JP6532136B2 - 抗体に結合する低分子化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、抗体への結合能を有する低分子化合物をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで簡便にスクリーニングするための方法に関するものである。
近年、開発が盛んに行われている医療用タンパク質の一つに抗体医薬がある。抗体医薬とは、抗体を有効成分とし、抗体の有する機能を利用した医薬品であり、標的分子に対して特異的に働くために従来の医薬品が有していた副作用が軽減されており、且つ、高い治療効果が期待できる。抗体医薬は、実際に様々な病態の改善に寄与している。その一方で、生体に大量に投与されることから、他の医療用タンパク質と比べた場合に純度が品質に与える影響が大きいといわれている。
これまでの抗体医薬品には、主に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の分子形が用いられてきた。しかし近年、低コストで生産可能な次世代抗体としてＦｃ領域をなくした低分子抗体の研究が積極的に進められている。その理由の一つとしては、低分子抗体はＩｇＧ抗体に比べて製造コストを低減できることが挙げられる。詳しくは、抗体のＦｃ領域には一般的に糖鎖が結合しているため、ＩｇＧ抗体の製造にはチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を用いる必要があった。しかしＣＨＯ細胞を使って製造してもＩｇＧ抗体の糖鎖は不均一であり、ヒト抗体の糖鎖と異なるものが混入してヒト体内で抗原抗体反応を引き起こすことがあったため、厳密な精製が必要であった。それに対して低分子抗体は、Ｆｃ領域に付加される糖鎖を考慮する必要もないことから、大腸菌や酵母などを使った安価な生産が可能である。
しかし低分子抗体にはＩｇＧ抗体に存在するＦｃ領域がないため、その精製の際に、ＩｇＧ抗体精製時によく使われるプロテインＡをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを使うことはできない。そこで、低分子抗体の精製のため、抗体のＦａｂ領域やＦｖ領域への結合性を有する低分子化合物を固定化した担体を使ったアフィニティークロマトグラフィーカラムが開発されている（特許文献１，プロメティック・バイオサイエンス社製の「Ｆａｂｓｏｒｂｅｎｔ（商標）」）。これらの低分子化合物は、抗体の軽鎖と重鎖との間に存在するヌクレオチド結合部位や、抗体の２つの軽鎖ドメインの間にある窪み（ポケット）を結合標的部位としている（特許文献１，非特許文献１）。
このように、近年、Ｆｃ領域を有さない抗体医薬品と、それに対応したアフィニティークロマトグラフィーが盛んに開発されている。しかし抗体医薬品の分子形には、これら以外に抗体の軽鎖の可変領域（ＶL）や重鎖の可変領域（ＶH）のみを用いたもの（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）や、ラクダの重鎖の可変領域を用いたもの（ｎａｎｏｂｏｄｙ）など様々な分子形があり、これらを標的部位とするアフィニティークロマトグラフィーの開発はまだ不十分である。
Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＩＢＣ’ｓ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ＆ Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ（２００９）
上述したように、現在までに開発されている低分子抗体精製用のアフィニティークロマトグラフィーに使われる低分子化合物は、抗体の軽鎖と重鎖の間に存在するヌクレオチド結合や抗体の２つの軽鎖ドメイン間にある窪みを結合標的部位とするものである。しかし、様々な抗体医薬が開発されており、各抗体を簡便に精製するために、精製用アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体に結合させる化合物であって、抗体に高い親和性を有するものを簡便にスクリーニングするための方法が求められている。
そこで本発明は、抗体への結合能を有する低分子化合物をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで簡便にスクリーニングするための方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、抗体の可変領域の中でも比較的変異の少ないフレームワーク領域の特定アミノ酸配列が抗体間で共通して保存されており、当該配列を用いれば様々な抗体に親和性の高い低分子化合物をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで簡便にスクリーニングできることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
［１］ 抗体に結合する低分子化合物をスクリーニングする方法であって、
上記抗体の軽鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列１を有するフレームワーク領域に含まれる第１の結合標的部位と、上記抗体の重鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列２を有するフレームワーク領域に含まれる第２の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする方法。
アミノ酸配列１： 配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第９位のＸａａがセリン、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、第１５位のＸａａがプロリン、バリン、トレオニンまたはロイシンであり、第２４〜３１位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第３９位のＸａａがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、第７９位および第８０位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列２： 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第９位のＸａａがグリシン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、第１４位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第１７位のＸａａがグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはアスパラギン酸であり、第４１〜４３位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第４７位のＸａａがバリン、メチオニン、イソロイシンまたはロイシンであり、第５０位のＸａａがバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンであり、第５６位のＸａａがトレオニン、アルギニン、メチオニン、グルタミン酸、リシン、アスパラギンまたはアスパラギン酸であり、第６１位のＸａａがロイシン、アラニン、バリンまたはフェニルアラニンであり、第６５位のＸａａがロイシン、メチオニン、トリプトファンまたはイソロイシンであり、第６６位のＸａａがセリン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、グリシンまたはシステインであるアミノ酸配列
上記抗体の軽鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列１を有するフレームワーク領域に含まれる第１の結合標的部位と、上記抗体の重鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列２を有するフレームワーク領域に含まれる第２の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする方法。
アミノ酸配列１： 配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第９位のＸａａがセリン、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、第１５位のＸａａがプロリン、バリン、トレオニンまたはロイシンであり、第２４〜３１位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第３９位のＸａａがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、第７９位および第８０位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列２： 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第９位のＸａａがグリシン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、第１４位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第１７位のＸａａがグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはアスパラギン酸であり、第４１〜４３位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第４７位のＸａａがバリン、メチオニン、イソロイシンまたはロイシンであり、第５０位のＸａａがバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンであり、第５６位のＸａａがトレオニン、アルギニン、メチオニン、グルタミン酸、リシン、アスパラギンまたはアスパラギン酸であり、第６１位のＸａａがロイシン、アラニン、バリンまたはフェニルアラニンであり、第６５位のＸａａがロイシン、メチオニン、トリプトファンまたはイソロイシンであり、第６６位のＸａａがセリン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、グリシンまたはシステインであるアミノ酸配列
［２］ 上記第１の結合標的部位が、下記アミノ酸配列３およびアミノ酸配列４を含む上記［１］に記載の方法。
アミノ酸配列３： 配列番号３に示されるアミノ酸配列において、第４位のＸａａがグリタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であるアミノ酸配列
アミノ酸配列４： 配列番号４に示されるアミノ酸配列
アミノ酸配列３： 配列番号３に示されるアミノ酸配列において、第４位のＸａａがグリタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であるアミノ酸配列
アミノ酸配列４： 配列番号４に示されるアミノ酸配列
［３］ 上記第２の結合標的部位が、下記アミノ酸配列５およびアミノ酸配列６を含む上記［１］または［２］に記載の方法。
アミノ酸配列５： 配列番号５に示されるアミノ酸配列において、第６位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列６： 配列番号６に示されるアミノ酸配列
アミノ酸配列５： 配列番号５に示されるアミノ酸配列において、第６位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列６： 配列番号６に示されるアミノ酸配列
本発明に係るスクリーニング方法は、様々な抗体、例えばＦｃ領域を有さない低分子抗体の精製に用いられるアフィニティークロマトグラフィーの担体にリガンドとして結合させる低分子化合物を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで簡便にスクリーニングすることができる。また、本発明方法によりスクリーニングされた低分子化合物は、様々な抗体に対して親和性を示す汎用的で多様性のあるものであるので、低分子抗体のみならず免疫グロブリンの工業的な製造に活用することもできる。当該低分子化合物は、抗体の精製の他にも、抗体の特徴付け、同定、定量などにも利用できる。さらに、従来、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの精製の際には、軽鎖と重鎖との間に存在するヌクレオチド結合部位を結合標的部位とした低分子化合物（結合標的部位の数：２）や、軽鎖ドメイン間を標的部位とした低分子化合物（結合標的部位の数：２）が利用されていた。つまり、従来の当該低分子化合物の抗体に対する結合標的部位の数は２である。それに対して本発明方法によりスクリーニングされた低分子化合物は、抗体を構成する重鎖と軽鎖にそれぞれ存在し、抗体１分子当たり合計で４つ存在する結合標的部位において抗体と結合することができる。よって、本発明に係る低分子化合物は、抗体とより高い親和性で結合することができるため、抗体の精製などに非常に適しているといえる。
本発明に係る抗体に結合する低分子化合物のスクリーニング方法は、当該抗体の軽鎖の可変領域において、アミノ酸配列１を有するフレームワーク領域に含まれる第１の結合標的部位と、当該抗体の重鎖の可変領域において、アミノ酸配列２を有するフレームワーク領域に含まれる第２の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする。
本発明方法では、抗体、特にヒト抗体に対する低分子化合物の結合能を評価すべき結合標的部位として、フレームワーク領域に含まれる窪み（ポケット）を用いる。フレームワーク領域は、抗体のＦａｂ領域の先端部分である可変領域（Ｖ領域）において、抗原と直接接触する相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）以外の比較的変異の少ない領域をいう。フレームワーク領域は、可変領域の中でもアミノ酸配列の変異が比較的少なく、抗体間でも立体構造がよく似ているといわれている。本発明方法では、フレームワーク領域の特定アミノ酸配列との親和性が高い化合物を選択する。よって、当該化合物は、様々な抗体に対して共通して比較的高い親和性を示す。
また、本発明方法では、軽鎖と重鎖の両方において、フレームワーク領域にそれぞれ含まれる特定のアミノ酸配列を有する結合標的部位に親和性を示す化合物を選択する。
本発明方法で用いる特定のアミノ酸配列は、ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列をアラインメントし、相同性が比較的高く且つ低分子化合物が侵入可能なような窪み（ポケット）を形成するものである。
本発明において「アラインメント」という用語は、ペアワイズアラインメントおよびマルチプルアラインメントを指し、タンパク質のアミノ酸配列について、２つまたは３つ以上の配列間で対応する部分が並ぶように整列させることをいう。ここで、「ペアワイズアラインメント」とは、比較すべきアミノ酸配列とデータベースに保存されたアミノ酸配列を１対１で総当り比較を行う配列比較をいい、「マルチプルアラインメント」とは、１対３以上の多数で行う多重配列比較をいう。また、２以上のアミノ酸配列などにおける配列相同性は、アラインメントのためのソフトウエアにより容易に算出される。
本発明方法で用いるアミノ酸配列において、「任意のアミノ酸または欠失」は、進化の過程におけるアミノ酸の挿入・欠失に対応した所謂「ギャップ」を表す。「任意のアミノ酸」としては、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸が好ましい。また、「欠失」は、タンパク質の化学構造上、その前後のアミノ酸の間の単結合を示す。
「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化されたポリペプチド鎖や、ペプチド結合によって連結された２以上のポリペプチド鎖も含む。従って、本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は同じ意味で使用される。また、「ドメイン」とはタンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
アラインメントした結果、一致しているアミノ酸の数をアラインメントさせたアミノ酸の総数で割った比率を「配列相同性」という。配列相同性が高いほど変異が少なく、立体構造が似ていることが期待される。一般的には、あるアミノ酸配列に対して、１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加および／または置換により５０％以上の配列相同性があれば立体構造が似ていることが期待され、４０％以上であれば低分子化合物のドッキングシミュレーション用の構造の鋳型として利用可能であるといわれている（Ｄ．Ｂａｋｅｒ ＆ Ａ．Ｓａｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，ｐｐ．９３−９６（２００１））。抗体の場合、軽鎖のフレームワーク領域同士、重鎖のフレームワーク領域同士のアミノ酸配列をそれぞれアラインメントすると配列相同性が５０％以上と高く、立体構造がよく似ている。一方、軽鎖と重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列をアラインメントすると配列相同性が３０％未満と低く、一般的には立体構造は似ていない。しかし本発明において特定したヒト抗体の軽鎖と重鎖のフレームワーク領域における結合標的部位のアミノ酸配列の配列相同性は４２％と高く、その立体構造が似ている可能性が高い。従って、これらの結合標的部位に対して同一の低分子化合物によるスクリーニングが実施可能となる。
本発明における結合標的部位が有するアミノ酸配列としては、軽鎖においては配列番号３および配列番号４、重鎖においては配列番号５および配列番号６に示した配列が好ましく、両者間の配列相同性は４０％以上であることが好ましく、さらに４５％以上であることがより好ましく、さらに５０％以上であることがより好ましい。結合標的部位の配列番号に示したアミノ酸配列は、軽鎖に関してヒト抗体として報告されているκ鎖、λ鎖、２種類あるうちのκ鎖のアミノ酸配列であるが、λ鎖の場合でも、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列と配列相同性が４０％以上と高いアミノ酸配列を持つ結合標的部位を指定すれば、同一の低分子化合物が結合することが期待されるので、その場合のスクリーニング方法も本発明に含まれることは明らかであるといえる。また同様に、ヒト由来の抗体でなくても、軽鎖、重鎖間でアミノ酸配列の配列相同性が高くなるような結合標的部位を指定した場合のスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明においては、特定のアミノ酸配列を有する２つの結合標的部位の両方に対して、ドッキングシュミレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する。
低分子化合物をスクリーニングするためのドッキングシミュレーションを行うためのコンピューターソフトフェアは、特に制限されないが、例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ創薬で一般的によく使われるソフトウエアｓｉｅｖｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｂｉｃ．ｏｒ．ｊｐ／ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｓｔ＿ｐｒ＿ｐｊ／ｍｙｐｒｅｓｔｏ／ｉｎｄｅｘ＿ｍｙｐｒ．ｈｔｍｌ）を挙げることができる。
本発明方法では、ドッキングシミュレーションによって化合物のドッキングスコアを得て化合物の順位付けを行い、低ドッキングスコアを示す化合物を選択する。本発明において「ドッキングスコア」とは、化合物と本発明に係る結合標的部位の結合エネルギーに対応する値で、値が小さいほど当該結合標的部位に対する化合物の親和性が高いといえる。
具体的には、上記ソフトウエアｓｉｅｖｇｅｎｅを用いたドッキングシュミレーションにおいて、第１結合標的部位と第２結合標的部位の両方に対するドッキングスコアが−２．０未満の化合物を選択することが好ましい。当該ドッキングスコアとしては、−３．０未満がより好ましい。一方、当該ドッキングスコアが低過ぎるとドッキングシミュレーションに用いた抗体に過剰適合し、他の抗体との親和性が下がることが予想されるので、当該ドッキングスコアとしては−５．５以上が好ましい。
本発明に係るスクリーニング方法はコンピューターを用いる簡便なものであるが、無制限の化合物を評価するとすれば効率は当然に悪い。よって、評価すべき化合物は、事前にある程度選別しておくことが好ましい。例えば、一般的な試薬メーカーから販売されている化合物から、可溶性などを基準として選択することができる。
本発明方法により選択された化合物は、例えば、水不溶性の基材からなる担体に固定化し、アフィニティーリガンドとして利用することができる。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、低分子抗体および免疫グロブリンに対して特異的に結合する低分子化合物を指す。
本発明において「低分子抗体」という用語は、免疫グロブリンからプロテアーゼ分解あるいは遺伝子工学的に作製した部分断片のみの抗体を指す。代表的な低分子抗体としては、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。Ｆａｂは軽鎖と重鎖がジスルフィド結合した分子で，分子量約６０ｋＤａ、ｓｃＦｖは軽鎖と重鎖の可変領域のみを短いリンカーで連結させたもので、分子量は約３０ｋＤａ、Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖのリンカーの長さを調節することにより２分子のｓｃＦｖが共有結合により会合した分子であり，２つの抗原結合部位を持つ。
本発明におけるアフィニティーリガンドが標的とする分子は、標的分子結合ドメインが結合可能な全ての分子であるが、例えば、抗体の軽鎖の可変領域（ＶL）、重鎖の可変領域（ＶH）のみを用いたもの（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）やラクダの重鎖の可変領域を用いたもの（ｎａｎｏｂｏｄｙ）など、様々な分子形を持つ断片化した低分子抗体、低分子抗体誘導体、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および抗体誘導体が挙げられる。ここで「低分子抗体誘導体」としては、例えば、ヒトＩｇＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工抗体が挙げられ、「抗体誘導体」としては、例えば、ヒトＩｇＧの一部のドメインを他生物種のＩｇＧ抗体のドメインに置き換えて融合させたキメラ抗体や、ヒトＩｇＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ；相補性決定領域）を他生物種抗体のＣＤＲに置き換えて融合させたヒト化抗体が挙げられる。
様々な分子形をした低分子抗体および免疫グロブリンに対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーや、結合によって生じる発熱・吸熱変化を検出する等温滴定型カロリメータ（ＩＴＣ）などの、生体分子間相互作用検出・解析装置によって評価できる。
本発明に用いる水不溶性担体は、アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいものが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。リガンドの固定化方法としては、例えば、担体に反応性基を導入し、リンカー基を介して公知のカップリング法により低分子化合物を結合させる方法を挙げることができる。
上記反応性基は、例えば、アミノ基、カルボキシ基、エーテル基、チオエーテル基などを挙げることができる。反応性基の導入は、「スペーサー」と呼ばれる化合物の導入により行ってもよい。カップリング法としては、例えば、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性基を導入し、リガンドとして固定化する低分子化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、または、担体とリガンドとして固定化する低分子化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、もしくは、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法などが挙げられる。
リガンドとして用いられる本発明の低分子化合物に対しては、担体を化学修飾して固定化してもよいし、固定化に有用なスペーサー分子を導入してもよい。本発明の本質は、低分子化合物をリガンドとして固定化したマトリックスにおいても低分子化合物の機能が同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように低分子化合物を修飾・改変しようが、本発明の範囲に含まれる。
本発明により見出された低分子化合物を水不溶性担体に固定化した上記アフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリン、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体をアフィニティークロマトグラフィー精製法により分離・精製・特徴付けすることが可能となる。
これらの抗体、抗体誘導体、低分子抗体、および、低分子抗体誘導体の精製法は、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法などに準じる手順により達成することができる（Ｒｏｑｕｅ Ａ．Ｃ．Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１１６０号，４４−５５頁（２００７年））。即ち、抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に使われる酸性緩衝液には、マトリックスからの所望の抗体などの解離を促進するための物質を添加してもよい。同様の手法にて、本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着する抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体は、該結合標的部位を有するとの特徴づけが可能となる。
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンドである低分子化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を添加してもよい。本発明の低分子化合物をリガンドとして利用した場合、タンパク質、例えばプロテインＡをリガンドとして利用するよりもリガンドの化学的安定性が高まることが予想される。ここで化学的安定性とは、低分子化合物の機能を保持する性質を意味する。本発明において「低分子化合物の機能を保持する」とは、免疫グロブリンの軽鎖、重鎖の可変領域のフレームワーク領域に存在する結合標的部位（ポケット）への親和性を保持することを指す。即ち、リガンドの「化学的安定性」が高い程、種々の化学的処理を行っても標的部位への親和性が低下する度合いが小さい。
本願は、２０１４年６月９日に出願された日本国特許出願第２０１４−１１８４６６号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１４年６月９日に出願された日本国特許出願第２０１４−１１８４６６号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１
公知のヒト抗体の軽鎖（κ鎖）と重鎖の代表的なアミノ酸配列をアラインメントした結果（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ；図１および図２）を用いて、各鎖で配列相同性の高いアミノ酸配列を抽出し、共通アミノ酸配列とした。得られた軽鎖、重鎖の各共通アミノ酸配列のフレームワーク領域のアミノ酸配列のアラインメントを実施し、軽鎖で共通する配列として配列番号１の配列と、重鎖で共通する配列として配列番号２を導き出した。さらに、これら配列番号１と配列番号２の配列それぞれにおいて、抗体の立体構造上、表面に露出しており、且つ、配列相同性が比較的高い配列を抽出した。軽鎖における当該配列を配列番号３と配列番号４に、重鎖における当該配列を配列番号５と配列番号６に示す。なお、配列番号３と配列番号４とを合わせた配列全体と、配列番号５と配列番号６とを合わせた配列全体との配列相同性は４２％であった。
公知のヒト抗体の軽鎖（κ鎖）と重鎖の代表的なアミノ酸配列をアラインメントした結果（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ２．ｐｈｐ；図１および図２）を用いて、各鎖で配列相同性の高いアミノ酸配列を抽出し、共通アミノ酸配列とした。得られた軽鎖、重鎖の各共通アミノ酸配列のフレームワーク領域のアミノ酸配列のアラインメントを実施し、軽鎖で共通する配列として配列番号１の配列と、重鎖で共通する配列として配列番号２を導き出した。さらに、これら配列番号１と配列番号２の配列それぞれにおいて、抗体の立体構造上、表面に露出しており、且つ、配列相同性が比較的高い配列を抽出した。軽鎖における当該配列を配列番号３と配列番号４に、重鎖における当該配列を配列番号５と配列番号６に示す。なお、配列番号３と配列番号４とを合わせた配列全体と、配列番号５と配列番号６とを合わせた配列全体との配列相同性は４２％であった。
立体構造が明らかにされている公知のヒト抗体のデータベースであるＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ，ｈｔｔｐ：／／ｐｄｂｊ．ｏｒｇ）に登録されているデータの中から、上記共通アミノ酸配列（配列番号１と配列番号２）との配列相同性が５０％以上のアミノ酸配列をフレームワーク領域中に有するものを検索し、抽出されたものの中からヒト抗体（ＰＤＢコード：２ｘａ８）の立体構造をダウンロードした。当該ヒト抗体２ｘａ８の軽鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号１との配列相同性は９４％、重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号２との配列相同性は８２％であった。軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の立体構造を見て、低分子化合物が結合可能な窪み（ポケット）を探索し、軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の共通アミノ酸配列のアラインメントにおいて配列相同性が４２％と高いアミノ酸配列（軽鎖：配列番号３と配列番号４，重鎖：配列番号５と配列番号６）に対応するアミノ酸配列を含む窪みを結合標的部位として選択した。このとき、選択したヒト抗体２ｘａ８の軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列（配列番号３，４）との配列相同性は９２％、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列（配列番号５，６）との配列相同性は１００％であった。また、ヒト抗体２ｘａ８における軽鎖、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列間の配列相同性は５０％であった。
ヒト抗体２ｘａ８の２つの結合標的部位それぞれに対して、ドッキングシミュレーションソフトｓｉｅｖｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｂｉｃ．ｏｒ．ｊｐ／ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｓｔ＿ｐｒ＿ｐｊ／ｍｙｐｒｅｓｔｏ／ｉｎｄｅｘ＿ｍｙｐｒ．ｈｔｍｌ）を利用して、ドッキングシミュレーションを実施した。化合物ライブラリーとしてナミキ商事社の在庫化合物（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｍｉｋｉ−ｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を利用し、化合物数を限定するために、選定条件として以下の５つの条件を定めた。
１． 入手しやすいＥＮＡＭＩＮＥ社製化合物
２． 分子量が２５０以上
３． 水素結合ドナー数が５以下、水素結合アクセプター数が１０以下
４． 水溶性（ｃｌｏｇＰ５未満）
５． 反応性の高い構造を除く
１． 入手しやすいＥＮＡＭＩＮＥ社製化合物
２． 分子量が２５０以上
３． 水素結合ドナー数が５以下、水素結合アクセプター数が１０以下
４． 水溶性（ｃｌｏｇＰ５未満）
５． 反応性の高い構造を除く
選定した１２４万個の化合物を使ってドッキングシミュレーションを実施した。得られたドッキングスコアによって化合物の順位付けを行い、それぞれの結合標的部位に対してドッキングスコア上位１００００個の化合物を選定した。軽鎖と重鎖それぞれの標的部位に対するドッキングスコアと化合物数の分布を表１に示す。表１中、ドッキングスコアは化合物と上記結合標的部位との結合エネルギーに対応し、値が小さいほど上記結合標的部位との親和性が高いことを示す。
軽鎖または重鎖の結合標的部位に対するドッキングスコアの値が小さい、のべ２００００個の化合物の中から、軽鎖および重鎖の両方の結合標的部位に対するドッキングスコアの平均が上位１０％以内に含まれるもの５つを候補化合物として選定した。それらの化学構造を以下に示す。
実施例２
立体構造が明らかにされている公知のヒト抗体のデータベースであるＰＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｐｄｂｊ．ｏｒｇ）に登録されているデータの中から、上記実施例１と同様にして、上記共通アミノ酸配列（配列番号１と配列番号２）との配列相同性が５０％以上のアミノ酸配列をフレームワーク領域中に有するものを検索し、抽出されたものの中からヒト抗体（ＰＤＢコード：２ｈｗｚ）の立体構造をダウンロードした。当該ヒト抗体２ｈｗｚの軽鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号１との配列相同性は９１％、重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号２との配列相同性は５７％であった。当該ヒト抗体２ｈｗｚにおいて、上記実施例１で選択した結合標的部位に対応する窪み（ポケット）を結合標的部位として選択した。このとき、選択したヒト抗体２ｈｗｚの軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列（配列番号３，４）との配列相同性は８３％、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列（配列番号５，６）との配列相同性は５８％であった。また、ヒト抗体２ｈｗｚにおける軽鎖、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列間の配列相同性は５８％であった。
立体構造が明らかにされている公知のヒト抗体のデータベースであるＰＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｐｄｂｊ．ｏｒｇ）に登録されているデータの中から、上記実施例１と同様にして、上記共通アミノ酸配列（配列番号１と配列番号２）との配列相同性が５０％以上のアミノ酸配列をフレームワーク領域中に有するものを検索し、抽出されたものの中からヒト抗体（ＰＤＢコード：２ｈｗｚ）の立体構造をダウンロードした。当該ヒト抗体２ｈｗｚの軽鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号１との配列相同性は９１％、重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号２との配列相同性は５７％であった。当該ヒト抗体２ｈｗｚにおいて、上記実施例１で選択した結合標的部位に対応する窪み（ポケット）を結合標的部位として選択した。このとき、選択したヒト抗体２ｈｗｚの軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列（配列番号３，４）との配列相同性は８３％、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列（配列番号５，６）との配列相同性は５８％であった。また、ヒト抗体２ｈｗｚにおける軽鎖、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列間の配列相同性は５８％であった。
ヒト抗体２ｈｗｚの２つの結合標的部位それぞれに対して、上記実施例１において、ヒト抗体２ｘａ８の２つの結合標的部位それぞれに対するドッキングスコア上位の１００００個の化合物を使って、ドッキングシミュレーションを実施した。軽鎖と重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアと化合物数の分布を表２に示す。
上記実施例１で最終的に選定された５つの化合物の、ヒト抗体２ｈｗｚの軽鎖、重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアを調べた。結果を表３に示す。なお、表３中、「ＮＳ−」から始まる化合物名はナミキ商事社が各化合物に付したコードナンバーであり、「ｐ１＿２ｘａ８」、「ｐ２＿２ｘａ８」、「ｐ１＿２ｈｗｚ」および「ｐ２＿２ｈｗｚ」はそれぞれヒト抗体２ｘａ８および２ｈｗｚの軽鎖および重鎖の各結合標的部位に対する各化合物のドッキングスコアを示し、「ａｖｇ＿２ｘａ８」および「ａｖｇ＿２ｈｗｚ」はそれぞれヒト抗体２ｘａ８および２ｈｗｚの上記各結合標的部位に対する各化合物のドッキングスコアの平均値を示す。
表３に示す結果により、２ｘａ８の結合標的部位に対するドッキングスコアの平均が上位１０％に入る５つの上記化合物は、２ｈｗｚの結合標的部位に対するドッキングスコアの平均も上位１０％に入ることを確認した。この結果は、ヒト抗体間において、本発明に係る上記結合標的部位の構造が軽鎖においても重鎖においても類似していることに起因していると考えられる。
比較例１
軽鎖と重鎖の２つの結合標的部位のうちどちらか一方だけに低いドッキングスコアを与える化合物の一例を表４に示す。表４中、「Ｎ／Ａ」は、軽鎖、重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアが上位１００００個の中に入っていなかったため、スコアの値が無いことを示す。
軽鎖と重鎖の２つの結合標的部位のうちどちらか一方だけに低いドッキングスコアを与える化合物の一例を表４に示す。表４中、「Ｎ／Ａ」は、軽鎖、重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアが上位１００００個の中に入っていなかったため、スコアの値が無いことを示す。
表４に示す結果のとおり、ＮＳ−０１５９９２７２のＩＤを持つ化合物は軽鎖の結合標的部位に対して良いスコアを与えたが、重鎖の標的部位には良いスコアを与えなかった。一方、ＮＳ−０２９９２１１４のＩＤを持つ化合物は、重鎖の結合標的部位に対して良いスコアを与えたが、軽鎖の標的部位には良いスコアを与えなかった。よって、これら化合物は、上記実施例１，２で選定された化合物に比較して、ヒト抗体への親和性が低いと考えられる。
Claims (3)
- 抗体に結合する低分子化合物をスクリーニングする方法であって、
上記抗体の軽鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列１を有するフレームワーク領域に含まれる第１の結合標的部位と、上記抗体の重鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列２を有するフレームワーク領域に含まれる第２の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする方法。
アミノ酸配列１： 配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第９位のＸａａがセリン、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、第１５位のＸａａがプロリン、バリン、トレオニンまたはロイシンであり、第２４〜３１位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第３９位のＸａａがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、第７９位および第８０位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列２： 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第９位のＸａａがグリシン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、第１４位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第１７位のＸａａがグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはアスパラギン酸であり、第４１〜４３位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であり、第４７位のＸａａがバリン、メチオニン、イソロイシンまたはロイシンであり、第５０位のＸａａがバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンであり、第５６位のＸａａがトレオニン、アルギニン、メチオニン、グルタミン酸、リシン、アスパラギンまたはアスパラギン酸であり、第６１位のＸａａがロイシン、アラニン、バリンまたはフェニルアラニンであり、第６５位のＸａａがロイシン、メチオニン、トリプトファンまたはイソロイシンであり、第６６位のＸａａがセリン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、グリシンまたはシステインであるアミノ酸配列 - 上記第１の結合標的部位が、下記アミノ酸配列３およびアミノ酸配列４を含む請求項１に記載の方法。
アミノ酸配列３： 配列番号３に示されるアミノ酸配列において、第４位のＸａａがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であるアミノ酸配列
アミノ酸配列４： 配列番号４に示されるアミノ酸配列 - 上記第２の結合標的部位が、下記アミノ酸配列５およびアミノ酸配列６を含む請求項１または２に記載の方法。
アミノ酸配列５： 配列番号５に示されるアミノ酸配列において、第６位のＸａａが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列６： 配列番号６に示されるアミノ酸配列
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