ES2573404T3

ES2573404T3 - Anticuerpos contra un ligando inductor de proliferación (APRIL)

Info

Publication number: ES2573404T3
Application number: ES10706979.1T
Authority: ES
Inventors: Jan Paul Medema; Van Hans Eenennaam; Marco Guadagnoli; Fiona Clare Kimberley; Uyen Truong Phan
Original assignee: Aduro Biotech Holdings Europe BV
Current assignee: Aduro Biotech Holdings Europe BV
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2016-06-07
Anticipated expiration: 2030-02-23
Also published as: EP3103476A3; US20130273064A1; CA2754127C; ES2928709T3; AU2010220421B2; US9000128B2; DK3103476T3; JP5867706B2; EP3103476A2; AU2010220421A1; AU2010220421A8; DK2403528T3; EP2403528A2; EP2403528B1; JP2012519198A; HRP20160702T1; US20130295103A1; WO2010100056A3; SI2403528T1; EP4147719A1

Abstract

Un compuesto de unión seleccionado de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une con APRIL humano que comprende: a) una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 10 y 11 respectivamente, o una variante de cualquiera de dichas secuencias que comprende hasta tres modificaciones de aminoácidos; y b) una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 13 y 14 respectivamente, o una variante de cualquiera de dichas secuencias que comprende hasta tres modificaciones de aminoácidos, en el que el compuesto de unión se une con el epítopo de APRIL humano conformacional SMPSHP, y preferentemente con IRSMPSHPDRA, y en el que el compuesto de unión bloquea completamente la unión de APRIL con TACI humano y bloquea al menos parcialmente la unión de APRIL con BCMA humano.

Description

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ejemplo, “aproximadamente” puede significar a una distancia de 1 o más de 1 desviación típica según la práctica de la técnica. Como alternativa, “aproximadamente” o “que comprende esencialmente” puede significar un intervalo de hasta 20 %. Además, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, las expresiones pueden significar hasta un orden de magnitud de hasta 5 veces de un valor. Cuando se proporcionan valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a no ser que se indique de otro modo, el significado de “aproximadamente” o “que comprende esencialmente” debería suponerse que está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor particular.

Se une “específicamente”, cuando se refiere a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, por ejemplo, APRIL, en una población heterogénea de proteínas y/u otros productos biológicos. Por lo tanto, en condiciones designadas, un ligando/antígeno específico se une a un receptor/anticuerpo particular y no se une en una cantidad significativa con otras proteínas presentes en la muestra.

“Administración” y “tratamiento”, como se aplica a un sujeto animal, humano, experimental, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refiere al contacto de un agente farmacéutico, terapéutico, de diagnóstico exógeno, o composición al animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. “Administración” y “tratamiento” pueden referirse, por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un fluido, en el que el fluido está en contacto con la célula. “Administración” y “tratamiento” también significan tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por un reactivo, diagnóstico, composición de unión o por otra célula.

Anticuerpos monoclonales

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales para APRIL humano de acuerdo con el conocimiento y la experiencia de la técnica de inyección en sujetos de ensayo de antígeno APRIL humano y después aislamiento de hibridomas que expresan anticuerpos que tienen la secuencia o características funcionales deseadas.

Se aísla fácilmente ADN que codifica los anticuerpos monoclonales y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente con genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma actúan como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan a células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá en más detalle posteriormente.

En una realización adicional, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature, 348, 552-554. Clackson et al., 1991, Nature, 352, 624-628, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581-597 describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por redistribución de cadenas (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10, 779-783), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res. 21, 22652266). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales.

Anticuerpos quiméricos

El ADN de anticuerpo también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo con la secuencia codificante dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos n.º 4.816.567; Morrison, et al, 1984, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81, 6851), o uniendo covalentemente con la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de material distinto de inmunoglobulina (por ejemplo, dominios proteicos). Típicamente dicho material distinto de inmunoglobulina sustituye los dominios constantes de un anticuerpo, o sustituye los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Anticuerpos humanizados y humanos

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos de una fuente que no es humana. Los restos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia restos “importados”, y se toman típicamente de un dominio variable “importado”. Puede realizarse humanización generalmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536), sustituyendo con CDR de roedores o secuencias de CDR las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos

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en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usare en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado “de mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta después como el marco conservado (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., 1987, J. Immunol. 151, 2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196, 901). Otro método usa un marco conservado particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras

o pesadas. El mismo marco conservado puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285; Presta et al., 1993, J. Immnol. 151, 2623).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con conservación de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Están disponibles habitualmente modelos de inmunoglobulina tridimensionales y los expertos en la materia están familiarizados con ellos. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse con su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse restos de FR y combinarse de las secuencias receptora e importada de modo que se consigue la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad aumentada por el antígeno o los antígenos diana. En general, los restos de CDR están implicados directamente y más sustancialmente en la influencia en la unión a antígeno.

La humanización de anticuerpos es una tarea de ingeniería proteica sencilla. Casi todos los anticuerpos murinos pueden humanizarse por injertos de CDR, dando como resultado la conservación de unión a antígeno. Véase, Lo, Benny, K. C., editor, en Antibody Engineering: Methods and Protocols, volumen 248, Humana Press, Nueva Jersey, 2004.

Como alternativa, es posible ahora producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras su inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de región de unión a cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362, 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immunology 7, 33; y Duchosal et al., 1992, Nature 355, 258. Los anticuerpos humanos también pueden derivar de bibliotecas de presentación en fagos (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227,381; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14, 309).

Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos anti APRIL humanizados introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en los ADN de anticuerpos anti APRIL humanizados, o por síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en, y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para los anticuerpos anti-APRIL humanizados. Se realiza cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales de los anticuerpos anti APRIL humanizados, tales como cambiar el número o posición de sitios de glucosilación. Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones de los polipéptidos de anticuerpos anti APRIL humanizados que son localizaciones preferidas para mutagénesis se denomina “mutagénesis de exploración de alanina”, como se describe en Cunningham y Wells, 1989, Science 244, 1081-1085. Aquí, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos con carga tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o con carga negativa (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con antígeno APRIL. Los restos de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan después introduciendo variantes adicionales u otras en, o por, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación en sí misma esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza exploración de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón diana o la región y las variantes de anticuerpos anti APRIL humanizados expresados se exploran con respecto a la actividad deseada.

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Figura 3 La Figura 3 muestra los ELISA de bloqueo del receptor para hAPRIL.01A, hAPRIL.03A y 12 anticuerpos monoclonales anti APRIL disponibles en el mercado conocidos. Esto ilustra que hAPRIL.01A y hAPRIL.03A son únicos en su capacidad para bloquear la unión de APRIL con BCMA (Figura 3A) y TACI (Figura 3B).

Figura 4 La Figura 4 muestra que hAPRIL.01A y hAPRIL.03A bloquean la proliferación de linfocitos B conducida por APRIL y el cambio de clase de isotipo pero no afectan a procesos mediados por BAFF. La Figura 4A es un ensayo de linfocitos B in vitro que demuestra que los anticuerpos monoclonales descritos bloquean funciones de APRIL conocidas tales como la supervivencia y proliferación de linfocitos B y producción de anticuerpos IgA con clase cambiada. Es importante la demostración de que ambos anticuerpos monoclonales bloquean la actividad de APRIL más eficazmente que TACI-Fc, que se administró a concentración equimolar. La Figura 4B muestra que los anticuerpos no afectan a las respuestas de linfocitos B conducidas por BAFF, mientras que TACI-Fc bloquea estos procesos.

Figura 5 La Figura 5 muestra los resultados de dirigir APRIL hAPRIL.01A y hAPRIL.03A (panel A) o TACI-Fc (panel B) in vivo, en una respuesta de linfocitos B independiente de T. Se expusieron ratones transgénicos a NP-Ficoll, y se trataron con hAPRIL.01A, hAPRIL.03A y TACI-Fc dos veces por semana. Se usaron PBS e IgG1 de ratón como controles negativos. Los títulos de inmunoglobulina (IgA, IgM e IgG) se midieron por ELISA. hAPRIL.01A, hAPRIL.03A y en menor medida TACI-Fc son capaces de inhibir respuestas de linfocitos B mediadas por APRIL en los ratones transgénicos hAPRIL y reducir los niveles de inmunoglobulina a los del WT.

Figura 6 La Figura 6 muestra el efecto de dirigir APRIL hAPRIL.01A, hAPRIL.03A y TACI-Fc en poblaciones de linfocitos B en el bazo (panel A) o en la cavidad peritoneal (panel B). Se expusieron ratones transgénicos a NP-Ficoll, y se trataron con hAPRIL.01A, hAPRIL.03A, TACI-Fc dos veces por semana. Se usaron PBS e IgG1 de ratón como controles negativos. Después de 30 días de tratamiento, se recogieron bazos y células de la cavidad peritoneal y se analizaron por citometría de flujo. El tratamiento con hAPRIL.01A o hAPRIL.03A no afectó a la (sub)población de linfocitos B en el bazo. Por el contrario, TACI-Fc redujo en gran medida la población de linfocitos B total y subpoblaciones madura y T2. En la cavidad peritoneal, TACI-Fc afectó a la relación de células B1 frente a B2, mientras que hAPRIL.01A y hAPRIL.03A no afectaron a estas subpoblaciones.

Figura 7 La Figura 7 muestra las secuencias de región variable de hAPRIL.01A y hAPRIL.03A. Las figuras 7A y 7B muestran las secuencias de aminoácidos de la secuencia variable de cadena pesada y ligera de hAPRIL.01A, respectivamente. Las Figuras 7C y 7D muestran las secuencias de aminoácidos de la secuencia variable de cadena pesada y ligera de hAPRIL.03A, respectivamente.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inmunización y selección de anticuerpos anti APRIL. Inmunización de ratones con ADNc de APRIL

Para generar anticuerpos contra la proteína APRIL humana, se subclonó un ADNc que codificaba la fase abierta de lectura de longitud completa de APRIL en el vector pCI-neo (Promega, Madison, WI). Se comprobó la expresión del vector obtenido por transfección transitoria de pCI-neo-hAPRIL en células 293 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA) e inmunotransferencia con IgG1 Aprily-5 de ratón anti hAPRIL (1:5000) (Alexis, San Diego, CA), seguido de IgG1-HRP de cabra anti ratón (1:2000) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL).

Los ratones se inmunizaron por inmunización con pistola génica usando una pistola Génica Helios (BioRad, Hercules, CA) y balas de oro recubiertas con ADN (BioRad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recubrieron partículas de oro de 1 μm con ADNc de pCI-neo-hAPRIL y vectores de expresión comerciales para Flt3L ratón y GM-CSF de ratón en una relación 2:1:1 (ambos de Aldevron, Fargo, ND). Se usó un total de 1 μg de ADN plasmídico para recubrir 500 μg de balas de oro.

Específicamente, se inmunizaron ratones BALB/c hembra de 7-8 semanas de edad en las orejas con una pistola génica, recibiendo 4 o 5 ciclos de un disparo en ambas orejas. Aproximadamente, se detectó un título de anti hAPRIL 1:3200 por ELISA en suero de ratón después de tres inmunizaciones de ADN en el ELISA, todas las etapas de incubación se siguieron de una etapa de lavado con PBST (PBS con Tween 20 0,1 %) 3 veces. Se recubrieron inmunoplacas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc, Rochester, NY) con anticuerpo policlonal de conejo anti FLAG (50 ng/pocillo en PBS) (Sigma, St. Louis, MO) durante una noche a 4 ºC y se bloquearon con suero de cabra 10 %/PBST durante 1 hora a TA. Las placas se incubaron con sobrenadante (1:4 en PBS) de células 293T transfectadas de forma transitoria con forma secretada de FLAG-hAPRIL conducida por promotor de CMV (pCR3-hAPRIL) durante 1 h a TA, seguido de incubaciones con diluciones de sueros de ratón e IgG de cabra anti ratón conjugado con HRP 1:2000 (Southern Biotechnology) durante 1 hora cada uno a TA. Después del lavado de PBST final, se visualizó la inmunorreactividad anti hAPRIL con 100 μl de sustrato OptiEIA TMB (BD Biosciences, Franklin Lake, NJ). Las reacciones se detuvieron con 100 μl de H2SO4 0,5 M y se leyeron las absorbancias a 460 y 620 nm. Los ratones que

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demostraron reactividad contra hAPRIL se inmunizaron una cuarta y última vez y se sacrificaron cuatro días después. Se prepararon poblaciones de células del bazo empobrecidos en eritrocitos como se ha descrito previamente (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134) y se congelaron a -140 ºC.

Selección de linfocitos B productores de anticuerpos anti APRIL

Para seleccionar clones de linfocitos B que producen anticuerpos anti APRIL, se sometieron 1,5 x 107 esplenocitos empobrecidos en eritrocitos a dos ciclos de selección negativa en 2,3 x 107 perlas activadas por tosilo Dynabeads® M-450 (Invitrogen, Carlsbad, CA) recubiertas con anticuerpo anti FLAG M2 (Sigma). Se usaron 50 μg de anticuerpo anti FLAG M2 para recubrir cada 1x108 perlas en 500 μl de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las perlas y la suspensión de esplenocitos se incubaron durante 30 minutos en hielo y se resuspendieron en DMEM F12/P/S/BCS 10 % frío. Los esplenocitos no unidos se separan de las perlas usando el MPC (concentrador de partículas magnéticas) Dynal (Invitrogen). Para la selección positiva, se incubaron esplenocitos con 2,3 x 107 perlas recubiertas con anti FLAG M2 unido con FLAG-hAPRIL durante 30 minutos en hielo. Las perlas y los esplenocitos no unidos se separaron como se ha descrito anteriormente con un total de 12 lavados. Se cultivaron linfocitos B específicos de antígeno como se describe en Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134. Brevemente, se mezclaron linfocitos B seleccionados con sobrenadante de linfocitos B 7,5 % (v/v) y 50000 células de apoyo EL-5 B5 irradiadas (2500 RAD) en un volumen final de 200 μl de DMEM F12/P/S/BCS 10 % en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos. El día ocho, los sobrenadantes se exploraron con respecto a reactividad a hAPRIL por ELISA como se ha descrito anteriormente. Se identificaron 21 sobrenadantes reactivos a APRIL y se ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir la interacción de APRIL con BCMA-Fc. En el ELISA, todas las etapas de incubación se siguieron de una etapa de lavado con PBST (PBS con Tween 20 0,1 %) 3 veces. Se recubrió una inmunoplaca de 96 pocillos Maxisorp con BCMA-Fc (50 ng/pocillo en PBS) (R & D Systems, Minneapolis, MN) durante una noche a 4 ºC y se bloqueó con suero de cabra 10 %/PBST durante 1 hora a TA. Se preincubaron sobrenadantes que contenían FLAG-hAPRIL con sobrenadantes de linfocitos B que contenían anticuerpos durante 1 hora a TA y después se añadieron a la placa recubierta con BCMA-Fc durante 1 hora a TA. Se detectó FLAG-hAPRIL unido por incubación con anticuerpo anti FLAG BioM2-biotina1 μg/ml (Sigma) y estreptavidina-HRP 1:2000 (Biotecnología Southern) durante 1 hora cada uno a TA. Después del lavado de PBST final, se visualizó BCMA-Fc unido a APRIL con 100 μl de sustrato de OptiEIA TMB (BD Biosciences). Las reacciones se detuvieron con 100 μl de H2SO4 0,5 M y se leyeron las absorbancias a 460 y 620 nm. Posteriormente, se inmortalizaron 8 clones de linfocitos B por minielectrofusión siguiendo los procedimientos publicados (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152, 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19, 125-34). Específicamente, se mezclaron linfocitos B con 106 células de mieloma NS-1, y se retiró el suero lavando con medio DMEM F12. Las células se trataron con solución de pronasa durante tres minutos y se lavaron con medio de fusión. Se realizaron electrofusiones en una cámara de fusión de 50 μl mediante un campo eléctrico alterno de 30 s, 2 MHz, 400 V/cm seguido de un pulso de campo elevado, cuadrado, de 10 μs, 3 kV/cm y de nuevo mediante un campo eléctrico alterno de 30 s, 2 MHz, 400 V/cm. Los contenidos de la cámara se transfirieron a medio selectivo de hibridoma y se sembraron en una placa de 96 pocillos en condiciones de dilución limitante. El día 14 después de las fusiones, los sobrenadantes de hibridoma se exploraron con respecto a actividad de APRIL y actividad de bloqueo de BCMA, como se ha descrito anteriormente. Se aislaron dos hibridomas anti hAPRIL definidos, denominados hAPRIL.01A y hAPRIL.03A y se subclonaron por dilución limitante para salvaguardar su integridad. Se confirmó la reactividad de hAPRIL y actividad de bloqueo de BCMA de los anticuerpos hAPRIL.01A y hAPRIL.03A con sobrenadantes de hibridoma (véase la Figura 1).

Ejemplo 2: Purificación y caracterización de anticuerpos anti APRIL Estabilización de hibridomas productores anti APRIL y purificación de anticuerpos anti APRIL

Se obtuvieron poblaciones celulares clonales para cada hibridoma por múltiples ciclos de diluciones limitantes (seis para hAPRIL.01A y cuatro para hAPRIL.03A). Se cultivaron hibridomas estables en medio sin suero usando biorreactores CELLine (Integra-Biosciences, Chur, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 7-10 días de cultivo, los sobrenadantes se recogieron y se filtraron a través de una membrana de nitrocelulosa de 0,22 μm. Los sobrenadantes se diluyeron 1:1 en tampón de unión de alta salinidad (glicina 1 M/NaCl 2 M, pH 9,0) y los anticuerpos se purificaron con columnas de proteína G HiTrap de 5 ml (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Después de lavado de PBS de la columna, los anticuerpos se eluyeron con glicina 0,1 M pH 2,7 y se neutralizaron con Tris 3 M. Se intercambió PBS por el tampón usando columnas de filtración en gel PD-10 (GE Healthcare). Se concentraron anticuerpos con unidades de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 (Millipore, Billerica, MA) y se cuantificaron usando espectrofotometría. Usando un kit de ensayo de isotipación de anticuerpos monoclonales de ratón (Serotec, Raleigh, NC), se determinó que el (sub)isotipo de los anticuerpos tanto hAPRIL.01A como hAPRIL.03A era IgG1, Kappa.

Análisis de unión

Se realizaron experimentos de ELISA basados en proteínas usando anticuerpos hAPRIL.01A y hAPRIL.03A purificados para determinar las afinidades de unión aparentes (presentadas como valores de CE50). La unión se comparó con IgG1 Aprily-5 anti hAPRIL de ratón (Alexis). Se recubrieron inmunoplacas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) con anticuerpo policlonal de conejo anti FLAG (Sigma) o BCMA-Fc (R & D Systems) a 50 ng/pocillo en PBS durante una noche a 4 ºC y se bloquearon con suero de cabra 10 %/PBST durante 1 h a TA. Las placas se lavaron

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Anticuerpo: Compañía Cat n.º

anti CD256, clon T3-6: BioLegend 318502

anti APRIL humano de ratón: LifeSpan Biosciences LS-C 18658

anti APRIL humano de ratón: LifeSpan Biosciences LS-C18659

anti APRIL humano de ratón: LifeSpan Biosciences LS-C18687

Anticuerpo monoclonal TNFSF13 (M01), clon H4-E8: Tebu-bio H00008741-M01

Anticuerpo monoclonal TNFSF13 (M02), clon G3: (ABNOVA) H00008741-M02

MAb APRIL/TNFSF13 humano (Clon 101115): R and D MAB884

Para estudiar si las características de bloqueo de hAPRIL.01A y hAPRIL.03A son únicas, todos los anticuerpos anti-APRIL disponibles en el mercado conocidos se ensayaron con respecto a su capacidad para bloquear la interacción de FLAG-hAPRIL con BCMA-Fc y TACI-Fc (Figuras 3A y 3B). El bloqueo de la unión con el receptor se estudió usando un ELISA. Se recubrió una placa de ELISA con 50 con 100 μl de BCMA-Fc a 1 μg/ml o con 100 μl de TACI-Fc a una concentración de 2 μg/ml en tampón de recubrimiento y se incubó durante una noche a 4 ºC. La placa se lavó después con PBS/Tween 0,2 % y después se incubó durante 1 hora a 37 ºC con 100 μl de PBS/BSA 5 % por pocillo. La placa se lavó después cuatro veces con PBS/Tween 0,2 %. En una placa separada se premezclaron anticuerpos monoclonales de APRIL con sobrenadante de APRIL y se incubaron durante 30 minutos en hielo. El medio acondicionado que contenía APRIL soluble se diluyó 1 en 4 y se mezcló con un volumen igual de PBS que contenía los anticuerpos valorados en diluciones de duplicación comenzando con 5 μg/ml. Se transfirieron 100 μl de la mezcla preincubada a la placa de ELISA y se incubaron durante 2 horas a 37 ºC. La placa se lavó después cuatro veces con PBS/Tween 0,2 %. Después se diluyó anticuerpo anti Flag-HRP en PBS a una concentración de 1:1000 y después se añadieron 100 μl de esta a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37 ºC. La placa se lavó después cuatro veces con PBS/Tween 0,2 % y después se añadieron 100 μl de ABTS a cada pocillo (el ABTS se diluyó a la relación de 10 ml de reactivo más 5 μl de H2O2 realizada inmediatamente antes de la adición). Se permitió que el color se revelara y después se leyó la DO a 405 nm en un lector de placas de ELISA. Se usó IgG1 humano como una proteína de control para recubrir la placa ya que este es el mismo isotipo que las proteínas de fusión de Fc y se controló con respecto a APRIL que se unía a la placa de forma no específica. Como resulta evidente a partir de la Figura 3, ninguno de los anticuerpos disponibles en el mercado fue capaz de bloquear la unión de FLAG-APRIL con TACI-Fc o BCMA-Fc, mientras que hAPRIL.01A y hAPRIL.03A sí inhiben (parcialmente) la unión con TACI-Fc y BCMA-Fc. Reactividad cruzada entre especies

También se examinó la unión de hAPRIL.01A y hAPRIL.03A con APRIL de ratón mediante BIAcore, pero no se observó unión de ninguno de los anticuerpos. Los anticuerpos parecen unirse solamente a APRIL humano.

Ejemplo 3: perfiles funcionales de respuesta de linfocitos B de ratón de anticuerpos murinos anti APRIL humano a APRIL

Para mostrar que los anticuerpos de la presente invención pueden bloquear funcionalmente APRIL in vitro, se usaron ensayos de linfocitos B de ratón para examinar dos respuestas conducidas por APRIL en linfocitos B, proliferación y producción de IgA.

Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ºC con CO2 5 %. Se cultivaron esplenocitos de ratón y linfocitos B purificados en RPMI-1640 (Gibco) complementado con FCS 8 %, glutamina 2 mM y beta-mercaptoetanol a 50 μM, y se complementó con penicilina y estreptomicina a una concentración de 10 μg/ml. Se aislaron linfocitos B de ratón esplénicos de ratones de tipo silvestre usando columnas de separación de células activadas magnéticas (MACS) con perlas de MACS CD45R/B220 (Miltenyi Biotec, Utrecht, Países Bajos). Las células se cultivaron en placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos a una densidad de 2 x 105/pocillo en un volumen final de 200 μl. Para todos los ensayos el medio acondicionado que contenía las diversas formas de APRIL soluble se normalizó con respecto a los niveles de expresión antes de su uso. Para medir la proliferación, las células se trataron con anti IgM (Jackson ImmunoResearch) y APRIL soluble en medio acondicionado o como proteína purificada a una concentración final de 1 μg/ml. Se añadió anticuerpo monoclonal anti Flag de reticulación al pocillo a una concentración final de 1 μg/ml. Las células se incubaron a 37 ºC y después de 48 horas se pulsaron con 0,3 μCi (0,011 MBq) de timidina tritiada ([6-3H]timidina, GE Healthcare, Países Bajos) durante 18 horas, antes de la recogida. Para medir la producción de IgA, se cultivaron linfocitos B de ratón y se trataron con APRIL, como anteriormente. Después de incubación durante 6 días, se recogió sobrenadante y se ensayó con respecto a contenido de IgA por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de ELISA con anti Ig de ratón 2 μg/ml (Southern Biotech), se bloquearon con PBS/BSA 1 % y se incubaron con el sobrenadante recogido. Se detectó después IgA unido con anti IgA de ratón marcado con HRP (Southern Biotech, Uithoorn, Países Bajos). Como control, las células se trataron con LPS 10 μg/ml (Invivogen) más TFGβ humano 1 ng/ml (Sigma-Aldrich). Como se muestra en la Figura 4A, hAPRIL.01A y en menor grado hAPRIL.03A son capaces de inhibir la recombinación de cambio de clase inducida por APRIL como se determinó por la secreción de IgA reducida a partir de linfocitos B esplénicos de ratón. TACI-Fc como control inhibió la secreción de IgA, mientras que IgG1 de ratón e Ig humano no afectaron a la secreción de IgA inducida por APRIL a partir de linfocitos B esplénicos. Además, se demostró que hAPRIL.01A y hAPRIL.03A inhibían la proliferación de linfocitos B esplénicos de ratón inducida por APRIL. Para establecer la especificidad de los anticuerpos, se estudió el efecto de hAPRIL.01A y hAPRIL.03A en la secreción y la proliferación

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Tabla 3: números de ID de secuencia para anticuerpos murinos anti APRIL humano hAPRIL.01A (de la presente invención) y de hAPRIL.03A (no de acuerdo con la invención reivindicada).

SEQ ID NO:: Descripción

1: región variable de cadena pesada de hAPRIL.01A (ADN)

2: región variable de cadena ligera de hAPRIL.01A (ADN)

3: región variable de cadena pesada de hAPRIL.03A (ADN)

4: región variable de cadena ligera de hAPRIL.03A (ADN)

5: región variable de cadena pesada de hAPRIL.01A (AA)

6: región variable de cadena ligera de hAPRIL.01A (AA)

7: región variable de cadena pesada de hAPRIL.03A (AA)

8: región variable de cadena ligera de hAPRIL.03A (AA)

9: CDR1 de cadena pesada de hAPRIL.01A (AA)

10: CDR2 de cadena pesada de hAPRIL.01A (AA)

11: CDR3 de cadena pesada de hAPRIL.01A (AA)

12: CDR1 de cadena ligera de hAPRIL.01A (AA)

13: CDR2 de cadena ligera de hAPRIL.01A (AA)

14: CDR3 de cadena ligera de hAPRIL.01A (AA)

15: CDR1 de cadena pesada de hAPRIL.03A (AA)

16: CDR2 de cadena pesada de hAPRIL.03A (AA)

17: CDR3 de cadena pesada de hAPRIL.03A (AA)

18: CDR1 de cadena ligera de hAPRIL.03A (AA)

19: CDR2 de cadena ligera de hAPRIL.03A (AA)

20: CDR3 de cadena ligera de hAPRIL.03A (AA)

Ejemplo 5: mapeo de epítopos usando el método Pepscan

Síntesis de péptidos y exploración Pepscan

Los péptidos lineales sintéticos y CLIPS se sintetizaron y exploraron usando tarjetas PEPSCAN mini de formato tarjeta de crédito (placa de 455 pocillos con pocillos de 3 μl) como se describe en Slootstra et al. (Slootstra et al., 1996, Mol. Diversity 1, 87-96) y Timmerman et al. (Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit. 20, 283-299). La unión de anticuerpos (hAPRIL.01A y hAPRIL.03A) con cada péptido se ensayó en un inmunoensayo ligado a enzimas basado en PEPSCAN (ELISA). Las tarjetas de polipropileno de formato tarjeta de crédito de 455 pocillos, que contienen los péptidos enlazados covalentemente, se incubaron con muestra (por ejemplo, anticuerpo 1 μg/ml diluido en una solución de PBS que contenía suero de caballo 5 % (v/v) y ovoalbúmina 5 % (peso/volumen)) y Tween 80 1 % (4 ºC, durante una noche). Después de lavar los péptidos se incubaron con una peroxidasa anti anticuerpo (dilución 1/1000, por ejemplo peroxidasa de conejo anti ratón, Southern Biotech) (1 hora, 25 ºC), y posteriormente, después de lavar se añadieron el sustrato de peroxidasa 2,2’-azino-di-3-etilbenzotiazolin sulfonato (ABTS) y 2 μl/ml de H2O2 3 %. Después de 1 hora se midió el desarrollo de color. El desarrollo de color del ELISA se cuantificó con una cámara CCD y un sistema de procesamiento de imágenes. La preparación consiste en una cámara CCD y un objetivo de 55 mm (Sony CCD Video Cámara XC-77RR, Nikon micro-nikkor lente de 55 mm f/2,8), un adaptador de cámara (adaptador de Cámara Sony DC-77RR) y Software de Procesamiento de Imágenes.

Síntesis de Péptidos

Se sintetizaron un total de 4225 péptidos, principalmente CLIPS. La secuencia diana usada, de 147 aminoácidos, con bucles de acuerdo con el alineamiento con 1XU2.pdb subrayada:

RAVLTQKQKKQHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGV RIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAY NSCYSAGVFHLHQDILSVI-IPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL (SEQ ID NO: 21).

Bucles en el lado “superior” de la proteína: QKKQHSVLHL (SEQ ID NO: 22), ALRRGRGL (SEQ ID NO: 23), QAQGYGVRI (SEQ ID NO: 24), QDAGVYLL (SEQ ID NO: 25), SREGQGRQETV (SEQ ID NO: 26), FHLHQGDILSV (SEQ ID NO: 27) y bucles en el lado “inferior” de la proteína: INATSKDDSDVTE (SEQ ID NO: 28), VLFQDVTFTMG (SEQ ID NO: 29), IRSMPSHPDRAYNSC (SEQ ID NO: 30), IIPRARAKL (SEQ ID NO: 31), NLSPHGTFLGF (SEQ ID NO: 32). Las regiones de interconexión son principalmente láminas. Obsérvese que el lado “superior” e “inferior” se eligen arbitrariamente. Se usaron las siguientes topologías de CLIPS: CLIPS T2 se acopla con la cadena lateral de dos cisteínas para formar una topología de un único bucle, mientras que CLIPS T3 se acopla con la cadena lateral de tres cisteínas para formar topología de doble bucle, mientras que CLIPS T2T2 primero se acopla T2 con dos cisteínas (marcadas C), y en segundo lugar se acopla T2 con dos cisteínas y finalmente CLIPS T2T3 se acopla T2 con dos cisteínas y se acopla T3 con tres cisteínas.

Claims

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