BRPI0712920A2

BRPI0712920A2 - anticorpo humanizado para c-kit

Info

Publication number: BRPI0712920A2
Application number: BRPI0712920-3A
Authority: BR
Inventors: Gordon Ng; Wenyan Shen
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2006-04-24
Filing date: 2007-04-24
Publication date: 2012-10-02
Also published as: CA2648882A1; MY153710A; AU2007243318B2; NZ594968A; KR20090029190A; JP2009534052A; EP2010571A2; JP2012126746A; JP5094842B2; WO2007127317A3; US7915391B2; EA015923B1; ZA200809065B; IL194776A; ES2705480T3; PE20080694A1; UA95478C2; JP5906120B2; MX2008013640A; US20110223165A1

Abstract

ANTICORPO HUMANIZADO PARA C-KIT. A presente invenção refere-se a composições e métodos para tratar distúrbios associados a c-kit, tal como fibrose, e mais particularmente, a composições que contêm anticorpos humanizados para c-kit.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO HUMANIZADO PARA C-KIT".

CAMPO TÉCNICO

Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 60/794.771, depositado em 24 de abril de 2006, o qual está incorporado por meio desse por referência.

A presente invenção refere-se a composições para tratar doen- ças inflamatórias, fibróticas, auto-imunes e cancerosas associadas a c-Kit e a composições que contêm anticorpos humanizados para c-Kit.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Mastócitos têm sido relacionados com a mediação de condições inflamatórias tais como asma, artrite reumatóide e doença inflamatória do intestino e o papel na inflamação alérgica é amplamente reconhecido. Os mastócitos estão aumentados em número em explantes pulmonares de as- máticos severos e são a principal fonte de mediadores inflamatórios clinica- mente relevantes tais como leucotrienos, histamina e citocinas Th2. Os mas- tócitos são a principal fonte de TNF pré-formado em tecidos doentes.

O Fator de Célula Tronco (SCF) é uma glicoproteína que sinaliza através do receptor de tirosina quinase de membrana e associado à célula, daqui por diante definido como c-Kit, e essa via de sinalização desempenha um papel chave na hematopoiese atuando tanto como um regulador positivo quanto negativo, geralmente em sinergia com outras citocinas. Um receptor de c-Kit livre solúvel pode desempenhar um papel na regulação de SCF. C- Kit é expresso em células-tronco hematopoiéticas pluripotentes que são as precursoras das células maduras que pertencem às linhagens linfóide e eri- tróide. Diferente de outras células hematopoiéticas, os precursores dos mas- tócitos e mastócitos maduros retêm altos níveis de expressão de c-Kit. Daí a sinalização de SCF através de c-Kit ser vital para o desenvolvimento, fun- ção, transporte e sobrevivência dos mastócitos. Ele também desempenha um papel na gametogênese e na melanogênese. Camundongos com muta- ções que inativam c-Kit no lócus W virtualmente não têm mastócitos. Muta- ções ativadoras de c-Kit no homem estão associadas com mastocitose. Células-tronco hematopoiéticas pluripotentes positivas para c-Kit são precursoras de múltiplos tipos celulares incluindo células mesenquimais, fibroblastos e mastócitos. A doença fibrótica é caracterizada em parte pela atividade e proliferação excessivas de fibroblastos resultando na deposição de matriz extracelular. Células-tronco hematopoiéticas pluripotentes da me- dula óssea positivas para c-Kit tem sido relatadas como sendo uma fonte de fibroblastos e mastócitos nos tecidos fibróticos.

Os mastócitos podem fornecer uma fonte sustentada de media- dores inflamatórios, angiogênicos, mitogênicos e fibrogênicos. Os mastócitos estão funcionalmente e anatomicamente acoplados aos fibroblastos e têm um papel direto na ativação dos fibroblastos. Os mastócitos aumentam a cinética e a magnitude da contração do colágeno mediada por fibroblasto, deposição da matriz extracelular e podem transformar fibroblastos em miofi- broblastos. Os fibroblastos, por sua vez, secretam SCF para ativar e expan- dir os mastócitos e ambos os tipos celulares são componentes da rede fibro- gênica.

O número de mastócitos e os mediadores de mastócitos estão significativamente elevados na maioria das doenças fibróticas humanas in- cluindo fibrose pulmonar idiopática (IPF) e Esclerodermia. Fenótipos diferen- ciais de mastócitos são detectados em alguns pacientes com esclerodermia e no modelo de camundongo Tsk de esclerodermia. Uma forma sistêmica agressiva de mastocitose pode ser caracterizada por mielofibrose, indicando que os mastócitos podem ser células efetoras na fibrose.

Gleevec™ e outros da classe como Sutent™ são inibidores do receptor de tirosina quinase multi-direcionados que podem atingir a atividade de sinalização de c-Kit, mas inibem várias outras quinases. Esses inibidores de quinase estão indicados para uso em oncologia. Mielossupressão, ane- mia e vários outros efeitos colaterais, incluindo cardiotoxicidade e edema periférico, têm sido relatados com Gleevec. Portanto, essas moléculas po- dem não possuir o melhor perfil risco-benefício para o tratamento crônico de doenças associadas com a sinalização de c-Kit. Assim, há uma necessidade por novas terapias e reagentes, particularmente aqueles que são mais po- tentes e seletivos, e que possuam perfis de segurança melhores para o tra- tamento de doenças inflamatórias e fibróticas associadas a c-Kit. Tal com- posto também deve mostrar perfis de eficácia e segurança significativamente melhores em doenças oncológicas, tais como leucemia de origem mielóide, doenças associadas com mutações de c-Kit tais como GIST e mastocitose, doenças associadas com superexpressão de c-Kit e/ou atividade autócrina excessiva de SCF como no melanoma e várias SCLCs. Terapias e reagen- tes que atingem c-Kit humano e capazes de gerar um benefício terapêutico sem efeitos adversos significativos atualmente são escassos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção fornece agentes que são antagonistas e antagonis- tas neutros de SCF no receptor c-Kit de membrana e associado à célula, tais como anticorpos monoclonais. Em uma modalidade mais específica, anticor- pos monoclonais humanizados (não-murinos) que se ligam a c-Kit são forne- cidos. Em modalidades ainda mais específicas, os anticorpos humanizados da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir daquelas descritas nas SEQ ID NOs 2, 4 e 6. A invenção também for- nece ácidos nucléicos que codificam qualquer um dos anticorpos preceden- tes ou agentes de ligação específicos. Em uma modalidade relacionada da invenção, um vetor que compreende qualquer uma das seqüências de ácido nucléico anteriormente mencionadas é fornecido. Em outra modalidade ain- da, é fornecida uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos ácidos nucléicos ou vetores anteriormente mencionados.

Em uma modalidade, agentes de ligação a c-Kit e antagonistas neutros podem compreender uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Em outra modalidade, qualquer um dos agentes anteriormen- te mencionados compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma ou mais das seqüências de aminoácidos descritas nas SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Em tais modalidades, a variação de seqüência em relação a SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, respectivamente, pode representar, por exemplo, uma substituição conser- vativa da região de estrutura correspondente de uma IgG usando um amino- ácido alternativo humano naquela posição.

Em modalidades exemplares, o anticorpo ou agente de ligação específico que se liga a c-Kit compreende uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Entretanto, é contemplado que os anti- corpos da invenção podem ser uma mistura de isotipos de anticorpos IgG (por exemplo, uma mistura dos subtipos IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4).

Qualquer um dos anticorpos mencionados anteriormente pode ser, por exemplo, um anticorpo IgG nativo ou mutado (por exemplo, do sub- tipo IgGI ou lgG3 ou qualquer outro subtipo de IgG). Os anticorpos anteri- ormente mencionados pode exibir uma avidez caracterizada por um kd me- nor do que 1 χ 10"2, ou menor do que 1 χ 10"3, ou 1 χ 10'4, ou 1 χ 10"5, ou 1 χ 10"6, ou 1 χ 10"7, ou 1 χ 10"8, ou 1 χ 10"9 como determinado por ressonância de plasma de superfície (análise BIAcore).

Os anticorpos anteriormente mencionados podem exibir uma IC50 de antagonista neutro menor do que 1 χ 10"2 ou menor do que 1 χ 10"3 ou 1 χ 10"4, 1 χ 10"5, 1 χ 10'6, 1 χ 10"7, 1 χ 10"8 ou 1 χ 10"9 como determinado por ensaios celulares. Em uma modalidade particular, a afinidade e a potên- cia funcional do anticorpo humanizado é pelo menos comparável à afinidade e à potência funcional do anticorpo de murino parental. Em uma modalidade preferida, o anticorpo humanizado não é um agonista do receptor de c-Kit e não ativa mastócitos o que poderia levar a reações anafilactóides e deve exibir um perfil de imunogenicidade e PD/PK que é pelo menos comparável ao do anticorpo de murino parental.

Vários métodos são contemplados na presente invenção. Por exemplo, um método de produzir um anticorpo mencionado anteriormente ou agente de ligação específica é fornecido, compreendendo cultivar a célula hospedeira anteriormente mencionada tal que o ácido nucléico seja expres- so para produzir o anticorpo ou agente. Tais métodos também podem com- preender a etapa de recuperar o anticorpo ou agente da cultura de célula hospedeira. Em uma modalidade relacionada, é fornecido um anticorpo iso- lado ou agente produzido pelo método acima mencionado. A invenção fornece ainda métodos de uso de qualquer um dos anticorpos anteriores ou agentes de ligação específicos, por exemplo, para tratar ou prevenir uma distúrbio associada a c-Kit, pela administração de uma quantidade eficaz desses. Um exemplo de tal distúrbio a ser tratada á uma doença fibrótica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. SR-1 inibe mastócitos em um modelo ativado por le- são.

Figura 2. Contagens de mastócitos em um modelo de cicatriza- ção de feridas.

Figura 3. Isoformas de SR-1 humanizadas inibem a ativação de c-Kit induzida por fator de célula tronco (SCF) e subseqüente fosforilação através de c-Kit. DESCRIÇÃO DETALHADA O anticorpo SR-1 de murino anti-c-Kit humano está descrito na

Patente U.S. No. 5.919.911 e Patente U.S. No.5.489.516, cada uma das quais está incorporada aqui por referência. SR-1 mostrou propriedades de ligação a c-Kit adequadas e bloqueou a sinalização do receptor mediada por SCF. Entretanto, essa molécula não possui todas as características que se- riam desejadas em um terapêutico humano além das conseqüências de i- munogenicidade óbvias. Broudy relatou que SR-1 possuía atividade como agonista que poderia levar a internalização e fosforilação do receptor J Cell Physiol. 1994 Mar; 158(3):545-54. Essas atividades funcionais tornam a mo- lécula menos eficaz e menos segura. Embora a humanização de monoclo- nais seja uma metodologia estabelecida e que é esperado que as atividades biológicas sejam geralmente apropriadamente traduzidas, a conformação do anticorpo SR-1 humanizado que depende do estrutura humano, pode ocasi- onar diferentes atividades intrínsecas em c-Kit e conseqüentemente funções biológicas. Nesse exemplo particular, as propriedades farmacológicas dese- jadas mas não as propriedades "agonistas" indesejadas seriam buscadas, mas a metodologia para se obter isso não foi publicadas. As regiões de de- terminação de complementaridade do anticorpo SR-1 foram inseridas em uma combinação única das cadeias pesada e leve humanas de IgGI e lgG2 e lgG4 estruturalmente diferentes enquanto mantinham, surpreendentemen- te, afinidade similar a c-Kit. Entretanto, cada uma dessas regiões de estrutu- ra provou ter desvantagens.

O SR-1 humanizado no perfil de lgG2 provou ter afinidade muito alta por c-Kit, mas em múltiplos tipos celulares foi incapaz de bloquear com- pletamente a internalização do receptor mediada por SCF e em ensaios de mastócitos em cultura levou a fosforilação de c-Kit, um sinal de sobrevivên- cia, e mediou aglomeração incomum das células. Estas propriedades são potencialmente indesejadas já que o objetivo de uma estratégia terapêutica é depletar apoptoticamente mastócitos e precursores por bloquear o sinal de sobrevivência de SCF e evitar a ativação dos mastócitos, o que poderia levar a reações anafilactóides in vivo. Quando as regiões de CDR de SR-1 de ca- mundongo foram inseridas no estrutura de IgGI humana, a afinidade e a potência funcional também foram mantidas, mas esse perfil é menos desejá- vel devido a ativação do complemento e citotoxicidade mediada por célula freqüentemente encontradas com este isotipo de anticorpo. Quando as regi- ões de CDR de SR-1 de camundongo foram inseridas no estrutura de lgG4 humana, a afinidade e a potência funcional também foram mantidas, mas inesperadamente esta molécula mostrou agregação significativa por purifica- ção e escalonamento.

Dessa forma, os presentes inventores buscaram superar as defi- ciências em cada uma dessas moléculas por criar um anticorpo que não tem ativação do complemento, e não ativa c-kit e mastócitos embora mantenha a afinidade desejada, potência de agonista neutro para o receptor c-Kit de membrana e não para o receptor c-Kit solúvel. Este anticorpo deveria mos- trar PD/PK apropriado e é eficaz para depletar mastócitos e sem evidência de agonismo de mastócito in vivo.

Cadeia leve kappa de SR-1 humanizado

Seq Id No. 1 representa o ácido nucléico que codifica a cadeia leve kappa humanizada de SR-1.

ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGACATCGTGATGACCC AGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAT TTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACCTTGCATCC AACCTAGAATCTGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGC GGGTC TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCC TGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGTGGGACCAA GG TGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATC TGTC TTCATCTTCCCGC CATC TGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCC TCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT GACGC TGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCC GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA (SEQ ID NO:1)

Seq Id No: 2 é como segue, onde a fonte em negrito representa as CDR1S (por exemplo, CDR1 é aminoácidos 43 a 58 de SEQ ID NO: 2, CDR2 é aminoácidos 74 a 80 de SEQ ID NO: 2 e CDR3 é aminoácidos 113 a 121 de SEQ ID NO: 2):

1 MVLQTQVFIS LLLWISGAYG DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCRASESVD 51 IYGNSFMHWY QQKPGQPPKL LIYLASNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS 101 SLQAEDVAVY YCQQNNEDPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:2).

Uma cadeia leve kappa humanizada madura é aminoácidos 20 a 248 de SEQ ID NO: 2.

Cadeia pesada de aqlico-lqG1 de SR-1 humanizada Seq Id No: 3

ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCAGTGGCCCCAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGT CTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTA CAATATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGAT ACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAGGGTCACCATTACCGCTGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGC TGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGATACTCGTTTTGGTAACTGGGG CCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC AACACC AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCC TGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGC TCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTC TTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TC TGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO : 3 ).

As CDR's estão representadas em fonte em negrito (por exem- plo, CDR1 é aminoácidos 50 a 54 de SEQ ID NO: 4, CDR2 é aminoácidos 69 a 85 de SEQ ID NO: 4, e CDR 3 é aminoácidos 118 a 125 de SEQ ID NO: 4):

1 mdwtwrvfcl lavapgah s q vqlvqsgaev kkpgasvkvs ckasgytfts 51 ynmhwvrqap gqglewmgvt ysgngdtsyn qkfkgrvtit adkststaym 101 elsslrsedt a vyycarerd trfgnwgqgt lvtvssastk gpsvfplaps 151 skstsggtaa lgclvkdyfp epvtvswnsg altsgvhtfp avlqssglys 201 xisswtvpss slgtqtyicn vnhkpsntkv dkkvepkscd kthtcppcpa 251 pellggpsvf lfppkpkdtl misrtpevtc vwdvshedp evkfnwyvdg 301 vevhnaktkp reeqyqstyr wsvltvlhq dwlngkeykc kvsnkalpap 351 iektiskakg qprepqvytl ppsrdeltkn qvsltclvkg fypsdiavew 401 esngqpenny kttppvldsd gsfflysklt vdksrwqqgn vfscsvmhea 451 lhnhytqksl slspgk (Seq Id no: 4)

Cadeia Pesada de IgG2 de SR-1 Humanizado

atggactggacctggagggtcttctgcttgctggcagtggccccaggtgcccactcccaggtgcagctggtgcagt ctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagtta caatatgcact gggtgc gc caggcccctggacaagggcttgagtggatgggagttatttattcaggaaatggtgat acttcctacaatcagaagttcaaaggcagggtcaccattaccgctgacaaatccaccagcacagcctacatggagc tgagca gcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagagagggatactcgttttggtaact gggg ccaagggactctggtcaccgtctctagtgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccagg agcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgga actcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcag CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGT CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA AAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAA AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (Seq Id No: 5)

O seguinte é a seqüência de aminoácido de extensão completa da cadeia pesada de lgG2 de SR-1, e as CDR1S estão representadas em fonte em negrito:

1 MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS 51 YNMHWVRQAP GQGLEWMGVT YSGNGDTSYN QKFKGRVTIT ADKSTSTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARERD TRFGNWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPC 151 SRSTSESTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 201 LSSWTVPSS NFGTQTYTCN VDHKPSNTKV DKTVERKCCV ECPPCPAPPV 251 AGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVQF NWYVDGVEVH 301 NAKTKPREEQ FNSTFRWSV LTWHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPAPIEKT 351 ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 401 QPENNYKTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH 451 YTQKSLSLSP GK (Seq Id No: 6)

MULC de SR-1

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTAACATTGTGTTGACCC AATCTC CAGCTTC TTTGGCTGTGTCTCTAGGGCTGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAT TTATGGC AATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCC AACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTG TGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAA GCTGG AAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATC TGGA GGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTG AACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCT CACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCC

ATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTGA (SEQ ID N0: 7)

As CDR1S estão representadas com fonte em negrito:

1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG NIVLTQSPAS LAVSLGLRAT ISCRASESVD 51 IYGNSFMHWY QQKPGQPPKL LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID 101 PVEADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K RADAAPTVS IFPPSSEQLT 151 SGGASWCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS

201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (Seq Id No: 8)

Cadeia Pesada de mulqG2a de SR-1

ATGGGATGGAGTTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAACTGCAGCAGC CTGGGGC TGAGC TGGTG AAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTA CAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGAGTTATTTATTCAGGAAATGGTGAT ACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAAA TCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAGAGGGATACTCGTTTTGGTAACTGGGG CCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGA GATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGA ACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTC AGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAG GTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCT TGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCAC ATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACAC ACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACC AGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCAT CTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAA CAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAA CAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGT GGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacg actaagagcttctcccggactccgggtaaatgA (Seq Id No: 9)

MGWSCIILFL VATATGVHSQ VQLQQPGAEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YNMHWVKQTP 61 GQGLE- WIGVI YSGNGDTSYN QKFKGKATLT ADKSSSTAYM QINSLTSEDS AVYYCARERD 121 TRFGNWGQGT LVTVSAAKTT APSVYPLAPV CGDTTGSSVT LGCLVKGYFP EPVTLTWNSG 181 SLSSGVHTFP AVLQS- DLYTL SSSVTVTSST WPSQSITCNV AHPASSTKVD KKIEPRGPTI 241 KPCPPCKCPA PNLLGGPSVF IFPPKIKDVL MISLSPIVTC VWDVSEDDP DVQISWFVNN 301 VEVHTAQTQT HREDYNSTLR WSAL- PIQHQ DWMSGKEFKC KVNNKDLPAP XERTISKPKG 3 61 SVRAPQVYVL PPPEEEMTKK QVTLTCMVTD FMPEDIYVEW TNNGKTELNY KNTEPVLDSD 421 GSYFMYSKLR VEKKNWVERN SYSCSWHEG LHN- HHTTKSF SRTPGK (Seq Id No: 10)

A CDR1 de cadeia leve de SR-1 é RASESVDIYGNSFMH (ami- noácidos 44 a 58 de SEQ ID NO: 8), a CDR2 é LASNLES (aminoácidos 74 a 80 de SEQ ID NO: 8), e a CDR3 é QQNNEDPYT, (aminoácidos 111 a 121 de SEQ ID NO: 8). A CDR1 de cadeia pesada é SYNMH, (aminoácidos 50 a 54 de SEQ ID NO: 10), a CDR2 é VIYSGNGDTSYNQKFKG, (aminoácidos 69 a 85 de SEQ ID NO: 10), a CDR3 é RDTRFGN, (aminoácidos 118 a 125 de SEQ ID NO: 10).

Entende-se que cada uma das cadeias pesadas e leves descri- tas no presente pedido são processadas na célula para uma forma madura. Conseqüentemente, peptídeos de sinal são clivados no caso de cadeias pe- sadas de anticorpos, a Iisina C-terminal é clivada. Conseqüentemente, a forma madura é processada proteoliticamente e também inclui outras modifi- cações pós-traducionais tais como glicosilação se expressas em células de mamíferos. O peptídeo de sinal para cada cadeia pesada e leve são os ami- noácidos 1 a 20 de SEQ ID Nos: 2 e 10, e os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NOs: 4, 6, e 10.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da cadeia leve de SR-1 de murino são descritas em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. As se- qüências de nucleotídeo e aminoácido da cadeia pesada de SR-1 de murino são descritas em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10. Variantes com substitui- ções adicionais (por exemplo, substituições conservativas dos aminoácidos murinos) também podem reter a alta afinidade de ligação. Substituições, de- leções ou inserções em posições dentro das CDRs e estrutura podem ser feitas sem afetar a afinidade.

Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve que retém as CDRs de murino originais de SR-1 murino, por e- xemplo posições próximas de 44 a 58, próximas de 74 a 80 e próximas de 113 a 121 de SEQ ID NO: 8. Em outras modalidades, o anticorpo humaniza- do compreende uma cadeia pesada que retém as CDRs murinas de SR-1 de murino, por exemplo, posições próximas de 50 a 54, próximas de 68 a 85 e próximas de 118 a 125 de SEQ ID N0:10, e tem uma região de estrutura derivada de humano. Conforme usado aqui, compreende-se que o termo "próxima" contempla duas a cinco diferenças de posição de aminoácido con- tanto que a afinidade a c-Kit seja mantida.

Em uma modalidade, tais agentes podem compreender uma se- qüência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 2, 4, ou 6. Em outra moda- lidade, qualquer um dos agentes mencionados acima compreende uma se- qüência de aminoácido que é pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 2, 4, ou 6. Em tais modalidades, a variação de seqüência em relação a SEQ ID NO: 2, 4, ou 6, respectivamente, pode representar, por exemplo, uma substi- tuição conservativa da região de estrutura correspondente de uma IgG u- sando um aminoácido humano alternativo nesta posição.

Em uma modalidade, os anticorpos mencionados acima exibem uma avidez caracterizada por um kd menor que 10"2 , ou menor que 10"3, ou 10"4, 10"5, 10"6, 10"7, 10"8, 10"9, conforme determinado por ressonância de plásmon de superfície (análise BIAcore). Em outra modalidade, os anticor- pos mencionados acima exibem uma IC50 de potência de antagonista neu- tro menor do que 1 χ 10"2, ou menor do que 1 χ 10"3, ou 1 χ 10"4, 1 χ 10"5, 1 χ 10"6, 1 χ 10"7, 1 χ 10"8, 1 χ 10"9, conforme determinado por ensaios celulares.

A presente invenção fornece uma variedade de agentes antago- nistas neutros e de ligação específica incluindo, mas não limitados aos anti- corpos humanos ou humanizados específicos de c-Kit, que são derivados de SR-1 de murino e retêm características desejáveis tais como Kd (constante de taxa de dissociação) para c-Kit a faixa de 1 χ 10 2 ou menos, ou atingindo até 1 χ 10"9 ou menos, (por exemplo, 10 2, 10"3, 10"4, 10-5, 10"6, 10"7, 10-8, 109 ou menos) e/ou IC50 de antagonista neutro para c-Kit na faixa de 1 χ 10'2 ou menos, ou atingindo 1 χ 10"9 ou menos (por exemplo, 10"2, 10"3, 10"4, 10"5, 10"6, 10"7, 10"8, 10"9 ou menos) e/ou a habilidade de reduzir os sintomas de um distúrbio associada a c-Kit. A invenção também fornece ácidos nucléicos que codificam tais polipeptídeos de agentes de ligação específica, vetores e células hospedeiras recombinantes, métodos de produzir tais agentes de ligação específica, formulações farmacêuticas incluindo tais agentes de liga- ção específica, métodos de preparar as formulações farmacêuticas, e méto- dos de tratar pacientes com as formulações e compostos farmacêuticos.

Ácidos nucléicos que codificam estas regiões variáveis de ca- deia leve modificadas foram construídos e co-expressos com os ácidos nu- cléicos que codificam uma cadeia pesada com CDR enxertada ou humani- zada e vice versa, e opcionalmente podem ser ligados a regiões constantes. Qualquer cadeia pesada e cadeias pesadas humanizadas ou quiméricas podem ser combinadas contanto que afinidade de ligação adequada seja mantida. Os genes desejados foram introduzidos em células de mamífero e os produtos de imunoglobulina recombinante resultantes foram expressos, purificados e caracterizados.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e inclui anti- corpos completamente formados, anticorpos monoclonais (incluindo anticor- pos humanos, humanizados ou quiméricos), anticorpos policlonais, anticor- pos muItiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos que podem se ligar ao antígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos), que compreendem regiões de determinação de complementaridade (CDRs) dos anteriores contanto que eles exibam a atividade biológica desejada. O termo "anticorpo" exclui expli- citamente anticorpo murino (isto é, anticorpo produzido por um hibridoma murino ou que tem as mesmas seqüências que um anticorpo produzido por um hibridoma murino) do escopo do termo.

O termo "agente de ligação específica" inclui anticorpos, confor- me definido acima, e peptídeos recombinantes ou outros compostos que contêm seqüências derivadas de CDRs que têm as propriedades de ligação ao antígeno desejadas. Especificamente incluídos no termo estão peptídeos que contêm seqüências de aminoácido que são pelo menos 80%, 90% ou 100% idênticas a uma ou mais CDRs murinas de SR-1 murino, incluindo pre- ferivelmente CDR3 de cadeia pesada.

Conforme usado aqui, o termo "antagonista neutro" é entendido como significado um agente de ligação específica que é capaz de inibir a atividade de um agonista. Estes agentes incluem anticorpos conforme defi- nidos acima, e peptídeos recombinantes ou outros compostos que contêm seqüências derivadas de CDRs que têm as propriedades de ligação ao antí- geno desejadas. Especificamente incluídos no termo estão peptídeos que contêm seqüências de aminoácido que são pelo menos 80%, 90% ou 100% idênticas a uma ou mais CDRs de SR-1 murino, preferivelmente incluindo CDR3 de cadeia pesada.

Também incluídos no termo estão "pepticorpos" que são molé- culas que compreendem um domínio Fc de anticorpo como o "veículo" liga- do a pelo menos um peptídeo de ligação ao antígeno. CDR1S de anticorpo do anticorpo SR-1 podem ser adequadas para incorporação em um pepticorpo, incluindo particularmente a CDR3 da cadeia pesada. A produção de pepti- corpos é descrita de forma geral na publicação PCT WO 00/24782, publica- da em 4 de maio de 2000. Os peptídeos podem ser ligados em tandem (isto é, seqüencialmente), com ou sem ligantes. Os peptídeos que contêm um resíduo de cisteinila podem fazer ligação cruzada com outro peptídeo que contém Cys, qualquer um ou ambos os quais podem ser ligados a um veícu- lo. Qualquer peptídeo que tem mais de um resíduo de Cys também pode formar uma ligação de dissulfeto intrapeptídica. Qualquer um destes peptí- deos pode ser derivatizado, por exemplo, a terminação carboxila pode ser capeada com um grupo amino, cisteínas podem ser capeadas, ou resíduos de aminoácido podem ser substituídos por porções com exceção de resí- duos de aminoácido (vide, por exemplo, Bhatnagar etal., J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996), e Cuthbertson et ai, J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997), os quais estão por meio disso incorporados por referência na sua totalidade). As seqüências de peptídeo podem ser otimizadas, de forma similar à matu- ração de afinidade para anticorpos, ou alteradas de outra forma por rastrea- mento de alanina, ou mutagênese aleatória ou dirigida seguida por rastrea- mento para identificar os melhores ligantes. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997).

Várias moléculas podem ser inseridas na estrutura do agente de ligação específica, por exemplo, dentro da porção do peptídeo em si, ou en- tre o peptídeo e as porções de veículo dos agentes de ligação específica, enquanto mantém a atividade desejada do agente de ligação específica. Po- de-se inserir facilmente, por exemplo, moléculas tais como um domínio Fc ou fragmento deste, polietileno glicol ou outras moléculas relacionadas tais como dextrano, um ácido graxo, um lipídio, um grupo de colesterol, um pe- queno carboidrato, um peptídeo, um agente citotóxico, um agente quimiote- rápico, uma porção detectável conforme descrita aqui (incluindo agentes flu- orescentes, radiomarcadores tais como radioisótopos), um oligossacarídeo, um oligonucleotídeo, um polinucleotídeo, RNA de interferência (ou outro), enzimas, hormônios, ou similares. Outras moléculas adequadas para inser- ção desta forma serão observadas por aqueles versados na técnica, e estão abrangidas dentro do escopo da invenção. Isso inclui a inserção de, por e- xemplo, uma molécula desejada entre dois aminoácidos consecutivos, op- cionalmente unidas por um Iigante adequado.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado de um componente da célula que o expressou. Componentes contaminantes da célula são materiais que poderiam interferir com usos diagnósticos e tera- pêuticos do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de anticorpo, e o mais preferivelmente mais do que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou interna, ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração por prata. Anticorpo de ocorrência natural isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes já que pelo menos um componente do am- biente natural do anticorpo não estará presente. Geralmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, anticorpos que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar pre- sentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um sítio ou epítopo antigênico indivi- dual, ao contrário de preparações de anticorpo policlonal que incluem tipi- camente anticorpos diferentes direcionados contra epítopos diferentes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de qualquer uma de suas cadeias, imunoglobulinas humanas podem ser classificadas em diferentes classes. Há cinco classes principais, IgA1 IgD, IgE1 IgG e IgM, e várias dessas podem ser divididas ainda em subclasses ou isotipos, por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, epsilon, gama e mu respectiva- mente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhecidas. Diferentes isotipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, os isotipos IgGI e lgG3 têm atividade de ADCC.

O termo região "hipervariável" refere-se aos resíduos de amino- ácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende os resíduos de aminoácido de uma região de determinação de complementaridade ou CDR [isto é, resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada como descrito por Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. Mesmo uma única CDR pode reconhecer e se ligar ao antígeno, embora com menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro que contém todas as CDRs. Entende-se que a CDR de um anticorpo pode incluir mais ou menos seqüências além dos limites especificados acima contanto que o an- ticorpo mantenha sua habilidade de se ligar à molécula alvo. Uma definição alternativa de resíduos de uma "alça" hipervariá- vel é descrita por Chothia et ai, J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987) como resí- duos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de ca- deia pesada.

Resíduos de "estrutura" ou FR são os resíduos da região variá- vel com exceção dos resíduos da região hipervariável.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de extensão completa intacto, preferivelmente a região variável ou de ligação ao antígeno do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de an- ticorpo incluem fragmentos Fab, Fab11 F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et ai, Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

Digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um sítio de ligação ao antígeno específico, e um fragmento "Fc" residual o qual contém a região constante. O fragmento Fab contém todo o domínio variável, assim como o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domí- nio constante (CH1) da cadeia pesada. O fragmento Fc apresenta carboidra- tos e é responsável por muitas funções efetoras do anticorpo (tal como liga- ção ao complemento e receptores celulares), que distinguem uma classe de anticorpo da outra.

O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que tem dois fragmentos "Fv de cadeia única" ou "sFv" que compreendem os domí- nios Vh e Vl do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab1 pela inclusão de alguns resíduos adicionais na terminação carbóxi do domínio Ch1 da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Preferivelmente, o polipeptídeo de Fv ainda compre- ende um Iigante de polipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que permite que Fv forme a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma revisão de sFv vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. I 13, Rosenburg & Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

"Fv" é o menor fragmento de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento e ligação ao antígeno completo. Essa região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em estreita associação não-covalente. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero Vh Vl. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação ao antígeno. Entretanto, um único domí- nio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs espe- cíficas para um antígeno) tem a habilidade de reconhecer e se ligar ao antí- geno, mas com uma afinidade menor que do o sítio de ligação inteiro.

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreen- dem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH VL). Pelo uso de um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os do- mínios de complementaridade de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404,097; WO 93/11161; e 30 Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de frag- mentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos de anticorpos intactos, mas também pode ser produzido diretamente por células hospedeiras recombi- nantes. Vide, por exemplo, Better et al, Science 240: 1041-1043 (1988); Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988); Carter et ai, Bio/Technology 10:163-167(1992).

Conforme fornecidos aqui, as composições e métodos de tratar distúrbios inflamatórios, auto-imunes, oncológicos e fibróticos podem utilizar um ou mais terapêuticos anti-c-Kit usados singularmente ou em combinação com outros terapêuticos para se obter os efeitos desejados. Agentes antifi- bróticos exemplares adequados para uso de acordo com a invenção incluem citocinas em que a citocina é selecionada a partir de fator de crescimento transformante β (TGF-β), interleucina- 4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleu- cina-9 (IL-9), interleucina-13(IL-13), fator estimulador de colônia de macrófa- go/granulócito (GM-CSF), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleuci- na-1 beta (IL-1 β), fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), interleu- cina-6 (IL-6), oncostatina M (OSM), fator de crescimento derivado de plaque- ta (PDGF), proteína quimiotática de monócito 1 (CCL2/MCP-1), e quimiocina pulmonar e regulada por ativação (CCL18/PARC).

Anticorpos derivados de SR-1 de acordo com a presente inven- ção são preferivelmente produzidos por metodologia de DNA recombinante usando um dos sistemas de expressão de anticorpo bem-conhecidos na téc- nica (vide, por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Tais anticorpos também são preferi- velmente proteínas de fusão quiméricas que têm seqüências variáveis e re- giões constantes derivadas de imunoglobulina, ou mais preferivelmente são anticorpos monoclonais mais similares aos seres humanos (tais como anti- corpos humanos ou humanizados) que compreendem resíduos de anticorpo humano mas preferivelmente retêm pelo menos as CDRs de SR-1 murino. Além de moléculas intactas de extensão completa, o termo "anticorpo" tam- bém refere-se a fragmentos destes ou multímetros ou agregados de molécu- las intactas e/ou fragmentos que se ligam a c-Kit. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo derivado de um anticorpo não-humano, tipicamente um anticorpo monoclo- nal de camundongo. Alternativamente, um anticorpo humanizado pode ser derivado de um anticorpo quimérico que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo parental não-humano, mas que exibe imunogenicidade diminuída quando comparado ao anticorpo parental quando administrado a seres humanos. A expressão "anticorpo qui- mérico", conforme usada aqui, refere-se a um anticorpo que contém uma seqüência derivadas de dois anticorpos diferentes (vide, por exemplo, Paten- te U.S. No. 4.816.567) que se originam tipicamente de espécies diferentes. O mais tipicamente, anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de an- ticorpo humano e de murino, geralmente regiões constantes de camundongo e variáveis de humanas.

Produção recombinante de anticorpos

A seqüência de aminoácido de uma imunoglobulina de interesse pode ser determinada por seqüenciamento de proteína direto, e seqüências de nucleotídeo codificantes adequadas podem ser desenhadas de acordo com a tabela de códon universal.

Alternativamente, DNA que codifica os anticorpos monoclonais pode ser isolado e seqüenciado a partir de células de hibridoma usando pro- cedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleo- tídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes eu codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). A determinação de se- qüência geralmente irá requerer o isolamento de pelo menos uma porção do gene ou cDNA de interesse. Geralmente isso requer a clonagem do DNA, ou preferivelmente, mRNA (isto é, cDNA) que codifica os anticorpos monoclo- nais. A clonagem é realizada usando técnicas convencionais (vide, por e- xemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, que está incorporado aqui por referência). Por exemplo, uma biblioteca de cDNA pode ser construída por transcrição reversa de poliA+ mRNA, preferivelmente, mRNA associado a membrana, e a biblioteca rastreada usando sondas para seqüências de gene de polipeptí- deo de imunoglobulina humana. Em uma modalidade preferida, entretanto, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para amplificar cDNAs (ou porções de cDNAs de extensão completa) que codificam um segmento de gene de imunoglobulina de interesse (por exemplo, um segmento variável de cadeia leve). As seqüências amplificadas podem ser facilmente clonadas em qualquer vetor adequado, por exemplo, vetores de expressão, vetores de minigenes, ou vetores de apresentação em fago. Será observado que o mé- todo particular de clonagem usado não é critico, contanto que seja possível determinar a seqüência de alguma porção do polipeptídeo de imunoglobulina de interesse.

Como usado aqui, uma molécula de ácido nucléico "isolada" ou seqüência de ácido nucléico "isolada" é uma molécula de ácido nucléico que é tanto (1) identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com a qual está ordinariamente associada na fonte natural do ácido nucléico ou (2) clonada, amplificada, sinalizada, ou distinta de outra forma dos ácidos nucléicos do ambiente tal que a seqüência do áci- do nucléico de interesse pode ser determinada. Uma molécula de ácido nu- cléico isolada é diferente da forma ou do ambiente no qual ela é encontrada da natureza. Entretanto, uma molécula de ácido nucléico isolada contida em células que expressam geralmente o anticorpo onde, por exemplo, a molécu- la de ácido nucléico está em uma localização cromossômica diferente da- quela de células naturais.

Uma fonte para RNA usada para clonagem e seqüenciamento é um hibridoma produzido por obter uma célula B do camundongo transgênico e fundir a célula B a uma célula imortal. Uma vantagem de usar hibridomas é que eles podem ser facilmente rastreados, e um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal humano de interesse selecionado. Alternativamente, RNA pode ser isolado de células B (ou baço total) do animal imunizado. Quando fontes diferentes de hibridomas são usadas, pode ser desejável ras- trear seqüências que codificam imunoglobulinas ou polipeptídeos de imuno- globulinas com características de ligação. Um método para tal rastreamento é o uso de tecnologia de apresentação em fago. Apresentação em fago é descrita em, por exemplo, Dower et ai, WO 91/17271, McCafferty et a!., WO 92/01047, e Caton & Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6450-6454 (1990), cada uma das quais está incorporado por referência. Em uma moda- lidade que usa tecnologia de apresentação em fago, cDNA de um camun- dongo transgênico imunizado (por exemplo, cDNA de baço total) é isolado, a reação em cadeia da polimerase é usada para amplificar seqüências de cD- NA que codificam uma porção de um polipeptídeo de imunoglobulina por exemplo, regiões de CDR, e as seqüências amplificadas são inseridas em um vetor de fago. cDNAs que codificam peptídeos de interesse, por exem- plo, peptídeos de região variável com características de ligação desejadas, são identificados por técnicas usuais tais como "panning".

A seqüência do ácido nucléico amplificado ou clonado é então determinada. Tipicamente a seqüência que codifica uma região variável in- teira do polipeptídeo de imunoglobulina é determinada, entretanto, algumas vezes será adequado seqüenciar apenas uma porção de uma região variá- vel, por exemplo, a região que codifica a CDR. Tipicamente a porção se- qüenciada terá pelo menos 30 bases de extensão, mais freqüentemente ba- ses que codificam pelo menos um terço ou pelo menos metade da extensão da região variável será seqüenciada.

O seqüenciamento pode ser executado em clones isolados de uma biblioteca de cDNA, ou quando PCR é usado, após subclonagem da seqüência amplificada, ou por seqüenciamento por PCR direto do segmento amplificado. O seqüenciamento é executado usando técnicas usuais (vide, por exemplo, Sambrook etal. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, e Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, que estão incorporados aqui por referência). Por comparar a seqüência do ácido nucléico clonado com as seqüências publicadas de genes de imunoglobulinas humanas e cDNAs, um versado na técnica será capaz de determinar facilmente, dependendo da região seqüen- ciada, (i) o uso do segmento de linhagem germinativa do polipeptídeo de imunoglobulina do hibridoma (incluindo o isotipo da cadeia pesada) e (ii) a seqüência das regiões variáveis da cadeia pesada e leve, incluindo seqüên- cias que resultam de adição à região-N e do processo de mutação somática. Uma fonte de informação de seqüência de gene de imunoglobulina é o Nati- onal Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Na- tional Institutes of Health, Bethesda, Md.

Uma vez isolado, o DNA pode ser operativamente ligado a se- qüências de controle de expressão ou colocado em vetores de expressão, os quais são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem proteína de imunoglobuli- na de outra maneira, para direcionar a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anti- corpos é bem-conhecida na técnica. Seqüências de controle de expressão referem-se a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificante opera- tivamente ligada em um organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são adequadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, operativamente ligado a uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar pro- motores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.

Um ácido nucléico é operativamente ligado quando ele é coloca- do em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, DNA para uma pré-seqüência ou líder secretória, é operativamente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensi- ficador está operativamente ligado a uma seqüência codificante se ele esti- ver posicionado a fim de facilitar a tradução. Geralmente operativamente ligado significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são contiguas, e no caso de um líder secretório, contiguas e em fase de leitura. Entretanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligar em sítios de restrição convenientes, se tais sítios não existirem, adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou Iigantes são usados de acordo com a prática convencional.

Célula, linhagem celular, e cultura celular são freqüentemente usados intercambiavelmente e todas as tais designações aqui contidas in- cluem a progênie. Transformantes e células transformadas incluem a célula primária do objeto e culturas derivadas dela sem considerar o número de transferências. Também deve ser compreendido que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações deli- beradas ou inadvertidas. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme pesquisado na célula originalmente transforma- da está incluída.

A invenção também fornece ácidos nucléicos isolados que codi- ficam agentes ou anticorpos de ligação específica da invenção, opcional- mente operativamente ligados a seqüências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira. Vetores e células hospedeiras que compreendem os ácidos nucléicos, e técnicas recombinantes para a produção dos agentes de ligação específica ou anticorpos, os quais podem compreender cultivar a célula hospedeira a fim de que o ácido nucléico seja expressão e, opcional- mente, recuperar o agente de ligação específica ou anticorpo da cultura de célula hospedeira ou meio de cultura.

Muitos vetores são conhecidos na técnica. Componentes do ve- tor podem incluir um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal (que pode, por exemplo, direcionar a secreção do agente de ligação específica, ou anticorpo), uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores se- lecionáveis (que podem, por exemplo, conferir resistência a antibiótico ou outro fármaco, deficiências auxotróficas de complemento, ou fornecer nutri- entes críticos não disponíveis nos meios), um elemento intensificador, um promotor, e uma seqüência de terminação da transcrição, todos os quais são bem-conhecidos na técnica.

Células hospedeiras adequadas incluem procariotos, leveduras ou células eucariotas superiores descritas acima. Procariotos adequados para este tipo de finalidade incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiellal Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia1 por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, e Streptomyces. Além de procario- tos, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codifi- cam agentes de ligação específica. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de pão comum, é a mais comumente usada entre microorganismos eucarió- ticos inferiores. Entretanto, vários outros gêneros, espécies, e cepas são comumente disponíveis e úteis aqui, tais como, Pichia, por exemplo, P. pas- toris, Schizosaccharomyces pombe·, Kluyveromyces, Yarrowia; Candida\ Tri- ehoderma rees/a; Neurospora crassa; Sehwanniomyces tal como Sehwanni- omyees oeeidentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, hospe- deiros de Neurospora, Penicillium, Tolypoeladium, e Aspergillus tais como A. ηiduIans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de agente de ligação específica ou anticorpo glicosilado são derivadas de organismos mul- ticelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de planta ou insetos. Várias cepas de baculovírus e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopietus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas), e Bombyx mori foram identifi- cados. Uma variedade de cepas virais para transfecção de tais celular são disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-1 de Autographa eali- forniea NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV.

Entretanto, interesse tem sido maior em células de vertebrado, e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero úteis são células de ovário de hamster chinês, incluindo células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, e células e ovário de hamster Chi- nês/-DHFR (CHO, Urlaub et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216 (1980)); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 sub- clonadas para crescimento em cultura em suspensão, [Graham et ai, J. Gen Viroi 36\ 59 (1977)]; células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); célu- las de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de hepatoma huma- no (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai, Annals N.Y Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 ou células FS4.

Células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com os ácidos nucléicos ou vetores descritos acima para produção de agente ou anticorpo de ligação específica e cultivadas em meios nutrientes convencio- nais modificados como apropriado para induzir promotores, selecionar trans- formantes, ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas. Além disso, vetores novos e linhagens celulares transfectadas com múltiplas cópias ou unidades de transcrição separadas por um marcador seletivo são particularmente úteis e preferidos para a expressão de agentes de ligação específica ou anticorpos.

As células hospedeiras usadas para produzir o agente de liga- ção específica ou anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et ai, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et ai, Anal. Bio- chem. 102: 255 (1980), Patente U.S. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; W090103430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. No. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hos- pedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme ne- cessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insuli- na, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotí- deos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco Gen- tamycinQ), elementos-traço (definidos como compostos inorgânicos geral- mente presentes em concentrações na faixa de micromolar), e glicose ou fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam co- nhecidas daqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aqueles previamente usados com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será claro para o versado na téc- nica. Os vetores de expressão, pDC323 e pDC324 como descritos no Pedi- do de Patente U.S. No. 20030082735, contendo o par da cadeia pesada e leve respectivo apropriado foram transferidos para dentro da linhagem celu- lar CS9.

Por cultivar as células hospedeiras, o agente de ligação especí- fico ou anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplas- mático, ou secretado diretamente no meio. Se o agente de ligação específica ou anticorpo foram produzidos intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultracentrifugação.

O agente de ligação específica ou composição de anticorpo po- de ser purificado usando, por exemplo, cromatografia de hidroxiapatita, cro- matografia de troca de cátion ou ânion, ou preferivelmente cromatografia de afinidade, usando o antígeno de interesse ou proteína A ou proteína G como um Iigante de afinidade. Proteína A pode ser usada para purificar agentes de ligação específica ou anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humanas (Lindmark et ai, J. Immunol. Meth. 62. 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para γ3 humano (Guss et ai, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A matriz a qual o Iigante de afinidade é ligada é o mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e menos tempo de processamento do que podem ser obtidas com a agarose. Quando o agente de ligação específica ou anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABXa (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tais como precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatofocalização, SDS- PAGE, e precipitação com sulfato de amônio também são possíveis depen- dendo do agente de ligação específica ou anticorpo a ser recuperado. Anticorpos quiméricos e humanizados Anticorpos monoclonais quiméricos, nos quais os domínios de Ig variáveis de um anticorpo de roedor são fundidos a domínios de Ig constan- tes humanos, podem ser gerados usando procedimentos usuais conhecidos na técnica (vide, Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6841-6855; e, Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646 . (1984)). Embora alguns anticorpos monoclonais quiméricos tenham se provado imunogênicos em seres humanos, os domí- nios variáveis de Ig de roedor ainda podem levar a uma resposta humana anti-roedor significativa.

Anticorpos humanizados podem ser obtidos por uma variedade de métodos incluindo, por exemplo, (1) enxertar as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) em um estrutura humano e região constante (um processo referido na técnica como humanização através de "enxerto de CDR") ou alternativamente, (2) transplantar os domínios humanos variáveis inteiros, mas "ocultando-os" com uma superfície similar à humana por substi- tuição de resíduos de superfície (um processo referido como "entalhamento (veneering)"). Estes métodos são descritos, por exemplo, em Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison & Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Ver- hoeyer et ai, Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); e Kettleborough, C.A. etal., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991) cada um dos quais está incorpo- rado aqui por referência.

Em particular, um anticorpo de roedor em administração repetida in vivo a um homem, isolado ou como um conjugado, irá gerar uma resposta imune no receptor contra o anticorpo de roedor; a assim chamada resposta de HAMA (Anticorpo Humano Anti-Camundongo). A resposta de HAMA pode limitar a eficácia do fármaco se dosagem repetida for necessária, a imuno- genicidade do anticorpo pode ser reduzida por modificação química do anti- corpo com um polímero hidrofílico tal como polietileno glicol ou por usar os métodos de engenharia genética para fazer a estrutura de ligação do anti- corpo mais similar à humana.

0 enxerto de CDR envolve introduzir uma ou mais das seis C- DRs dos domínios variáveis de cadeia pesada ou leve da Ig de camundongo nas regiões de estrutura apropriadas de um domínio variável humano de Ig.

Esta técnica (Riechmann, L., et ai, Nature 332, 323 (1988)), utiliza as regi- ões conservadas do estrutura (FR1 a FR4) como uma estrutura para supor- tar as alças de CDR que são os contatos primários com o antígeno. Uma desvantagem significativa de enxerto de CDR1 entretanto, é que ele pode resultar em um anticorpo humanizado que tem uma afinidade de ligação substancialmente menor do que o anticorpo de camundongo original, por que os aminoácidos das regiões do estrutura podem contribuir para a ligação ao antígeno, e porque os aminoácidos das alças de CDR podem influenciar a associação dos dois domínios variáveis de Ig. Anticorpos SR-1 quiméricos não mostram potência funcional apropriada em ensaios a base de célula.

Para manter a afinidade do anticorpo monoclonal humanizado, a técnica de enxerto de CDR pode ser melhorada por escolher as regiões de estrutura humanas que mais se parecem com as regiões do estrutura do anticorpo de camundongo original, e por mutagênese sítio-dirigida de ami- noácidos isolados dentro do estrutura ou CDRs auxiliada por modelagem em computador do sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976).

Um método de humanizar um anticorpo compreende alinhar as seqüências das cadeias pesadas e leves não-humanas com as seqüências das cadeias pesadas e leves humanas, selecionar e substituir o estrutura não-humano por um estrutura baseado em tal alinhamento, modelagem mo- lecular para prever a conformação da seqüência humanizada e comparar a conformação com o anticorpo parental. Este processo é seguido por muta- ção reversa repetida de resíduos na região de CDR com perturbação da es- trutura das CDRs até que a conformação prevista do modelo da seqüência humanizada se aproxime intimamente da conformação das CDRs não- humanas do anticorpo não-humano parental. Tais anticorpos humanizados podem ainda ser derivatizados para facilitar a absorção e depuração, por exemplo, através de receptores de Ashwell (vide por exemplo, as Patente U.S. Nos. 5.530.101 e 5.585.089).

Várias humanizações de anticorpos monoclonais de camundon- go por desenho racional foram relatadas (vide, por exemplo, 20020091240 publicado em 11 de julho de 2002, WO 92/11018 e Patente U.S. No., 5.693.762, Patente U.S. No. 5.766.866. Manipulação humana de anticorpos também foi descrita, por exemplo, em Studnicka et al. Patente U.S. No. 5.766.886; Studnicka et ai Protein Engineering 7: 805-814 (1994).

Produção de variantes de anticorpo

Variantes de seqüência de aminoácido do agente de ligação es- pecífica ou anticorpo podem ser preparadas por introduzir alterações de nu- cleotídeo apropriadas no DNA codificante ou por síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido dos agentes de ligação específica ou anticorpos. Qualquer combinação de deleção, inserção e subs- tituição é feita para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácido também podem alterar os processos pós-traducionais do agente de ligação específi- ca ou anticorpo humanizado ou variante, tal como alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação.

Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de seqüên- cia de aminoácido do agente de ligação específica ou anticorpo são prepa- radas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), muta- gênese por PCR1 e mutagênese de cassete de uma variante preparada ante- riormente ou uma versão não-variante do agente de ligação específica ou anticorpo.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do agente de ligação específica ou anticorpo que são localizações preferidas para mutagênese é chamada "mutagênese de rastreamento de alanina" con- forme descrito por Cunningham & Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (o mais preferivelmente ala- nina ou polialanina) para afetar a interação de aminoácidos com o antígeno. As localizações de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas por introduzir mais ou outras variantes nos sítios de substituição. Desta forma, embora o sítio para introduzir uma varia- ção de seqüência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da muta- ção per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, rastreamento de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes expressas são pesquisadas quanto à atividade desejada.

Geralmente variantes de seqüência de aminoácido do agente de ligação específica ou anticorpo terão uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade de seqüência de aminoácido com as se- qüências de aminoácido do agente de ligação específica ou anticorpo origi- nal (murino ou humanizado) da cadeia pesada ou da cadeia leve, ou pelo menos 65% ou pelo menos 70%, ou pelo menos 75% ou pelo menos 80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade, e o mais preferivel- mente pelo menos 95% de identidade, incluindo por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100%. Identidade ou homologia com relação a esta seqüência é definida aqui como a porcentagem de resíduos de aminoá- cido na seqüência candidata que são idênticos à seqüência original, após alinhamento das seqüências e introdução de intervalos, se necessário, para se obter a porcentagem máxima de identidade de seqüência, e não conside- rando nenhuma substituição conservativa (conforme definido na Tabela I abaixo) com parte da identidade de seqüência. Nenhuma das extensões, deleções ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas, na seqüência do agente de ligação específica ou anticorpo devem ser consideradas como afetando a identidade ou homologia. Dessa forma, a identidade de seqüên- cia pode ser determinada por métodos usuais que são comumente usados para comparar a similaridade na posição dos aminoácidos de dois polipeptí- deos. Usando um programa de computador tal como BLAST ou FASTA, dois polipeptídeos são alinhados para pareamento otimizado dos seus respecti- vos aminoácidos (ao longo de toda a extensão de uma ou ambas as se- qüências, ou ao longo de uma porção predeterminada de uma ou ambas as seqüências). Os programas fornecem uma penalidade por abertura prede- terminada e uma penalidade por intervalo predeterminada, e uma matriz de pontuação tal como PAM 250 [uma matriz de pontuação padrão; vide Da- yhoff et ai, em Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978)] pode ser usada em conjunto com o programa de computador, por exemplo, o percentual de identidade pode então ser calculado como: o nú- mero total de pareamentos idênticos multiplicado por 100 e então dividido pela soma do comprimento da seqüência mais longa dentro da distância pa- reada e o número de intervalos introduzidos nas seqüências mais longas a fim de alinhar as duas seqüências.

Inserções

Inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões amino- ou carbóxi-terminais que variam em comprimento de um resíduo a polipeptí- deos que contêm cem ou mais resíduos, assim como inserções intra- seqüência de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um agente de ligação específica ou anticorpo com um resíduo de metionila terminal ou o agente de ligação específica ou anticorpo (incluindo fragmento de anticorpo) fundido a um sinalizador de epí- topo ou um epítopo de receptor de recuperação. Outras variantes insercio- nais do agente de ligação específica ou molécula de anticorpo incluem a fu- são a um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do agente de ligação específica ou anticorpo, por exemplo, na terminação-N ou terminação-C.

Exemplos de sinalizadores de epítopos incluem o polipeptídeo sinalizador de HA de influenza e seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Moi Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; o sinalizador de c-myc e os anticorpos para ele 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Moi Cell. Bioi 5(12): 3610- 3616 (1985)]; e o sinalizador da glicoproteína D (gD) do vírus Herpes Sim- plex e seu anticorpo [Paborsky et ai, Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]. Outros sinalizadores exemplares são uma seqüência de polihistidi- na, geralmente de cerca de seis resíduos de histidina, que permite o isola- mento de um composto assim marcado usando quelação com níquel. Outros marcadores e sinalizadores, tais como o sinalizador FLAG® (Eastman Ko- dak, Rochester, NY) são bem-conhecidos e usados rotineiramente na técni- ca.

O termo "epítopo de ligação de receptor de recuperação (salva- ge)" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por e- xemplo, IgGi, lgG2, lgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar a meia- vida sérica in vivo da molécula de IgG. Substituições

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoá- cido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécu- la do agente de ligação específica ou anticorpo removido e um resíduo dife- rente inserido no seu lugar. Mutagênese substitucional dentro de qualquer uma das regiões hipervariáveis ou de CDR ou regiões de estrutura é con- templada. Substituições conservativas são mostradas na tabela 1. A substi- tuição mais conservativa é encontrada sob o título de "substituições preferi- das". Se tais substituições não resultarem em uma alteração da atividade biológica, então mais alterações substanciais denominadas, "substituições exemplares" na Tabela 1, ou conforme descrito adicionalmente abaixo com relação às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos examinados.

TABELA 1

<table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table>

Modificações substanciais nas propriedades biológicas do agen- te de ligação específica ou anticorpo são efetuadas por selecionar substitui- ções que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura do estrutura do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da mo- lécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrên- cia natural são divididos em grupos baseados nas propriedades em comuns da cadeia lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe. Substituições conservativas envolvem a substituição de um ami- noácido por outro membro de sua classe. Substituições não-conservativas envolvem a substituição de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter a con- formação apropriada do agente de ligação específica ou anticorpo humani- zado ou variante também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir a ligação cruzada aberrante. De forma inversa, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adiciona- da(s) ao agente de ligação específica ou anticorpo para melhorar sua estabi- lidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Maturação de afinidade

A maturação de afinidade envolve preparar e examinar as vari- antes do agente de ligação específica ou anticorpo que têm mutações (dele- ções, inserções ou substituições) dentro das CDRs de um agente de ligação específica ou anticorpo parental e selecionar variantes que têm propriedades biológicas melhoradas tais como afinidade de ligação em relação a um agen- te de ligação específica parental ou anticorpo. Uma forma conveniente para gerar tais variantes de substituição é a maturação de afinidade usando apre- sentação em fago. Resumidamente, vários sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácido possíveis em cada sítio. As variantes do agente de ligação es- pecífica ou anticorpo assim geradas também podem ser apresentadas de uma forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões ao produto do gene Ill de M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes apresentadas em fago são então examinadas quanto a sua ati- vidade biológica (por exemplo, afinidade de ligação).

A mutagênese de rastreamento de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significati- vamente para a ligação ao antígeno. Alternativamente, ou, adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno- anticorpo para identificar pontos de contato entre o agente de ligação espe- cífica ou anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos da vizi- nhança são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elabo- radas aqui. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a rastreamento conforme descrito aqui e agentes de ligação es- pecífica ou anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Técnicas que utilizam embaralhamento de genes e evolução di- rigida também podem ser usadas para preparar e examinar variantes do a- gente de ligação específica ou anticorpo quanto à atividade desejada. Por exemplo, Jermutus et ai, Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jan 2;98(1):75-80 relata que estratégias de seleção in vitro adaptadas baseadas em apresen- tação de ribossomo foram combinadas com diversificação in vitro por emba- ralhamento de DNA para evoluir a taxa de dissociação ou estabilidade ter- modinâmica dos fragmentos de anticorpo de Fv de cadeia única (scFvs); Fermer et ai, Tumour Biol. 2004 Jan-Apr;25(1-2):7-13 relatam que o uso de apresentação em fago em combinação com embaralhamento de DNA au- mentou a afinidade em quase três ordens de magnitude.

Glicosilaeão alterada

Variantes do agente de ligação específica ou anticorpo também podem ser produzidas, as quais têm um padrão de glicosilação em relação ao agente de ligação específica ou anticorpo, por exemplo, por deletar uma ou mais porções de carboidrato encontradas no agente de ligação específica ou anticorpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no agente de ligação específica ou anticorpo.

A glicosilação de polipeptídeos incluindo anticorpos é tipicamen- te N-Iigada ou O-ligada. N-Iigada refere-se à ligação da porção de carboidra- to à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptí- deo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer amino- ácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. A pre- sença de qualquer uma dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptí- deo cria um potencial sítio de glicosilação. Dessa forma, sítios de glicosila- ção N-Iigados podem ser adicionados a um agente de ligação específica ou anticorpo por alterar a seqüência de aminoácido tal que ela contenha uma ou mais dessas seqüências de tripeptídeo. Glicosilação O-Iigada refere-se à ligação de um ou mais dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, o mais comumente serina ou treonina, embo- ra 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados. Sítios de glicosilação O-Iigada também podem ser adicionados a um agente de liga- ção específica ou anticorpo por inserir ou substituir um ou mais resíduo de serina ou treonina à seqüência do agente de ligação específica original ou anticorpo.

Outras modificações

Resíduo(s) de cisteína podem ser removidos ou introduzidos na região Fc, eliminando ou aumentando assim a formação de ligação de dis- sulfeto intercadeia nesta região. Agente de ligação específica homodimérico ou anticorpo assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular de- pendente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Vide, Caron et ai, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Agentes de ligação específica homodiméricos ou anticorpos também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et ai, Câncer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, um agente de ligação específica ou anticorpo pode ser manipulado, o qual tem duas regiões Fc e pode assim ter capacidades aumentadas de Iise pelo complemento e ADCC. Vide, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

Foi mostrado que seqüências dentro da CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue a MHC Classe Il e dispare uma resposta de célula T auxiliar indesejada. Uma substituição conservativa pode permitir que o a- gente de ligação específica ou anticorpo retenha atividade de ligação ainda que reduzindo sua habilidade de disparar uma resposta de célula T indese- jada. Também é contemplado que um ou mais dos 20 aminoácidos N- terminais da cadeia pesada ou leve sejam removidos.

Modificações de ou adição de um epítopo de ligação de receptor de recuperação (por exemplo, por mutação da região apropriada ou por in- corporar o epítopo em um sinalizador de peptídeo que é então fundida de ligação específica ou anticorpo no final o uno meio, por exemplo, por síntese de DNA ou de peptídeo) (vide, por exemplo, W096/32478) ou adicionar mo- léculas tais como PEG ou polímeros solúveis, incluindo polímeros de polis- sacarídeo.

O epítopo de ligação de receptor de recuperação constitui prin- cipalmente uma região em que qualquer um ou mais resíduos de aminoácido de uma ou duas alças de um domínio Fc são transferidas para uma posição análoga do agente de ligação específica ou anticorpo ou fragmento. Ainda mais preferivelmente, três ou mais resíduos de uma ou duas alças do domí- nio Fc são transferidas. Ainda mais preferivelmente, o epítopo de uma ou duas alças do domínio Fc são transferidas, ainda mais preferido, o epítopo é tirado do domínio Ch2 da região Fc (por exemplo, de uma IgG) e é transferi- do para a região CH1, CH3, ou VH, ou mais do que uma das tais regiões, do agente de ligação específica ou anticorpo. Alternativamente, o epítopo é ti- rado do domínio Ch2 da região Fc (por exemplo, de uma IgG) e transferido para a região Cl ou para a região Vl, ou ambas, do agente de ligação espe- cífica ou fragmento de anticorpo. Vide os pedidos internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478 que descrevem variantes de Fc e sua interação com receptor de recuperação.

A regulação da homeostase de IgG in vivo depende da sua liga- ção ao FcRn. Modificação da interação entre o domínio Fc de IgG e FcRn foi relatada como melhorando a meia-vida sérica de anticorpos monoclonais. Mutações em, Fe que resultam em maior afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal FcRn e que reduzem a degradação e melhoram o perfil de PK seri- am preferíveis. O sítio de ligação de FeRn em IgG está localizado na interfa- ce dos domínios Ch2-Ch3. Mutações de resíduos nesta área (M428L e T250Q/M428L, T250Q/M428L, P257I/Q311I , M252Y/S254T/T256E , H433K/N434F/Y436H, ou M252Y/S254T7T256E/H433K/N434F/Y436H) re- sultam em afinidade aumentada de IgGI por FcRn humano em pH 6.0 e pH 7.3. Adicionalmente, algumas destas mutações resultaram em propriedades farmacocinéticas aumentadas (depuração mais lenta, meia-vida mais longa) quando dados intravenosamente a macacos.

Outros locais da região constante foram identificados, os quais são responsáveis pela citotoxicidade dependente do complemento (CDC), tal como o sítio de ligação de C1q e/ou a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) [vide, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992); Shields et al, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001), incorporados aqui por referência na sua totalidade]. Mutação de resíduos dentro dos sítios de ligação do receptor Fc pode resultar em função efetora alterada (isto é, au- mentada ou diminuída), tal como atividade de ADCC ou CDC alterada. Co- mo descrito acima, mutações potenciais incluem inserção, deleção ou substi- tuição de um ou mais resíduos, incluindo substituição com alanina, uma substituição conservativa, uma substituição não conservativa, ou substitui- ção por um resíduo de aminoácido correspondente na mesma posição de uma subclasse diferente (por exemplo, substituição de um resíduo de IgG por um resíduo de IgG correspondente naquela posição).

Outras modificações covalentes

Modificações covalentes do agente de ligação específica ou an- ticorpo também estão incluídas dentro do escopo desta invenção. Elas po- dem ser feitas por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do agente de ligação específica ou anticorpo, se aplicável. Outros tipos de mo- dificações covalentes podem ser introduzidas no agente de ligação específi- ca ou anticorpo por reagir os resíduos de aminoácido alvo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeia laterais selecio- nadas ou com os resíduos N- ou C-terminais.

Resíduos de cisteinila o mais comumente são reagidos com a- haloacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para dar derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Resíduos de cisteinila também são derivatizados por reação com bromotri- fluoroacetona (e aminas correspondentes), tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para dar derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Resíduos de cisteinila também são derivatizados por reação com bromotri- fluoroacetona, ácido alfa-bromo-p-(5-imidozoil)propiônico, fosfato de cloroa- cetila, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil dissulfeto, metila, 2-piridil dissulfe- to, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7- nitrobenzo-2-oxa-,3-diazol.

Resíduos de histidila são derivatizados por reação com dietilpi- rocarbonato em pH 5,5 a 7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidila. Brometo de bromofenacila também é útil; a reação é realizada preferivelmente em cacodilato de sódio a 1M em pH 6,0.

Resíduos de Iisinila e amino-terminais são reagidos com anidrido de ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A derivatização com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinila. Outros reagentes adequados para derivatizar resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como metil picolinimidato, fosfato de piridoxal, piri- doxal, cloroboroidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, O-metilisouréia, 2,4- pentanodiona, e reação com glioxilato catalisada por transaminase.

Resíduos de arginila são modificados por reação com um ou mais reagentes convencionais, dentre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2- cicloexanodiona, e ninhidrina. A derivatização de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas por causa do alto pKa do grupo funcional. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de Iisina assim como com o grupo episilon-amino de arginina.

A modificação específica de resíduos de tirosila pode ser feita, com interesse particular na introdução de marcadores espectrais em resí- duos de tirosila pela reação com compostos de diazônio aromáticos ou te- tranitrometano. O mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados 3-nitro, respec- tivamente. Resíduos de tirosila são iodados usando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio.

Grupos laterais de carboxila (aspartila ou glutamila) são modifi- cados seletivamente pela reação com carbodiimidas (R-N.dbd.C.dbd.N-R1), onde ReR' são grupos alquila diferentes, tal como 1-cicloexil-3-(2-morfolinil- .4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos de aspartila e glutamila são convertidos para resíduos de asparaginila e glutaminila por reação com íons de amônio.

Resíduos de glutaminila e asparaginila são freqüentemente de- samidados para os resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, res- pectivamente. Estes resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos está dentro do escopo desta invenção.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fos- forilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos alfa-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (Τ. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente envolve acoplar quimica- mente ou enzimaticamente glicosídeos ao agente de ligação específica ou anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos em que eles não requerem a produção do agente de ligação específica ou anticorpo em uma célula hos- pedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação N- ou O- ligada.

Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser ligado(s) a (a) arginina e histidina, (b) grupos hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano ou (f) a grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em W087/05330 publicada em de setembro de 1987, e em Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

A remoção de qualquer porção de carboidrato presente no agen- te de ligação específica ou anticorpo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente, a desglicosilação química requer exposição do agente de ligação específica ou anticorpo ao composto de ácido trifluorometanossulfô- nico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N- acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), embora deixando o agente de ligação específica ou anticorpo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) e por Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981). Clivagem enzimática de porções de carboidrato em um agente de ligação específica ou anticorpo pode ser obtida pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases conforme descrito por Hotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

Outro tipo de modificação covalente do agente de ligação espe- cífica ou anticorpo compreende ligar o agente de ligação específica ou anti- corpo a um de uma variedade de polímeros não-proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polióis polietoxilados, sorbitol polioxieti- lados, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, ou polí- meros de polissacarídeo tais como dextrano. Tais métodos são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Patente U.S. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; 4.179.337; 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; 4.609.546 ou EP 315 456.

Usos terapêuticos

"Tratamento" é uma intervenção realizada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou alteração da patologia de uma distúrbio. Conseqüentemente, "tratamento" refere-se a tratamento terapêutico ou profi- lático ou medidas preventivas. Aqueles necessitados de tratamento incluem aqueles já com a distúrbio assim como aqueles nos quais a distúrbio deve ser prevenida.

"Mamífero" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésti- cos e de fazenda, e de zoológico, de esportes ou animais de estimação, tais como cachorros cavalos, gatos, vacas etc. preferivelmente o mamífero é um ser humano.

Conforme usado aqui, a expressão "quantidade terapeuticamen- te eficaz" pretende referir-se a uma quantidade terapêutica ou profilática de anticorpo c-Kit humanizado, que fornece uma redução no número e/ou ativi- dade de mastócitos ou células progenitoras, redução nos elementos fibrói- des, ou seus precursores, ou que fornece uma redução na severidade ou progressão de sintomas associados com doença associada a c-Kit (isto é, que fornece "eficácia terapêutica"). Mastócitos e células-tronco hematopoié- ticas pluripotentes progenitoras são os tipos celulares primários que expres- sam c-Kit e assim é contemplado que células derivadas de HSC tais como mastócitos e que estão envolvidos em doenças podem ser tratados com as composições e métodos da invenção.

A expressão "atividade redutora de fibrose" pretende referir-se a habilidade de inibir, completamente ou parcialmente e reverter a inflação que resulta da ativação do sistema imune e fibrose.

Como usado aqui, o termo "doença ou distúrbio fibrótico" refere- se a condições que envolvem fibrose em um ou mais tecidos. Como usado aqui, o termo "fibrose" refere-se à formação aberrante ou desenvolvimento excessivo de tecido conjuntivo fibroso em um órgão ou tecido como um pro- cesso reativo, em oposição à formação de tecido fibroso como um constituin- te normal de cura de um órgão ou tecido. A fibrose é caracterizada por acú- mulo de fibroblasto e depósito de colágeno em excesso da deposição normal em qualquer tecido particular. Como usado aqui, o termo "fibrose" é usado de forma sinônima a "cura aberrante, envolvendo transformação de célula fibroblástica mesenquimal, proliferação excessiva de fibroblastos, atividade de deposição de colágenos ou outras proteínas da matriz extracelular".

Fibroblastos são células do tecido conjuntivo, as quais estão dispersas no tecido conjuntivo por todo o corpo. Os fibroblastos secretam uma matriz extracelular não-rígida que contém colágeno do tipo I e/ou tipo III. Em resposta a um dano a um tecido,. Fibroblastos próximos ou células precursoras mesenquimais em circulação migram para a ferida, podem ser tornar alternativamente ativadas sob a influência de outras células tais como mastócitos e seus mediadores, proliferam e produzem grandes quantidades de matriz extracelular colagenosa. Colágeno é uma proteína fibrose rica em glicina e prolina que é um componente importante da matriz extraceiular e tecido conjuntivo, cartilagem e osso. Moléculas de colágeno são estruturas em hélice de fita tripla, chamadas cadeias a, as quais são enroladas em tor- no umas das outras em uma hélice similar a uma corda. O colágeno existe em várias formas ou tipo; destes, o tipo I, o mais comum, é encontrado na pele, tendão, e osso; e o tipo III é encontrado na pele, vasos sangüíneos, e órgãos internos.

Doenças fibróticas associadas a mastócitos incluem fibrose ou cicatrização patológica (incluindo esclerose endocárdica), fibrose intersticial idiopática, fibrose pulmonar intersticial, fibrose perimuscular, fibrose de Symmers, fibrose pericentral, hepatite, dermatofibroma, cirrose biliar, cirrose alcoólica, fibrose pulmonar aguda, fibrose pulmonar idiopática, síndrome do desconforto respiratório agudo, fibrose de rim, /glomerulonefrite, fibrose renal /neuropatia diabética, esclerodermia/, esclerodermia sistêmica/local, quelói- des, cicatrizes hipertróficas, adesão/artrite articular severa, mielofibrose, ci- catrização da córnea, fibrose cística, distrofia muscular (de Duchenne), fibro- se cardíaca, fibrose muscular /separação da retina, estreitamento esofágico, e doença de "payronles". Distúrbios fibróticas adicionais podem ser induzi- das ou iniciadas por cirurgia, incluindo revisão de cicatriz, cirurgias plásticas, glaucoma, fibrose de catarata, cicatrização da córnea, adesões articulares, doença enxerto vs. hospedeiro, cirurgia de tendão, encarceramento do ten- dão, contratura de dupuytren, adesões/fibrose de OB/GYN, adesões pélvi- cas, fibrose peridural. Restenose. Também é contemplado que condições fibróticas onde a deposição de fibronectina é um fator causador podem ser tratadas de acordo com a invenção. Fibrose pulmonar idiopática, pulmão de bleomicina, fibrose cística, e nefropatia glomerular incluindo doenças carac- terizadas por depósitos de Fn nos rins e em última análise levando a falha renal são exemplos de condições que também podem ser tratadas de acor- do com a presente invenção. Inflamação envolvendo ativação do sistema imune e onde mastócitos secretam citocinas inflamatórias tal como TNF, e pode ativar e interagir diretamente com linfócitos pode então ser tratada de acordo com a presente invenção. Esclerodermia é tida como uma doença auto-imune do tecido conjuntivo que resulta em uma distúrbio fibrótica carac- terizada por espessamento e endurecimento da pele, causado pela super- produção de colágeno novo por fibroblastos e outros órgãos. A escleroder- mia também é referida como uma doença local ou sistêmica que envolve vários órgãos. Esclerodermia também é referida como esclerose sistêmica. O desenvolvimento de patologias de esclerodermia está associado com nú- meros celulares aumentados na tecido/órgãos afetados pela doença.

Esclerose sistêmica é caracterizada pela formação de tecido fi- broso hialinizado e espessado, com espessamento da pele e adesão a teci- dos subjacentes, especialmente das mãos e face. A doença também pode ser caracterizada por disfagia devido a perda de peristalse, e fibrose submu- cosa do esôfago, dispnéia causada por fibrose pulmonar, fibrose miocárdica e alterações vasculares (Stedman's Medicai Dictionary, 26a Edição, Williams & Wilkins, 1995)). A fibrose pulmonar afeta 30 a 70% de pacientes com es- clerodermia, resultando freqüentemente em doença pulmonar restritiva (A- tamas et ai. Cytokine and Growth Factor Rev 14: 537-550 (2003)). Alguns pacientes têm uma sobreposição de esclerodermia e outras doenças do te- cido conjuntivo, tal como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, e polimiosite. Quando características de esclerodermia estão presentes junto com características de polimiosite e lúpus eritematoso sistêmico, a condição é referida como uma doença do sistema conjuntivo mista (MCTD).

Sabe-se que os sintomas presentes em algumas formas de dermatite são causados por desgranulação de mastócitos cutâneos, resul- tando em, inter alia, liberação de histamina. Dessa forma, outra distúrbio as- sociada a mastócitos adequada para tratamento de acordo com a invenção é urticária pigmentosa. Esta distúrbio apresenta lesões de pele características que são máculas ou nódulos isolados ou múltiplos pigmentados que ficam irritados ao esfregar e contêm grandes números de mastócitos. Há diferen- tes formas de dermatite associadas (inflamação da pele) tal como eritema, edema, erupções papulares, e prurido podem estar presentes tanto em co- mo em dermatites humanas como de animais todas as quais são tratáveis de acordo com a invenção. A mastocitose é em muitos casos uma doença neoplásica e en- volve crescimento de mastócitos novos ou anormais e pode ser uma conse- qüência de sinalização autócrina de SCF elevada ou mutação de c-Kit ativa- dora. A mastocitose pode ser limitada ou sistêmica envolvendo múltiplos ór- gãos tais como medula óssea. Mastócitos liberam certos mediadores, ou químicos, dos quais um é histamina, no corpo em resposta a certos eventos. Pessoas com mastocitose sistêmica desenvolvem um aumento no número de mastócitos, ou desenvolvem mastócitos com formato alterado, os quais podem não funcionar apropriadamente. Além disso, os mastócitos falham em morrer quando devem, aumentando ainda mais a quantidade total de células mastocitárias. Quando os mastócitos desgranulam e liberam seus conteúdos, isso pode causar muitas condições ou doenças agudas e poten- cialmente sérias. Muitas distúrbios de mastócitos também incluem distúrbios proliferativas que resultam em doença localizada tal como mastocitoma cu- tâneo solitário até a doença mais severa de leucemia de células mastocitá- rias. Exemplos incluem mastocitoma cutâneo, mastocitose agressiva, mas- tocitose indolente, mastocitose com distúrbio hematológica associada, urticá- ria pigmentosa, telangiectasia macularis euptiva perstans (tmep), doença de células mastocitárias sistêmica, leucemia de células mastocitárias, leucemia mielóide, mastocitose sistêmica (com ou sem manifestações cutâneas tais como urticária pigmentosa), síndrome / distúrbio de ativação de mastócitos, e distúrbios de células mastocitárias pediátricas mais comuns tais como mastocitoma solitário e mastocitose cutânea difusa.

A síndrome ou distúrbio de ativação de mastócitos é caracteri- zada por um número normal ou quase normal de mastócitos. Entretanto, os mastócitos são facilmente ativados para liberar seus conteúdos, o que resul- ta em muitos dos sintomas. O perigo da anafilaxia e choque está presente com este distúrbio, mas ao contrário de distúrbios proliferativos de mastóci- tos, esta síndrome pode não ter o potencial de progredir para um estágio mais agressivo ou maligno. Exemplos de tais distúrbios associadas com desgranulação de mastócitos podem incluir dor abdominal, urticárias e erup- ções da pele, anafilaxia, inflação do esôfago, alterações na pressão sanguí- nea e choque, eólicas e distensão intestinal, dor óssea (leve para seve- ra/debilitante), coceira, com e sem erupções, dor no peito, fígado, baço, e envolvimento de outros órgãos, dificuldades cognitivas/ lapsos de memória, malabsorção, doença degenerativa de disco intervertebral, dores de cabeça de enxaqueca, diarréia, dor muscular, tonteira/vertigem/delírios, náusea, fra- queza, osteoporose, osteopenia, fadiga, neuropatia periférica e parestesia, rubor, freqüência cardíaca elevada, refluxo esofágico, e vômito.

O papel dos mastócitos em doenças alérgicas foi validado clini- camente por fármacos que bloqueiam mediadores específicos de mastócitos tais como histamina e corticosteróides que entre suas atividades, causam apoptose de mastócitos. Doenças relacionadas aos mastócitos adicionais incluem reações alérgicas mediadas por histamina que podem ser tratadas por inibir a desgranulação de mastócitos e basófilos induzida por quimiocina e liberação de histamina. Exemplos de distúrbios ou doenças associadas com mastócitos que podem ser tratadas de forma eficaz com os métodos e composições em questão também incluem, mas não são limitados a, derma- tite de contato, dermatite atópica, dermatite alérgica, dermatite eczematosa e dermatite causada por mordidas ou picadas de insetos.

Outras indicações relacionadas a células mastocitárias adequa- das para tratamento pelos métodos e composições da invenção incluem condições inflamatórias pulmonares em doenças pulmonares intersticiais, por exemplo, sarcoidose, síndrome respiratória neonatal (RDS), displasia broncopulmonar (BPD), e condições caracterizadas por uma elevação na atividade de PLA2 sérica, tal como RDS de adulto (ARDS). Também foi publicado que células mastocitárias apresentam um papel na artrite. Os mastócitos estão aumentados nos tecidos sinoviais in- flamados de pacientes de RA e AO, e Gleevec tem mostrado causar apopto- se de mastócitos em explantes sinoviais e estudos de casos humanos mos- tram eficácia em pacientes de RA. Mastócitos têm papeis no choque séptico, pancreatite, doenças vasculares do colágeno, insuficiência renal aguda, peri- tonite, e uveíte auto-imune.

Estudos também sugerem que os mastócitos participam na pato- fisiologia de esclerose múltipla. Acredita-se que os mastócitos no cérebro liberem aminas vasoativas que podem causar desmielinização. A histamina liberada dos mastócitos pode alterar a integridade dos vasos sangüíneos e causar prejuízo parcial da barreia hemato-encafálica novamente implicado na etiologia da esclerose múltipla. Dessa forma, é contemplado que os mé- todos e composições da invenção são adequados para tratamento e melhora da morbidade associada com a esclerose múltipla.

c-Kit também é expresso em certas células não-imunes tais co- mo melanócitos e células intestinais assim como espermatócitos. A invenção pode ter utilidade no tratamento de melanoma e GIST e pode ter utilidade como um contraceptivo masculino. Administração e preparação de formulações farmacêuticas

Os agentes de ligação específica ou anticorpos anti-c-Kit usados na prática de um método da invenção podem ser formulados em composi- ções farmacêuticas que compreendem um veículo adequado para o método de liberação desejado. Veículos adequados incluem qualquer material que, quando combinados com o agente antagonista ou anticorpo de ligação es- pecífica anti-c-Kit e neutro, retêm a ligação de alta afinidade e potência em c-Kit e é não-reativo com os sistemas imunes do indivíduo. Exemplos inclu- em, mas não são limitados a qualquer um de vários veículos farmacêuticos usuais tais como soluções de salina tamponada com fosfato estéreis, águia bacteriostática, e similares. Uma variedade de veículos aquosos podem ser usados, por exemplo, água, água tamponada, salina a 04%, glicina a 0,3% e similares, e pode incluir outras proteínas para estabilidade aumentada, tais como albumina, lipoproteína, globulina, etc. submetidas a modificações quí- micas leves ou similares.

Concentrações de anticorpo exemplares na formulação podem variar de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 180 mg/ml ou de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, ou de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 25 mg/mL, ou alternativamente de cerca de 2 mg/mL a cerca de 10 mg/mL. Uma formulação do anticorpo pode ser preparada em uma solução com pH tamponado, por exemplo, em pH que varia de cerca 4,5 a cerca de 6,5, ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5, ou alternativamente cerca de 5,0. Exemplos de tampões que são adequados para um pH dentro desta faixa incluem ace- tato (por exemplo acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gliconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos. A concen- tração de tampão pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 200 mM, ou de cerca de 10 mM a cerca de 60 mM, dependendo por exemplo, do tampão e da isotonicidade desejada da formulação.

Um agente de tonicidade, que também pode estabilizar o anti- corpo, pode ser incluído na formulação. Agentes de tonicidade exemplares incluem polióis, tal como manitol, sacarose ou trealose. Preferivelmente a formulação aquosa é isotônica, embora soluções hipertônicas ou hipotônicas possam ser adequadas. Concentrações exemplares do poliol na formulação podem variar de cerca de 1% a cerca de 15% p/v.

Um tensoativo também pode ser adicionado à formulação de anticorpo para reduzir a agregação do anticorpo formulado e/ou minimizar a formação e particulados na formulação e/ou reduzir a absorção. Tensoativos exemplares incluem tensoativos não-iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbato 20, ou polissorbato 80) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). Concentrações exemplares de tensoativos podem variar de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, ou de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, ou alternativamente de cerca de 0,004% a cerca de 0,01% p/v.

Em uma modalidade, a formulação contém os agentes definidos acima (isto é, anticorpo, tampão, poliol, e tensoativo) e é essencialmente livre de um ou mais conservantes, tais como álcool benzílico, fenol, m-cresol, clorobutanol e Cl de benzetônio. Em outra modalidade, um conservante po- de ser incluído na formulação, por exemplo, em concentrações que variam de cerca de 0,1% a cerca de 2%, ou alternativamente de cerca de 0,5% a cerca de 1%. Um ou mais outros veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqueles descritos em Remington1S Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980) podem ser incluí- dos na formulação contando que eles não afetem adversamente as caracte- rísticas desejadas da formulação. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem agentes tamponantes adicionais; co-solventes; antio- xidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos de metal (por exemplo completos de Zn-proteína); políme- ros biodegradáveis tais como poliésteres/ e/ou contra-íons formadores de sal tal como sódio.

Formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para ar- mazenamento por misturar o anticorpo que tem o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis op- cionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido as- córbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzi- lamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benze- tônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); po- lipeptídeos de baixo peso molecular (menor do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; políme- ros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissa- carídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, maltose, ou dextri- nas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, mani- tol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; com- plexos de metal (por exemplo, complexos de proteína-Zn); e/ou tensoativos não-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

Em uma modalidade, uma formulação adequada da invenção reivindicada contém um tampão isotônico tal como um tampão de fosfato, acetato ou TRIS em combinação com um agente de tonicidade, tal como um poliol, sorbitol, sacarose ou cloreto de sódio que tonifica e estabiliza. Um exemplo de tal agente de tonicidade é sacarose ou sorbitol a 5%. Além dis- so, a formulação poderia incluir opcionalmente um tensoativo a fim de evitar agregação e para estabilização em 0,01 a 0,02% p/vol. O pH da formulação pode variar de 4,5 a 6,5 ou 4,5 a 5,5. Outras descrições exemplares de for- mulações farmacêuticas para anticorpos podem ser encontradas em US .2003/0113316 e patente US ns 6.171.586, cada uma incorporada aqui por referência na sua totalidade.

A formulação aqui contida também pode conter mais do que um composto ativo conforme necessário para o indicação particular sendo trata- da, preferivelmente aquelas com atividades complementares que não afetam adversamente uma a outra. Por exemplo, pode ser desejável fornecer adi- cionalmente um agente imunossupressor. Tais moléculas estão adequada- mente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos também podem ser encerrados em mi- crocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomos, mi- croesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington1S Pharma- ceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Suspensões e formas cristalinas de anticorpos também são con- templadas. Métodos para fazer suspensões e formas cristalinas são conhe- cidos do versado na técnica. As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. As composições da invenção podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem-conhecidas. Por exemplo, a esterilização é facilmente realizada por filtração através de membranas de filtração estéreis. As soluções resultantes podem ser embaladas para uso ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, a preparação Iiofilizada sen- do combinada com uma solução estéril antes da administração.

O processo de secagem por congelamento é freqüentemente empregado para estabilizar peptídeos para armazenamento em longo prazo, particularmente quando o polipeptídeo é relativamente instável em composi- ções líquidas. Um ciclo de liofilização é geralmente composto de três etapas: congelamento, secagem primária, e secagem secundária; Williams & Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volume 38, Número 2, pági- nas 48-59 (1984). Na etapa de congelamento, a solução é resfriada até que ela é adequadamente congelada. A massa de água na solução forma gelo neste estágio. O gelo sublima no estágio de secagem primário, que é condu- zido por reduzir a pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, usando vácuo. Finalmente, água absorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundário sob pressão reduzida da câmara e uma elevada temperatura. O processo produz um material conhecido como torta Iiofiliza- da. Após isso, a torta pode ser reconstituída antes de usar.

A prática de reconstituição comum para material Iiofilizado é adi- cionar de volta um volume de água pura (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes anti- bacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de fármacos para administração parenteral; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 18, Números 11 e 12, páginas 1311-1354(1992).

Excipientes foram observados em alguns casos agir como esta- bilizadores para produtos secos por congelamento; Carpenter et aí., Deve- Iopments in Biological Standardization, Volume 74, páginas 225-239 (1991). Por exemplo, excipientes conhecidos incluem polióis (incluindo manitol, sor- bitol, e glicerol); açúcares (incluindo glicose e sacarose); e aminoácidos (in- cluindo alanina, glicina e ácido glutâmico).

Além disso, polióis e açúcares, em particular dissacarídeos, são eficazes tanto em processos de secagem por congelamento quanto durante o armazenamento. Outras classes de moléculas, incluindo mono- e dissaca- rídeos e polímeros tais como PVP , também foram relatados como estabili- zadores de produtos liofilizados.

Para injeção, a formulação farmacêutica e/ou medicamento pode ser um pó adequado para reconstituição com uma solução apropriada como descrito acima. Exemplos destes incluem, mas não são limitados a, pós se- cos por congelamento, por secagem rotativa, ou pós secos por atomização, pós amorfos, grânulos, precipitados, ou particulados. Para injeção, as formu- lações podem conter opcionalmente estabilizantes, modificadores de pH, tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações destes.

Preparações para liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações para liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anti- corpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, fil- mes, ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada inclu- em poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou po- li(vinilálcool)), polilactídeos (Patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tal como Lupron De- pot™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático - ácido glicólico e acetato de leuprolídeo), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etileno- vinil acetato e ácido lático-ácido glicóli- co permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo tempo, eles podem des- naturar ou se agregar como um resultado de exposição a umidade a 37°C., resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser desenvolvidas para esta- bilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o meca- nismo de agregação é descoberto como sendo formação de ligação S—S intermolecular através de intercâmbio de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida por modificar resíduos de sulfidrila, liofilizá-los a partir de soluções ácidas, controlar o conteúdo de umidade, usar aditivos apropriados e desen- volver composições de matriz de polímero específicas.

As formulações da invenção podem ser projetadas para ser de atuação curta, de liberação longa, de atuação longa, ou de liberação susten- tada conforme descrito aqui, dessa forma, as formulações farmacêuticas também podem ser formuladas para liberação controlada ou para liberação lenta.

Dosagens específicas podem ser ajustadas dependendo das condições da doença, da idade, peso corporal condições de saúde geral, sexo, e dieta do indivíduo, intervalos de dose, vias de administração, taxa de excreção, e combinação de fármacos. Qualquer uma das formas de dosa- gem acima contendo quantidades eficazes estão bem dentro dos limites da experimentação de rotina e, portanto, bem dentro do escopo da presente invenção.

O agente de ligação específica ou anticorpo é administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e se desejado, para tratamento local, administra- ção intralesional. Infusões parenterais incluem administração intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Além disso, o agente de ligação específica ou anticorpo é adequadamente admi- nistrado por infusão de pulso, particularmente com doses decrescentes do agente de ligação específica ou anticorpo. Preferivelmente a dosagem é da- da por injeções, o mais preferivelmente, injeções intravenosas ou subcutâ- neas, dependendo em parte se a administração é rápida ou crônica. Outros métodos de administração são contemplados, incluindo administração tópi- ca, particularmente transdérmica, transmucosa, retal, oral ou local, por e- xemplo, através de um cateter colocado próximo ao local desejado. O mais preferivelmente, o agente de ligação específica ou anticorpo da invenção é administrado intravenosamente em uma solução fisiológica que varia em dose entre 0,01 mg/kg a 100 mg/kg em uma freqüência que varia desde dia- riamente ate semanalmente até mensalmente (por exemplo, todos os dias, a cada dois dias, a cada três dias, ou 2, 3, 4, 5, ou 6 vezes por semana) prefe- rivelmente uma dose que varia de 0,1 a 45 mg/kg, 0,1 a 15 mg/kg ou 0,1 a 10 mg/kg em uma freqüência de 2 ou 3 vezes por semana, ou até 45mg/kg uma vez por mês.

Administração com outros agentes

Os anticorpos da invenção também podem ser administrados concomitantemente com outros agentes terapêuticos antiinflamatórios. Ad- ministração concomitante inclui administração de dois agentes terapêuticos em momentos diferentes e em vias diferentes, contanto que haja alguma sobreposição no tempo durante o qual os agentes estão exercendo seus efeitos terapêuticos. Agentes anti-c-Kit exemplares conhecidos na técnica incluem Mesilato de Imatinibe (GleevecD). Deve ser observado que o Mesi- Iato de Imatinibe também antagoniza a sinalização da tirosina quinase Abl e, portanto não é um inibidor específico de c-Kit. EXEMPLOS Humanizacão de SR-1

SR-1 foi humanizado por um enxerto de CDR direto, surpreen- dentemente sem mutações reversas necessárias para manter a afinidade apesar de que ainda não foi demonstrada a atividade funcional desejada. Os estruturas humanos que mantiveram a maioria dos resíduos canônicos e não introduziram resíduos de prolina adicionais, foram escolhidos como seqüên- cias aceptoras. Baseado nesses critérios, a seqüência aceptora da cadeia pesada era VH1 1-46 para o estrutura I e Il e VH1 1-e para o estrutura III, com JH4 como a região J mais próxima (também conhecida com estrutura IV). A seqüência aceptora da cadeia leve era a seqüência da linhagem ger- minativa VK4 B3 com JK2 como a região J mais próxima.

A troca de classe de isotipo foi feita para produzir lgG2, IgGI, lgG4P e formas de IgGI aglicosiladas do anticorpo humanizado. O sítio de glicosilação consenso N-Iigado foi removido da seqüência da região constan- te de IgGI humana pela mutação de um único resíduo de asparagina para ácido glutâmico na posição 297 (numeração de Kabat).

O SR-1 humanizado na forma de IgGI aglicosilada (hSR-1 algG1) se liga da maneira desejada com maior afinidade por c-Kit de mem- brana comparado a c-kit solúvel e é um antagonista neutro altamente poten- te de SCF e não media agonismo de c-Kit diretamente em todos os ensaios baseados em célula testados, usando leituras proximais e distais de sinali- zação de c-Kit. O isotipo de IgGI aglicosilado foi escolhido para evitar a fun- ção efetora e morte celular através de efeitos não-participantes. Esse anti- corpo mostrou uma meia-vida inesperada e desejada, PK não linear e elimi- nação de anticorpo mediada por alvo saturável em macacos. Ele também depletou mastócitos in vivo como esperado. Ligação ao Dímero de c-Kit

A ativação de c-Kit por ligação pelo fator de célula-tronco (SCF) leva a dimerização/oligomerização, autofosforilação e internalização do re- ceptor, o mais provavelmente através de uma via dependente de clatrina. O anticorpo monoclonal SR-1 se liga ao dímero de c-Kit com afinidade 1000 vezes maior comparada ao monômero do domínio extracelular de c-Kit solú- vel conforme determinado por Biacore. A modelagem cinética sugere que SR-1 se ligaria preferencialmente ao receptor nativo associado à membrana mesmo na presença de ng/ml do monômero de receptor do solúvel livre.

Carboidratos presentes em uma glicoproteína podem influenciar as propriedades biológicas e funcionais. A humanização de SR-1 para uma forma de IgGI aglicosilada mostrou que os parâmetros de ligação foram conservados. SR-1 algG1 humanizado ligou-se ao Fc do receptor c-Kit re- combinante com um Kd de ligação de equilíbrio de KinExA de 1,0 pM e u- sando o ensaio Biacore, hSR-1 algG1 bloqueou a ligação do fator de célula- tronco (SCF) com um Ki = 70 pM. hSR-1 algG1 se liga com uma alta afini- dade ao dímero do receptor versus o monômero. Esta é uma característica importante não prevista para ser traduzida com certeza com a humanização e, como o monômero solúvel de c-Kit, é menos provável que aja como um destino para o anticorpo in vivo.

Inibicão da Sobrevivência Celular Dependentes de c-Kit e da Sinalização de Receptor

A linhagem celular megacarioblástica humana UT-7 é dependen- te de SCF para sobrevivência e a remoção de SCF ou sua inibição resulta em rápida perda de viabilidade e proliferação diminuída. Esse ensaio é ade- quado para determinação da IC50 da potência de antagonistas de SCF. hSR-1 algG1 exibiu uma IC50 média de 35 pM.

hSR-1 algG1 inibiu de forma potente a fosforilação de c-Kit me- diada por SCF e a internalização em células M07e, indicando que o anticor- po pode bloquear eventos de sinalização de c-Kit mediados por SCF. Em contraste aos achados de SR-1 sendo capaz de mediar intrinsecamente a internalização e fosforilação de c-Kit, surpreendentemente, nenhuma evi- dência de agonismo foi detectada na leitura da fosforilação próxima ao re- ceptor c-Kit de M07e para hSR-1 algG1. Notavelmente, lgG2 de hSR-1, o anticorpo lgG2, foi levemente menos potente e não inibiu completamente a internalização do receptor c-Kit mediada por SCF.

hSR-1 IgGI mostra neutralização com 1,0 ug/ml do efeito sinér- gico de SCF sobre a formação de colônia de derivada de GM-CSF usando de células de medula óssea primárias CD34+, CD117+ (c-Kit) humanas iso- ladas. De forma consistente com nosso novo achado, hSR-1 algG1 não me- diou a internalização e fosforilação de c-Kit e nenhuma atividade de sobrevi- vência agonista intrínseca de hSR-1 algG1 foi observada até a concentração de 10 ug/ml do anticorpo nesse ensaio. De fato, o anticorpo foi capaz de ini- bir a sobrevivência abaixo da linha de base.

Ausência de Agregação de Mastócito, Atividade de CDC e FcR

Mastócitos humanos cultivados derivados de células CD34+ de medula óssea foram usados para avaliar a potência aparente e classificação de compostos. hSR-1 algG1 inibiu a sobrevivência de mastócito dependente de SCF, não conferiu sinal de sobrevivência para mastócitos, não mediou a fosforilação do receptor c-Kit (Figura 3) e não mostrou habilidade para medi- ar a agregação de mastócito homotípico. Em contraste, hSR-1 algG2 foi ca- paz de bloquear a sobrevivência de mastócito-SCF, mas ele próprio mostrou atividade agonista parcial conferindo um sinal de sobrevivência, mediando a fosforilação do receptor c-Kit e resultou em um efeito reprodutível sobre a agregação de mastócitos. Nenhuma anormalidade inesperada foi observada para hSR-1 algG1 quando este anticorpo foi administrado in vivo em dose de até 30 mg/kg uma vez por semana por 4 semanas ou até ou até 150 mg/kg subcutaneamente uma vez por semana por 2 semanas em primatas não- humanos.

hSR-1 algG1 não mostra ligação a FcR inespecífica detectável em células U-937 que expressam o receptor Fcy I = CD64, receptor Fcy Il = CD32 e receptor Fcy Ill = CD16. Em contraste, a ligação de isotipos IgGI e lgG4P de SR-1 foi detectada supostamente a FcyRI de alta afinidade. Por- tanto, nenhuma atividade de ADCC é prevista para hSR-1 algGIe os dados experimentais não mostram morte celular por citotoxicidade dependente de complemento. Anticorpos IgGI de camundongo/humano quiméricos aglicosi- Iados foram relatados como retendo alguma função efetora (Hybridoma. 1991 Abr; 10(2):211-7) e então estas atividades desejadas de hSR-1 algG1 não são esperadas. Os dados mostram que a aplicação de metodologias padronizadas e, portanto, a escolha de isotipos lgG2 ou IgGI ou lgG4 típicos pode não gerar uma molécula com as características apropriadas, que seja um Iigante de alta afinidade, um antagonista neutro funcional em c-Kit e que não ativaria mastócitos.

Farmacocinética

Um estudo de PK preliminar foi conduzido para comparar a PK de hSR-1 lgG2 e de hSR-1 IgGI em macacos cinomolgos machos após uma única administração IV ou SC a 3 mg/kg. Os perfis de tempo indicaram uma pK não-linear para ambos. As concentrações diminuíram mais rapidamente em concentrações mais baixas. Os dois anticorpos mostraram exposições similares, conforme medido pela C0ZCmax e AUC0-tiast após uma única admi- nistração IV ou SC em macacos cinomolgos. Baseado no AUC0-tiast a depu- ração sérica foi aproximadamente < 0,3 ml/h/kg para ambos os anticorpos humanizados. A biodisponibilidade foi de aproximadamente 82% e 69% para as versões humanizadas de SR-1, hSR-1 lgG2 e hSR-1 IgGI, respectiva- mente, após administração SC.

Baseado nos dados de exposição preliminares de SR-1 e anti- corpos humanizados em macacos verdes africanos após administração re- petida uma vez por semana, os anticorpos humanizados obtiveram exposi- ções maiores comparados com SR-1. Notavelmente, hSR-1 algG1 mostrou- se igualmente melhor em PK de grupo e foi demonstrado previamente que o grau de glicosilação de uma molécula pode alterar suas propriedades farma- cocinéticas e, no caso de um anticorpo, seu metabolismo e outras proprie- dades biológicas. Câncer Immunol Immunother. 1992;35(3): 165-74. Tabela 1. Estimativas de Parâmetros Farmacocinéticos Após uma Única Administração IV ou SC de hSR-1 lgG2 ou hSR-1 algG1 a 3 mg/kg em Ma- cacos Cinomolgos Machos

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Co = concentração inicial estimada após administração IV Cmax = concentração máxima após administração SC

Tmax = tempo de Cmax

AUCo-tiast= área sob a curva concentração-tempo a partir do tem- po O até o último ponto de tempo com uma concentração quantificável

CL= depuração após administração IV; CLVF= depuração apa- rente após administração SC

F%= % de biodisponibilidade a depuração calculada com base em AUCo-tiast - não aplicável

Co, Cmaxi AUC0-(Iast), CL, CL/F e F% referem-se a 3 Figuras signi-

ficativas.

Projeções para Administração Humana

A dose mínima eficaz no modelo de PD em lesão de expansão de mastócito é de < 0,3 mg/kg administrados uma vez por semana por 2 semanas em macacos. Baseado na conversão da dose baseada na área da superfície corporal, a dose mínima eficaz em seres humanos é projetada como sendo < 0,1 mg/kg com um regime de dosagem equivalente. Entretan- to, essa é uma estimativa preliminar já que a PK e a relação farmacodinâmi- ca entre o grau e a duração da inibição de c-Kit em humano por hSR-1 algG1 e os pontos finais clínicos são desconhecidos no momento. Uma projeção mais exata será feita quando mais dados farma- cocinéticos e farmacodinâmicos estiverem disponíveis. Potência in vivo: Deplecão de Mastócitos Basais do Pulmão e Colo em Ma- caco com SR-1 e hSR-1 alqG1

Em seres humanos, mastócitos MCt que expressam triptase e não têm quimase estão localizados primariamente em tecidos mucosos tais como pulmão e cólon e esse subtipo foi detectado na pele e em níveis mais elevados em alguns pacientes com esclerodermia, sugerindo possível ativa- ção alternativa de mastócitos nessa condição. Os mastócitos MCtc que ex- pressam triptase e quimase também estão co-localizados em alguns desses tecidos e, similarmente, tem sido associados com esclerodermia e outras condições fibróticas. Portanto, ambos os subtipos podem representar os al- vos primários para um inibidor de c-Kit em doenças que envolvem tecidos mucosos e conjuntivos (por exemplo, IPF, SSc, asma, RA e IBD). A terapêu- tica também precisaria ser altamente potente, eficaz e ter um bom volume de distribuição e PK, já que mastócitos tem geralmente vida longa e são resi- dentes no tecido. Além disso, mastócitos são altamente quiescentes até se- rem ativados para desgranular e sintetizar os mediadores de novo, quando então eles desempenham um papel chave na resposta inflamatória.

Os objetivos para os estudos in vivo foram demonstrar a deple- ção de mastócitos da mucosa basal e tecido conjuntivo tal como os presen- tes no pulmão e no cólon e determinar os efeitos sobre a hematopoiese e os efeitos sobre células precursoras assim como um impacto sobre a eritropoi- ese, melanogênese e espermatogênese (portanto utilidade na contracepção masculina) após alta inibição fracionada e mantida de c-Kit. O anticorpo mo- noclonal SR-1 foi selecionado com base na sua potência funcional equiva- lente em c-Kit humano e de macaco no ensaio CFU de célula de medula ós- sea CD34+ (inibição em 1,0 ug/ml) e em sua PK em macaco.

SR-1 foi administrado em doses que variaram entre 3 mg/kg a 30 mg/kg uma vez por semana por 4 semanas. Em estudos periódicos, foi mostrado que os mastócitos basais do cólon estavam maximamente deple- tados após 2 doses no dia 14 (Ctr0ugh > 800 vezes a IC50 da célula) e, assim, o dia 14 foi escolhido como o ponto de tempo para determinar a atividade farmacológica de antagonistas de c-Kit sobre mastócitos basais do cólon. Por razões práticas, os mastócitos basais pulmonares foram avaliados no dia 28 no momento da necropsia e finalização do estudo.

Em uma dose de 3,0 mg/kg de SR-1 administrada uma vez por semana, a depleção de mastócitos basais pulmonares foi observada em um nível de Ctr0Ugh PK de > 200 vezes a IC50 celular de UT-7. Os efeitos de do- ses menores de SR-1 sobre mastócitos basais do cólon e pulmão, melano- gênese e espermatogênese não foram avaliados.

Entretanto, um estudo de dose mais baixa de hSR-1 algG1 foi realizado em 0,3, 1,0 e 3,0 mg/kg. Os níveis de Ctr0ugh no dia 14 foram >200, >2000 e >8000 vezes a IC50 da célula e esses níveis de Ctr0Ugh correspon- dem a ineficácia, quase semidepleção (69%) e quase depleção total (96%) dos mastócitos basais do cólon (resumido na Tabela 1). A relação entre ex- posição, potência celular e efeito para hSR-1 algG1 está em correspondên- cia com os achados de SR-1 relatados.

Eficácia In vivoàe SR-1 e hSR-1 alqG1 no Modelo Farmacodinâmico de Le- são de Expansão de Mastócito em Macaco

A lesão da pele é seguida por uma resposta inflamatória robusta, na qual primeiro os neutrófilos e então os macrófagos e mastócitos migram dos tecidos próximos e da circulação, granulação e reepitelização de tecidos e contração associada aos fibroblastos dos tecidos conjuntivos subjacentes à lesão (Diegelmann RF, et ai, Front Biosci. 2004, Jan l;9:283-9). A lesão cutânea é um modelo para estudar mecanismos que podem ser relevantes na fibrose já que os vários tipos celulares envolvidos estão associados com essa doença. Além disso, ela foi relatada em seres humanos estando asso- ciada com um aumento de SCF derivado de fibroblasto e ativação e densi- dade aumentada de mastócitos (Trautmann A, et al, J. Pathol. 2000, Jan; 190(1): 100-6). Após a lesão cutânea em macaco, o número de mastóci- tos aumenta de uma maneira dependente do tempo com um platô que é al- cançado 14 dias após a lesão, o qual é comparável com o paradigma huma- no. Doses de 0,3, 1 ou 3 mg/kg de SR-1 administradas uma vez por semana levaram a inibição quase máxima da expansão de mastócitos ativa- da pela lesão no dia 14 (Figura 1). A inibição máxima é definida como a ha- bilidade de bloquear em 100% o aumento de mastócitos além do número da linha de base no dia 14 após a lesão. Os níveis de Ctr0ugh para a dose de 3 mpk foram > 7 vezes a IC50 de UT-7 no Dia 14 (Tabela 2). Com 3 semanas, os níveis séricos eram cerca de 2 vezes a IC50 de UT-7 e nessa exposição foi observada apenas inibição parcial (Fig. 1). Com 3 semanas, a eficácia máxima ainda foi observada para ambas as coortes de 1 e 3 mg/kg, onde os níveis séricos de Ctr0ugh estavam mantidos em >200 vezes a IC50. Esses estudos sugerem que uma exposição de Ctr0Ugh mantida de >7 vezes a con- centração de IC50 é provavelmente necessária para a inibição máxima de mastócitos expandidos por lesão.

Doses de 0,3, 1,0 e 3,0 mg/kg de hSR-1 algG1 foram avaliadas com base na eficácia máxima mostrada por SR-1 nesse modelo. Na dose mais baixa testada (0,3 mg/kg) a inibição máxima da expansão induzida por lesão de mastócitos foi observada dentro de 2 semanas. Os níveis séricos de Ctrough neste momento foram > 200 vezes a IC50 de UT-7 (Tabela 2).

A Tabela 2 resume os efeitos de PD/PK de SR-1 e hSR-1 algG1 no modelo de PD de lesão.

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Uma lesão incisional foi feita seguida de biópsia por punção até o dia 21 em primata humano (lado esquerdo) ou primata não humano (lado direito) (Figura 2). Os mastócitos e/ou fibroblastos que expressam SCF fo- ram revelados por coloração cromogênica ou IHC respectivamente. Em hu- mano, a expressão de SCF aumenta e retorna para a linha de base e é tem- poralmente seguida por um aumento transitório no número de mastócitos durante a cicatrização normal da lesão. Uma resposta similar de mastócitos à lesão é observada em macaco. Durante a fibrose e cicatrização aberrante da lesão, a expressão de SCF e o número de mastócitos permanecem ele- vados (Figura 2). hematopoiese e melanogênese A genética do camundongo mostra que c-Kit desempenha um papel na hematopoiese durante o desenvolvimento embrionário, mas em ser humano, as mutações de c-Kit inativadoras e/ou de perda da função hetero- zigotas em indivíduos Piebald não estão ligadas a anormalidades hematoló- gicas. SCF e c-Kit são importantes na hematopoiese humana já que SCF é usado em combinação com G-CSF para mobilização de célula-tronco hema- topoiética. Além disso, o inibidor de múltiplas quinases, Gleevec, o qual atin- ge primariamente BCR-ABL, PDGFR e c-Kit, tem como seu efeito farmaco- lógico primário a mielossupressão, e anemias severas graus 3 a 4 e trombo- citopenias tem sido relatadas em pacientes com GIST (Hensley ML, et ai, Semin. Hematol. 2003, Abr; 40(2 Supl 2):21 -5).

A genética do camundongo indica que c-Kit desempenha um papel na migração de melanoblastos da crista neural durante a embriogêne- se e esse papel é sustentado no Piebaldismo humano. Gleevec foi relatado como causador de despigmentação "em bandas" no cabelo em um pequeno número de pacientes com GIST, mas esse não foi um achado consistente e hiperpigmentação também foi relatada. A contribuição de outras quinases, tais como PDGF, não pode ser excluída. Estudos em camundongos com inibidores de múltiplas quinases e um anticorpo para c-Kit mostram que a inibição da pigmentação do pêlo é totalmente reversível sugerindo que a ini- bição de c-Kit afeta a função do melanócito e não a sobrevivência no ambi- ente pós-natal (Moss etal, 2003).

SR-1 foi usado em estudos com doses que variavam entre 3 a .30 mg/kg administradas uma vez por semana por 4 semanas para determi- nar as exposições necessárias para inibir a hematopoiese, espermatogêne- se e melanogênese ativa. Um painel de sangue total incluindo células dife- renciadas foi realizado em amostras de sangue retiradas na linha de base, dia 4, 7, 14, 21 e 28 após o início do estudo. A análise de amostras de san- gue recentemente isoladas foi realizada no laboratório do Queen Elizabeth Hospital Clinicai Hematology, Barbados.

Nenhum impacto significativo de SR-1 comparado com indiví- duos de controle e valores basais foi detectado sobre qualquer parâmetro hematológico analisado, embora houvesse diminuições não significativas em RBCs em animais tratados com fármaco 4 semanas após o início da admi- nistração. Na maior dose testada, 30 mg/kg uma vez por semana por 4 se- manas, níveis de exposição de potência >70.000 vezes a IC50 de UT-7 fo- ram obtidos. Ausência de um efeito significativo sobre parâmetros hematoló- gicos foi confirmada pela análise histopatológica da medula óssea, não mos- trando diferença entre coortes tratadas com fármaco e de controle e nenhu- ma depleção de células-tronco hematopoiéticas positivas para CD117, suge- rindo potências vias redundantes para hematopoiese na espécie NHP de macaco verde africano. O efeito de 3-30 mpk administrados uma vez por semana por 4 semanas sobre a melanogênese também foi examinado, já que poderia ter utilidade no melanoma. Para avaliar os efeitos sobre mela- nócitos ativados que podem refletir melhor um estado de doença, o pêlo foi depilado para ativar a melanogênese. A cor normal do pêlo da pele do ani- mal não foi visivelmente afetada em nenhuma coorte. Entretanto, a inibição da pigmentação do pêlo em graus variáveis foi observada em pêlo crescido recentemente em macacos que receberam a dose de 30 mg/kg. Nenhum efeito foi observado na coorte de 10 mg/kg sugerindo que nenhuma dose com efeito se encontra entre 10 a 30 mg/kg. Na coorte de 10 mg/kg, as ex- posições de SR-1 foram > 8000 vezes a IC50 de UT-7. A eficácia máxima para a depleção de mastócito foi obtida em > 7 vezes a IC50 de UT-7. Esses dados sugerem que a inibição de c-Kit afeta a função do melanócito e que doses/exposições maiores podem ser necessárias para o bloqueio em doen- ças caracterizadas pela atividade excessiva do melanócito. Espermatogênese

Estudos em camundongos mostraram que c-Kit é importante para a manutenção e proliferação de espermatogônia diferenciada positiva para receptor c-Kit mas não para a etapa inicial de diferenciação celular da espermatogônia. Ambos os indivíduos Piebald macho e fêmea que são hete- rozigotos para um alelo do receptor c-Kit inativo são férteis sugerindo que esse grau de inativação de c-Kit não parece afetar o desenvolvimento da célula germinativa primordial, espermatogênese ou oogênese. SR-1 mostrou inibição dose-dependente da espermatogênese de 0,3 a 30 mg/kg. A dose de 0,3 mg/kg uma vez por semana é menor do que o efeito máximo observado nas doses mais elevadas e estudos com uma variação de doses menores são necessários para definir a ED50. As exposições obtidas são 7 vezes a IC50 de UT-7 que é a exposição necessá- ria para a eficácia máxima da expansão de mastócito no modelo de lesão. A extrapolação de PK sugeriu que o anticorpo pode provavelmente desapare- cer 1 mês após a última dose, mas 9 meses foi selecionado como um ponto de tempo conservador para avaliar a recuperação. Espermatogênese normal foi encontrada em todos os animais tratados aos 9 meses, demonstrando que o uso de uma molécula similar a hSR-1 algG1 é útil como um contracep- tivo masculino. Sumário

Anticorpo humanizado IgGI anti-c-Kit aglicosilado (hSR-1 algGI) é um anticorpo altamente potente e específico que é neutralizante em todos os ensaios baseados em célula testados usando leituras proximais e distais de sinalização de c-Kit. Intrinsecamente, ele não media a internalização ou fosforilação de receptor c-Kit como relatado para o anticorpo monoclonal parental SR-1 de murino. A seleção do isotipo IgGI aglicosilado sobre os isotipos IgGI, lgG2 e lgG4 humanizados não foi prevista com base em abor- dagens usuais. hSR-1 algGI foi escolhido empiricamente através de nova experimentação para mostrar que ele exibia as características farmacológi- cas apropriadas no receptor c-Kit de membrana, evitando atividade agonista em c-Kit e sobre mastócitos, não tendo função efetora e de morte celular através de efeitos não participativos. Esse anticorpo mostrou boa biodispo- nibilidade s.c. e meia-vida, PK não linear e eliminação do anticorpo mediada por alvo saturável e depleção de mastócitos em macacos. Esses dados po- deriam prever uma dose eficaz adequada para depletar mastócito humano.

A dose eficaz mínima de SR-1 monoclonal parental de camun- dongo no modelo de PD de lesão de macaco é < 0,3 mg/kg (Ctr0Ugh > 7 vezes a IC50 da célula), e em exposição levemente maior (Ctr0Ugh > 800 vezes a IC50 da célula) foi eficaz também em depletar mastócitos basais da pele, cólon e pulmão. Similarmente, níveis de exposição maiores do que >8000 vezes a IC50 da célula são necessários antes que impactos qualitativos so- bre a pigmentação capilar em pêlo crescido recentemente possam ser ob- servados. A inibição da pigmentação capilar em pêlo crescido recentemente foi relatada com inibidores de múltiplas quinases e um anticorpo de c-Kit em roedores e hSR-1 algG1 pode ter utilidade em doenças associadas com ati- vidade excessiva do melanócito.

O efeito é reversível após cessado o tratamento. Um efeito sub- máximo sobre a inibição da espermatogênese foi mostrado em níveis > 7 vezes a IC50 da célula, a exposição que confere eficácia máxima no modelo de PD de lesão.

Todas as patentes U.S., publicações de pedidos de patente U.S, pedidos de patente, patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações não- patentes referidas acima nesta especificação e/ou lista- das na Folha de Rosto do Pedido, estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

A partir do disposto acima, será observado que, embora modali- dades específicas da invenção tenham sido descritas aqui para fins de ilus- tração, várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Amgen Inc.

<120> ANTICORPO HtIMANIZADO PARA C-KIT

<130> A-1126-WO-PCT

<150> 60794771

<151> 2006-04-24

<160> 10

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg tgcctacggg 60

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120

atcaactgca gagccagtga aagtgttgat atttatggca atagttttat gcactggtac 180

cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacc ttgcatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 300

agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtac 360

acgttcggag gtgggaccaa ggtggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga 717 <210> 2 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Xle Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 3

<211> 1401

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 3

atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggcagtgg ccccaggtgc ccactcccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggatacac cttcaccagt tacaatatgc actgggtgcg ccaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggagttatt tattcaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca aaggcagggt caccattacc gctgacaaat ccaccagcac agcctacatg 300

gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagagggat 360

actcgttttg gtaactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctctagtgc ctccaccaag 420

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480

10 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtaccagag cacgtaccgt 960

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380

tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 4 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens ＜400＞ 4

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Val Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Xle Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Thr Arg Phe Gly Asn Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg .305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp .385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys .465

<210> 5

<211> 1389

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggcagtgg ccccaggtgc ccactcccag gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120

tgcaaggctt ctggatacac cttcaccagt tacaatatgc actgggtgcg ccaggcccct 180

ggacaagggc ttgagtggat gggagttatt tattcaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca aaggcagggt caccattacc gctgacaaat ccaccagcac agcctacatg 300

gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagagggat 360

actcgttttg gtaactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctctagtgc ctccaccaag 420

ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 480

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540

gctctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660

gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc 720

gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 840

gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900

aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc 960

ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020

aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa 1080

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140

acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200

cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260

ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380

ggtaaatga 1389

<210> 6

<211> 462

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

.1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Val Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn .65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Thr Arg Phe Gly Asn Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala .145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val .225 230 235 240

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val .305 310 315 320

Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly .385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 7

<211> 717

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

aacattgtgt tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggct gagggccacc 120

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat atttatggca atagttttat gcactggtac 180

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 300 75

cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtac 3 60 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 42 0 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttga 717

<210> 8

<211> 238

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trr ''^1 Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 15

Gly Ser Thr Gly Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30

Val Ser Leu Gly Leu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 76

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 173 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235

<210> 9

<211> 1401

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

atgggatgga gttgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtgcaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

ggacagggcc tggaatggat tggagttatt tattcaggaa atggtgatac ttcctacaat 240

cagaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caaatcaaca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag agagagggat 360

actcgttttg gtaactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacaaca 420

gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc ctcggtgact 480

ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct gagccagtga ccttgacctg gaactctgga 540

tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacaccctc 600

agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc tggcccagcc agtccatcac ctgcaatgtg 660

gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg gcccacaatc 720

aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc 780

atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt 840

gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac 900

gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg 960

gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc 1020 aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg 1080 tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa 1140 caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg 1200 accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat 1260 ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat 1320 agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc 1380 tcccggactc cgggtaaatg a 1401

<210> 10

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly .1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Ser Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

.65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Ile Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Thr Arg Phe Gly Asn Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val

130 135 140

Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr

.145 150 155 160 78

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser

195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

210 215 220

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 225 230 235 240

Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile

260 265 270

Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp

275 280 285

Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His

290 295 300

Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 305 310 315 320

Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys

325 330 335

Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu

370 375 380

Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 385 390 395 400

Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu

420 425 430

Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His

435 440 445

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro

450 455 460

Gly Lys

465

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Agente de ligação que se liga especificamente a c-Kit e que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à se- qüência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 2.

2. Agente de ligação da reivindicação 1, que compreende uma seqüência de aminoácido 95% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido da região variável descrita em SEQ ID NO: 2.

3. Agente de ligação da reivindicação 1, que compreende uma seqüência de aminoácido 98% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido da região variável descrita em SEQ ID NO: 2.

4. Agente de ligação da reivindicação 1, ainda compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.

5. Agente de ligação da reivindicação 1, com pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa na região de determinação de com- plementaridade em que a afinidade do agente de ligação ao c-Kit é mantida.

6. Agente de ligação da reivindicação 5, em que há uma substi- tuição de aminoácido conservativa.

7. Agente de ligação que se liga especificamente a c-Kit e que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à se- qüência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 4.

8. Agente de ligação da reivindicação 7, que compreende uma seqüência de aminoácido 95% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido da região variável descrita em SEQ ID NO: 4.

9. Agente de ligação da reivindicação 7, que compreende uma seqüência de aminoácido 98% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido da região variável descrita em SEQ ID NO: 4.

10. Agente de ligação da reivindicação 7, ainda compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

11. Agente de ligação da reivindicação 7, com pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa na região de determinação de com- plementaridade em que a afinidade do agente de ligação ao c-Kit é mantida.

12. Agente de ligação da reivindicação 11, em que há uma subs- tituição de aminoácido conservativa.

13. Agente de ligação que se liga especificamente a c-Kit e que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à se- qüência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 6.

14. Agente de ligação da reivindicação 13, que compreende uma seqüência de aminoácido 95% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido da região variável descrita em SEQ ID NO: 6.

15.Agente de ligação da reivindicação 13, que compreende uma seqüência de aminoácido 98% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido da região variável descrita em SEQ ID NO: 6.

16.Agente de ligação da reivindicação 13, ainda compreenden- do a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

17.Agente de ligação da reivindicação 13, com pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa na região de determinação de com- plementaridade em que a afinidade do agente de ligação ao c-Kit é mantida.

18.Agente de ligação da reivindicação 17, em que há uma subs- tituição de aminoácido conservativa.

19.Agente de ligação de qualquer uma das reivindicações 1 a .18, que exibe uma um kd de avidez por c-Kit de menos do que 10~2, como determinado por análise de ressonância de plasma de superfície.

20.Seqüência de ácido nucléico que codifica um agente de liga- ção específica que se liga a c-Kit compreendendo uma seqüência de amino- ácido pelo menos 80% idêntica a uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 2, 4 ou 6.

21. Ácido nucléico que compreende uma seqüência de ácido nucléico pelo menos 90% idêntica a um ácido nucléico selecionado do grupo que descrito em SEQ ID NOS: 1, 3, ou 5.

22. Vetor que compreende o ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 20-21.

23. Célula hospedeira que compreende o vetor como definido na reivindicação 22.

24. Método de produzir um agente de ligação específica a c-Kit 3 que compreende cultivar uma célula hospedeira como definida na reivindica- ção 23 para que o ácido nucléico seja expresso para produzir o agente de ligação específica.

25.Método como definido na reivindicação 24, ainda compreen- dendo a uma etapa de recuperar o agente de ligação específica da cultura de célula hospedeira.

26.Método de reduzir ou tratar fibrose, inflamação, auto- imunidade ou câncer ou outras doenças e distúrbios relacionadas ao c-Kit em um indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um anticorpo de c-Kit ao indivíduo.

27.Método da reivindicação 26, em que distúrbio ou doença é fibrose.

28.Método da reivindicação 26, em que o anticorpo antagonista é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia única, ou um fragmento de anticorpo.

29.Método da reivindicação 28, em que o agente de ligação ao peptídeo ou polipeptídeo, o receptor solúvel ou o receptor de heterodímero solúvel ainda compreende um domínio Fc.

30.Método da reivindicação 27, em que o distúrbio fibrótico é selecionado do grupo que consiste em esclerodermia, doença pulmonar in- tersticial, fibrose pulmonar idiopática, fibrose que surge de hepatite B ou C crônica, fibrose induzida por radiação, e fibrose que surge de cura de feri- das.

31.Método da reivindicação 30, ainda compreendendo adminis- trar um segundo antagonista para uma citocina pró-fibrótica, em que a cito- cina é selecionada dentre fator de crescimento transformante β (TGF-β), in- terleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-9 (IL-9), interleucina-13 (IL-13), fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1 β), fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), interleucina-6 (IL-6), oncostatina M (OSM), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), proteína quimio- tática de monócitos 1 (CCL2/MCP-1), e quimiocina pulmonar e regulada por 4 ativação (CCL18/PARC).

32. Composição farmacêutica para reduzir ou prevenir fibrose em um indivíduo que sofre de um distúrbio fibrótico compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição como definida na reivindicação 1.