KR102119187B1 - 줄기 세포 인자 억제제 - Google Patents
줄기 세포 인자 억제제 Download PDFInfo
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Abstract
줄기 세포 인자의 억제제들과 관련된 방법들, 조성물들 및 용도를 본 명세서에서 제시한다. 예를 들자면, 섬유증 및 조직 재건 질환들의 치료용 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체들과 방법들이 본 명세서에서 제시된다.
Description
본 출원은 2011년 1월 10일자로 제출된 미국 특허 출원 번호 61/431,246를 우선권으로 주장하며, 모든 목적을 위하여 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
연방차원에서 지원을 받은 연구 또는 개발에 대한 진술
본 발명은 National Institutes of Health에서 수여하는 HL059178하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 이 발명에 대해 특정 권리를 소유한다.
발명의 분야
줄기 세포 인자의 억제제들에 관련된 방법들, 조성물들 및 용도들이 본 명세서에서 제시된다. 예를 들자면, 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체들과 섬유증(fibrotic) 질환 및 조직 재건(remodeling) 질환들을 치료하는 방법들이 본 명세서에서 제시된다.
조직 재건 및 섬유증이 관련된 질환들은 전세계적으로 주요 사망 원인이다. 서방 세계에서 모든 자연사의 거의 45%는 일부 유형의 만성 섬유증식성 질환들로 인한 것이며, 관련된 건강관리 비용은 수십억불이다. 조직 재건은 기존 조직들의 재편 또는 회복(renovation)이며, 이는 조직의 특징들(가령, 혈관 재건)을 변화시키거나 또는 조직의 동적 평형을 확립하는데(가령, 뼈 재건) 참여할 수 있다. 섬유증은 장기 또는 조직의 정상적인 구성분으로 섬유성 조직이 형성되는 것과는 반대로, 장기 또는 조직에서 수리 또는 반응 과정으로 과도한 결합 조직의 형성 또는 발달되는 것이다. 섬유증은 거의 모든 조직들과 장기 체계들에 영향을 주며, 그리고 섬유증 조직 재건은 암 전이에 영향을 줄 수 있고, 그리고 이식 수령인들에서 만성적 이식 거부를 가속화시킬 수 있다. 섬유증이 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)의 주요 원인이 되는 질환들은 다른 것들중에서 간질성 폐 질환들, 간경변, 신장 질환들, 심장 질환들, 그리고 전신 경화증을 포함한다.
줄기 세포 인자 (SCF) 및 이의 수용체 c-Kit는 섬유증 및 조직 재건 질환들 (El-Koraie, et al., Kidney Int. 60: 167 (2001); Powell, et al., Am. J. Physiol. 289: G2 (2005); El Kossi, et al., Am. J. Kidney Dis. 41: 785 (2003); Powell, et al., Am. J. Physiol. 277: C183 (1999))에 연루되어 있다. c-Kit는 많은 세포 유형들에서 존재하는 유형 III 수용체-티로신 키나제다(Orr-Urtreger et al., Development 109: 911 (1990)). 이것은 분화의 초기 단계에서 또한 발현되며(Andre et al., Oncogene 4: 1047 (1989)) 그리고 특정 종양들은 c-kit의 상승된 발현을 나타낸다. SCF는 c-Kit 수용체 키나제에 특이적인 리간드다. 결합은 c-Kit의 이합체화(dimerization) 및 이의 키나제 활성의 활성화를 야기시킨다. SCF는 뮤린 섬유아세포들의 상청액으로부터 처음으로 단리되었다. 그 당시, SCF는 비만 세포 성장 인자 (MGF)(Williams et al., Cell 63: 167 (1990)) 또는 조혈성 성장 인자 KL (Kit 리간드) (Huang et al., Cell 63: 225 (1990))로 불리었다. 상동체는 쥐의 간 세포들과 지정된 줄기 세포 인자 (SCF)로부터 후속적으로 단리되었다(Zsebo et al., 세포 63: 195 (1990)). 대응하는 인간 단백질은 SCF, MGF, 또는 Steel Factor(SF)로 다양하게 지명된다(Cell 63: 203 (1990)).
c-Kit 수용체 티로신 키나제의 억제제는 비정상적 조직 섬유증을 상당히 억제시킬 수 있을 것이라고 기존 연구들에서 제안되었다(가령, Aono, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 171: 1279 (2005); Vuorinen, et al., Exp. Lung Res. 33: 357 (2007); Vittal, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 321: 35 (2007); Distler, et al., Arthritis Rheum 56: 311 (2007) 참고). 그러나, 이 억제제는 몇 가지 단점들을 보유한다. 경구 투여에 의해 전신으로 제공되어야 하고, 이 억제제의 사용과 관련된 어느 정도의 독성을 가지며, 그리고 이 화합물은 효과를 위하여 세포내로 전달되어야만 한다. 결과적으로, 대체 치료법들이 요구된다.
요약
줄기 세포 인자의 억제제들과 관련된 방법들, 조성물들 및 용도들이 본 명세서에서 제시된다. 예를 들자면, 섬유증 및 조직 재건 질환들의 치료를 위한, 뿐만 아니라 연구 및 진단용으로 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체들과 방법들이 본 명세서에서 제시된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 조성물들, 방법들 및 용도들은 줄기 세포 인자 (SCF)의 억제와 관련된 치료법들을 제시한다. 일부 구체예들은 SCF를 표적으로 하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 구체예들에서, SCF의 억제는 c-Kit의 활성에 영향을 준다. 본 명세서에서 제시된 조성물들, 방법들 및 용도들은 섬유증 질환들과 조직 재건과 연관된 만성적 병들(maladies)의 치료에 용도를 찾는다. 일반적으로 세포내 신호생성 경로들과의 간섭으로 인하여 바람직하지 못한 부작용들을 야기하는 일부 다른 치료법들과는 달리, 본 명세서에서 제시되는 구체예들은 SCF의 활성을 조절함으로써 이러한 부작용들을 제거 또는 최소화시킨다. 결과적으로, 독성이 최소화된다. 더욱이, 세포외 리간드를 표적화하는 것은 세포내 표적과 상호작용하도록 세포 안으로 조성물을 운반해야 할 필요성을 제거한다. 일부 구체예들에서, 이 조성물들은 기도로 운반되고, 따라서 경구 투여를 요구하는 기존 기술들과 비교하여 장점이 있으며, 이렇게 함으로써 전신 생물이용성을 초래한다.
일부 구체예들에서, 줄기 세포 인자의 억제제를 제공하고, 그리고 이 억제제의 치료요법적으로 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법들이 본 명세서에서 제시된다. 일부 구체예들에서 이 억제제는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편들, 등등)이다. 일부 구체예들에서 이 억제제는 작은 간섭 RNA다. 좀더 구체적인 구체예들에서, 이 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체다. 일부 구체예들은 이 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 줄기 세포 인자에 특이적으로 결합한다는 것을 제시한다. 일부 구체예들은 이 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합한다는 것을 제시한다.
본 명세서에서 제시되는 방법들의 일부 구체예들에서, 개체는 질환을 가진다. 따라서, 일부 구체예들은 이 억제제를 투여함으로써 이 질환의 최소한 한 가지 징표 또는 징후의 심각성을 방지 또는 감소시킨다는 것을 제시한다. 일부 구체예들에서, 개체는 줄기 세포 인자의 비정상적 활성을 보유하거나 또는 개체는 비정상으로 콜라겐을 생산한다. 일부 구체예들에서, 개체는 섬유증 또는 재건 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 질환을 보유한다. 추가 구체예들에서, 이 질환은 폐 질환이다. 일부 구체예들은 개체가 특발성 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환들, 급성 호흡곤란 증후군, 포낭성 섬유증, 기관지주위 섬유증, 과민성 폐렴, 또는 천식을 포함하나 이에 한정되지 않는, 폐 질환을 가진다는 것을 제시한다. 추가적으로, 일부 구체예들은 개체가 경피증, 염증, 간경변, 신장 섬유증, 유조직 섬유증, 심근내막섬유증, 종격 섬유증, 표피하 결절성 섬유증, 섬유성 조직구증, 섬유흉(fibrothorax), 간의 섬유증, 섬유근육통, 잇몸 섬유증, 또는 방사선-유도된 섬유증을 포함하나 이에 한정되지 않는, 질환을 가진다는 것을 제시한다.
투여 방식에 제한은 없지만, 이 방법의 일부 구체예들에서, 이 항체는 가령, 비강내 투여에 의해 개체의 기도로 운반된다.
일부 구체예들에서, 이 억제제의 투여는 수용체의 활성을 감소시킨다. 일부 구체예들은 이 억제제의 투여로 줄기 세포 인자와 수용체의 상호작용이 감소된다는 것을 제시한다. 좀더 구체적인 구체예들에서, 이 수용체는 수용체 티로신 키나제이며, 여전히 좀더 구체적인 구체예들에서, 이 수용체는 c-Kit이다. 중요한 것은, 이 방법들은 표적이 된 수용체 또는 줄기 세포 인자의 원천의 위치에 한정되지 않는다. 예를 들자면, 일부 구체예들에서 이 수용체는 조혈성 선조 세포, 말라닌세포, 배아 세포, 호산구, 림프구, 섬유아세포, 근섬유아세포, 또는 비만 세포에서 발견된다. 추가적으로, 일부 구체예들에서, 줄기 세포 인자는 뼈 골수 세포, 간 세포, 상피 세포, 평활근 세포, 또는 섬유아세포로부터 기인된다. 일부 구체예들에서, 개체에게 이 억제제의 투여는 섬유아세포 활성화의 직접적 억제를 초래한다.
일부 구체예들은 줄기 세포 인자 (가령, 단백질 또는 이의 펩티드 단편 (가령, 에피토프))에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제시한다. 예를 들자면, 일부 구체예들은 서열 번호: 1의 아미노산 서열의 펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제시한다. 추가 구체예들은 SCF 이소폼(isoform) b 전구체 (가령, GenBank 수탁 번호 NP_000890 (서열 번호: 4)로 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형, 또는 SCF 이소폼 a 전구체 (가령, GenBank 수탁 번호 NP_003985 (서열 번호: 6)로 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제시한다. 일부 구체예들은 SCF에 대한 NCBI 참고 유전자 서열(Reference Gene Sequence)의 해독 산물 (가령, 수탁 번호 NG_012098 (서열 번호: 7)) 또는 이의 변이체들 또는 단편들인 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 변이체들 또는 변형된 형태들에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제시한다. 일부 구체예들은 SCF의 성숙형의 처음 11개 아미노산 (가령, EGICRNRVTNN (서열 번호: 8))을 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제시한다.
일부 구체예들은 SCF를 인코드하는 핵산, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태의 해독 산물 (가령, 단백질 또는 펩티드) 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제시한다. 예를 들자면, 구체예들은 GenBank 수탁 번호 NM_000899 (서열 번호: 3), NM_003994 (서열 번호: 5), 및 NG_012098 (서열 번호: 7)에 의해 특정된 것과 같은 서열, 또는 이의 단편들 또는 변이체들(가령, 조절 요소(가령, 프로모터, 인헨서, 폴리머라제 결합 부위, 등등)에 작용가능하도록 연결된 돌연변이들, cDNAs, 발현-최적화된 변이체들, 등등)을 포함하는 서열들을 보유하는 핵산들의 해독 산물 (가령, 단백질 또는 펩티드), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제시한다. 일부 구체예들에서, 이 항체 또는 항원-결합 단편은 펩티드 서열 EGICRNRVTNN (서열 번호: 8)을 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 해독 산물인 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합한다. 일부 구체예들에서, 펩티드들과 단백질들 (그리고 이의 단편들과 이의 변이체들) 그리고 이 펩티드들과 단백질들 (그리고 이의 단편들고 이의 변이체들)을 인코드하는 핵산들 (그리고 이의 단편들과 이의 변이체들)은 항체들을 만드는데 이용된다. 본 명세서에서 제시되는 항체들을 생산하는데 이용되는 벡터들, 플라스미드들, 발현 구조체들, 세포들, 세포계들, 하이브리도마, 그리고 유기체들 또한 고려된다.
일부 구체예들은 단클론 항체를 제시하고, 그리고 일부 구체예들은 인간화된 항체를 제시한다. 일부 구체예들에서, 조성물은 약물로 또는 약물의 제조에 이용된다. 일부 구체예들에서, 약물은 질환을 치료하는데 이용된다. 조성물이 약물로의 사용되는 용도는 치료될 수 있는 질환에 한정되지 않는다. 예를 들자면, 일부 구체예들에서, 질환은 특발성 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환들, 급성 호흡곤란 증후군, 포낭성 섬유증, 기관지주위 섬유증, 과민성 폐렴, 천식, 경피증, 염증, 간경변, 신장 섬유증, 유조직 섬유증, 심근내막섬유증, 종격 섬유증, 표피하 결절성 섬유증, 섬유성 조직구증, 섬유흉, 간의 섬유증, 섬유근육통, 잇몸 섬유증, 또는 방사선-유도된 섬유증이다. 일부 구체예들에서, 시험관내에서 또는 모델계(가령, 생체내)에서 질환을 연구하는데 조성물이 이용된다.
본 명세서에서 구체예들은 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체(가령, 단클론 항체)를 제조하는 방법을 제시하는데, 이 방법은 SCF의 면역학적 부분(가령, 서열 번호: 1 또는 8에 의해 제시되는 것과 같이)을 포함하는 또는 이로 구성된 펩티드를 제공하는 단계, 숙주를 이 펩티드로 면역화시키는 단계, 숙주로부터 면역 세포를 단리시키는 단계, 이 면역 세포를 이용하여 하이브리도마를 제조하는 단계, 그리고 이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예들은 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체(가령, 단클론 항체)를 제조하는 방법을 제시하는데, 이때 이 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 줄기 세포 인자 (가령, 단백질 또는 이의 펩티드 단편 (가령, 에피토프))에 특이적으로 결합한다. 예를 들자면, 일부 구체예들은 서열 번호: 1의 아미노산 서열의 펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제시한다. 추가 구체예들은 SCF 이소폼 b 전구체 (가령, GenBank 수탁 번호 NP_000890 (서열 번호: 4)로 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형, 또는 SCF 이소폼 a 전구체 (가령, GenBank 수탁 번호 NP_003985 (서열 번호: 6)로 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제시한다. 일부 구체예들은 SCF에 대한 NCBI 참고 유전자 서열 (가령, 수탁 번호 NG_012098 (서열 번호: 7))의 해독 산물 또는 이의 변이체들 또는 단편들인 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 변이체들 또는 변형된 형태들에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제시한다. 일부 구체예들은 SCF의 성숙형의 첫 11개 아미노산 (가령, EGICRNRVTNN (서열 번호: 8))을 포함하는 펩티드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제시한다.
일부 구체예들은 SCF를 인코드하는 핵산, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태의 해독 산물 (가령, 단백질 또는 펩티드), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제시한다. 예를 들자면, 구체예들은 GenBank 수탁 번호 NM_000899 (서열 번호: 3), NM_003994 (서열 번호: 5), 및 NG_012098 (서열 번호: 7)에 의해 정의된 서열, 또는 이의 단편들 또는 이의 변이체들 (가령, 돌연변이들, cDNAs, 발현-최적화된 변이체들, 조절 요소(가령, 프로모터, 인헨서, 폴리머라제 결합 부위, 등등)에게 작용가능하도록 연결된, 등등)을 포함하는 서열을 보유하는 핵산들의 해독 산물 (가령, 단백질 또는 펩티드), 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제시한다. 일부 구체예들에서, 이 항체 또는 항원-결합 단편은 펩티드 서열 EGICRNRVTNN (서열 번호: 8)을 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 해독 산물인 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형에 결합한다. 일부 구체예들에서 이 펩티드들, 단백질들, 그리고 이의 단편들과 이의 변이체들; 그리고 이 펩티드들, 단백질들, 그리고 이의 단편들과 이의 변이체들을 인코드하는 핵산들, 그리고 이의 단편들과 이의 변이체들은 제시되는 기술에 의해 제공되는 것과 같은 항체들을 제조하는 방법에 용도를 발견한다. 본 명세서에서 제시되는 항체의 생산에 용도를 발견한 벡터들, 플라스미드들, 발현 구조체들, 세포들, 세포계들, 하이브리도마, 그리고 유기체들을 만드는 방법들 또한 고려된다.
일부 구체예들은 줄기 세포 인자의 억제제를 제공하는 단계 및 이 억제제를 세포 또는 조직으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제시한다.
추가적으로, 일부 구체예들은 줄기 세포 인자에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 조성물을 개체에게 투여하기 위한 수단, 및/또는 사용 지침들을 포함하는 키트를 제시한다.
추가 구체예들은 본 명세서에서 포함된 교시에 근거하여 관련 분야에 숙지의 기술을 가진 자들에게는 자명할 것이다.
본 기술의 이들 특징, 기타 특징들, 측면들 및 장점들은 다음의 도면들과 관련되어 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 항체로 SCF를 억제시키면 조직 재건 중재물질들의 발현이 감소됨을 설명하는 일련의 도표를 보여준다. 도 1a는 항-SCF 항체가 블레오마이신 처리된 폐에서 히드록시프롤린의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다; 도 1b는 항-SCF 항체가 IL-25 mRNA의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다; 도 1c는 항-SCF 항체가 IL-13 mRNA의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다; 도 1d는 항-SCF 항체가 혈장내 존재하는 가용성 SCF의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다. 도 1e는 항-SCF 항체가 IL-25 수용체의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 2는 IL-4가 인간 섬유아세포들에서 c-kit 발현을 자극한다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 3은 SCF에 특이적인 항체들을 생산하는데 이용되는 면역 펩티드의 아미노산 서열과 대응하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 4는 SCF에 특이적인 단클론 항체가 MCP-1 생산을 위한 HMC-1 세포들의 활성화를 억제시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 5는 블레오마이신 손상 후 SCF 생산 결핍된 마우스에서 더 적은 양의 히드록시프롤린이 탐지된다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 1은 항체로 SCF를 억제시키면 조직 재건 중재물질들의 발현이 감소됨을 설명하는 일련의 도표를 보여준다. 도 1a는 항-SCF 항체가 블레오마이신 처리된 폐에서 히드록시프롤린의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다; 도 1b는 항-SCF 항체가 IL-25 mRNA의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다; 도 1c는 항-SCF 항체가 IL-13 mRNA의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다; 도 1d는 항-SCF 항체가 혈장내 존재하는 가용성 SCF의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다. 도 1e는 항-SCF 항체가 IL-25 수용체의 양을 감소시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 2는 IL-4가 인간 섬유아세포들에서 c-kit 발현을 자극한다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 3은 SCF에 특이적인 항체들을 생산하는데 이용되는 면역 펩티드의 아미노산 서열과 대응하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 4는 SCF에 특이적인 단클론 항체가 MCP-1 생산을 위한 HMC-1 세포들의 활성화를 억제시킨다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
도 5는 블레오마이신 손상 후 SCF 생산 결핍된 마우스에서 더 적은 양의 히드록시프롤린이 탐지된다는 것을 설명하는 도표를 보여준다.
상세한 설명
줄기 세포 인자의 억제제들과 관련된 방법들, 조성물들, 그리고 용도들을 본 명세서에서 제시한다. 예를 들자면, 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체들, 줄기 세포 인자를 표적으로 하는 항체들을 생산하는 방법들, 그리고 섬유증과 조직 재건 질환들의 치료용 뿐만 아니라 연구 및 진단 용도들을 위한 방법들을 본 명세서에서 제시한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 조성물들, 방법들, 그리고 용도들은 줄기 세포 인자 (SCF)를 억제하는 것과 관련된 치료법들을 제시한다. 일부 구체예들은 SCF를 표적으로 하는 단리된 항체를 제시한다. 일부 구체예들에서, SCF의 억제는 c-Kit의 활성에 영향을 준다. 본 명세서에서 제시된 조성물들, 방법들 및 용도들은 섬유증 질환들과 조직 재건과 관련된 만성적 병들을 치료하는데 용도를 찾는다.
정의
본 기술의 구체예들을 용이하게 이해하기 위하여, 다수의 용어 및 구들이 하기에서 정의된다. 상세한 설명을 통하여 추가적인 정의들이 제시된다.
명세서 및 청구범위를 통하여, 다음의 용어들은 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 명백하게 관련된 의미들을 가진다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이 구절 "한 구체예에서"는 비록 그런 의미일 수는 있지만, 반드시 동일한 구체예를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 본 명세서에서 이용된 것과 같이 구절 "또다른 구체예에서"는 비록 그런 의미일 수는 있지만, 반드시 상이한 구체예를 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 하기에서 설명되는 것과 같이, 본 발명의 다양한 구체예들은 본 발명의 범위 또는 영역을 벗어나지 않고 용이하게 조합될 수 있다.
추가적으로, 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "또는"은 포괄적인 "또는" 관계사이며, 그리고 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 용어 "및/또는"과 대등하다. 용어 "~에 기초된"은 배타적이지 않고, 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 설명되지 않은 추가 인자들에 기초될 수 있다는 것을 허용한다. 추가적으로, 명세서를 통하여, 단수( "a", "an", 및 "the")은 복수 언급을 포함한다. "~에(in)"은 "~에(in)"과 "상에(on)"을 포함한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"은 펩티드 결합을 통하여 연결된 아미노산을 포함하는 화합물들을 지칭하여, 호환적으로 이용된다. 유전자에 의해 인코드된 "단백질"또는 "폴리펩티드"는 이 유전자에 의해 인코드되는 아미노산 서열에 한정되지 않고, 이 단백질의 해독후 변형들을 포함한다.
용어 "아미노산 서열"이 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하기 위하여 명세서에서 언급되는 경우, "아미노산 서열" 및 유사 용어들, 이를 테면, "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 언급된 단백질 분자와 관련하여 완벽한, 고유의 아미노산 서열에 국한시키려는 의도는 없다. 더욱이, "아미노산 서열"은 이 단백질을 인코드하는 핵산 서열로부터 유추될 수 있다.
단백질과 관련하여 이용되는 용어 "초기(nascent)"는 새로 합성된 단백질을 지칭하며, 이 단백질은 당화 및 폴리펩티드 단축(shortening)을 포함하나 이에 한정되지 않는 해독후 변형들을 겪지 않았다. 단백질과 관련하여 이용되는 용어 "성숙(mature)"은 해독후 프로세싱을 겪었거나 및/또는 세포내 위치(이를 테면 막 또는 다중-분자 복합체내에)하고, 특별한 기능을 실행할 수 있는(만약 이 위치에 있지 않다면, 기능을 하지 못할 수 있는), 단백질을 지칭한다.
용어 "부분(portion)"은 단백질과 관련하여 이용될 때("주어진 단백질의 부분"으로서) 이 단백질의 단편들을 지칭한다. 이 단편들은 4개의 아미노산 잔기에서부터 전체 아미노산 서열에서 1개 아미노산이 빠진 것까지의 크기 범위일 수 있다(예를 들자면, 크기 범위는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 등등의 아미노산에서부터 최대 전체 아미노산 서열에서 1개 아미노산이 빠진 것까지).
용어 "상동체(homolog)" 또는 "상동성(homologous)"은 폴리펩티드과 관련되어 이용될 때 두 폴리펩티드 사이에 높은 수준의 서열 동일성(identity), 또는 3차원 구조간에 높은 수준의 유사성 또는 작용 부위와 작용 기전 사이에 높은 수준의 유사성을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 상동체는 참조 서열과 60% 이상의 서열 동일성을 보유하고, 더욱 바람직하게는 75% 이상의 서열 동일성을 보유하고, 그리고 여전히 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 보유한다.
용어 "변이체(variant)" 및 "돌연변이체(mutant)"는 폴리펩티드와 관련되어 이용될 때 또다른, 보통 관련된 폴리펩티드와는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 지칭한다. 변이체는 "보존적(conservative)" 변화들을 보유할 수 있는데, 이때 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 성질들을 보유한다. 보존적 아미노산 치환들중 한 가지 유형은 유사한 측쇄들을 보유하는 잔기들의 호환가능성을 지칭한다. 예를 들자면, 지방족 측쇄들을 보유하는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄들을 보유하는 아미노산 군은 세린과 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄들을 보유하는 아미노산 군은 아스파라긴과 글루타민이며; 방향족 측쇄들을 보유하는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이며; 염기성 측쇄들을 보유하는 아미노산 군은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 그리고 황-함유 측쇄들을 보유하는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산들 치환 기들은 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민. 더욱 드물게는, 변이체는 "비-보존적" 변화들 (가령, 글리신을 트립토판으로 대체)을 가질 수 있다. 유사한 소수 변이들은 아미노산 삭제들 또는 삽입들 (가령, 추가들), 또는 양쪽 모두를 또한 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기들이 그리고 어떻게 많은 아미노산 잔기들이 생물학적 활성의 폐지없이 치환되고, 삽입되거나 또는 삭제되는지를 결정하는 지침들은 당업계에 잘 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램, 예를 들자면, DNAStar 소프트웨어를 이용하여 찾을 수 있다. 기능적 분석에서 변이체들이 테스트될 수 있다. 바람직한 변이체들은 10% 미만, 그리고 바람직하게는 5% 미만, 그리고 여전히 더욱 바람직하게는 2% 미만의 변화들 (치환들, 삭제들, 및 기타)을 보유한다.
용어 "도메인(domain)"은 폴리펩티드와 관련되어 이용될 때, 독특한 구조적 및/또는 기능적 특징을 보유하는 폴리펩티드의 일부분(subsection)를 지칭하는데; 전형적으로, 이 특징은 다양한 폴리펩티드들에 걸쳐 유사하다. 이런 일부분은 협력하여 작용하는 아미노산들 또는 폴딩 또는 기타 배치로 인하여 상당히 근접해 있는 아미노산들을 또한 포함할 수 있기도 하지만, 전형적으로 인접(contiguous) 아미노산들을 포함한다. 단백질 도메인의 예로는 막통과 도메인들, 그리고 당화 부위를 포함한다.
용어 "유전자(gene)"는 RNA, 또는 폴리펩티드 또는 이의 전구체 (가령, 프로인슐린)의 생산에 필수적인 코딩 서열들을 포함하는 핵산(가령, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 기능적 폴리펩티드는 전장 코딩 서열에 의해 인코드되거나 또는이 폴리펩티드의 원하는 활성 또는 기능적 성질들 (가령, 효소적 활성, 리간드 결합, 신호 변환, 등등)이 유지되는 한, 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 인코드된다. 용어 "부분(portion)"이 유전자와 관련되어 이용될 때, 이 유전자의 단편들을 지칭한다. 이 단편들은 크기가 몇 개의 뉴클레오티드에서부터 전체 유전자 서열에서 1개 뉴클레오티드를 뺀 범위까지가 될 수 있다. 따라서, "유전자의 최소한 한 부분을 포함하는 뉴클레오티드"는 이 유전자의 단편들 또는 전체 유전자를 포함할 수 있다.
용어 "유전자(gene)"는 구조적 유전자의 코딩 영역들을 또한 포괄하고, 그리고 5' 및 3' 양쪽 말단에 약 1 kb 거리의 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열들로 포함하는데, 이 유전자는 전장 mRNA의 길이에 대응한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고, mRNA 상에 존재하는 서열들을 5' 해독안된 서열들이라고 한다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고, mRNA 상에 존재하는 서열들은 3' 해독안된 서열들이라고 한다. 용어 "유전자(gene)"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형을 모두 포괄한다. 유전자의 게놈 형 또는 클론은 "인트론(introns)" 또는 "개재 영역들(intervening regions)"또는 "개재 서열들"로 불리는 넌-코딩 서열들에 의해 중절된(interrupted) 코딩 영역을 포함한다. 인트론들은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 분절들(segments)이고; 인트론들은 인헨서와 같은 조절 요소들을 함유할 수 있다. 인트론들은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 또는 "접합되어 배제되고(spliced out)"; 따라서 인트론은 메신져 RNA (mRNA) 전사체 안에는 없다. 해독 동안 mRNA는 서열을 특징짓거나 또는 초기(nascent) 폴리펩티드에서 아미노산들의 순서를 정하는 기능을 한다.
인트론을 함유하는 것에 추가적으로, 유전자의 게놈형들(genomic forms)은 RNA 전사체 상에 존재하는 서열의 5' 및 3' 양단부에 위치하는 서열들을 또한 포함할 수 있다. 이들 서열들은 "측면(flanking)" 서열들 또는 영역들이라고 불린다(이들 측면 서열은 mRNA 전사체 상에 존재하는 해독안된 서열들에 대해 5' 또는 3'에 위치한다). 5' 측면 영역은 유전자의 전사를 조절 또는 전사에 영향을 주는 조절 서열들, 이를 테면 프로모터들과 인헨서들을 포함할 수 있다. 3' 측면 영역은 전사의 종료, 전사후 분할 및 폴리아데닐화를 지휘하는 서열들을 포함할 수 있다.
용어들 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 2개 또는 그 이상의, 바람직하게는 3개 이상의, 그리고 보통 10개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들로 구성된 분자를 지칭한다. 정확한 크기는 많은 요인들에 의해 달라질 것이며, 이는 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 따라 달라진다. 올리고뉴클레오티드는 화학적 합성, DNA 복제, 역 전사, 또는 이의 조합을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
용어들 "유전자를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드" 또는 명시된 폴리펩티드를 "인코드하는 핵산 서열"은 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열 또는 다른 말로, 유전자 산물을 인코드하는 핵산 서열을 지칭한다. 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형으로 존재할 때, 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥으로 되거나(가령, 센스 가닥) 또는 이중-가닥으로 될 수 있다. 1차 RNA 전사체의 적절한 전사 개시 및/또는 정확한 프로세싱을 허용하는데 필요하다면, 적합한 조절 요소들, 이를 테면 인헨서들/프로모터들, 접합 졍션(splice junctions), 폴리아데닐화 신호들, 등등은 유전자의 코딩 영역에 근접하게 위치될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 발현 벡터들에 이용되는 코딩 영역은 내생성 인헨서들/프로모터들, 접합 졍션, 개재(intervening) 서열들, 폴리아데닐화 신호들, 등등 또는 내생성 및 외생성 양쪽 모두의 조절 요소들의 조합을 함유할 수 있다.
용어 "재조합체(recombinant)"가 핵산 분자와 관련되어 이용될 때, 분자 생물학적 기술들에 의해 서로 연결된 핵산 분절들로 구성된 핵산 분자를 지칭한다. 용어 "재조합체"가 단백질 또는 폴리펩티드와 관련되어 이용될 경우, 재조합 핵산 분자를 이용하여 발현된 단백질 분자를 지칭한다.
용어들 "상보적인(complementary)"과 "상보성(complementarity)"은 염기-쌍형성 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오티드들 (가령, 뉴클레오티드들의 서열)을 지칭한다. 예를 들자면, 서열 "5'-A-G-T-3'"은 서열 "3'-T-C-A-5'"에 상보적이다. 염기 쌍형성 규칙에 따라 핵산의 일부 염기만 대등한 경우 상보성은 "부분적(partial)"일 수 있다. 또는, 핵산들 간에 "완전한(complete)" 또는 "전체적(total)" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥들 사이에 상보성 수준은 핵산 가닥들 사이에 혼성화(hybridization)의 효과 및 강도에 상당한 영향을 가진다. 이는 핵산들 사이에 결합에 따라 달라지는 증폭 반응들, 뿐만 아니라 탐지 방법들에서 특히 중요하다.
용어 "야생형(wild-type)"이 유전자와 관련되어 이용될 경우, 자연적으로 생성되는 원천으로부터 단리된 유전자의 특징을 보유하는 유전자를 지칭한다. 용어 "야생형"이 유전자 산물과 관련되어 이용되는 경우, 자연적으로 생성되는 원천으로부터 단리된 유전자 산물의 특징을 보유하는 유전자 산물을 지칭한다. 용어 "자연적으로 생성되는(naturally-occurring)"은 물체에 적용될 때, 이 물체는 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들자면, 자연 원천으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스를 포함)에 존재하고, 그리고 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 생성되는 것이다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰되는 유전자이고, 따라서 이 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형으로 임의적으로 명명된다. 대조적으로, 용어 "변형된(modified)" 또는 "돌연변이체(mutant)"은 유전자 또는 유전자 산물에 대해 언급될 때 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교하였을 때 서열 및/또는 기능적 성질들 (가령, 변경된 특징들)에서 변형을 보이는 유전자 또는 유전자 산물을 각각 지칭한다. 자연적으로 생성되는 돌연변이들은 단리될 수 있고; 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교하여 변경된 특징들을 보유하는 사실로 확인될 수 있다.
용어 "대립유전자(allele)"는 유전자에서 상이한 변이들을 지칭한다; 이러한 변이들은 변이체들과 돌연변이들, 다형(polymorphic) 좌(loci) 및 단일 뉴클레오티드 다형 좌, 프레임쉬프트 및 접목(splice) 돌연변이들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대립유전자는 집단에서 자연적으로 발생될 수 있고, 또는 집단의 임의의 특정 개체의 일생 동안 발생될 수도 있다.
따라서, 용어들 "변이체"과 "돌연변이체"은 뉴클레오티드 서열과 관련되어 이용될 때, 또다른, 보통 관련된 뉴클레오티드 산 서열로부터 하나 이상의 뉴클레오티드가 상이한 핵산 서열을 지칭한다. "변이(variation)"은 상이한 2개의 뉴클레오티드 서열간의 차이인데; 전형적으로, 한 서열은 참조(reference) 서열이다.
용어 "안티센스(antisense)"는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기들의 서열이 DNA 이중구조(duplex)의 센스 가닥에서 데옥시리보뉴클레오티드 잔기들의 서열과 관련하여 5' 에서 3'의 역 방향에 있는, 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 지칭한다. DNA 이중구조의 "센스 가닥"은 자연 상태에서 세포에 의해 "센스 mRNA"로 전사되는 DNA 이중구조내 가닥을 말한다. 따라서, "안티센스" 서열은 DNA 이중구조내 넌-코딩 가닥과 동일한 서열을 보유하는 서열이다. 용어 "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이며, 그리고 이의 1차 전사체 또는 mRNA의 프로세싱, 운반 및/또는 해독을 간섭함으로써, 표적 유전자의 발현을 차단시키는 RNA 전사체를 지칭한다. 안티센스 RNA의 상보성은 가령, 5' 넌-코딩 서열, 3' 넌-코딩 서열, 인트론들, 또는 코딩 서열에서 특정 유전자 전사체의 임의의 부분과 있을 수 있다. 추가적으로, 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 안티센스 RNA는 안티센스 RNA가 유전자 발현을 차단시키는 효과를 증가시키는 리보자임 서열들의 영역을 함유할 수 있다. "리보자임(Ribozyme)"은 촉매성 RNA를 지칭하며, 그리고 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제를 포함한다. "안티센스 억제"는 표적 단백질의 발현을 저지시킬 수 있는 안티센스 RNA 전사체들의 생산을 지칭한다.
용어 "프라이머(primer)"는 정제된 제한 다이제스트로 자연적으로 생성되거나 또는 합성에 의해 만들어지며, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건들(가령, 뉴클레오티드들과 유도제, 이를 테면 DNA 중합효소 존재하에, 그리고 적합한 온도 및 pH에서)하에 있을 때 합성의 개시 점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이 프라이머는 증폭시 최대 효과를 위하여 바람직하게는 단일 가닥이지만, 그러나, 대안으로 이중 가닥으로 될 수 있다. 이중 가닥으로 된 경우, 프라이머는 연장 산물들을 만드는데 이용되기 전, 이들 가닥들을 분리시키기 위하여 우선 처리된다. 바람직하게는, 이 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드다. 이 프라이머는 유도 물질 존재하에 연장 산물들의 합성을 준비하는데 충분히 길어야만 한다. 프라이머들의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 원천 및 이용 방법을 포함하는 많은 인자들에 따라 달라질 것이다.
용어 "프로브(probe)"는 정제된 제한 다이제스트로 자연적으로 생성되거나 또는 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의한 합성으로 만들어지며, 관심 대상의 또다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 (가령, 뉴클레오티드들의 서열)을 지칭한다. 프로브는 단일-가닥으로 되거나 또는 이중-가닥으로 될 수 있다. 프로브들은 특정 유전자 서열들의 탐지, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에 이용되는 임의의 프로브는 임의의 탐지시스템에서 탐지가능한 효소(가령, ELISA 뿐만 아니라, 효소-기반의 조직화학적 분석), 형광, 방사능활성, 및 발광 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 "리포터 분자"로 라벨될 것도 고려된다. 본 발명을 임의의 특정 탐지 시스템 또는 라벨에 제한시키려는 의도는 없다.
용어 "단리된(isolated)"은 핵산과 관련되어 이용될 때 "단리된 올리고뉴클레오티드"로써, 이 핵산의 자연적 원천과 통상적으로 연합되어 있는 최소한 한 가지 오염 핵산으로부터 분리되고, 확인된 핵산 서열을 지칭한다. 단리된 핵산은 자연 상태에서 볼 수 있는 것과는 상이한 형태 또는 환경으로 존재한다. 대조적으로, 비-단리된 핵산들, 이를 테면 DNA 및 RNA는 이들이 존재하는 자연 상태로 발견된다. 비-단리된 핵산들의 예로는 다음을 포함한다: 숙주 세포 염색체 상에서 이웃 유전자와 근접되어 발견되는 주어진 DNA 서열(가령, 유전자); RNA 서열들, 이를 테면 다수의 단백질들을 인코드하는 수많은 다른 mRNAs들과 혼합되어 세포에서 발견되는, 특이적 단백질을 인코드하는 특이적 mRNA 서열. 그러나, 특정 단백질을 인코드하는 단리된 핵산은 예로써 단백질을 보통 발현시키는 세포내 핵산을 포함하는데, 이때 핵산은 천연 세포들의 것과는 상이한 염색체 위치에 있거나, 또는 자연에서 발견되는 것과는 상이한 핵산 서열이 측면에 위치해 있다. 단리된 핵산 또는 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥으로 또는 이중-가닥으로 된 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 또는 올리고뉴클레오티드가 단백질을 발현시키는데 이용될 때, 이 올리고뉴클레오티드는 최소한으로 센스 또는 코딩 가닥을 함유할 것이며 (가령, 이 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥으로 되어 있을 수 있다), 그러나, 센스가닥과 안티센스 가닥을 모두 함유할 수 있다(가령, 이 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥으로 되어 있을 수 있다).
용어 "정제된(purified)"은 이들의 자연 환경으로부터 격리된, 단리된 또는 분리된 핵산 또는 아미노산 서열의 분자를 지칭한다. 따라서,"단리된 핵산 서열"은 정제된 핵산 서열일 수 있다. "실질적으로 정제된" 분자들은 이들과 자연적으로 연합되어 있는 다른 성분들이 최소한 60% 없으며, 바람직하게는 최소한 75% 없으며, 그리고 더욱 바람직하게는 최소한 90% 없다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위하여(to purify)"은 시료로부터 오염물질들을 제거하는 것을 또한 지칭한다. 오염 단백질들의 제거로 시료내 관심대상의 폴리펩티드의 비율을 증가된다. 또다른 예에서, 재조합 폴리펩티드들은 식물, 박테리아, 효모, 또는 포유류 숙주 세포들에서 발현되며, 숙주 세포 단백질들을 제거함으로써 이 폴리펩티드들은 정제되고; 따라서, 시료내 재조합 폴리펩티드들의 비율은 증가된다.
주어진 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드를 "포함하는 조성물" 용어는 주어진 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드를 함유하는 임의의 조성물을 광범위하게 지칭한다. 조성물은 수성 용액을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열들 또는 이의 단편들을 포함하는 조성물들은 혼성화(hybridization) 프로브들로 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 서열들은 염(가령, NaCl), 계면활성제들 (가령, SDS), 및 기타 성분들 (가령, Denhardt 용액, 분유, 연어 정자 DNA, 등등)을 함유하는 수성 용액에서 이용된다.
용어 "테스트 화합물"은 임의의 화학적 실체(entity), 약제학적, 약물, 그리고 질환, 병, 질병, 또는 신체적 기능의 장애의 치료하거나 또는 방지하기 위하여, 또는 시료의 생리학적 또는 세포적 상태를 변경시키는데 이용될 수 있는 유사한 것들을 지칭한다. 테스트 화합물들은 공지의 그리고 잠재적 치료 화합물들을 모두 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법들을 이용하여 스크리닝함으로써 테스트 화합물이 치료제인지를 판단할 수 있다. "공지의 치료 화합물"은 이러한 치료 또는 방지에 효과적인 것으로 나타난(가령, 동물 시험 또는 인간에게 투여하는 사전 경험을 통하여) 치료 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "항체"는 광의적으로 온전한 항체들, 단클론 항체들 (인간, 인간화된, 또는 키메라 항체들을 포함), 다클론 항체들, 그리고 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 전술한 것들의 상보성 결정 영역들(CDRs)을 포함하는, 항원에 결합되는 항체 단편들(가령, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일 쇄 항체들)을 지칭하는데 이용된다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "항체 단편들"은 고유 항체의 부분, 바람직하게는 고유 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편들의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편들; 다이아바디(diabodies); 선형 항체들 (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 단일-쇄 항체 분자들; 그리고 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체들을 포함한다.
특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적"인 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드상의 에피토프에 결합하는 항체다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "활성있는" 또는 "활성"은 고유의 또는 자연적으로 생성되는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "시험관내(in vitro)"는 인위적 환경과 인위적 환경내에서 일어나는 공정 또는 반응을 지칭한다. 시험관내 환경들은 시험관 및 세포 배양을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 "생체내(in vivo)"는 자연 환경(가령, 동물 또는 세포)과 자연 환경내에서 일어나는 공정 또는 반응을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "억제제(inhibitor)"는 표적의 활성, 가령, 표적의 생물학적, 효소적, 화학적, 또는 면역학적 활성을 제거, 최소화 또는 감소시키는 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "질환"은 종의 구성원들에 대해 정상적인 또는 평균으로 간주되는 상태로부터의 일탈을 지칭하는데, 해당 종의 대다수의 개체에게 유해하지 않는 조건들하에서 영향을 받은 개체에게는 해롭다(가령, 설사, 메스꺼움, 열, 통증, 염증, 등등).
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "투여"는 생리적인 시스템 (가령, 개체 또는 생체내, 시험관내에서, 또는 생체외 세포들, 조직들, 그리고 장기들)으로 약물, 프로드럭(prodrug), 항체 또는 기타 물질 또는 치료적 처리를 제공하는 행위를 지칭한다. 인간 몸으로 투여하는 예시적인 경로들은 눈(안약), 입(경구), 피부(경피), 코(비강), 폐(흡입), 경구 점막(볼), 귀, 주사에 의해(가령, 정맥내, 피하내, 종양내, 복막내, 등등) 그리고 이와 유사한 것을 일 수 있다. "공동-투여(coadministration)"은 생리적인 시스템 (가령, 개체 또는 생체내, 시험관내에서, 또는 생체외 세포들, 조직들, 그리고 장기들)으로 하나 이상의 화학적 물질의 투여 또는 치료적 처치(가령, 방사선 치료)를 지칭한다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 하나 이상의 추가 치료제와 "결합된" 투여는 동시(병발적) 그리고 임의의 순서로 연속 투여를 포함한다. 치료 처리들의 "공동투여"는 병발적일 수 있거나, 또는 임의의 일시적 순서 또는 물리적 조합일 수 있다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "치료하는(treating)"은 개체에게 또는 개체의 몸에 본 기술의 치료 조성물을 임의의 방식으로 도입시킴으로써 질환 또는 장애의 최소한 한 가지 부작용 또는 징후를 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다. "치료(treatment)"는 치료적 처치(therapeutic treatment)와 예방적 또는 방지적 대책 모두를 지칭하는데, 이때 목적은 표적이 된 병리적 상태 또는 장애를 저지하거나 지연(경감)시키는 것이다. 치료를 요하는 자들은 장애를 이미 가진 자들, 뿐만 아니라 이 장애를 가질 경향이 있는 또는 이 장애를 방지하고자 하는 자들을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "치료적으로 효과적인 투약량(dose)"은 유익한 또는 원하는 임상 효과를 가져오는데 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 전술한 투약량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 그러나, 효과적인 투약량으로 간주되는 정확한 측정은 각 환자들에게 개별적인 인자들, 가령, 환자의 나이, 신체 크기, 질환의 유형 및 정도, 질환 단계, 투여 경로, 이용되는 보충 요법의 유형 또는 정도, 진행되는 질환 과정, 그리고 원하는 치료 유형(가령, 적극적 치료 대(vs) 통상적 치료)을 포함하나 이에 한정되지 않는 인자들에 근거될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "효과적인 양"은 유익한 또는 원하는 결과를 달성하는데 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 효과적인 양은 1회 이상의 투여, 제공 또는 투약으로 투여될 수 있지만, 특정 제제 또는 투여 경로에 한정시키려는 의도는 없다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 불활성 또는 활성이 있는, 시험관, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도에 특별히 적합하도록 조성물을 만들어주는 바람직한 운반체와 활성 물질의 조합을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "약제학적으로 수용가능한" 또는 "약리학적으로 수용가능한"은 개체에게 투여될 때 부작용들, 가령, 독성, 알레르기, 또는 면역학적 반응들을 실질적으로 만들지 않는 조성물들을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, "운반체들"은 이용되는 투약량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유류에 비독성인 약제학적으로 수용가능한 운반체들, 부형제들, 또는 안정화제들을 포함한다. 대개 생리적으로 수용가능한 운반체는 pH-완충된 수성 용액이다. 생리적으로 수용가능한 운반체들의 예로는 완충액들 이를 테면 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산; 아스코르브산을 함유하는 항산화제들; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기들)의 폴리펩티드들; 단백질들, 이를 테면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 폴리머들, 이를 테면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산들, 이를 테면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물들; 킬레이트제들, 이를 테면 EDTA; 슈가 알코올, 이를 테면 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 카운터이온들, 이를 테면 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제들을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어들 "환자" 또는 "개체"는 본 기술의 조성물들에 의해 치료되는 유기체들 또는 본 기술에 의해 제공되는 다양한 테스트를 받게 되는 개체들을 지칭한다. 용어 "개체(subject)"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 개체는 영장류다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "시료"는 이의 최대한 넓은 의미로 이용된다. 하나의 의미로, 이는 동물 세포들 또는 조직들을 지칭할 수 있다. 또다른 의미에서, 임의의 원천, 이를 테면 생물학적 그리고 환경 시료들로부터 수득된 견본 또는 배양물을 포함한다. 생물학적 시료들은 식물 또는 동물(인간 포함)로부터 수득될 수 있고, 그리고 유체, 고체, 조직들 및 기체를 포괄한다. 환경적 시료들은 환경적 물질, 이를 테면 표면 물질, 흙, 물 그리고 산업적인 시료들을 포함한다. 이들 시료는 본 기술에 적용가능한 시료 유형들로만 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다.
기술의 구체예들
본 명세서의 공개내용은 특정 설명되는 구체예들을 언급하지만, 이들 구체예는 예로써 제시되며, 이에 제한시키고자 함은 아니다.
1. SCF의 억제제들
줄기 세포 인자 (SCF)는 c-Kit 수용체 키나제에 특이적인 리간드다. SCF가 c-Kit에 결합되면 c-Kit의 이합체화와 이의 키나제 활성이 활성화되는데, 이는 조혈, 멜라닌생성, 및 수정능력에 중요하다. c-Kit를 통하여, SCF는 세포 생존, 증식, 분화, 흡착, 및 기능적 활성화를 촉진시키는 작용을 한다. c-Kit의 비정상적 활성화는 섬유증 및 조직 재건 결함을 포함하는 질환들을 초래할 수 있다. 특히, 공지의 재건 결함을 가진 다중 폐 질환들 뿐만 아니라 다른 장기 및 조직들에 영향을 주는 기타 만성 조직 재건 질환들이 있다. 섬유증 또는 조직 재건 결함과 관련된 질환의 특이적 예들은 특발성 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환들, 급성 호흡곤란 증후군, 포낭성 섬유증, 기관지주위 섬유증, 과민성 폐렴, 천식, 경피증, 염증, 간경변, 신장 섬유증, 유조직 섬유증, 심근내막섬유증, 종격 섬유증, 표피하 결절성 섬유증, 섬유성 조직구증, 섬유흉, 간의 섬유증, 섬유근육통, 잇몸 섬유증, 그리고 방사선-유도된 섬유증이다.
따라서, SCF와 c-Kit의 상호작용의 간섭을 이용하여 섬유증 및 조직 재건 결함의 원인이 되는 c-Kit의 비정상적 활성화와 관련된 질환을 치료 또는 연구할 수 있다. c-Kit 수용체는 조혈성 선조 세포들, 멜라닌세포들, 배아 세포들, 호산구들, 림프세포들, 그리고 비만 세포들에서 발견된다. 따라서, c-Kit와 SCF 상호작용을 저지시키면 섬유증과 조직 재건 질환들 표현형에 연루된 몇 가지 질환-관련된 세포 집단의 활성화를 변경시킬 수 있다.
추가적으로, SCF는 섬유증 반응에서 주요 중재물질들, IL-25 및 IL-13을 유도한다. 데이터들에 따르면 IL-25는 T-세포와 항원-독립적 방식으로 IL-13 발현을 구동시킬 수 있다고 제시된다. 따라서, 이들 과정들은 항원-특이적 반응 없이 진행될 수 있고, 결과적으로 만성적으로 재건 및 섬유증 질환들을 영속시킬 수 있다. SCF는 IL-25를 유도하고, 이는 다시 IL-13의 생산, 근섬유아세포 분화, 그리고 콜라겐 생산을 유도하는 복합 캐스케이드가 확립되는 것으로 생각된다. IL-4는 섬유증-연관된 사이토킨으로 또한 확인되었다.
2. 항체들
일부 구체예들에서, c-Kit와 상호작용하는 SCF의 능력의 억제는 SCF를 인지하는 항체로 이루어진다. 이 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있고, 그리고 예를 들자면, 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체일 수 있다. 표적 항원들에 대항하는 단클론 항체들은 통상적인 단클론 항체 방법론들, 이를 테면 Kohler 및 Milstein(Nature, 256:495 (1975))의 체세포 혼성화 기술들을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산된다. 일부 구체예들에서, 체세포 혼성화 과정들이 바람직하기는 하지만, 단클론 항체들을 생산하는 다른 기술들 또한 마찬가지로 고려된다(가령, B 림프세포들의 바이러스성 또는 발암성 형질변형).
SCF에 대항하는 항체들은 본 명세서에서 설명되는 실험, 진단 및 치료 방법들에서 용도를 찾는 것으로 간주된다. 특정 구체예들에서, 본 명세서에서 제시되는 이 항체들을 이용하여 생물학적 시료들에서 SCF의 발현을 탐지한다. 예를 들자면, 조직 생검을 포함하는 시료를 절단할 수 있고, 예를 들자면, 면역형광 또는 면역조직화학을 이용하여 단백질이 탐지될 수 있다. 대안으로, 시료로부터 개별 세포들을 단리시킬 수 있고, 그리고 FACS 분석에 의해 고정된 또는 살아있는 세포들에서 단백질 발현이 탐지될 수 있다. 더욱이, 이 항체들을 단백질 어레이에 이용하여 SCF의 발현을 탐지할 수 있다. 다른 구체예들에서, 본 명세서에서 제시되는 이 항체들을 이용하여 시험관내 세포-기반 분석 또는 생체내 동물 모델에서 SCF의 억제에 의해 c-Kit를 발현시키는 세포들의 활성을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 항체들을 이용하여 SCF에 대항하는 항체의 치료적으로 효과량을 투여함으로써 인간 환자를 치료한다.
항체들의 생산을 위하여, 다양한 숙주 동물들에게 원하는 에피토프에 대응하는 펩티드 (가령, SCF의 단편, 가령, 서열 번호: 1 또는 8에 의해 제시되는 서열을 포함하는 단편 또는 이의 면역원성 부분들)를 주사함으로써 면역화시킬 수 있는데, 토끼, 마우스, 쥐, 양, 염소 등등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. SCF에 대한 항체들은 SCF 이소폼 b 전구체 (가령, GenBank 수탁 번호 NP_000890 (서열 번호: 4)로 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편)의 펩티드, 부분 또는 전체 단백질, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태를 포함하는 항원, 또는 SCF 이소폼 a 전구체 (가령, GenBank 수탁 번호 NP_003985 (서열 번호: 6)로 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편)의 펩티드, 부분 또는 전체 단백질, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태를 포함하는 항원으로 면역화(가령, 주사에 의해)에 의해 생성될 수 있다. 항체들은 SCF에 대한 NCBI 참고 유전자 서열(가령, 수탁 번호 NG_012098 (서열 번호: 7))의 해독 산물 또는 이의 변이체들 또는 단편들로 면역화시켜 또한 생성될 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 펩티드는 면역원성 운반체 (가령, 디프테리아 유독소, 소 혈청 알부민 (BSA), 또는 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH))에 접합(conjugated)될 수 있다. 다양한 아쥬번트들을 이용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있는데, 숙주 종에 따라 Freund(완전 및 비완전), 미네랄 겔들, 이를 테면 수산화 알루미늄, 표면 활성 물질들, 이를 테면 리소레시틴, 플로론 폴리올들, 폴리음이온들, 펩티드들, 오일 유제, 키홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀, 그리고 잠재적으로 유용한 인간 아쥬번트들, 이를 테면 BCG (Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다클론 항체들은 임의의 공지의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 다클론 항체들은 선택적으로 KLH, 혈청 알부민, 등등에 접합시키고, 멸균 염에 희석시키고, 그리고 안정적인 유제를 형성하기 위하여 아쥬번트와 복합시킨, 관련 항원 (정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질, 등등)의 다중 피하 또는 복막 주사에 의해 동물(가령, 토끼, 쥐, 마우스, 당나귀, 등등)을 면역화시켜 만들 수 있다. 그 다음 다클론 항체는 이렇게 면역화된 동물의 혈액, 복수 및 이와 유사한 것으로부터 회수된다. 수집된 혈액이 응고되고, 혈청은 따라내고, 원심분리에 의해 정화시키고, 항체 역가를 분석한다. 친화력 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등등의 당업계에 잘 공지되어 있는 표준 방법들에 따라 혈청 또는 복수로부터 다클론 항체들을 정제시킬 수 있다.
단클론 항체들의 제조를 위하여, 배양물내 연속 세포주들에 의한 항체 분자들의 생산을 제공하는 임의의 기술이 이용될 수 있다(가령, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참고). 이러한 기술들은 Kohler 및 Milstein에 의해 최초로 개발된 하이브리도마 기술, 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(가령, Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983) 참고), 그리고 인간 단클론 항체들을 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 제시되는 일부 구체예들에서, 이 항체들은 하이브리도마로부터 마련된다. 하이브리도마 방법을 이용하여, 상기에서 설명된 것과 같이 마우스, 헴스터 또는 기타 적절한 숙주 동물을 면역화시켜 림프세포들에 의해 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 항체들의 생산을 유도한다. 대안으로, 림프세포들은 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프세포들을 단리하고, 그리고 예를 들자면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 적합한 골수종 세포계와 융합시켜 하이브리도마 세포들을 만들고, 이들은 융합안된 림프세포들과 골수종 세포들로부터 선별될 수 있다. 면역침전, 면역블랏팅에 의해 또는 시험관내에서 결합 분석 이를 테면 방사능면역분석(RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정하였을 때, 선택된 항원에 대항하여 특이적으로 지향되는 단클론 항체들을 생산하는 하이브리도마는 표준 방법들(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 이용하여 시험관내에서 (가령, 배양물에서) 증식되거나 또는 동물에서 복수 종양으로 생체내에서 증식될 수 있다. 그 다음 배양 배지로부터 단클론 항체들을 정제시키나, 상기 다클론 항체에서 설명된 것과 같이, 복수액으로부터 정제시킬 수 있다.
하이브리도마를 마련하기 위한 바람직한 동물계는 뮤린계다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 잘-확립된 과정이다. 면역화 프로토콜과 융합을 위하여 면역화된 비장세포들의 단리 기술들은 당업계에 공지되어 있다. 융합 짝들(가령, 뮤린 골수종 세포들)과 융합 과정들 또한 공지되어 있다. 본 명세서에서 기술의 구체예들은 SCF 단백질의 부분 또는 단편인 펩티드로 마우스를 면역화시켜 마련한 하이브리도마로부터 생산된 항체들 (가령, 단클론 항체들)을 제공한다. 예를 들자면, 일부 구체예들은 가령, GenBank 수탁 번호 NP_000890 (서열 번호: 4))에서 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태로 면역화시킴으로써, 또는 GenBank 수탁 번호 NP_003985 (서열 번호: 6))에서 이용가능한 서열의 단백질 또는 펩티드 단편, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태로 면역화시킴으로써, SCF에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구체예들은 SCF에 대한 NCBI 참고 유전자 서열(가령, 수탁 번호 NG_012098 (서열 번호: 7))의 해독 산물인 단백질 또는 펩티드 또는 이의 변이체들 또는 변형된 형태에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
예를 들자면, 본 명세서의 기술의 구체예들은 서열 번호: 1 또는 8의 아미노산 서열의 펩티드로 마우스를 면역화시켜 마련한 하이브리도마로부터 생산된 단클론 항체들을 제공한다. 하나 이상의 치환들, 삭제들, 삽입들, 또는 기타 변화들을 포함하는 서열 번호: 1 또는 8의 변이체를 이용하여 마련한 항체와 관련된 방법들 및 조성물들을 또한 고려하는데, 이때 전술한 변이체는 SCF에 특이적인 항체를 생산한다. 당업계에 잘 공지되어 있는 다양한 기술들에 따라 서열 번호: 1 또는 8 그리고 이에 유사한 서열들의 폴리펩티드들를 생산할 수 있다. 예를 들자면, 서열 번호: 1 또는 8의 폴리펩티드 또는 이의 변이체는 박테리아 발현 시스템과 서열 번호: 1 또는 8의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 또는 이의 변이체를 이용하여 생산될 수 있다. 예로써, 서열 번호: 1에 따른 폴리펩티드는 서열 번호: 2에 따른 뉴클레오티드 서열을 이용하여 만들 수 있다.
더욱이, 인간 단백질들에 대해 지향된 인간 단클론 항체들은 마우스 시스템보다는 완벽한 인간 면역 시스템을 운송하는 이식유전자 마우스를 이용하여 생성시킬 수 있다. 이식유전자 마우스의 비장세포들을 관심 항원으로 면역화시키고, 이를 이용하여 인간 단백질의 에피토프에 특이적 친화력을 가진 인간 단클론 항체들을 분비하는 하이브리도마를 만들 수 있다.
단클론 항체들은 재조합 DNA 기술 분야의 당업자들에게 공지된 기타 방법들에 의해 또한 만들어질 수 있다. 예를 들면, 조합 항체 디스플레이(combinatorial antibody display)를 이용하여 단클론 항체들을 만들 수 있다(가령, Sastry et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 5728 (1989); Huse et al., Science, 246: 1275 (1989); Orlandi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:3833 (1989) 참고). 상기에서 설명된 것과 같이 면역원(immunogen)으로 동물을 면역화시킨 후, 생성 B-세포 모둠의 항체 레퍼토리를 클론시킨다. 올리고머 프라이머들의 혼합물과 PCR을 이용하여, 다양한 집단의 면역글로블린의 가변 영역의 DAN 서열을 수득하는 방법들은 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, 5'리더 (신호 펩티드) 서열들 및/또는 프레임워크 1 (FR1) 서열들에 대응하는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프라이머들, 뿐만 아니라 보존된 3' 영역에 대한 프라어미들을 이용하여 다수의 뮤린 항체들로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 증폭시키고 단리시킬 수 있다(가령, Larrick et al., Biotechniques, 11: 152 (1991)). 인간 항체들로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 증폭시키는데 유사한 전략을 또한 이용할 수 있다(가령, Larrick et al., Methods: Companion to Methods in Enzymology, 2: 106 (1991) 참고).
대안으로, U.S. 특허 제4,816,567호에서 설명된 것과 같이 재조합 DNA 방법들을 이용하여 단클론 항체들을 또한 만들 수 있다. 단클론 항체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드들은 가령, 이 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용한 RT-PCR에 의해 (가령, 성숙 B-세포들 또는 하이브리도마 세포들로부터) 단리되고, 그리고 이들의 서열들은 통상적인 과정에 의해 결정된다. 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드들을 적합한 발현 벡터들 안에 클론시키고, 숙주 세포들로 형질감염시키면, 이를 테면 다른 방법으로는 면역글로블린 단백질을 생산하지 않는 대장균(E. coli) 세포들, 원숭이 COS 세포들, 중국 헴스터 난소(CHO) 세포들, 또는 골수종 세포들로 형질감염시키면, 이 숙주 세포들에 의해 단클론 항체들이 생성된다. 또한, 원하는 종의 재조합 단클론 항체들 또는 이의 단편들은 설명된 것과 같이 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다(McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
단클론 항체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 대체 항체들을 만들기 위한 재조합 DNA 기술을 이용하여 다수의 상이한 방식으로 더 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 예를 들자면, 마우스 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인들은 1) 키메라 항체를 만들기 위하여 예를 들자면, 인간 항체의 영역을 대신하여 치환되거나, 또는 2) 융합 항체를 만들기 위하여 비-면역글로블린 폴리펩티드를 대신하여 치환될 수 있다. 기타 구체예들에서, 불변 영역들은 절두(truncated)되거나 제거되어 단클론 항체의 원하는 항체 단편을 만든다. 더욱이, 가변 영역의 부위-지정된 또는 고밀도 돌연변이생성을 이용하여 단클론 항체의 특이성, 친화력 등을 최적화시킬 수 있다.
예를 들자면, 키메라 마우스-인간 단클론 항체들 또한 고려되는데, 이는 당업계에 공지되어 있는 재조합 DNA 기술들에 의해 생산될 수 있다. 예를 들자면, 뮤린 (또는 기타 종들) 단클론 항체 분자의 불변 영역을 인코드하는 유전자를 제한효소로 절단하여 뮤린 불변 영역을 인코드하는 영역을 제거하고, 그리고 인간 불변 영역을 인코드하는 등가 부분이 치환된다(가령, Robinson et al., PCT/US86/02269; 유럽 특허 출원 184,187; 유럽 특허 출원 171,496; 유럽 특허 출원 173,494; WO 86/01533; US 4,816,567; 유럽 특허 출원 125,023 (이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다); Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988); Liu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443 (1987); Liu et al., J. Immunol., 139:3521-3526 (1987); Sun et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:214-218 (1987); Nishimura et al., Canc. Res., 47:999-1005 (1987); Wood et al., Nature, 314:446-449 (1985); and Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559 (1988)).
항원 결합에 직접적으로 관련되지 않는 가변 영역의 서열들을 인간 가변 영역들의 등가 서열로 대체함으로써 키메라 항체는 더 인간화될 수 있다. 인간화된 키메라 항체들의 전반적인 검토는 S.L. Morrison, Science, 229:1202-1207 (1985) 및 Oi et al., Bio Techniques, 4:214 (1986)에 의해 제공된다. 이들 방법들은 중쇄 또는 경쇄 최소한 한 가지로부터 면역글로블린 가변 영역들의 전부 또는 일부를 인코드하는 핵산 서열들을 단리, 조작 및 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산의 원천들은 당업계 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 그 다음 키메라 항체, 또는 이의 단편을 인코드하는 재조합 DNA를 적절한 발현 벡터 안으로 클론시킬 수 있다.
적합한 인간화된 항체들은 대안으로 CDR 치환에 의해 만들어질 수 있다(가령, US 제5,225,539호; Jones et al., Nature, 321:552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science, 239:1534 (1988); 및 Beidler et al., J. Immunol., 141:4053 (1988) 참고). 특정 인간 항체의 모든 CDRs들은 비-인간 CDR의 최소한 일부로 대체될 수 있거나 또는 CDRs의 단지 일부만 비-인간 CDRs로 대체될 수 있다. 인간화된 항체가 Fc 수용체에 결합하는데 중요한 다수의 CDRs를 대체시키는 것만 필수적이다.
인간 항체의 CDR의 최소한 일부를 비-인간 항체로부터 유도된 CDR로 대체시킬 수 있는 임의의 방법에 의해 항체를 인간화시킬 수 있다. 인간 CDRs은 올리고뉴클레오티드 부위-지정된 돌연변이생성을 이용하여 비-인간 CDRs로 대체시킬 수 있다.
특이적 아미노산들이 치환된, 결손된, 또는 추가된 키메라 및 인간화된 항체들 또한 고려된다. 특히, 바람직한 인간화된 항체들은 이를 테면 항원에 결합을 개선시키도록 프레임워크 영역 안에 아미노산 치환들을 보유한다. 예를 들자면, 마우스 CDRs를 보유하는 인간화된 항체에서, 인간 프레임워크 영역 안에 위치한 아미노산들은 마우스 항체에서 대응하는 위치들에 있는 아미노산들로 대체될 수 있다. 이러한 치환들은 일부 경우들에서 인간화된 항체들이 항원에 결합하는 것을 개선시키는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 제시되는 특히 구체예들에서, 항체 단편을 이용하는 것이 바람직하다. 항체 단편들을 생산하는 다양한 기술들이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편들은 고유 항체들의 단백질분해성 절단을 통하여 유도된다(예를 들자면 Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 및 Brennan et al., 1985, Science, 229:81). 예를 들자면, 항체들의 파파인 절단으로 이들 각각은 Fab 단편들이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편들-단일 항원-결합 부위를 가지는-과 남아있는 Fc 단편을 만든다. 펩신 처리로 2개의 항원 복합 부위를 보유하는 F(ab')2 단편이 생성되고, 이는 여전히 항원과 가교할 수 있는 능력을 가진다.
그러나, 상기에서 설명된 것과 같이 재조합 숙주 세포들에 의해 이들 단편들을 직접적으로 생산하는 것이 현재 일반적이다. 따라서 Fab, Fv, 및 scFv 항체 단편들은 대장균(E. coli) 또는 기타 숙주 세포들에서 모두 발현될 수 있고, 이들 세포들로부터 분비될 수 있으며, 따라서 이들 단편들의 대량 생산이 허용된다. 대안으로, 이러한 항체 단편들은 상기에서 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 이 항체 단편은 예를 들자면, U.S. 특허 제5,641,870호에서 설명된 것과 같이, 또한 선형 항체들일 수 있고, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편들을 생산하기 위한 기타 기술들은 숙련자들에게 자명할 것이다.
Fv는 완벽한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 보유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한, 비-공유 연합된 한 개의 중쇄 및 한 개의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 이 구성에서 각 가변 도메인의 3개 CDRs은 상호작용하여 VH-VL 이합체의 표면에서 항원-결합 부위를 특정짓는다. 집합적으로, 6개의 CDRs은 이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDRs을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다는 친화력이 더 낮기는 하지만, 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 보유한다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab 단편들은 이 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 함유하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기를 추가함으로써 Fab'단편들과는 상이하다. F(ab')2 항체 단편들은 원래 Fab'단편들의 쌍으로 만들어지며, 이 쌍 사이에 힌지 시스테인들을 보유한다. 항체 단편들의 기타 화학적 커플링 또한 당업계 숙련자들에게 알려져 있다.
본 명세서에서 제공되는 기술은 또한 항체를 변형시켜 이의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 고려한다. 이는 예를 들자면, 이 항체 단편에서 적절한 영역을 돌연변이시킴으로써 또는 에피토프를 펩티드 테그에 통합시키고, 그 다음 한쪽 단부 또는 중간에서 이 항체 단편에 융합시킴으로써(가령, DNA 또는 펩티드 합성에 의해) 이 항체 단편으로 구출(salvage) 수용체 결합 에피토프를 통합시킴으로써 이루어질 수 있다.
이 기술은 본 명세서에서 제시되는 키메라, 인간화된, 그리고 인간 항체들, 또는 이의 항체 단편들에 실질적으로 상동성인 변이체들 및 등가체들을 포괄한다. 여기에는 예를 들자면, 보존적 치환 돌연변이들, 가령 유사한 아미노산들에 의해 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들자면, 보존적 치환은 한 아미노산을 동일한 일반 분류내 또 다른 아미노산으로의 치환을 말하는데, 이를 테면, 예를 들자면, 하나의 산성 아미노산은 또다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산은 또다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산은 또다른 중성 아미노산으로 치환. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다.
추가 구체예는 Fab 발현 라이브러리의 구축을 위한 당업계에 잘 공지되어 있는 기술들을 이용하여 (Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)) 원하는 특이성을 가진 단클론 Fab 단편들을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 이 기술은 SCF를 특이적으로 인지하는 이중특이적 항체들을 포괄한다. 이중특이적 항체들은 최소한 2가지 상이한 에피토프들을 특이적으로 인지하고, 결합할 수 있는 항체들이다. 이중특이적 항체들은 고유 항체들 또는 항체 단편들일 수 있다. 이중특이적 항체들을 만드는 기술들은 당업계에서 흔한 것이다(Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; 및 U.S. 특허 제5,731,168호).
단일 쇄 항체들을 생산하기 위하여 설명된 기술들 (U.S. 제4,946,778호; 여기에 참고자료로 편입된다)을 개작하여 원하는 특이적 단일 쇄 항체들을 만들 수 있다. 단일-쇄 Fv 항체 단편들은 항체의 VH 및 VL 도메인들을 포함하고, 이때 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 단일-쇄 Fv 항체 단편들이 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성하도록 만들 수 있도록 VH 및 VL 도메인들 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. 단일-쇄 Fv 항체 단편들에 대한 검토를 위하여, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참고한다.
3. 기타 SCF 억제제들
SCF의 억제는 다양한 다른 유형들의 억제제들에 의해 이루어질 수 있다고 또한 생각된다. 예를 들자면, 일부 구체예들에서 작은 간섭 RNA (siRNA)는 SCF mRNA를 표적으로 하고, 이를 분해하도록 기획될 수 있다. siRNAs는 길이가 20-25개의 뉴클레오티드들로 된 이중-가닥으로 된 RNA 분자들이다. 이들의 특징에 제한은 없지만, 전형적으로 siRNA는 길이가 21개인 뉴클레오티드들이고, 그리고 양단에 2-nt 3'오버행(overhangs)을 보유한다. 각 가닥은 5'인산염기와 3'히드록실기를 보유한다. 생체내에서, 이 구조는 긴 dsRNAs 또는 작은 헤어핀 RNAs를 siRNAs로 전환시키는 효소, 다이스(dicer)에 의해 프로세싱된 결과로 생긴 것이다. 그러나, siRNAs는 또한 합성되고, 외부로부터 세포들 안으로 도입되어, 관심 유전자의 특이적 녹다운(knockdown)을 일으킬 수 있다. 필수적으로 서열이 공지된 임의의 유전자는 적절하게 맞추어진 siRNA과의 서열 상보성에 근거하여 표적화시킬 수 있다. 예를 들자면, 당업계 숙련자는 siRNA를 합성할 수 있다(가령, Elbashir, et al., Nature 411: 494 (2001); Elbashir, et al. Genes Dev 15 :188 (2001); Tuschl T, et al., Genes Dev 13 :3191 (1999) 참고).
일부 구체예들에서, RNAi를 이용하여 SCF를 억제시킬 수 있다. RNAi는 인간을 포함하는 대부분의 진핵세포에서 외부 유전자들의 발현을 조절하기 위하여 진화론적으로 보존된 세포성 방어를 나타낸다. RNAi는 전형적으로 이중-가닥으로 된 RNA (dsRNA)에 의해 촉발되고, 단일-가닥으로 된 표적 RNAs (가령, mRNA)의 서열-특이적 분해를 일으킨다. mRNA 분해의 중재물질들은 세포에서 효소적 분할에 의해 긴 dsRNA로부터 보통 만들어지는 작은 간섭 RNAs (siRNAs)다. siRNAs는 일반적으로 대략 길이가 21개 뉴클레오티드들(가령, 길이가 21-23개의 뉴클레오티드들)이고, 그리고 2개의 뉴클레오티드 3' 오버행에 의해 특징화되는 염기-쌍을 이룬 구조를 가진다. 작은 RNA, 또는 RNAi를 세포 안으로 도입시킨 후, 이 서열은 RISC (RNA-유도된 침묵 복합체)라고 불리는 효소 복합체로 운반되는 것으로 생각된다. RISC는 표적을 인지하고, 엔도뉴클레아제로 이 표적을 절단한다. 더 큰 RNA 서열들이 세포로 운반된다면, RNase III 효소(가령, 다이스)는 더 긴 dsRNA를 21-23개 nt의 이중-가닥으로 된 siRNA 단편들로 전환시킨다. 일부 구체예들에서, RNAi 올리고뉴클레오티드들은 융합 단백질들의 졍션(junction) 영역을 표적화하도록 기획된다. 화학적으로 합성된 siRNAs는 배양된 체세포들에서 포유류 유전자 기능의 게놈-범위 분석을 위한 강력한 반응물들이 되었다. 유전자 기능 확인을 이들의 차기를 넘어서, siRNAs는 유전자-특이적 치료제로써 상당한 잠재력을 또한 보유한다. (가령, Tuschl and Borkhardt, Molecular Intervent. 2002; 2(3): 158-67 참고, 여기에 참고자료로 편입된다).
동물 세포들에게 siRNAs의 형질감염으로 특이적 유전자들의 강력하고, 오래 지속되는 전사후 침묵을 초래한다(Caplen et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2001; 98: 9742-47; Elbashir et al., Nature. 2001; 411:4 94-98; Elbashir et al., Genes Dev. 2001; 15: 188-200; 그리고 Elbashir et al., EMBO J. 2001; 20: 6877-88, 이들 모두는 여기에 참고자료로 편입된다). siRNAs로 RNAi를 실행하기 위한 방법들 및 조성물들은 예를 들자면, U.S. 특허 제6,506,559호에서 설명되며, 여기에 참고자료로 편입된다.
siRNAs는 표적이 된 RNA와 이들의 단백질 생성물의 양을 흔히 탐지불가능한 수준으로 낮추는데 엄청나게 효과적이다. 침묵 효과(silencing effect)는 수개월 동안 지속될 수 있고, 그리고 상당히 특이적이다-표적 RNA와 siRNA의 중앙 영역 사이에 한 개-뉴클레오티드 불일치만으로도 침묵을 저지하는데 흔히 충분하다 (Brummelkamp et al, Science 2002; 296: 550-53; 그리고 Holen et al, Nucleic Acids Res. 2002; 30: 1757-66, 이들 모두는 여기에 참고자료로 편입된다).
siRNAs의 기획에 있어서 중요 인자는 siRNA 결합을 위한 접근가능한 부위들의 존재다. Bahoia et al., (J. Biol. Chem., 2003; 278: 1599197; 여기에 참고자료로 편입된다)은 효과적인 siRNAs를 기획하기 위하여 mRNAs에 접근가능한 부위들을 발견하기 위하여 스캐닝 어래이(scanning array)라고 불리는 DNA 어래이 유형의 사용을 설명한다. 이들 어래이들은 크기가 모노머에서부터 서열에서 각 염기의 단계적 추가에 의해 물리적 장벽(마스크)을 이용하여 합성된 특정 최대, 보통 Co-mers까지 범위의 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 따라서 어래이들은 표적 유전자 영역의 온전한 올리고뉴클레오티드 보체(complement)를 나타낸다. 표적 mRNA가 이들 어래이에 혼성화되어 표적 mRNA의 이 영역의 포괄적인 접근성 프로파일이 제공된다. 이러한 데이터는 안티센스 올리고뉴클레오티드들(7mers 내지 25mers 범위의)의 기획에 유용하고, 가령, 효과와 표적 특이성을 유지하기 위하여 올리고뉴클레오티드 길이와 결합 친화력 사이에 절충을 이루는데 중요하다(Sohail et al, Nucleic Acids Res., 2001; 29(10): 2041-45). siRNAs를 선별하기 위한 추가 방법들 및 우려들은 예를 들자면, WO 05054270, WO05038054A1, WO03070966A2, J Mol Biol. 2005 May 13;348(4):883-93, J Mol Biol. 2005 May 13;348(4):871-81, 및 Nucleic Acids Res. 2003 Aug 1;31(15):4417-24에서 설명되고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 추가적으로, siRNAs 및 RNAi 반응물질의 선별 및 기획에 이용될 수 있는 상업적 또는 공개된 이용가능한 소프트웨어 (가령, MWG 온라인 siMAX siRNA 기획 도구)가 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 블런트 말단들 (가령, US20080200420 참고, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다), 오버행(가령, US20080269147A1 참고, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다), 잠금 핵산들 (가령, WO2008/006369, WO2008/043753, 및 WO2008/051306 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)을 포함하는 siRNA를 이용한다. 일부 구체예들에서, siRNAs는 유전자 발현을 통하여 또는 박테리아를 이용하여 기획된다(가령, Xiang et al., Nature 24: 6 (2006) 및 WO06066048 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다).
기타 구체예들에서, shRNA 기술들 (가령, 20080025958 참고, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)이 이용된다. 작은 헤어핀 RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 단단한 헤어핀 회전을 만드는 RNA 서열로써, RNA 간섭을 통하여 유전자 발현을 침묵시키는데 이용될 수 있다. shRNA는 세포들 안으로 도입되는 벡터를 이용하고, 그리고 U6 프로모터를 이용하여 shRNA가 항상 발현되도록 보장한다. 이 벡터는 항상 딸 세포들로 전달되어, 유전자 침묵이 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포성 기전에 의해 siRNA로 절단되고, 그 다음 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)에 결합된다. 이 복합체는 mRNAs에 결합되고, 이를 절단시켜, 이것에 결합된 siRNA와 필적되도록 한다. shRNA는 RNA 중합효소 III에 의해 전사된다.
본 발명은 또한 하기에서 설명되는 것과 같이 본 발명의 RNAi 화합물들을 포함하는 약제학적 조성물들과 제제들을 또한 포함한다.
SCF는 막통과 형태와 가용성 형태 모두로 존재한다. 막통과 형으로부터 SCF 가용성 도메인의 분할시, 세포 표면으로부터 SCF가 방출되어, c-Kit의 리간드로 기능한다. 따라서, 예를 들자면, 막-결합된 형태로부터 가용성 도메인을 절단하는 프로테아제의 활성을 억제 또는 그렇지 않으면 감소시킴으로써, 막-결합된 형태로부터 가용성 SCF의 방출을 억제시켜 SCF 활성이 변경될 수 있을 것으로 생각된다.
추가적으로, SCF에 결합 또는 변형시키는 화학물질 (가령, 소(small) 분자, 가령, 약리학적 물질) 또는 기타 생물학적 물질들에 의해 억제될 수 있다고 생각된다. 예를 들자면, 예를 들면 SELEX 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 시험관내 진화 방법들을 이용함으로써, 당업계 숙련자들은 SCF를 특이적으로 인지하고, 이에 결합하는 RNA 압타머 또는 기타 핵산들을 기획하고 생산할 수 있다, 더욱이, SCF를 특이적으로 분해시키거나 또는 SCF의 구조의 변경을 유도하여 c-Kit와의 상호작용이 덜 효과적으로 함으로써 SCF 활성이 억제될 수 있다. 일부 구체예들에서, SCF 억제제는 "기획된 안키린 반복 단백질(designed ankyrin repeat protein)" (DARPin) (가령, Stumpp MT & Amstutz P, "DARPins: a true alternative to antibodies", Curr Opin Drug Discov Devel 2007, 10(2): 153-59 참고, 모든 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 편입된다). 일부 구체예들에서, SCF는 소(small) 분자, 가령, SCF에 결합하여 이의 기능을 차단시키는 소 분자에 의해 억제된다(가령, c-Kit 수용체와 결합 및/또는 기타 상호작용(가령, 활성화 상호작용)을 억제한다).
SCF 활성의 변경은 SCF의 발현을 억제시킴으로써, 예를 들면, SCF의 전사를 억제함으로써, SCF의 해독을 억제함으로써, SCF mRNA의 프로세싱을 억제함으로써, SCF 폴리펩티드의 프로세싱을 억제함으로써, SCF 폴리펩티드의 폴딩을 억제함으로써, 세포내에서 SCF의 트래피킹(trafficking)을 억제함으로써, 또는 SCF가 혈장 막으로 삽입되는 것을 억제함으로써 영향을 받을 수 있다고 생각된다. 크로마틴 구조에서 변화 또는 SCF의 후생적 조적의 기타 수단에서의 변화 (가령, DNA 메틸화에서 변화)에 의해, SCF 활성이 변경될 수 있다. 또한, 소포 또는 기타 세포 격실에 특이적으로 SCF를 격리시켜, SCF가 c-Kit와의 작용을 방해함으로써, SCF 활성이 변경될 수 있다.
4. SCF의 억제제들을 이용하는 치료법들
SCF의 억제는 질환들을 치료하는 치료법들에서 용도를 찾는다. 따라서, 질환을 앓고 있는 개체들에게 유익하도록 SCF를 억제시키는 치료법들이 본 명세서에서 제시된다. 특히, 본 명세서에서 나타낸 것과 같이, 섬유증 및 조직 재건과 관련된 질환 상태는 비정상적 SCF 활성을 나타낸다. 예를 들자면, 섬유증 또는 조직 재건 표현형들을 가진 질환을 가진 개체로부터 단리된 섬유아세포들은 SCF에 직접적으로 반응하고, 이는 콜라겐 생산의 증가를 포함하는 좀 더 심각한 표현형의 생성을 초래한다. 이와 같이, 본 명세서에서 나타낸 것과 같이, SCF의 억제는 염증 및 표적 조직의 재건을 포함하는 몇 가지 질환 결과의 생성에 상당히 영향을 줄 수 있다. 역학적 질환 과정 또는 좀더 예측가능한 질환 과정을 가지는 급성 및 만성 장애와 관련된 섬유증의 생성 동안 SCF를 표적으로 하는 치료법들이 또한 고려된다. SCF를 억제하는 치료법으로부터 이익을 볼 수 있는 징후들은 특발성 폐 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환들, 급성 호흡곤란 증후군, 포낭성 섬유증, 기관지주위 섬유증, 과민성 폐렴, 천식, 경피증, 염증, 간경변, 신장 섬유증, 유조직 섬유증, 심근내막섬유증, 종격 섬유증, 표피하 결절성 섬유증, 섬유성 조직구증, 섬유흉, 간의 섬유증, 섬유근육통, 잇몸 섬유증, 및 방사선-유도된 섬유증을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
중요한 것은, SCF를 표적으로 하는 치료법들은 기타 유사한 치료법들, 예를 들자면 c-Kit를 표적으로 하는 치료법들과 관련된 독성을 감소 또는 제거한다. 이들 바람직하지 못한 독성 효과들은 세포외 표적 보다는 세포내 표적과 관련되고, 그리고 세포 신호생성에 더 광범위하고 일반적인 변화들을 초래한다. 치료법들은 이들의 투여 경로에 제한되지 않지만, 본 명세서에서 제시되는 기술의 구체예들은 비강내 투여에 의해 기도를 통하여 SCF 억제제를 운반한다. 이러한 투여는 경구로 투여된 조성물을 경유하여 전신 운반에 의존하기 보다는 섬유증 및 조직 재건과 관련된 폐 질환의 표적 조직들로 치료제를 직접 운반하는 것을 허용한다.
특히 구체예들, SCF에 특이적인 항체의 효과량을 함유하는 생리적으로 적절한 용액은 국소적으로, 안구내로, 비경구로, 경구로, 비강내, 정맥내로, 근육내로, 피하로, 또는 임의의 기타 효과적인 수단을 통하여 투여될 수 있다. 특히, 이 항체는 비강내 투여에 의해 개체의 기도로 운반될 수 있다. 대안으로, 조직은 바늘에 의한 직접적인 주사 또는 카테테르 또는 기타 운반 튜브를 경유하여 SCG에 특이적인 항체의 효과량을 함유하는 생리적으로 적절한 조성물 (가령, 멸균된 용액, 이를 테면 염수 또는 인산염 완충액, 현탁액, 유제)을 제공받을 수 있다. 임의의 효과적인 영상 장치, 이를 테면 X-선, 소노그램(sonogram), 또는 광-섬유 시각화 시스템을 이용하여 표적 조직을 위치시키고, 투여를 유도할 수 있다. 또다른 대안에서, SCF에 특이적인 항체의 효과량을 함유하는 생리적으로 적절한 용액은 혈류로 전신으로 투여되어 직접적으로 닿지 않는 조직 또는 해부학적으로 단리된 조직을 치료할 수 있다. 이러한 조작은 SCF에 특이적인 항체가 조직과 접촉할 수 있도록 표적 조직과 충분히 접촉되도록 SCF에 특이적한 항체의 효과량을 배치하는 공통적인 목표를 가진다.
SCF 억제제 (가령, SCF에 특이적인 항체)를 개체에게 투여하는 데 있어서, SCF 억제제는 약제학적으로 효과적인 양으로 투여되는 것이 고려된다. 약제학적으로 효과적인 양은 이용되는 치료제, 개체의 나이, 상태 및 성별 그리고 개체의 질환 정도에 따라 다양해진다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 일반적으로 투약량은 부작용, 이를 테면 혈액과점도 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전, 및 이와 유사한 것을 야기할 정도로 커지 않아야 한다. 투약량은 원하는 치료 목표를 이루기 위하여 개별적인 의사 또는 수의사에 의해 또한 조절될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "약제학적으로 효과적인 양"에 포괄되는 정확한 양은 투여 경로, 치료될 개체의 유형 및 이러한 고려사항에 있는 특정 개체의 신체 특징에 따라 달라질 것이다. 이들 인자들과 이 양을 결정하는 이들의 연관성은 의학, 수의학 및 기타 관련된 기술에 종사하는 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 이 양과 투여 방법은 최적의 효과를 얻기 위하여 맞춰질 수 있지만, 체중, 식사, 병발 약물 및 당업자가 인지하는 기타 인자들에 따라 달라질 것이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제시되는 기술에 따라 SCF 억제제 (가령, SCF에 특이적인 항체)는 약제학적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구체예들에서, SCF 억제제 (가령, SCF에 특이적인 항체)는 치료적으로 효과적인 투약량으로 투여된다. 투약량과 빈도는 실질적으로 유해한 효과없이 SCF 억제제의 효과적인 수준에 도달하도록 선택된다. 투여될 때, SCF 억제제 (가령, SCF에 특이적인 항체)의 투약량은 일반적으로 일일 0.001 내지 10,000 mg/kg/day의 범위 또는 투약량(가령, 0.01 내지 1000 mg/kg/day 또는 투약량; 0.1 내지 100 mg/kg/day 또는 투약량)이다.
약제학적 조성물들은 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 운반체들, 희석제들, 또는 부형제들과 연관된 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함한다. 약제학적으로 수용가능한 운반체들은 당업계에 공지되어 있고, 이를 테면 예를 들자면, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro ed., 1985)에서 설명된 것들이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제시되는 기술에 따라, SCF 억제제 (가령, SCF에 특이적인 항체)의 단일 투약량이 개체에게 투여된다. 기타 구체예들에서, 다중 투약량은 수시간, 수일, 수주 등등의 간격을 두고 2회 또는 그 이상의 시점을 통하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 화합물들은 장기간(가령, 만성적으로), 예를 들자면, 수개월 또는 수년의 기간 동안(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상의 개월 또는 년; 가령, 개체의 일생 동안). 이러한 구체예들에서, 장기간 동안 화합물들은 일정하게 계획된 일정(가령, 매일, 매주, 등등)에 따라 취할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제시되는 기술에 따른 SCF 억제제 (가령, SCF에 특이적인 항체)는 또다른 화합물 또는 하나 이상의 다른 화합물(가령, 2개 또는 3개 또는 그 이상의 다른 화합물)과 함께 공동-투여된다.
5. 키트
일부 구체예들은 개체를 치료하기 위한 키트들을 본 명세서에서 제시한다. 일부 구체예들에서, 키트들은 SCF의 억제제 및 적절한 용액들과 완충액들을 포함한다. 구체예들은 사용을 위한 모근 관리 및 지침들을 포함한다.
실시예들
재료 및 방법들
SCF 뉴클레오티드 서열들 및 단백질들
줄기 세포 인자 (SCF)를 인코드하는 인간 유전자는 키트 리간드로 알려져 있고, 공식적인 기호 KITLG 및 HGNC 번호 HGNC:6343을 가진다. SCF는 SF; MGF; SCF; FPH2; KL-1; Kitl; SHEP7; 및 kit-리간드로도 또한 알려져 있다. 이들 유전자에 대해 상이한 이소폼들을 인코드하는 2개의 전사체 변이체들이 발견되었다. SCF (kit 리간드) 이소폼 b 전구체는 GenBank 수탁 번호 NM_000899 (mRNA 전사체; 서열 번호: 3) 및 NP_000890 (단백질 서열; 서열 번호: 4)로 이용가능한다. SCF (kit 리간드) 이소폼 a 전구체는 GenBank 수탁 번호 NM_003994 (mRNA 전사체; 서열 번호: 5) 및 NP_003985 (단백질 서열; 서열 번호: 6)로 이용가능하다. NCBI 참고 유전자 서열은 수탁 번호 NG_012098 (서열 번호: 7)을 가진다. 양쪽 이소폼들의 경우, 첫 25개 아미노산들은 신호 펩티드를 포함하고, 성숙형은 아미노산 26에서 시작한다. 성숙형의 첫 11개 아미노산들은 EGICRNRVTNN (서열 번호: 8)이다.
블레오마이신 모델
특이적 병원균-없는(SPF) 암컷, CBA/J 마우스 (6-8 주령; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에서 60 μl의 인산염-완충된 염수(PBS)에 용해된 0.003 U의 블레오마이신 (Blenoxane, 멸균 황산 블레오마이신 ; Bristol-Meyers Pharmaceuticals, Evansville, IN; 0.15 U/마우스 체중 Kg)의 i.t.주사에 의해 간질 폐 섬유증을 유도하였다. 대조군들은 동일 경로를 통하여 60 μl의 PBS를 제공받았다. 모든 과정은 멸균 환경에서 실시되었고, 제도적의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.
온전한 폐 조직학
마취에 의해 유도된 안락사 이후, 블레오마이신-공격을 받은 마우스의 전체 폐는 10% 포르말린에서 완전히 팽창시키고, 잘게 잘라서, 24시간 동안 새로운 포르말린에 두었다. 통상적인 조직학적 기술들을 이용하여 파라핀 안에 전체 폐를 내장시키고, 온전한 폐의 5-μm 단편들을 헤마토실린 및 에오신으로 착색시켰다.
항-SCF 다클론 항체들의 생산 및 투여
토끼들을 재조합 (온전한 단백질) SCF로 면역화시키고, 그리고 다클론 SCF-특이적 항체들을 생산함으로써, 항-SCF 항체들이 만들어졌다. 단백질 G 컬럼을 이용하여 혈청으로부터 다클론 항체들을 단리시켰다. 단리된 IgG 부분을 정량화시키고, 염수내에 현탁된 명시된 농도로 이용하였다. 사전-면역 혈청으로부터 IgG를 유사한 방식으로 단리시켜, 대조군으로 이용하였다. 간단하게 설명하면, 100, 150 또는 200 μg의 대조군 또는 항-SCF는 블레오마이신으로 처리한 후, 7일 시점에 비강내 투여를 통하여 마우스에게 제공되었다. 이 처리는 블레오마이신 투여 후 12일 까지 일일 기반으로 반복되었다. 따라서, 처리 프로토콜은 치료요법적인 것으로 간주된다.
마우스 항-인간 단클론 항체들의 생성
면역성 인간 펩티드 (가령, 서열 번호: 1 또는 8)를 확인한 후, 표준 프로토콜을 이용하여 마우스를 면역화시켰다. 고역가 혈청 항체들의 판단은 적절한 면역화를 나타내었고, 융합 하이브리도마가 만들어졌다. SCF-특이적 항체에 대하여 개별 클론들로부터 배양 상청액을 분석하였고, 특이성에 근거하여 선택되었다. 이 펩티드에 대항하는 특이적 단클론 항체들을 생산하는 5개의 하이브리도마가 증식되었고, 최대 역가를 가진 단클론 항체들은 생물학적으로 관련 배양물에서 후속적으로 테스트되었다. 일부 구체예들에서, 서열 EGICRNRVTNN (서열 번호: 8)을 보유하는 펩티드를 이용하여 항체 (가령, 단클론 항체)를 만들었다. 일부 구체예들에서, SCF 단백질 서열 (가령, 서열 번호: 4 및/또는 서열 번호: 6에 의해 제공되는 것과 같은)의 임의의 펩티드 단편(가령, 항원성 단편)을 이용하여 항체들을 만들었다. 일부 구체예들에서, 돌연변이체 또는 변이체 형태(가령, SCF의 서열 번호: 4 및 서열 번호: 6)에서 제공되는 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는)를 이용하여 항체 생산용 펩티드를 제공한다. 이들 구체예들은 추가들, 삭제들, 치환들, 해독후 변형들 (가령, 당화, 환형화, N- 및 C-말단 변형, 등등)과 항체 생산을 위한 펩티드를 제공하는데 적용되는 것과 같이 분자 생물학 분야에 공지된 단백질 및 펩티드들의 기타 변이를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
마우스 항-인간 단클론 항체들의 테스트
단클론 항체들이 SCF를 저해한다는 것을 설명하기 위하여, SCF에 민감한 비만 세포계들을 테스트하였다. c-Kit를 반현시키고, SCF에 반응하는 HMC-1 세포계, 비만세포종 세포계를 우선 이용하였다. 간단하게 설명하면, HMC-1 세포들을 특이적 성장 배지에 성장시켰고, 1 × 106 세포들/ml의 농도로 24-웰 조직 배양 플레이트에 도말시켰다. 재조합 인간 SCF (1-100 ng/ml)는 단클론 항-SCF 항체 (12 μg/ml)와 혼합시켰고, 30분간 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리후, 이 항체/SCF 또는 SCF만을 HMC-1 세포들에 추가하였다. 1 시간 또는 24 시간 후, 배양된 HMC-1 세포들을 수거하였고, 그리고 mRNA 및 단백질 수준들은 단클론 항체들에 의한 SCF 억제 지표로 측정되었다.
정량적 PCR에 의한 mRNA 발현의 분석
테스트될 세포 또는 조직을 1 ml의 Trizol 시약(Invitrogen)에 분산시켰다. RNA는 설명된 것(Invitrogen)과 같이 단리시켰고, 5 μg의 mRNA를 역-전사시켜 유전자 발현을 평가하였다. 사이토킨 mRNA의 탐지는 기존의 이용가능한 프라이머/프로브 세트(PE Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 측정하였고, 그리고 ABI Prism 7500 서열 탐지 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 분석하였다. GAPDH mRNA는 mRNA 발현을 표준화하기 위하여 대조군으로 측정되었다. 유전자 발현에서 변화들은 도전을 받지 않은 마우스에서 유전자 발현과 비교하여 계산되었다.
사이토킨 생산의 측정
사이토킨의 단백질 수준은 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)으로부터 구입된 Bio-Plex 비드-기반의 사이토킨 분석을 이용하여 정량화하였다. 표준 프로토콜을 이용하여, 이 방법으로 사이토킨의 수준을 신속하고 일관성있게 평가할 수 있다.
통계학적 분석
Prism GraphPad 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 다른 언급이 없는 한, 나타낸 데이터는 2회 또는 그 이상의 실험을 대표한다. 모든 실험에서 통계학적 의미는 원-웨이 ANOVA, 이어서 Newman-Keuls 포스프 테스트로 측정되었다. 유의적인 차이는 p < 0.05로 간주되었다.
환자 집단으로부터 폐 섬유아세포들의 단리 및 증식
University of Michigan Medical School의 Institutional Review Board는 이 연구를 승인하였다. 모든 환자는 폐 X선 촬영, 폐 기능 측정, 그리고 광섬유 내시경 전에 세절편 컴퓨터 단층촬영(thin-section computed tomography)을 포함하는 임상적 평가를 받았다. 이들 환자에서 징후들, 생리적인 징후들, 그리고 방사능사진에서 발견된 편집물로부터 간질 폐렴(interstitial pneumonia)이 측정되었다. 2000년 5월과 2002년 5월 사이에 간질 폐렴으로 의심되는 환자들로부터 University of Michigan Medical School의 Clinical Core를 통하여 외과적으로 폐 생검을 획득하였다. 흉곽 절개를 통하여 환자로부터 잘라낸 견본들에서 조직학적으로 정상적인 폐를 수득하였다. 각 생검은 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)에서 멸균 기술을 이용하여 별도로 진행하고, 1차 섬유아세포계들의 배양을 위하여 처리하였다. 임의의 기타 임상적인 발견들에 대해 알고 있지 않았던 2명의 병리학자들은 각 생검을 독립적으로 검토하였고, 조직학적 분류는 특발성 간질성 폐렴에 대해 이미 공개된 기준에 근거하였다.
간질 폐렴 및 정상 생검을 잘게 자르고, 분산된 조직 조각들을 15% 태아 소 혈청(DMEM-15, BioWhittaker), 1 mmol/L 글루타민 (BioWhittaker), 100 U/ml 페니실린(BioWhittaker), 100 μg/ml 스트렙토마이신(BioWhittaker), 그리고 0.25 μg 암포테리신 B (Fungizone; BioWhittaker)가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM, BioWhittaker, Walkersville, MD)를 포함하는 150-㎠ 세포 배양 플라스크(Corning Inc., Corning, NY)에 위치시켰다. 모든 1차 폐 세포계들은 5% CO2 배양기내에서 37℃, DMEM-15에서 유지되었고, 그리고 총 5회 연속 계대되어, 순수한 폐 섬유아세포들 집단을 얻었다. 모든 1차 섬유아세포 세포계들은 하기에 설명된 실험들에서 6 내지 10 계대에서 이용되었고, 모든 실험은 필적가능한 조건하에서 실행되었다.
1. 항-SCF 항체는 섬유증 및 염증을 감소시킨다.
기술의 구체예들을 개발하는 동안 실행된 실험들에서 항-SCF 항체는 섬유증과 염증을 감소시킨다는 것이 증명되었다. 설명된 것과 같이 마우스에서 폐 섬유증이 유도되었다. 블레오마이신 손상 후 7일 시점에, 마우스들은 비강내 투여를 통하여 기도로 항-SCF 항체 치료를 받았다. 블레오마이신 노출 후 12일 시점까지 치료를 지속하였다. 16일 시점에 폐를 수거하였고, 현미경으로 검사하였고, 현미경 사진을 연속 촬영하였다. 폐 조직에서 항-SCF 항체들은 전반적으로 염증을 감소시켰다는 것이 증명되었다. 추가적으로, 콜라겐 침착을 나타내는 Masson의 트리크롬 착색(trichrome staining)이 감소되었다.
2. 항-SCF 항체는 SCF, 히드록시프롤린, IL-25, 및 IL-13 수준을 감소시킨다.
기술의 구체예를 발전시키는 동안 히드록시프롤린 및 특정 사이토킨의 수준을 감시하였다. 히드록시프롤린, 콜라겐 전구체의 존재에 대해 상기 실험으로부터 폐 조직 단편들을 검사하였다. 히드록시프롤린의 생산 및 SCF의 혈장 수준이 투약량-의존적 방식으로 감소되었다는 것이 데이터에서 증명되었다(도 1A 및 D). 또한, mRNA 수준의 함수로써 측정하였을 때 IL-25 및 IL-13 발현은 IL-25 수용체의 발현과 마찬가지로 감소되었다 (도 1B, C, 및 E).
특히, 실험들은 BLM 모델에서 항-SCF 항체 치료 효과를 테스트하였다(도 1). 0일 시점에 마우스를 염수(도 1, "SAL") 또는 BLM (도 1, "BLM")으로 처리하였다. 8일 및 12일 시점에서, 상이한 집단들을 기관지내로 표시된 투약량의 비-면역(도 1, "IgG") 또는 항-SCF 항체들(도 1, "aSCF")로 또한 처리하였다. 각 처리 집단으로부터 H&E 착색된 폐 조직 단편들을 획득하였고, 검사하였다. 폐 히드록시프롤린 함량으로 생화학적으로 섬유증을 정량화하였다(도 1A). 그 다음 실시간 PCR에 의해 IL-13 mRNAs에 대해 폐를 분석하였다(도 1C). SAL- 또는 BLM-처리된 마우스로부터 수집한 혈장 및 폐 조직을 ELISA (도 1D)에 의해 가용성 SCF(도 1D) 또는 실시간 PCR에 의해 IL-25 mRNA에 대해 분석하였다(도 1B). 값은 평균 +/- 표준 편차로 나타내고, n = 7이다. 단일 별표(*)는 염수 대조군과 비교하였을 때 통계학적 유의성(P < 0.05)을 나타내고, 이중 별표(**)는 BLM + IgG 조절 군에 대해 유의성을 나타낸다.
3. IL-4는 인간 섬유아세포들에서 c-kit 발현을 자극한다.
기술의 구체예를 발전시키는 동안 실행된 실험에서 IL-4는 인간 섬유아세포들에서 c-kit 발현을 자극시켰다는 것이 설명되었다. 폐 염증의 마우스 모델에 추가적으로, SCF 수용체는 과민성 폐렴으로 진단을 받고, 따라서, 사전-섬유증 환경을 보유한 환자들로부터 섬유아세포 집단에서 발현된다. 폐 섬유아세포들은 환자들의 정상 영역의 폐(정상)과 과민성 폐렴으로 진단을 받은 환자들로부터 생장시켰다. 1 또는 10 ng/ml의 IL-4로 자극한 후 c-kit의 발현을 측정하였다. 실시간 PCR을 이용하여 개별 세포계들 (133, 131, 173, 177A, 177B)을 평가하였다. 비-섬유증 질환들을 가진 환자들로부터 성장된 폐 섬유아세포들과 비교하였을 때, 과민성 폐렴 환자들의 섬유아세포들은 섬유증-관련된 사이토킨 IL-4로 자극될 때 c-kit의 상당한 상향조절을 나타내었다. SCF는 염증 병소의 섬유아세포들을 활성화시키지만, 정상 조직의 섬유아세포들은 활성화시키지 못하고, 그리고 콜라겐을 포함하는 섬유증-관련된 유전자의 발현을 촉진시켰다는 것이 데이터에서 설명되었다(도 2).
4. 마우스 항-인간 단클론 항체는 SCF-유도된 HMC 비만 세포 활성화를 차단시켰다.
기술의 구체예를 발전시키는 동안 실행된 실험에서 SCF에 특이적인 단클론 항체는 MCP-1 생산에 대해 HMC-1 세포들의 활성화를 억제하였다는 것을 설명하였다. 비만 세포의 활성화는 SCF-유도된 고유한 반응으로, SCF-중개된 사이토킨 반응의 항체 중화를 모니터하는데 이용할 수 있다. 기존 연구들에서 단세포 화학주성 단백질 (MCP)-1은 비만 세포들에서 SCF에 의해 상당히 상향조절된다는 것이 설명되었다. 서열 번호: 1 (도 3)에 대항하여 단클론 항체들이 만들어졌다. 100 ng/ml의 SCF로 자극된인간 비만 세포계, HMC-1을 이용하여 이 항체의 효과를 테스트하였다. 단클론 항체 (6 μg/ml)는 배양된 HMC-1 세포들 (1 × 106 세포들/ml) 상에 SCF 또는 SCF+항-SCF를 배치시키기 5분 전 재조합 SCF와 함께 사전항온처리되었다. 후속적으로 세포들을 12시간 동안 항온처리하였고, 그 다음 세포-없는 상청액을 수거하였고, Bio-Plex에 의해 MCP-1을 분석하였다. SCF에 특이적인 단클론 항체가 MCP-1 생산을 위한 HMC-1 세포들의 활성화를 억제시켰다는 것이 데이터로부터 설명되었다 (도 4).
5.
BLM-유도된 손상을 받은 SCF-결핍 마우스는 섬유증이 감소되었다.
본 명세서에서 제시되는 기술의 구체예를 발전시키는 동안, KitlS1/KitlS1-d 돌연변이체 마우스에서 SCF 결핍을 검사하였다(도 5). 이들 마우스는 한 개 대립유전자 (S1)에서 SCF 유전자가 완벽하게 결손되었고, 다른 유전자(S1d)에서는 막-결합된 리간드의 결손을 가지며, 이로써 가용성 SCF의 발현이 상당히 감소된다. 이들 마우스와 이들의 야행형 대조군(WT)은 BLM-유도된 폐 손상을 받았을 때, 야생형과 비교하여 돌연변이체 마우스에서 섬유증이 형태학적으로(Masson 트리크롬 착색) 그리고 히드록시프롤린 분석에 의해 생화학적으로 모두 상당히 감소되었다(도 5).
야생형 및 SCF 결핍 마우스는 0일 시점에서 염수("SAL") 또는 BLM ("BLM")으로 처리하였고, 21일 후에 폐를 수거하였다. 폐 히드록시프롤린 함량으로 섬유증을 생화학적으로 정량화하였다. 값은 평균 +/- 표준 편차를 나타내고, n = 3이다. 단일 별표(*)는 WT 염-처리된 조절 평균과 비교하였을 때 통계학적 유의성(P < 0.05)을 나타내고, 이중 별표(**)는 WT BLM-처리된 집단과 비교하였을 때 유의성을 나타낸다.
S1/S1d 마우스에서 사이토킨 발현과 텔로메라제 유도의 유사한 억제가 또한 나타났다. 이들 데이터를 함께 취합하면, SCF/c-Kit 신호생성 유도된 폐 섬유증에 대한 기본적 역할을 나타내었다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공고 및 특허들은 모든 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 설명된 조성물들, 방법들 그리고 기술의 용도들의 다양한 변형 및 변이들은 설명된 기술의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않고 당업자들에게 자명할 것이다. 기술들이 특정 예시적인 구체예들과 연관하여 설명되고 있지만, 청구되는 본 발명을 이러한 특이적 구체예들로 과도하게 한정시켜서는 안된다. 또한, 약학, 생화학, 의학 또는 관련 분야의 당업자들에게 자명한 본 발명을 실행하기 위한 설명된 방식들의 다양한 변형들은 다음의 청구범위내에 있는 것으로 의도된다.
<110> The Regents of the University of Michigan
<120> Stem Cell Factor Inhibitor
<130> IPA130651
<150> US 61/431,246
<151> 2011-01-10
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
tcgtcgtcga accgcaaagc gaaaaacccg ccgggcgatt cgtgc 45
<210> 3
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gggcttcgct cgccgcctcg cgccgagact agaagcgctg cgggaagcag ggacagtgga 60
gagggcgctg cgctcgggct acccaatgcg tggactatct gccgccgctg ttcgtgcaat 120
atgctggagc tccagaacag ctaaacggag tcgccacacc actgtttgtg ctggatcgca 180
gcgctgcctt tccttatgaa gaagacacaa acttggattc tcacttgcat ttatcttcag 240
ctgctcctat ttaatcctct cgtcaaaact gaagggatct gcaggaatcg tgtgactaat 300
aatgtaaaag acgtcactaa attggtggca aatcttccaa aagactacat gataaccctc 360
aaatatgtcc ccgggatgga tgttttgcca agtcattgtt ggataagcga gatggtagta 420
caattgtcag acagcttgac tgatcttctg gacaagtttt caaatatttc tgaaggcttg 480
agtaattatt ccatcataga caaacttgtg aatatagtgg atgaccttgt ggagtgcgtg 540
aaagaaaact catctaagga tctaaaaaaa tcattcaaga gcccagaacc caggctcttt 600
actcctgaag aattctttag aatttttaat agatccattg atgccttcaa ggactttgta 660
gtggcatctg aaactagtga ttgtgtggtt tcttcaacat taagtcctga gaaagattcc 720
agagtcagtg tcacaaaacc atttatgtta ccccctgttg cagccagctc ccttaggaat 780
gacagcagta gcagtaatag gaaggccaaa aatccccctg gagactccag cctacactgg 840
gcagccatgg cattgccagc attgttttct cttataattg gctttgcttt tggagcctta 900
tactggaaga agagacagcc aagtcttaca agggcagttg aaaatataca aattaatgaa 960
gaggataatg agataagtat gttgcaagag aaagagagag agtttcaaga agtgtaattg 1020
tggcttgtat caacactgtt actttcgtac attggctggt aacagttcat gtttgcttca 1080
taaatgaagc agctttaaac aaattcatat tctgtctgga gtgacagacc acatctttat 1140
ctgttcttgc tacccatgac tttatatgga tgattcagaa attggaacag aatgttttac 1200
tgtgaaactg gcactgaatt aatcatctat aaagaagaac ttgcatggag caggactcta 1260
ttttaaggac tgcgggactt gggtctcatt tagaacttgc agctgatgtt ggaagagaaa 1320
gcacgtgtct cagactgcat gtaccatttg catggctcca gaaatgtcta aatgctgaaa 1380
aaacacctag ctttattctt cagatacaaa ctgcagcctg tagttatcct ggtctctgca 1440
agtagatttc agcttggata gtgagggtaa caatttttct caaagggatc tggaaaaaat 1500
gtttaaaact cagtagtgtc agccactgta cagtgtagaa agcagtggga actgtgattg 1560
gatttggcaa catgtcagct ttatagttgc cgattagtga tatgggtctg atttcgatct 1620
cttcctgatg taaaccatgc tcacccatat cccactatac aaatgcaaat ggttgcctgg 1680
ttccatttat gcaagggagc cagtactgaa ttatgccttg gcagagggga gactccaaaa 1740
gagtcatcgc aggaagaagt taagaacact gaacatcaga acagtctgcc aagaaggaca 1800
ttggcatcct gggaaagtcc gccttttccc ttgaccacta tagggtgtat aaatcgtgtt 1860
tgcaaaatgt gttatgatgt gtttatattc taaaactatt acagagctat gtaaagggac 1920
ttaggagaaa atgctgaatg taagatggtc ccatttcaat ttccaccatg ggagagccta 1980
aaaataaatt atgacattta gtatctaagg ttagaaaacc acgcccacat gctaatatgg 2040
gtgttgaaaa ctaggttact tataatgcaa ggaatcagga aactttagtt atttatagta 2100
taatcaccat tatctgttta aaggatccat ttagttaaaa tcgggcactc tatattcatt 2160
aaggtttatg aattaaaaag aaagctttat gtagttatgc atgtcagttt gctatttaaa 2220
atgtgtgaca gtgtttgtca tattaagagt gaatttggca ggaattccca agatggacat 2280
tgtgctttta aactagaact tgtaagacat tatgtgaata tcccttgcca atttttttta 2340
taataagaaa acatctgact aaagtcaaag aatgatttct tatggtttat tttgatgaaa 2400
gttcttttaa catgtcttga atgtacacat aaaggaatcc aaagctttcc attctaactt 2460
aatctttgtg ataacattat tgccatgttc tacaaccgta agatgacagt tttcaatgta 2520
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aatttctagt atatttggat tttagcttct gttcaaagca aatccagatg caactccagt 2640
aagtggcctt tgctcttttt tgtaccaaag agcccagatg attcctacag tccctttctt 2700
ctctaacatg ctgtggttcc ttaaatatga gtaatttctc taagatataa cccaggtgct 2760
ttgagaagct gcattaaggt gttcaggccc tcagatatca catggtacac ttgattagta 2820
ataaaaccag agatcaattt aaattgctga taggtcctgt ctcagtgtgt ggcattgact 2880
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agaagataga tacttctcaa tctagtagtt tgatttattt aaccaatggt ttcagtttgc 3000
ttgagcatat gaaaatcctg cttaatgtgc ttaagagtat aataaatgtg tacttttgtc 3060
ctcaaaccta gtagctgggt tttaacactc atggacatgg tcttaatcaa tggagttaaa 3120
taaacaaatt cagcaagtta ttaaatctga catggtagga gaggggagat gtgtcctgct 3180
tattaaatgt gttggtccat tgaaagttac atggattgcc aatttttaaa acactaaagt 3240
tgaataaaat gcatgaacaa tagaaaaatg ctgaacatta ttttggatgc tagctgcttg 3300
gacattaact gtgttatttc tgctttgaga tgaaaatata tatttatctt tgcttatttt 3360
atcccagatg tgttctgaat atccttcttc ataaatcatg gaaaactcac tgctgagata 3420
gtaaaccatg aaatcgcctt ttcagttggt gccatgtatc tgacagttcc atcttggaag 3480
gtttcaaaat taccttttaa aatgatctca gaagtctgta gattctcaat gatactgaaa 3540
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cactgccaca ttttaatgag tcagagaaaa attaattttt cttcaataca ataatagaac 3720
aagtagccta ttctcttaaa aagtatgtga aaagaaaatt atgaaaaaat atgcatacct 3780
aatgaagtat tggttttagt aagaattaaa tacatttcat tgagctttaa agtactttgg 3840
agaaactttg gggcacgttt tcctactcta attcaactaa agttataaat aaagagaaaa 3900
actcattcag aaatcatgga ttttaaaaat attttactgc agccaagttt tcatttcaaa 3960
atgtaatttc agtttggagc ttttaggcat tatgtatatt taaaaaatat attcttcaaa 4020
aatgcatttt ggcatggtgg gatggatgtt gcaaaagata tccggagcct ccagtctgtc 4080
attaactgat atggtaaatc acctctcttc tttgggtctc aattttttat ttatctatat 4140
ggtaaactca gagatcactc cttaggggtg agtcctattg caatatgacc gacaaagaag 4200
acaaaatagc attgaaacta acccatacaa aatatccaac tctggattct gtgaataagt 4260
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tttagtcata ttagtcagga tgagaaacta taagatgtgt gtaacatttg gaaatgcacc 4500
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ttgaaatgcc tttgtttgta aaaataaaat aatggtactt tcattttata acaaggtgtt 4860
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<213> Homo sapiens
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Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg
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Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro
35 40 45
Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu
50 55 60
Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser
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Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser
85 90 95
Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val
100 105 110
Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys
115 120 125
Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe
130 135 140
Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr
145 150 155 160
Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg
165 170 175
Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro
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Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg
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Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu
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Val
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<213> Homo sapiens
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ggggtgagtc ctattgcaat atgaccgaca aagaagacaa aatagcattg aaactaaccc 4140
atacaaaata tccaactctg gattctgtga ataagtatct tgaccataaa aagtcattgc 4200
tgttcttgtt tctaatgtaa atagtgtcca ttagtaaaag tgaaattcag tcttaagtag 4260
ggtgaattgg atcaccattt acacaagaga tggctttttc ctttgcttga ataaacattt 4320
tggatcacct ccaaagaatg aaaaccagta gtacgtttta gtcatattag tcaggatgag 4380
aaactataag atgtgtgtaa catttggaaa tgcaccaaag tgagcgttta aatcttctca 4440
ttttattgaa aactaagagc agaaaatgta aaatgctcat gaaggttttg aatgccaaaa 4500
gatattttag aatcaattta taaaggggta attcattaat tacactttaa aattggaaag 4560
tgggataaga aatctaaagt aaaccagctt atctttgaaa caatattatt ttgaaattgg 4620
ctttaaaata aaaccattca gattgaaatt ctaattagct catttgtgga gtttgatcac 4680
acaattcata atgttgctgc tttccattaa ctagtcttga aatgcctttg tttgtaaaaa 4740
taaaataatg gtactttcat tttataacaa ggtgtttttt tcaagaaata atccatgcta 4800
aaatggatat ttgtgatcct gaaatgttta ctaagcattg taaatttatt tataactgcc 4860
atctccaact acatccttat gatgttttta acaataaaat taaaacaact gttaaactaa 4920
aaaccacacc gttttccagt acttgatctc tgagctacaa tactcactaa atataatttt 4980
ccaatcaaaa tattctattc tatattctaa gggttaatat gtgattatag tgtccacttg 5040
ccaccatttt tttaaatcaa tggacttgaa aagtattaat ttagatggat gcgcagatat 5100
accctcagtt cagtcataga ttggagtttg catataataa tgtaaatgta tgtcgacact 5160
attctaaata gttctattat gactgaaatt taattaaata aaaaaggttg taaaatgtga 5220
tgtgtatgtg tatatactgt atgtgtactt tttaaaatag gtgtatgtcc caaccctttt 5280
ttatacaggt ttgaatttaa aattacatga tatatacata tactttattg ttctaaataa 5340
agaattttat gcactctcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 5376
<210> 6
<211> 245
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg
20 25 30
Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro
35 40 45
Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu
50 55 60
Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser
85 90 95
Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val
100 105 110
Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys
115 120 125
Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe
130 135 140
Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr
145 150 155 160
Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Gly Lys Ala
165 170 175
Lys Asn Pro Pro Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu
180 185 190
Pro Ala Leu Phe Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr
195 200 205
Trp Lys Lys Arg Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gln
210 215 220
Ile Asn Glu Glu Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu Lys Glu Arg
225 230 235 240
Glu Phe Gln Glu Val
245
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<211> 94673
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
agaatactct gtgaacttat tatgtatttc atcattttca aggctggtaa aatcacacgc 60
cttcacatag gcaaagagaa cttcacattc ttgtagtttg gaaactccat aggaaggaga 120
tactgttccc cattagctca agcacaaaag tcccacagtg gattctgatt ggcccatctc 180
atgtgatgta cccattcctc caccaatcag gactggacag atcagggtac taagcctatc 240
tccgatagtg gaaggaggtg ggaaaacaga accatgtgaa tgacagtctc tcttgaaaga 300
taaggaatag tctgaattct ctaagtgaaa gtgagtgcta ataatggaag aagagtgaca 360
ggaaagtgtg ctaagcaaat aaaaaaaaaa aaaatctaag ccgggcatgg tggctcacgc 420
atgtaattcc agcactttgg gaggccaagg cgggcagatc acctgaggtc agcagttcga 480
gaccagcctg agcaacatgg agaaaccccg tctctactga aaatacaaaa cttagtcagg 540
catggtggtg catgtctgta atcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga gaatcgcttg 600
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caagagtgaa gctctgtccc cccccgacaa aaaaaaattc ctaaccacag tccatatgtc 720
taggttagat catggttttc ccatttatca attgagggat cttgagcaaa tcaccatact 780
tctttgatcc tcagtttcct tatttatcaa gtagaaaagt taaaaattac ctctcttaca 840
tgattgtcat aagaagttat tgacagaata taaactaagg gcttagacca attcctggct 900
tatatgggca acagcaacct aattgaccaa tatttaaggg attcgctctg ttctttcccc 960
tgtgacagat attgacaata aaataatgag caagggcagt cataattact ttaaccaaat 1020
agtcaaacaa acaaatacaa aactgcagtt gttttataaa aaataggtaa ttcatgctcg 1080
actttatagt aagaggagaa ttgaacaaag caaagagatc agggaaaacc tccctgagga 1140
agaaaatata gggaatactg agttgagatc tacatgataa atgcatactt actgggcaca 1200
atgatagggt gaaacaaagt ggtccaaaca gaggcagaaa ggagggtatt tgcaaatggc 1260
ctgaggtgag aattatgagg acagaagggc cttggccctg gaaaaaaggg agcacataat 1320
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attacacctg cctcttaaca acaaaaacga taaagctcag gaaaaaagct tttcaaaatt 1740
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tgctggcctg catcccctat caaaagccag tcttaaggag agatctcagt cattctgacc 2040
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tttaaacata atattctgat acaccatatt ggataacaat caaggcacca tattttgcaa 7980
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caccgcaaac tcatcggtgc tcacttgaaa aagcaagcct tgttcacctt tgcagaaagg 11700
gcatccccac tgcataattg catccctgtg caaacctggg aagaaagagc acaggttgga 11760
ggggggcgtt gtgtttgtct tgtatgccca tactgtgttg ccttttcagg agcagaagtt 11820
catctgctga acataagccc tgtgagtgct tagaactttt ccctcttttt caccttgaca 11880
taaaatccct aaagctgagg acctttccct ttcaatgtct tcactctgct ccagggctga 11940
attgcatctc attattggct tgtttcacct aaatgtgagt atttgagtgg cagtgaacca 12000
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acgacattcg tcccatgaca tttgggagtg gattaggata cggaaaccca ggccatttgt 82800
ttaggaggaa aaaagatggt attttaaagc aaccatagtc aaacaactta tgaatgtgtt 82860
gaatagtcag ttagcattcc aagaaaagag ttaggtcttt ctgtttcttg ctgtaccctc 82920
aacacctaac ttgctgcccg tgcattgttg gctctctata aatgtttgtt gaatgagaga 82980
ctgagtgagt gactcagccc taaatgaaag tttaagcaaa tggcaaagaa gattgttctt 83040
ctgaagtagg gtttgttttt atcttttgtg tgaatgtgtg tatttaatgt attgggttgg 83100
attaatgaga cagcaaggta tgcatatcaa gggggaatat aatcacatga gaaattaact 83160
aataaattat ttttcttaag gtatgaatta ttactcatgt ataaaatgaa tcacattagc 83220
caggttaaag aagccagaat tatccagaaa aaaacccagc tcacttattc agtagtcaat 83280
gggaaataga tggcagaatg aatgaaaaca tgactcattc tccttcacaa agtgccttac 83340
tcgtcatctc tgcaaagctc caccaaggct caggtcacat actgccacct acaaaaacct 83400
gacttcccaa atgaaaataa tctctatttc tggccctcta aatagatttc atatgacact 83460
tggtaggaca tcacagtcac ctaaatgaac attttgtgcc cttttcaaaa ccataaactc 83520
ttagggggca ggattttttt ttcttaattt agttttggag ccccactaaa caatgtcact 83580
tatactgtgc acatataaat gatgaataac tatttgttga ataaattaat ggaaagatga 83640
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aaacttgtat gtgtctatga gtacataaga attcaaatgc tgagggaaaa gtaggaaaag 83760
aggtagaaaa gggccagttc gtcctcagaa tctgaaaacc ccaaagtaaa aatgtgtgta 83820
tatcatttgt aatcatctat tgactaccca ttatatgaag taaaccctta catttggcct 83880
tctaccagca gagatggaaa accctccaag gaactcttaa gtctagttcc tagataggtg 83940
tgtagtagag ggaaggtctg ggagaacaaa ctgtgatgtg gttggagaga aaatcttcta 84000
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tatacattta aaaaatagat ataatttgga ttataatcat tttcttggtt aacaaggaag 84120
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ataggaagac cccatctcta caaataattt aaaaattggg tgggcatagt ggtatgcacc 84540
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gctgtaataa gccatgatca aatcacagca ttccaacctg ggtgatagag caaggcctgg 84660
tctcaaaata taaaaataaa aaattaactg aagtgtgttt atttgacacc atgcgtgaga 84720
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tagcatccta caaaaacctt tttcatattg ggttgtggat agcaaagatt aagatagata 84840
aataaaacag atggattaca ttaaaaactt tatgttaata cgttacagga aacttttgct 84900
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agcttaatat aactttgttg tgtcctcaaa ttgtttatag cctacaaaag gaaatcagac 85020
atatacataa taaccaattt ttaaaagtga actaaaagtt tacagagtta ctttgatcaa 85080
agtccaggcc tctgcatatg ttcatacaag ttgtgaattc aacacagttc tagatactgg 85140
aatgaatgac atattagaat tgagcacacc caaatacagt tacctatttt tgaaaggaga 85200
gagaaatcac taacaatagg agaaaagctt cactttgtaa gtggtggagg tagcatctgt 85260
actgagcaca tggcgtaaac taagtcagta tagtcccaaa gtagaaactg tgttcaaggg 85320
tcagtttgga cagttggatt ccagtggaag tcacatataa agagttaaat gctgagaaga 85380
aagggtgagc atcggtttga gaaagggttt gaattccagg aatggggctt aaatgccttg 85440
tgtcacataa ggaggtattg ggagaaaatg gtgtaggaaa gatgtgggtg acaatcaaag 85500
ctgaggtgtg agaaaactaa tcgggtgttg gtatggcaag atgtacggga gtggttaact 85560
agagaaattg agtccactta ccaggccagt ctttaaataa gatgtgagag agaatgacaa 85620
ctgaattagc atcagggcca ggaaataaga aagcatagac catttgaaga cattgcagta 85680
aaagaatcaa caaatcctag ttactaatgg gatgtgagac ttggcatcac aggcagaact 85740
caagaatgat ttggagacta tgggacttac cagagtgcgg tggcattaac aggaaatgga 85800
aaatcaggag aagaagctgt tggtaaatat tattgaaact aaccagtggc caaatatgtt 85860
agactggaac ttcagataac agtcaggcct ggaaagaatg atttgcaatt tgagagttat 85920
ctgcaaagaa tcttatttga gaccttgaaa gagaaattgc ttagtcacag aaatggcccc 85980
gtgtggttga tagtaaatag catgggtttg attgtggaga ggttcactaa agaaatacaa 86040
acaaaatttt ggtatatctg agctaagggg gaagaaaata aatcttagaa ttggaataaa 86100
ggacaagctg aagacaagct tggaaattta ggcctcaagg cttggcaatg gttggttacc 86160
aaatagcaag acctgtgatt ctttgctaga tgtttcctaa gactttcaaa gctttgggag 86220
tttggtttct gtagatacat tgtaaagcag atgattagaa aggattaggc ttggattcaa 86280
gccttgactc tttggtgtag aatactagat gaatttatat cagttatcag ttcatgtctt 86340
ttaaaccctg gtttttcatg tgtaatgagg gttagtgata aatgtactct tcttatttca 86400
caagggttct tgcaagaacc caggttatca ttataaaaat tgtagttttg ttctatggga 86460
aaacaggtgc cagtctttac gtttattttc tttgctaagt gacccgggga caaaaatcaa 86520
aaatagattt ccaatcttct ctacatttaa ttctctctct ctctctttct ttcttgagag 86580
tctttctttc ttaagagtct tgctctgtag cccaggctgg agtgcagtgg cgtgatctca 86640
gctcactgca acctccgcct cctgggttga agggggtttt gtgcctcacc cccagagtag 86700
ctgggactac agatgtgcac taacacaccc agctaatttt tgtattttta gtagagacag 86760
ggtttcacca tgttggccag gctggtctca aactcctgac ttcagatgat ccgcctacct 86820
cagcctctca aagtgctggg attacaggtg tgagccacca tgcctgtcct atatttaatt 86880
ctctatatta agctttgtgt ttccaattat ttatacattt aaaaaataca tccttttgct 86940
ttttgtgatt cccttttgct ttctaaccat gcttttaaaa tatcttctat atattttgga 87000
tttctgaagt tttatcttag tatctcttaa tttttgttct agatttaatt ctgatttcct 87060
aaatacaggt tgtctagctt ctagagttct ctgcttggta aattgttgta taagacagtt 87120
tttaatatat tacatttaga gagactggaa aaatattgca attcttatta cactatggaa 87180
ttttatggct aatctgtgta atgatctcaa tactttaaaa acagtgatct gtgatgctgg 87240
gttgataaac aaggacaaaa gtagtgaaag agattgagca gagaagacga gaaatgcaaa 87300
acacatttat ttagagactg ggattgaaga tgggatgata ccatctatat gtattttttt 87360
taagtagaga aggaaataca aatactttac tggaaagttg aaacatctga aagctagtag 87420
attaacacaa gtactgaata actaaaacaa aatatggctt tcatgcttca acaagtacaa 87480
taagctatgc tgaggccaaa cgaactttcc ccagaacttt gttgggatgc ggtgccaaga 87540
ttacagtctt tctttttttg gttggaagta ttgaacgaaa tctttctgct gctatttcct 87600
cagctggaag aaatgattgc tagaacctaa ctagatagtc aagatactag agcggctcag 87660
tggccatgtg aggctattac ttgttggtgg ccattgacca gcttctccac ctgtcttagg 87720
gatctctttc atgctactcc atctatctcc atttctctaa tctccactct ccagacactt 87780
tgttcgtcaa tccttctccc ttcacccctg tttactacct tttataatct tgctagagaa 87840
attcaaagct aactaagttg ataattatat tatcacaaac tgagatcatt ggtagaatgt 87900
caggaggtat gaaagtcaca gggtgaaata tttattgagt gtctattaag tgccagacat 87960
tattataaga gtggaggtac agcagtaaaa gagatagaga agctccctgc cctcatggag 88020
cttacatttt aatgggagga catagataat aaacaaaaag taagattgtt tcagataatg 88080
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atatgatttc ggctattgag atttttaaaa aggcagaagg cagatacacc ataatctctc 88260
ttttcttcct tcctttctag gctggtaaca gttcatgttt gcttcataaa tgaagcagct 88320
ttaaacaaat tcatattctg tctggagtga cagaccacat ctttatctgt tcttgctacc 88380
catgacttta tatggatgat tcagaaattg gaacagaatg ttttactgtg aaactggcac 88440
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attcttcaga tacaaactgc agcctgtagt tatcctggtc tctgcaagta gatttcagct 88680
tggatagtga gggtaacaat ttttctcaaa gggatctgga aaaaatgttt aaaactcagt 88740
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agaacttgta agacattatg tgaatatccc ttgccaattt tttttataat aagaaaacat 89580
ctgactaaag tcaaagaatg atttcttatg gtttattttg atgaaagttc ttttaacatg 89640
tcttgaatgt acacataaag gaatccaaag ctttccattc taacttaatc tttgtgataa 89700
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ggttccttaa atatgagtaa tttctctaag atataaccca ggtgctttga gaagctgcat 90000
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gaacaataga aaaatgctga acattatttt ggatgctagc tgcttggaca ttaactgtgt 90540
tatttctgct ttgagatgaa aatatatatt tatctttgct tattttatcc cagatgtgtt 90600
ctgaatatcc ttcttcataa atcatggaaa actcactgct gagatagtaa accatgaaat 90660
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ttttaaaatg atctcagaag tctgtagatt ctcaatgata ctgaaagctt tgcacctctt 90780
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aatgaagtgt tcctggatat tgtattgtaa tttaatgtgc ttaccacact gccacatttt 90900
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cttaaaaagt atgtgaaaag aaaattatga aaaaatatgc atacctaatg aagtattggt 91020
tttagtaaga attaaataca tttcattgag ctttaaagta ctttggagaa actttggggc 91080
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catggatttt aaaaatattt tactgcagcc aagttttcat ttcaaaatgt aatttcagtt 91200
tggagctttt aggcattatg tatatttaaa aaatatattc ttcaaaaatg cattttggca 91260
tggtgggatg gatgttgcaa aagatatccg gagcctccag tctgtcatta actgatatgg 91320
taaatcacct ctcttctttg ggtctcaatt ttttatttat ctatatggta aactcagaga 91380
tcactcctta ggggtgagtc ctattgcaat atgaccgaca aagaagacaa aatagcattg 91440
aaactaaccc atacaaaata tccaactctg gattctgtga ataagtatct tgaccataaa 91500
aagtcattgc tgttcttgtt tctaatgtaa atagtgtcca ttagtaaaag tgaaattcag 91560
tcttaagtag ggtgaattgg atcaccattt acacaagaga tggctttttc ctttgcttga 91620
ataaacattt tggatcacct ccaaagaatg aaaaccagta gtacgtttta gtcatattag 91680
tcaggatgag aaactataag atgtgtgtaa catttggaaa tgcaccaaag tgagcgttta 91740
aatcttctca ttttattgaa aactaagagc agaaaatgta aaatgctcat gaaggttttg 91800
aatgccaaaa gatattttag aatcaattta taaaggggta attcattaat tacactttaa 91860
aattggaaag tgggataaga aatctaaagt aaaccagctt atctttgaaa caatattatt 91920
ttgaaattgg ctttaaaata aaaccattca gattgaaatt ctaattagct catttgtgga 91980
gtttgatcac acaattcata atgttgctgc tttccattaa ctagtcttga aatgcctttg 92040
tttgtaaaaa taaaataatg gtactttcat tttataacaa ggtgtttttt tcaagaaata 92100
atccatgcta aaatggatat ttgtgatcct gaaatgttta ctaagcattg taaatttatt 92160
tataactgcc atctccaact acatccttat gatgttttta acaataaaat taaaacaact 92220
gttaaactaa aaaccacacc gttttccagt acttgatctc tgagctacaa tactcactaa 92280
atataatttt ccaatcaaaa tattctattc tatattctaa gggttaatat gtgattatag 92340
tgtccacttg ccaccatttt tttaaatcaa tggacttgaa aagtattaat ttagatggat 92400
gcgcagatat accctcagtt cagtcataga ttggagtttg catataataa tgtaaatgta 92460
tgtcgacact attctaaata gttctattat gactgaaatt taattaaata aaaaaggttg 92520
taaaatgtga tgtgtatgtg tatatactgt atgtgtactt tttaaaatag gtgtatgtcc 92580
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ttctaaataa agaattttat gcactctcat aaatttaccc tgtcatttta tatcttaagg 92700
ttatcacata tgtctacaac atggttgaac atttattaag ctacagtcaa aattttctgt 92760
ggaaactttt gtcattaatc tagattttat taagctacag tcaaaatttt ctatggaaac 92820
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attcaataaa tatttattga ttactaaaat aagtaatcaa ggaaaataaa aaatgaatta 92940
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tcctctgttt accttttata ttgccaactt cgaccaatat atgactagat aactagaata 93660
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ccctatccac tccccatttt gtatcatttt caggaaagta cttaaaagta tttgatctgg 94260
aaacatttct atgtatatct ctgttaactt tcagaaagcg taaccctgat acccttgtta 94320
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taactctttt acactgtaca ctgcagtatt gcactagagt agggtataaa atacagttaa 94440
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aatctttacc cactgcacca taataaccag gaaattatag ataggcatta cga 94673
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn
1 5 10
Claims (30)
- 줄기 세포 인자 이소폼 b에 특이적으로 결합하는, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편으로서,
상기 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편은 SEQ ID NO:1에 의해 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 단클론 항체인 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 다이아바디(diabodies) 또는 선형 항체인 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 인간화된 항체인 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 다클론 항체인 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab′, F(ab′)2, F(ab′), F′(ab)2, Fv 단편, 또는 scFv 단편인 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 재조합 기술에 의해 제조되는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편은 조합 항체 디스플레이 기술(combinatorial antibody display technology), 파아지 디스플레이 기술, 또는 발현 라이브러리 기술에 의해 제조되는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편은 폴리펩티드 합성에 의해 제조되는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 체세포 혼성화, 하이브리도마, 또는 배양물내 연속 세포주(continuous cell line)에 의해 제조되는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 B 림프세포들의 바이러스성 또는 발암성 형질변형에 의해 생성되는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 항체는 재조합 숙주 세포에 의해 생성되는 것인, 항-줄기 세포 인자 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편.
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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