximal en la inhibición de la espermatogénesis en niveles >7 veces la célula IC50, la exposición que confirió máxima eficacia en el modelo PD de herida. Todas las patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patentes de Estados Unidos, solicitudes de patentes de Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones no patentuales referidas en esta especificación y/o enlistadas en la Hoja de Solicitud de Datos, se incorporan aquí para referencia en su totalidad .

De lo antes expuesto se apreciará que a pesar de que realizaciones especificas de la invención han sido des-criptas en la presente con un proposito ilustrativo, varias modificaciones podrán realizarse sin desviarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un agente ligante que liga específicamente c-Kit y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.2. 2. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.2. 3. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 98% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.2. 4. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4. 5. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en la región determinante de complementacion donde se mantiene la afinidad del agente ligante a c-Kit. 6. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 5 donde hay una sustitución de aminoácido conservativa. 7. Un agente ligante que se liga específicamente a c-Kit y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. NO 4. 8. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende una secuencia de aminoácidos 95% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. NO 4. 9. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende una secuencia de aminoácidos 98% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. NO 4. 10. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2. 11. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 7, que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en la región determinante de complementacion donde se mantiene la afinidad del agente ligante a c-Kit. 12. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 11, donde hay una sustitución de aminoácido conservativa. 13. Un agente ligante que se liga específicamente a c-Kit y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. NO 6. 14. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende una secuencia de aminoácidos 95% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de región variable indicada en SEQ. ID. NO 6. 15. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende una secuencia de aminoácidos 98% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de región variable indicada en SEQ. ID. NO 6. 16. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2. 17. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en la región determinante de complementación donde se mantiene la afinidad del agente ligante a c-Kit. 18. Un agente ligante de acuerdo con la reivindicación 7, donde hay una sustitución de aminoácido conservativa. 19. Un agente ligante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que exhibe avidez kd para c-Kit de menos de 10-2, según lo determinado por análisis de resonancia plasmon de superficie. 20. Un ácido nucleico que codifica un agente ligante especifico que se liga con c-Kit que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en las indicadas en SEQ ID NOS 2, 4 o 6. 21. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 90% idéntica a un ácido nucleico seleccionado del grupo indicado en SEQ ID NOS 1, 3 o 5. 22. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 20-21. 23. Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 22. 2 . Un método para producir un agente ligante c-Kit especifico que comprende cultivar una célula hospedante de la reivin-dicación 23 de modo que el ácido nucleico se exprese para producir el agente ligante especifico. 25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además la etapa de recuperar el agente ligante especifico del cultivo de célula hospedante. 26. Un método para reducir o tratar la fibrosis, inflamación, auto inmunidad o enfermedades o afecciones cancerosas relacionadas con c-Kit en un individuo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo c-Kit al individuo. 27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, donde la afección o enfermedad es fibrosis. 28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, donde el anticuerpo antagonista es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anti-cuerpo de cadena simple o un fragmento de anticuerpo. 29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, donde el agente ligante de péptido o polipéptido, receptor soluble o receptor heterodimero soluble comprende además un dominio Fe. 30. Un método de acuerdo con la reivindicación 27, donde la afección fibrótica es seleccionada del grupo consistente en esclerodermia , enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis resultante de hepatitis crónica B o C, fibrosis inducida por radiación y fibrosis provocada por la cicatrización de heridas. 31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende además administrar un segundo antagonista a una cito-quina profibrótica , donde la citoquina es seleccionada de transformar el factor de crecimiento b(TGFb), interleuquina-4(IL-4), interleuquina-5 (IL-5) , interleuquina-9 (IL-9), in-terleuquina-13 ( IL-13, factor de estimulación de colonia de granulocitos/macrofagos (GM-CSF) , factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleuquina-1 beta (IL-lb), factor de creci-miento de tejido conectivo (CTGF) , interleuquina-6 ( IL-6 ) , on-costatina M (OSM) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), proteina quimiotáctica de monocitos 1 (CCL2/MCP-1), y quimioquina pulmonar y regulada por activación (CCL18/PARC) . 32. Una composición farmacéutica para reducir o prevenir la fibrosis en un individuo que sufre de una afección fibrótica que comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición de acuerdo con la reivindicación 1.