ES2660372T3

ES2660372T3 - Sustancias y procedimientos para la utilización en la prevención y/o el tratamiento en la enfermedad de Huntington

Info

Publication number: ES2660372T3
Application number: ES15736262.5T
Authority: ES
Inventors: Oskar SMRZKA; Stefan BARTL
Original assignee: Affiris AG
Current assignee: Affiris AG
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2018-03-22
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: US20220073650A1; CN106687475A; US20170145117A1; PL3166660T3; WO2016005547A1; ES2660372T8; JP2017523165A; DK3166660T3; US20210040236A1; US20180327513A1; EP3166660B1; US10053518B2; AU2015286606A1; EP3166660A1

Abstract

Dispositivo de aféresis que comprende un portador sólido que puede ponerse en contacto con el flujo sanguíneo o de plasma, en el que el portador sólido incluye una molécula de unión a la huntingtina (HTT).

Description

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pesada que comprende ATYYGYTMDY (SEC ID nº: 56), la CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende SSVTSSY (SEC ID nº: 57), la CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende STS (SEC ID nº: 58) y CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende HQYRRPPRT (SEC ID nº: 59), por ejemplo tal como se muestra en el Ejemplo 5.

Las CDR son las regiones determinantes de complementariedad y representan las regiones variables de los anticuerpos con las que el anticuerpo se une su epítopo específico. El tipo y número de cadenas pesadas determinan la clase del anticuerpo, es decir, los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Los anticuerpos contienen además dos cadenas ligeras idénticas, que pueden ser de tipo lambda o kappa.

Según la presente invención, los anticuerpos monoclonales para la utilización en el presente dispositivo de aféresis preferentemente son anticuerpos manipulados en los que las CDR de los anticuerpos no humanos se transfirieron a un marco de anticuerpo humano y se adaptaron de esta manera en su secuencia de manera que la afinidad y la especificidad del anticuerpo de ratón derivado de hibridoma original por lo menos se conservasen y la inmunogenicidad de células T y células B para el ser humano de la proteína nuevamente manipulada se minimizasen (anticuerpo monoclonales humanizados). Lo anterior resulta especialmente necesario si se fugan cantidades mínimas no deseadas de proteína adsorbedora al torrente sanguíneo del paciente (posiblemente debido a la generación de fragmentos de corte, por ejemplo por proteólisis u otros procesos de degradación de las proteínas que afectan a la proteína adsorbedora inmovilizada). Las CDR también pueden transferirse a otros formatos manipulados, tales como los anticuerpos monoclonales biespecíficos o quiméricos, anticuerpos con funciones de estabilización mejoradas. Los anticuerpos para la utilización en el presente dispositivo de aféresis preferentemente son anticuerpos anti-HTT humanos.

Mientras que los anticuerpos humanos o humanizados pueden presentar ventajas en la presente invención, también pueden utilizarse otras moléculas de unión a HTT, tales como los anticuerpos murinos, en el dispositivo de aféresis según la presente invención. Una forma de realización específicamente preferente de la presente invención utiliza más de un solo tipo de molécula de unión a HTT, por ejemplo por lo menos dos anticuerpos anti-HTT (o fragmentos de anticuerpo ligantes de HTT) que se unen a diferentes regiones de HTT. También pueden ser de origen diferente (por ejemplo un anticuerpo humano o humanizado y un anticuerpo murino). Las moléculas de unión a HTT también pueden seleccionarse por su estabilidad y comportamiento de inmovilización (por ejemplo su reciclabilidad) o por su afinidad y especificidad. La afinidad de dicho anticuerpo según se define mediante la constante de equilibrio de disociación (KD) preferentemente se encuentra comprendida entre 10-7 y 10-9, es decir, en el intervalo nanomolar (nM), proporcionando una tasa de asociación razonablemente elevada. Con el fin de incrementar la especificidad y la avidez, resulta generalmente preferible combinar dos o más anticuerpos. Análogamente a los efectos in vivo de los tratamientos de vacuna (ver posteriormente), resulta preferido un efecto de avidez/combinatorial de dos o más anticuerpos para conseguir una eliminación eficiente de la proteína diana respecto del plasma.

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos. La presente definición de anticuerpo humano excluye específicamente anticuerpos humanizados que comprenden residuos ligantes de antígeno no humano. Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos aminoácidos más comunes en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de entre un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo tal como en Kabat

E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Bethesda, MD, 1991, NIH Publication 913242, vols. 1 a 3. En una forma de realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I, tal como en Kabat et al., supra. En una forma de realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III tal como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoácidos de una RHV no humana y residuos aminoácidos de una RM humana. El término "marco" o "RM" se refiere a residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable (RHV). La RM de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios de RM: RM1, RM2, RM3 y RM4. De acuerdo con lo anterior, las secuencias de RHV y de RM generalmente aparecen en la secuencia siguiente en la VH (o VL): RM1-H1(L1)-RM2-H2(L2)-RM3-H3(L3)-RM4. En determinadas formas de realización, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un, y típicamente dos dominios variables, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las RHV (por ejemplo las CDR) corresponde a las de un anticuerpo no humano, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las RM corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "variante humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sido sometido a humanización. En una forma de realización preferida, se injerta una RHV murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". La secuencia de aminoácidos de la región variable murina se alinea con una colección de genes V de anticuerpo de línea germinal humana y se clasifica según la identidad y homología de la

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secuencia. La secuencia aceptora se selecciona basándose en una homología global elevada de las secuencias y opcionalmente además en la presencia de los residuos canónicos correctos ya presentes en la secuencia aceptora. El gen V de línea germinal codifica únicamente la región hasta el inicio de la RHV3 para la cadena pesada y hasta el centro de la RHV3 de la cadena ligera. Por lo tanto, los genes V de la línea germinal no se alinean a lo largo de todo el dominio V. El constructo humanizado comprende los marcos humanos 1 a 3, las RHV murinas y la secuencia de marco humano 4 derivada de JK4 humana, y las secuencias de JH4 para las cadenas ligera y pesada, respectivamente. Antes de seleccionar una secuencia aceptora particular, pueden determinarse las denominadas estructuras de bucle canónicas del anticuerpo donante. Estas estructuras de bucle canónicas están determinadas por el tipo de residuos presentes en las denominadas posiciones canónicas. Estas posiciones se encuentran (parcialmente) fuera de las regiones RHV y deben mantenerse funcionalmente equivalentes en el constructo final para conservar la conformación de la RHV del anticuerpo parental (donante). En el documento nº WO 2004/006955 A1, se informa de un procedimiento para humanizar anticuerpos que comprende las etapas de identificar los tipos de estructura canónica de las RHV en un anticuerpo maduro no humano; la obtención de una biblioteca de secuencias peptídicas para las regiones variables de anticuerpo humano; la determinación de los tipos de estructura canónica de RHV de las regiones variables en la biblioteca; y la selección de las secuencias humanas en las que la estructura canónica de la RHV es la misma que el tipo de estructura canónica de la RHV del anticuerpo no humano en sitios correspondientes dentro de las regiones variables no humanas y humanas. En resumen, la secuencia aceptora potencial se selecciona basándose en una homología global elevada y opcionalmente además en la presencia de los residuos canónicos correctos ya presentes en la secuencia aceptora. En algunos casos, el simple injerto de la RHV únicamente resulta en la retención parcial de la especificidad de unión del anticuerpo no humano. Se ha encontrado que resultan necesarios por lo menos algunos residuos de marco no humano específicos para reconstituir la especificidad de unión y que también resulta necesario que el injerto se produzca en el marco humano, es decir, deben introducirse las denominadas "mutaciones inversas" además de introducirse las RHV no humanas (ver, por ejemplo, Queen et al., PNAS 86:10029-10033, 1989). Estos residuos aminoácidos de marco específicos participan en las interacciones RM-RHV y estabilizan la conformación (bucle) de las RHV. En algunos casos también se introducen mutaciones directas con el fin de adoptar más estrechamente la secuencia de línea germinal humana. De esta manera, la "variante humanizada de un anticuerpo según la invención" (que se origina, por ejemplo, del ratón) se refiere a un anticuerpo que se basa en las secuencias de anticuerpo de ratón en las que las VH y VL se han humanizado mediante las técnicas estándares anteriormente indicadas (incluyendo el injerto de RHV y opcionalmente la posterior mutagénesis de determinados aminoácidos en la región marco y RHV-H1, RHV-H2, RHV-L1 o RHV-L2, mientras que RHV-H3 y RHV-L3 permanecen sin modificar).

En general, las técnicas para desarrollar anticuerpos adecuados para la utilización en el tratamiento de pacientes humanos de mAB murinos o de otros mAB principalmente seleccionados se encuentran bien establecidas (revisión en Safdari et al., 2013; PMID: 24568279). Por lo tanto, los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria pueden someterse a dichos procedimientos de desarrollo para proporcionar anticuerpos mejorados mediante la aplicación de dichas técnicas validadas, especialmente procedimientos basados en el injerto de CDR (tal como en la revisión de, por ejemplo, Kim y Hong, Methods Mol. Biol. 907:237-45, 2012 [PMID: 22907355] o Whitelegg N. y Rees A.R., Antibody Variable Regions: Towards a Unified modelling method, en: Methods in Molecular Biology, Biotechnology and Medicine, ed. Lo. B., 248:51-91, 2004) [PMI: 14970491], la humanización de línea germinal o "super-humanización" (tal como en la revisión de Pelat T. et al., Mini Rev. Med. Chem. 9(14):1633-8, dic. 2009, [PMID: 20105119] y la resuperficialización (tal como se indica en Mader y Kunert et al., Prot. Eng. Des. Selec. 23:947-954, 2010 [PMID: 21037278] o procedimientos relacionados que se basan en estas técnicas establecidas.

La expresión "región hipervariable" o "RHV" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que es hipervariable en secuencia ("regiones determinantes de complementariedad" o "RDC") y/o que forma bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o que contiene los residuos de contacto con antígeno ("contactos de antígeno"). Generalmente, los anticuerpos comprenden seis RHV: tres en la VH (H1, H2 y H3) y tres en la VL (L1, L2 y L3). Se dan a conocer RHV ejemplares en la presente memoria.

Según la presente invención, también pueden utilizarse en el presente dispositivo de aféresis anticuerpos anti-HTT que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 60 a nº 64. En determinadas formas de realización, una secuencia de VH que presenta una identidad de por lo menos 90%>, 91%>, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% contiene sustituciones (por ejemplo sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones respecto a la secuencia de referencia pero un anticuerpo anti-HTT que comprende la secuencia conserva la capacidad de unirse a HTT, especialmente el epítopo dado. En determinadas formas de realización, se ha sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEC ID nº: 60 a nº 65. En determinadas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones o deleciones en regiones fuera de las RHV (es decir, en las RM).

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Huntingtina (Modregger et al., 2002). Se ha demostrado que un intracuerpo derivado de una biblioteca de scFv recombinantes con diana en la región PRR de la Huntingtina dentro de la célula resulta beneficioso en un modelo animal de enfermedad de Huntington (Southwell et al., 2011) mediante el incremento selectivo de la renovación intracelular de la forma mutante de la proteína HTT. Los anticuerpos monoclonales que reconocen los tramos de poliprolina flanqueantes de la región PRR han sido publicados anteriormente como sondas (ACm MW7 por Ko et al., 2001); sin embargo, no se ha considerado ningún uso terapéutico en la enfermedad de Huntington ni ha podido ser demostrado debido a la baja complejidad de su epítopo, consistente en un tramo de poliprolina no único para la Huntingtina dentro del proteoma humano. Más generalmente, no se ha considerado anteriormente que la Huntingtina sea la diana de la aféresis debido a que la Huntingtina siempre ha sido considerada una diana intracelular adecuada únicamente para el reconocimiento intracelular. En contraste con el anticuerpo monoclonal MW7, que se une a epítopos con más de 5 prolinas consecutivas (Ko et al., 2001), el mAB PRR13 proporcionado por la presente invención presenta un epítopo complejo y se une específica y selectivamente a su epítopo nuclear contenido en p6773, por ejemplo tal como se muestra en el Ejemplo 5; sin embargo, pueden utilizarse ambos anticuerpos en el dispositivo de aféresis según la presente invención.

Según la presente invención resulta especialmente preferente utilizar anticuerpos monoclonales anti-HTT inmovilizados en el presente dispositivo de aféresis.

Se da a conocer un anticuerpo monoclonal para la utilización en el presente dispositivo de aféresis que presenta un dominio ligante capaz de unirse a la proteína HTT o a un fragmento de la misma que contiene la secuencia de p7543 (SEC ID nº: 3) o preferentemente el epítopo nuclear de C6-17, por ejemplo tal como se determina en el Ejemplo 4. En una forma de realización preferida, dicho anticuerpo monoclonal se caracteriza como el anticuerpo monoclonal C6-17 que comprende la VH de SEC ID nº: 60 y la VL de SEC ID nº: 61, que comprende una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende GYTFTEYT (SEC ID nº: 66), una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende INPNNGGT (SEC ID nº: 67), una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende ASLDGRDY (SEC ID nº: 68), una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende QSLLNSRTRKNY (SEC ID nº: 69), una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende WAS (SEC ID nº: 70) y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende KQSYNLLT (SEC ID nº: 71), por ejemplo tal como se muestra en el Ejemplo 5.

Según la presente invención, la región 586 de la caspasa se refiere a una región en la proteína HTT que circunda un stio de corte de caspasa anteriormente definido en la posición 586 de la proteína Huntingtina que es susceptible de corte de proteasa por la caspasa-6 y otras proteasas, tales como la caspasa-2, -8 o -10 (Wong et al., 2014). El papel etiológico del corte de proteasa dentro de dicha región fue establecido previamente por Graham et al., 2006, y la prevención o reducción del fragmento de Huntingtina resultante ha sido reconocido como beneficioso. En la presente invención se demuestra que algunos péptidos particulares derivados de dicha región pueden inducir eficazmente anticuerpos con una accesibilidad inesperadamente mejor a la Huntingtina que péptidos vecinos de la misma región, por ejemplo tal como se muestra en los Ejemplos 1 y 7. Los anticuerpos generados por dichos péptidos resultan preferentes para la utilización en el dispositivo de aféresis según la presente invención.

Todavía otra exposición proporciona un anticuerpo monoclonal para la utilización en el presente dispositivo de aféresis que presenta un dominio de unión capaz de unión a un péptido de la proteína HTT que presenta una secuencia de p7564 (SEC ID nº: 2) o preferentemente el epítopo de M1D1, por ejemplo según el Ejemplo 5, figura 17. En una forma de realización preferida, dicho anticuerpo monoclonal se caracteriza como siendo el anticuerpo monoclonal M1D1 que comprende la VH de SEC ID nº: 64 y la VL de la SEC ID nº: 65, que comprende una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende GFTFNTYA (SEC ID nº: 72), una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende IRSKSNNYAT (SEC ID nº: 73), una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende VRHGEYGNPWFAY (SEC ID nº: 74), una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende QSLVHSNGNTY (SEC ID nº: 75), una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende KVS (SEC ID nº: 76) y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SQSTHVPYT (SEC ID nº: 77), por ejemplo tal como se indica en el Ejemplo 5.

En contraste con la técnica anterior, anticuerpos monoclonales y policlonales derivados de un péptido 583IVLD586 que se encuentran a frecuencia elevada dentro del proteoma humano (Warby et al., 2008), el anticuerpo M1D1 reconoce un epítopo nuclear que consiste en la secuencia derivada de Huntingtina SSEIVLD que contiene un ácido aspártico C-terminal libre que es único dentro de la base de datos de proteínas RefSeq humana, proporcionando de esta manera una especificidad elevada para la proteína Huntingtina cortada por caspasa, por ejemplo tal como se muestra en el Ejemplo 4, figura 12 y en el Ejemplo 5, figura 17. En contraste con el anticuerpo de Warby et al., el anticuerpo según la presente invención es más específico. También presenta un epítopo nuclear diferente de "IVLD" (ver el Ejemplo 1, figura 3). Dicha especificidad más elevada también se debe al hecho de que "IVLD" (según Warby) aparece más de varios cientos de veces dentro del proteoma humano, mientras que el epítopo de M1D1 aparece únicamente una vez según el análisis de BLAST-RefSeq. M1D1 tal como es proporcionado por la presente invención es un clon diferente con CDR únicas-isotipo IgM. Sin embargo, tal como ya se ha indicado, la totalidad de dichos anticuerpos puede utilizarse en el dispositivo de aféresis según la presente invención debido a su especificidad para HTT. Según una forma de realización

preferida, se utiliza una combinación de mAB según la presente invención. Dicha combinación puede resultar beneficiosa debido al aspecto combinatorial/de avidez. La especificidad de M1D1 para el neoepítopo generado por el corte por caspasa-6 de la HTT resulta particularmente beneficioso para la aféresis porque reduce específicamente el fragmento N-terminal tóxico anteriormente indicado de HTT (por ejemplo, Graham et al., 2006 y citaciones en el mismo).

Según una forma de realización preferida, el anticuerpo que debe utilizarse en el dispositivo de aféresis de la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos de VH y VL siguientes:

>Secuencia de aminoácidos de consenso de VH de C6-17:

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>Secuencia de aminoácidos de consenso de VL de C6-17:

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>Secuencia de aminoácidos de consenso de VH de PRR13:

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>Secuencia de aminoácidos de consenso de VL de PRR13:

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Según una forma de realización preferida, el anticuerpo para la utilización en el dispositivo de aféresis de la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos de VH y VL siguientes:

>Secuencia de aminoácidos de consenso de VH de M1D1:

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>Secuencia de aminoácidos de consenso de VL de M1D1:

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Según una forma de realización preferida, el anticuerpo para la utilización en el dispositivo de aféresis de la presente invención es un anticuerpo humanizado, especialmente un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de VH y VL siguientes:

>VL de hPRR13 (región variable de cadena pesada):

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seguidamente se pasa por la columna de trabajo, que se une a las moléculas ligantes de antígenos deseadas, permitiendo que las sustancias no deseadas fluyan hacia el exterior de la columna. Se utilizan tampones estériles para todos los procedimientos. A continuación, las moléculas ligantes de antígenos deseadas se eluyen de la columna de trabajo en un estado funcional utilizando, por ejemplo, tampones sucesivos de citrato sódico/ácido cítrico y acetato sódico/ácido acético, tal como se da a conocer en el documento nº US 5.817.528 A o cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia. Las moléculas ligantes de antígeno recolectadas seguidamente se acoplan con un material de matriz estéril bajo condiciones estériles. Preferentemente, el material de matriz es un material a base de carbohidratos, tal como SepharoseTM, dextrano, agarosa o celulosa. Entre otros materiales de matriz adecuados se incluyen matrices autoclavables, tales como perlas, fibras y membranas o películas compuestas de vidrio o polímeros sintéticos, tales como polimetacrilatos, poliestirenos y poliamidas. En los casos en que se utilizan perlas, el diámetro de las mismas no se encuentra limitado con la condición de que la fase líquida de la aféresis pueda circular. Sin embargo, para reducir la resistencia al flujo, se utilizan preferentemente perlas con un diámetro de entre 50 y 3.000 µm, especialmente de entre 200 y 3.000 µm. El material de matriz se esteriliza mediante enjuagues previos con una solución estéril y un tratamiento adicional de vapor a temperatura baja según el documento nº US 5.817.528 A o cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia. El material de matriz estéril y libre de pirógenos seguidamente se activa mediante incubación con solución de bromuro de cianógeno tal como se indica en el documento nº US 5.817.528 A o cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia. Sucesivamente se acoplan con la columna las moléculas ligantes de antígenos deseadas mediante incubación. Alternativamente, también puede llevarse a cabo simultáneamente la activación y acoplamiento mediante incubación de las moléculas ligantes de antígeno junto con 1,1'-carbonildiimidazol según el documento nº US 5.817.528 A o cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia. Tras finalizar el procedimiento de acoplamiento, el material de matriz que presenta anticuerpos acoplados con el mismo se lava extensivamente y se somete a ensayo para éster de cianato, esterilidad y pirogenicidad. La cantidad del anticuerpo que debe inmovilizarse en la columna y el tamaño de la columna no se encuentran limitados. El material de matriz acoplado también se somete a ensayo para el total de proteína unidad y la actividad ligante de la proteína acoplada. A continuación, el material de matriz acoplado se utiliza para rellenar bajo condiciones asépticas carcasas de vidrio silanizado despirogenadas y estériles para formar columnas acopladas con proteínas estériles y libres de pirógenos. El caudal por el dispositivo de aféresis puede controlarse seleccionando apropiadamente los diámetros internos de los tubos del circuito o mediante la utilización de una bomba auxiliar (documento nº US 4.770.774 A). La columna de la invención puede utilizarse repetidamente mediante la elución de la proteína HTT adsorbida o fragmentos de la misma.

La presente invención proporciona además un dispositivo de aféresis que comprende un portador sólido capaz de ponerse en contacto con el flujo sanguíneo o plasmático, caracterizado porque el portador sólido incluye un receptor o adsorbedor de unión a HTT específico y selectivo. El portador del dispositivo de aféresis se define adicionalmente como una columna estéril y libre de pirógenos.

Según la presente invención el dispositivo de aféresis proporcionado en la presente memoria se utiliza preferentemente para proporcionar un dispositivo de prevención y/o tratamiento para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad de Huntington.

Se da a conocer además un kit para la utilización en la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad de Huntington que comprende un portador de aféresis sólido que contiene receptores o adsorbedores ligantes de Huntingtina, en los que dicho portador es, nuevamente, una columna estéril y libre de pirógenos.

Todavía otra exposición proporciona un procedimiento de diagnóstico in vitro de la enfermedad de Huntington en un mamífero, que comprende las etapas de: determinar el nivel de HTT libre, agregado, acomplejado o fragmentado en una muestra de un mamífero utilizando los anticuerpos según la presente invención, especialmente el anticuerpo PRR13, M1D1 y C6-17, con el fin de diagnosticar la enfermedad de Huntington, realizar un seguimiento del avance de la enfermedad o, de otro modo, utilizar HTT como biomarcador en el caso de que el nivel de HTT en dicha muestra se incremente en comparación con una muestra de referencia de individuos sanos, los cuales no se encuentran afectados genéticamente por la enfermedad de Huntington. Durante el curso de la presente invención se ha demostrado que la patología de la enfermedad de Huntington se correlaciona además con la (baja) cantidad de HTT presente en el plasma y otros líquidos corporales y material tisular. la determinación de los cambios en dichos niveles (bajos) de HTT resultó ser posible con los anticuerpos según la presente invención, aunque evidentemente también permiten la utilización de o tras técnicas tras la exposición de la presente invención de que los cambios en el nivel de HTT se correlacionan con la enfermedad y el estado de la enfermedad. Por lo tanto, no sólo resulta posible diagnosticar la enfermedad con las presentes herramientas sino también realizar un seguimiento del tratamiento de la enfermedad. Este aspecto diagnóstico puede combinarse con la presente tecnología de aféresis para el diagnóstico y seguimiento de pacientes que se ha planificado que sean tratados o que están siendo tratados con el dispositivo de aféresis según la presente invención.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un procedimiento para el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Huntington en un mamífero, que comprende las etapas de:

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-determinar el nivel de Huntingtina de tipo salvaje o mutada o fragmentos de la misma en una muestra de un mamífero utilizando los anticuerpos PRR13, M1D1 o C6-17 solos o en combinación,

-diagnosticar la enfermedad de Huntington en el caso de que el nivel de Huntingtina wt o mutada en dicha muestra se encuentre incrementada en comparación con una muestra de referencia de individuos sanos, los cuales no se encuentran afectados genéticamente por la enfermedad de Huntington,

-y, opcionalmente, el seguimiento del efecto de las estrategias terapéuticas de reducción de la Huntingtina en muestras de pacientes de enfermedad de Huntington premanifiesta o manifiesta, en el que las estrategias terapéuticas se seleccionan preferentemente de entre la vacunación activa y la vacunación pasiva.

Según la exposición, la determinación del nivel de HTT mutado en una muestra implica preferentemente los ensayos basados en la inmunoprecipitación o en la captura, tales como el ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), el inmunoensayo ligado a enzima (EIA), las inmunoprecipitaciones sobre otras superficies y portadores, tales como resinas y perlas, la espectrometría de masas, la transferencia western o la inmunohistoquímica y el análisis basado en la inmunofluorescencia, tal como los ensayos basados en FRET o en procedimientos de obtención de imágenes adecuados (por ejemplo, PET y SPECT) y la citometría de flujo o cualesquiera otras técnicas conocidas por el experto en la materia.

Según la exposición, la muestra se obtiene preferentemente de líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, plasma, suero, orina, saliva, sudor o líquido lacrimal, u otros líquidos corporales o extractos de tejidos y células, especialmente tejido cerebral, tejido muscular y células derivadas de sangre, en las que la expresión y estructura de la Huntingtina (mutante) se ha modificado.

Según la exposición, el mamífero es preferentemente un ser humano.

Además, se da a conocer además un procedimiento para determinar in vitro el estadio de la enfermedad de Huntington o el efecto de una nueva terapia con diana en la Huntingtina, tal como el presente enfoque de vacunación activa o pasiva en un mamífero, que comprende las etapas de:

-determinar el nivel de Huntingtina de tipo salvaje o mutada o fragmentos de la misma en una muestra de un mamífero utilizando los anticuerpos PRR13, M1D1 o C6-17 solos o en combinación (estos anticuerpos pueden utilizarse solos o en combinación para la captura y detección de la proteína Huntingtina o fragmentos con la posterior detección por medios bioquímicos, espectrometría de masas u otros procedimientos analíticos) y

-determinar el estadio de la enfermedad de Huntington.

Dicha determinación también resulta posible a partir de los niveles de HTT en un paciente dado: ello puede utilizarse para el seguimiento del desarrollo de la enfermedad mediante la comparación de los niveles de HTT (los cambios en los mismos) de un paciente dado durante el tiempo (determinación relativa en el mismo individuo), aunque también para el diagnóstico inicial del estadio de la enfermedad (determinación absoluta en correlación con una cohorte de pacientes con un estado de enfermedad conocido). El "cambio de los niveles de HTT" será, por lo menos en el largo plazo del tratamiento, una reducción de los niveles de HTT de manera que, por ejemplo, los niveles plasmáticos de HTT en los pacientes tratados según la presente invención bajarán (tal como se ilustra en, por ejemplo, la figura 9). Sin embargo, también resulta posible que en algunos pacientes o en algún estadio de la enfermedad (especialmente en el caso de que se combine con otras estrategias de tratamiento) al inicio del tratamiento puede producirse un incremento de los niveles de HTT. Lo anterior, sin embargo, también es indicativo de un tratamiento exitoso porque, por ejemplo, un anticuerpo puede estabilizar paradójicamente una proteína en el plasma pero simultáneamente bloquear su actividad patológica. Este fenómeno ha sido observado en, por ejemplo, un incremento paradójico de IgE tras el tratamiento anti-IgE. Otro ejemplo son los anticuerpos contra la hormona de crecimiento, que han conducido a un incremento inesperado de su efecto estimulante del crecimiento debido a la estabilización.

Además, la presente exposición proporciona un procedimiento para realizar un seguimiento del avance de la enfermedad de Huntington o para realizar un seguimiento de la eficacia del tratamiento de la enfermedad de Huntington en un mamífero, que comprende las etapas de:

-determinar el nivel de HTT mutada en una muestra de un mamífero utilizando PRR13, M1D1 y C6-17 según la presente invención y

-determinar el avance de la enfermedad de Huntington o la eficacia del tratamiento de la enfermedad de Huntington mediante la comparación del nivel obtenido de HTT mutada y el nivel de HTT mutada obtenido en la primera medición de los niveles de HTT mutado, preferentemente en una medición en el momento del diagnóstico de los síntomas asociados a la enfermedad, en el que un cambio ("cambio" que

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habitualmente es una bajada de los niveles de HTT, por lo menos a largo plazo, tal como se ha explicado anteriormente) del nivel de HTT es indicativo de una terapia exitosa y preferentemente se utiliza con fines pronósticos y para el ajuste de la terapia.

Nuevamente, dicho procedimiento resulta posible mediante la presente invención debido a que se ha demostrado por primera vez la eficacia de reducción de la cantidad de HTT extracelular como diana terapéutica.

En el procedimiento de aféresis dado a conocer, no resulta crítico utilizar anticuerpos que distinguen entre HTT "sana" y "patológica" (es decir, HTT "de tipo salvaje" o "mutada"). Lo anterior implica que también pueden utilizarse anticuerpos que no pueden distinguir entre estas dos formas (pero que se unen a ambas formas) para ligar la HTT en el dispositivo de aféresis (o en el procedimiento diagnóstico según la presente invención) y resultan generalmente preferentes en dichos procedimientos.

El dispositivo de aféresis según la presente invención puede comprender anticuerpos específicos de la región 586 de la caspasa de la Huntingtina y antisueros y estructuras derivados de la misma, tales como scFv, Fab, Fd, Fab', F(ab')2, scFAB, intracuerpos o Fv, o cualquier otro formato, especialmente cualquiera de los formatos preferentes dados a conocer en la presente memoria (en forma de una única molécula de unión a HTT o de combinación de dos o más moléculas de unión a HTT con el fin de incrementar la avidez y la especificidad).

En una forma de realización específicamente preferente de la presente invención, se utilizan anticuerpos o moléculas ligantes de antígenos con diana en la región 586 de caspasa de la Huntingtina (HTT) en el dispositivo de aféresis que son generados mediante inmunización con los péptidos anteriormente indicados que comprenden por lo menos un péptido inmunogénico de la región 586 de la caspasa de la Huntingtina tal como se ha indicado anteriormente o en combinación, por ejemplo tal como se muestra en los Ejemplos 2 y 3.

La invención se da a conocer además mediante los ejemplos y las figuras siguientes, aunque sin limitarse a los mismos.

La figura 1 muestra el análisis del título inmunológico mediante ELISA de los péptidos derivados de la región PRR y la región 586 de la caspasa de la Huntingtina humana (indicada como PRR y C6, respectivamente) en comparación con la región N-terminal y poli-Q menos inmunógena de la Huntingtina.

La figura 2 muestra inmunosueros de ratón inducidos por péptidos derivados de la PRR y de la región 586 de caspasa de la Huntingtina humana. Se capturó un fragmento N-terminal recombinante de 610 aminoácidos de la Huntigtina a partir de extractos de células HEK293 transfectados transitoriamente en un diseño de ELISA y se incubó con inmunosueros, demostrando de esta manera la unión y especificidad de los anticuerpos inducidos.

La figura 3 muestra que los inmunosueros individuales generados contra el péptido de inmunización p6776 proporcionan títulos de ELISA antipéptido comparables contra el péptido de inmunización (indicado como logEC50).

La figura 4 muestra que los mismos inmunosueros de la figura 3 mostraban diferencias en la señales anti-Huntingtina recombinante según las mediciones de ELISA de captura de proteínas (OD, anti-recHTT610), mostrando de esta manera la variación individual de la respuesta inmunológica.

La figura 5 no muestra cambios en las señales de la Huntingtina (EM48) en ratones R6/1 tratados con la vacuna peptídica (p6771, p6773) en la comparación con ratones R6/1 tratados con portador KLH o PBS o ratones de tipo salvaje tratados con portador KLH (los números indican la densidad óptica corregida [COD] utilizando el mAB específico de Huntingtina EM48; barras de error=desviaciones estándar; n=10).

La figura 6 muestra que, en contraste con los resultados de la figura 5, el número de sinapsis marcadas con sinaptofisina (utilizando el mAB SY38) que contenían HTT humana mutada (marcada con EM48), se redujo significativamente (p=0,001) en ratones R671 tratados con vacuna peptídica (p6771, p6773) en comparación con ratones R6/1 tratados con KLH, sugiriendo un efecto beneficioso del tratamiento con los péptidos.

La figura 7 muestra que la utilización del marcador específico de neuronas NeuN, los ratones R6/1 muestran un efecto neuroprotector significativo en ganglios basales en los grupos tratados con vacunas peptídicas (p6771, p6773) en comparación con grupos de control tratados con KLH o PBS.

La figura 8 muestra que la tinción con GFAP de ganglios basales muestra una reducción no significativa de la activación astroglial en animales R6/1 tratados con vacunas peptídicas (p6771, p6773) en comparación con controles de KLH y PBS, respectivamente.

La figura 9 muestra la determinación de Huntingtina en plasma mediante análisis FRET en animales wt y transgénicos YAC128, respectivamente, 12 meses después del tratamiento con vacuna individual, vacuna

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combinada o control de portador (KLH).

La figura 10 muestra el ensayo de Rotarod en ratones tratados y YAC128 de control que mide la latencia hasta la caída (indicada como valor promedio, en segundos; n=25 animales en cada grupo) llevado a cabo a los 4, 6, 8, 10 y 12 meses (indicado como "media en M4" -"media en M12") en ratones transgénicos YAC128 tratados con diversas vacunas peptídicas individuales y combinadas, tal como se indica.

La figura 11 muestra que el epítopo nuclear de 5 inmunosueros inducidos por vacuna de p6776 determinado mediante barrido de sustitución de alaninas mediante ELISA de péptidos utilizando los péptidos indicados que contenían sustituciones individuales de aminoácido alanina.

La figura 12 muestra que el mAB M1D1 reconoce específicamente fragmento de Huntingtina recombinante con ácido aspártico 586 libre en el extremo C-terminal de manera más fuerte que recHTT610.

La figura 13 muestra que los sobrenadantes procedentes de hibridomas derivados de ratones inmunizados con el péptido p6773 proporciona un reconocimiento fuerte del péptido de inmunización en 7 de entre 9 clones candidatos previamente cribados al someterlos a ensayo mediante ELISA de péptidos.

La figura 14 muestra que sólo 2 de los 9 mAB candidatos mostrados en la figura 13, es decir, PRR13 y PRR18, reconocían específicamente Huntingtina recombinante al someterlos a ensayo mediante ELISA de captura con recHTT610.

La figura 15 muestra el análisis de especificidad de 4 mAB anti-Huntingtina preseleccionados obtenidos de ratones inmunizados con el péptido p7543.

La figura 16 muestra el cribado de mAB preseleccionados mediante determinación de la especificidad contra péptido 7564 "cortado", mediante ELISA de péptidos.

La figura 17 muestra que el mAB M1D1 reconoce los péptidos Huntingtina de la región de corte de la caspasa-6 de por lo menos 7 aminoácidos de longitud que contienen ácido aspártico C-terminal libre.

La figura 18 muestra la reducción específica de la cantidad de la Huntingtina recombinante recHTT610 de suero humano utilizando los mAB PRR13 y C6-17 en comparación con el anticuerpo IgG de control de isotipo.

Las figuras 19-21 muestra la capacidad de reconocimiento de los anticuerpos utilizados según la presente invención.

Las figuras 22 y 23 muestran ejemplos de humanización de los anticuerpos.

Ejemplos

Ejemplo 1: identificación de péptidos con diana en el extremo N-terminal de la Huntingtina

Inmunizaciones de animales

Se acoplaron péptidos inductores de anticuerpos anti-HTT con portador KLH utilizando GMBS como reticulante amina-sulfhidrilo (Thermo/Pierce, nº de cat. 22309) siguiendo los procedimientos recomendados estándares para el acoplamiento de péptidos mediante cisteína. El péptido conjugado se formuló con adyuvante de gel de hidróxido de aluminio (concentración final de 1 µg/ml; Alhydrogel; Brenntag, nº de cat. 21645-51-2) utilizando 30 µg de péptido acoplado en un volumen de 200 µl en cada inyección. Las inmunizaciones se llevaron a cabo típicamente en ratones BALB/c hembra (típicamente 5 ratones en cada grupo, de 10 semanas de edad) utilizando las formulaciones anteriormente indicadas. Los grupos de control se inmunizaron con KLH y/o PBS no conjugados y adyuvante solo. Los animales fueron vacunados 3 a 6 veces a intervalos periódicos de 2 semanas y se recolectó plasma o suero un día antes de cada refuerzo y en el sangrado final.

ELISA de péptidos

Se determinaron las respuestas inmunológicas inducidas por los péptidos en los ratones mediante ELIS utilizando heparina como anticoagulante. Las placas de ELISA (Nunc Maxisorb) se recubrieron con BSA activada con maleimida como portador al que se acoplaron péptidos que contenían cisteína mediante enlaces tioéter estables. Para las titulaciones, se añadieron diluciones de plasma y se cuantificaron los anticuerpos específicos de los péptidos mediante anticuerpos anti-IgG de ratón biotinilados (Southern Biotech, nº de cat. 1034-08) como anticuerpo de detección combinado con estreptavidina-POD (Roche, nº de cat. 1089153) y posterior reacción de color utilizando ABTS. Se determinaron los valores de EC50 utilizando el ajuste de las curvas con una ecuación logística de 4 parámetros utilizando GraphPad Prism (software GraphPad).

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Ejemplo 3: el tratamiento de vacuna combinada conduce a niveles plasmáticos reducidos de Huntingtinaen ratones transgénicos YAC128 en combinación con mejoras motoras según mediciones con la pruebaRotarod en animales de 4 a 12 meses de edad, demostrando de esta manera que los anticuerpos anti-HTT inducidos por la combinación de péptidos son capaces de proporcionar un efecto beneficioso in vivo conrespecto al fenotipo HTT

Inmunizaciones en ratones YAC128

Se reunieron cinco cohortes de ratones YAC128 que expresaban Huntingtina humana mutante de longitud completa (ver Bard et al., 2014 y citas en el mismo) y camadas de control WT que consistían en 150 YAC128 en total y 25 WT en total. Los ratones WT se trataron con control de KLH. Los ratones YAC128 se dividieron en 6 grupos de tratamiento, incluyendo los 5 tratamientos experimentales con péptidos y un grupo de control de KLH. Los ratones recibieron los tratamientos mediante inyección s.c. a los 1, 2, 3, 6 y 9 meses de edad, tal como en el Ejemplo 1. Para la inmunización combinada, se mantuvo la cantidad total de péptidos de 30 µg por dosis mediante la combinación de dos péptidos a razón de 15 µg+15 µg por cada dosis de 200 µl de volumen.

Determinación de los niveles plasmáticos de Huntingtina en ratones YAC128 tratados con vacuna

Se determinaron los niveles plasmáticos de Huntingtina mediante un ensayo de detección basado en FRET (por sus siglas en inglés, transferencia de energía por resonancia de Förster), que rinde la proporción entre los dos anticuerpos de detección, tal como ha sido descrito anteriormente por Weiss et al., 2009 [PMID: 19664996]. La correlación entre la reducción de HTT en plasma por los anticuerpos anti-HTT y los cambios fenotípicos asociados en ratones YAC128 proporciona evidencia de la utilidad de una estrategia terapéutica basada en anticuerpos para la reducción del nivel de HTT en el plasma. Se demuestra que la reducción del nivel de HTT en plasma por los anticuerpos inducidos por péptidos resulta beneficiosa; por lo tanto, puede esperarse que los anticuerpos monoclonales derivados correspondientes resultan beneficiosos para un enfoque terapéutico de aféresis con el fin de reducir específicamente el nivel plasmático de HTT, tal como se demuestra en la presente memoria.

Ensayo Rotarod

Se entrenaron ratones YAC128 de dos meses de edad durante 3 días consecutivos en el Rotarod (Ugo Basille) a una velocidad fija de 18 revoluciones por minuto (RPM). Los ratones recibieron 3x pruebas de entrenamiento de 120 s cada día con un intervalo entre pruebas (IEP) de 1 h. Los ratones que caían del rodillo fueron inmediatamente reemplazados durante la duración de la prueba. Se registró la latencia hasta la primera caída y el número de caídas en cada prueba de entrenamiento. Se puntuó la media de las 3 pruebas con cada ratón. Para los ensayos en Rotarod longitudinal a intervalos de 2 meses entre las edades de 2 y 12 meses, se utilizó un programa acelerado de 5 a 40 rpm durante 300 s. Los ratones recibieron 3 pruebas con un IEP de 1 h y se registró la latencia hasta la primera caída. Se registró la media de las 3 pruebas.

Resultados:

Figura 9: determinación de Huntingtina en plasma mediante análisis FRET en animales wt y transgénicos YAC128, respectivamente, a los 12 meses del tratamiento de inmunización individual, inmunización combinada o portador de control (KLH). Se utilizaron los péptidos de las regiones PRR y región 586 de caspasa (p6771, y p7564 y p7543, respectivamente). Puede conseguirse una reducción significativa de la Huntingtina plasmática mediante el tratamiento combinado utilizando las combinaciones de péptidos p7543+p7564 o p7543+p6771 al comparar los niveles plasmáticos de Huntingtina con el tratamiento con portador de control (KLH) (p<0,001 y p<0,01, respectivamente; prueba t de Student, n=25 animales por grupo de tratamiento). Los números indican las unidades relativas (FRET); las barras de error indican desviaciones estándares.

Figura 10: prueba Rotarod en ratones YAC128 tratados y de control para medir la latencia hasta la caída (indicada como valor promedio en segundos; n=25 animales en cada grupo) realiza a los 4, 6, 8, 10 y 12 meses (indicada como "promedio en M4" -"promedio en M12") en ratones YAC128 transgénicos tratados con diversas inmunizaciones de péptidos individuales y combinaciones según se indica. Cabe destacar que los grupos de combinaciones "p7543+p7564" y "p7543+p6771" mostraron un rendimiento global mejor en este ensayo que los grupos tratados con un solo péptido, p7543, p6771 y p7564, respectivamente. Se mejoró significativamente el rendimiento motor en M4-M10 en el grupo de combinación p7543+p7564 en comparación con los grupos de portador de control (p<0,03, 0,02 y 0,01, respectivamente; pruebas t de Student, n=25). Este resultado concuerda con la reducción del nivel de Huntingtina plasmática indicado en la figura 9 y demuestra que la reducción de HTT en el torrente sanguíneo de un paciente de Huntington resulta beneficioso.

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Ejemplo 4: mapeado de epítopos de anticuerpos monoclonales y policlonales obtenidos mediante inmunización con los péptidos p6773, p7564 y p7543

Determinación de epítopos nucleares

Se llevó a cabo el mapeado de los epítopos de los péptidos utilizando el barrido de sustitución de alaninas mediante la determinación de los valores de títulos (OD[EC50]) mediante ELISA tal como se explica en el Ejemplo 1 o, alternativamente, mediante la aplicación de micromatrices de péptidos tal como ha sido descrito por Stadler et al., 2008. Brevemente, los péptidos que contenían sustituciones de alanina únicas en cada posición del péptido de aplicaron en puntos sobre las matrices y se determinó la pérdida de señal debido a las sustituciones en posiciones únicas mediante anticuerpos secundarios marcados por fluorescencia en combinación con un sistema de obtención de imágenes Odyssey de LI-COR Biosciences. Ello permitió una evaluación de la contribución de cada aminoácido individual del péptido al epítopo. Mediante la utilización de este procedimiento, el péptido de inmunización original que debía mapearse más las variantes por sustitución de una sola alanina para cada posición individual o el péptido se aplicaron en puntos sobre micromatrices y se hibridaron con los anticuerpos monoclonales respectivos o sueros inmunológicos que debían someterse a ensayo. Al reducir la señal resultante del péptido con sustitución de alanina a menos de 70% de la señal del péptido de inmunización original, se definió la posición de aminoácido con sustitución de alanina respectiva como parte del epítopo nuclear. Las secuencias resultantes de epítopo nuclear se proporcionan posteriormente para los sueros individuales o los mAB.

Resultados:

Se derivaron anticuerpos policlonales purificados por afinidad y anticuerpos monoclonales a partir de ratones individuales inmunizados con péptidos derivados de la región PRR (incluyendo p6771 y p6773) y péptidos derivados de la región 586 de caspasa (incluyendo p7543 y p6776). Los epítopos se mapearon utilizando el barrido de alaninas. Brevemente, se determinaron los epítopos de sueros individuales y anticuerpos monoclonales mediante el ensayo de los anticuerpos frente a péptidos con sustituciones de aminoácidos individuales para cada posición utilizando micromatrices de péptidos o ELISA de péptidos convencional (tal como se ejemplifica en la figura 11).

Alineaciones de péptidos y epítopos para los péptidos derivados de la región PRR p6771 y p6773 según se determinó mediante barrido de sustitución de alaninas:

LPQPPPQAQPLLPC............ péptido de inmunización p6771

LPQPPPQAQPLLPQPQPC.. péptido de inmunización p6773

.........................LLPQP.......... epítopo mapeado para el mAB PRR13

.......PPQAQPL...................... epítopo mapeado para el suero policlonal 1 de p6773

.......PPQAQP........................ epítopo mapeado para el suero policlonal 2 de p6773

.................QPLL.................... epítopo mapeado para el suero policlonal 3 de p6773

.........PQAQPLL.................... epítopo mapeado para el suero policlonal 4 de p6773

(SEC ID nº: 1, 4 y 77-81)

Alineaciones de péptidos y epítopos para los péptidos derivados de sueros inmunológicos policlonales inducidos por vacuna de p7543 y mAB C6-17 según se determinó mediante barrido de sustitución de alaninas:

GTDNQYLGLQIGC péptido de inmunización p7543

QYLGLQIG epítopo mapeado para el AC monoclonal C6-17

YLGLQIG epítopo mapeado para el suero policlonal 1 de p7543

DNQYLGLQIG epítopo mapeado para el suero policlonal 2 de p7543

DNQYLGL epítopo mapeado para el suero policlonal 3 de p7543

YLGLQIG epítopo mapeado para el suero policlonal 4 de p7543

(SEC ID nº: 3 y 82-86)

Alineaciones de péptidos y epítopos para los péptidos derivados de región 586 de caspasa que comprendían el ácido aspártico 586:

Figura 11: se determinó el epítopo nuclear de 5 sueros inmunológicos inducidos por p6776 mediante barrido de sustitución de alaninas mediante ELISA de péptidos utilizando los péptidos indicados que contenían sustituciones por alanina de aminoácidos individuales. Los 5 sueros (representados por columnas oscuras a brillantes) se hibridaron con péptidos con sustitución de alanina tal como se indica (para las secuencias de los péptidos, ver la Tabla 1). En consecuencia, 2 de cada 5 animales mostraron una reducción de la señal con los péptidos con sustitución de alaninas p7754, p7756, p7757 y p7758, respectivamente, delineando de esta manera un epítopo nuclear con la secuencia de aminoácidos IVLD. Los números indican la razón de OD titulada (logEC50) [péptido con sustitución de Ala: péptido wt].

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El mapeado de epítopos de los sueros inducidos por p7564 y mAB M1D1 se proporciona en el Ejemplo 5, figura

17.

Figura 12: el mAB M1D1 reconoce específicamente que el fragmento de Huntingtina recombinante con ácido aspártico 586 libre en el extremo C-terminal es más fuerte que recHTT610. El ELISA de proteínas (realizado tal como en el Ejemplo 1) utilizó Huntingtina recombinante de 610 y 586 aminoácidos de longitud (HTT610 y HTT586, respectivamente). Los valores indican la proporción entre la señal de mAB M1D1 (OD, ELISA de captura de proteínas tal como se explica en el Ejemplo 1) y la señal del anticuerpo de control mAB 2166. Los valores se normalizaron respecto al mAB 2166 de referencia que reconocía un epítopo interno presente en ambos fragmentos como control de carga de las proteínas.

Ejemplo 5: generación y caracterización de los anticuerpos monoclonales PRR13, C6-17 y M1D1

Anticuerpos monoclonales

Para la producción y aislamiento de anticuerpos monoclonales, se utilizó el kit de clonación de hibridoma ClonaCell-HY (STEMCELL Technologies, nº de cat. 28411) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se llevaron a cabo fusiones de hibridoma con la línea celular de mieloma SP2-0 bajo selección con HAT y se cribaron inicialmente los sobrenadantes mediante ELISA de péptidos utilizando el péptido de inmunización, respectivamente, y un péptido de control irrelevante para la determinación del fondo. En el caso de M1D1, se utilizó un ELISA contra el péptido p6776 que contenía el ácido aspártico C-terminal libre para determinar la especificidad para el péptido cortado con ácido aspártico C-terminal libre, tal como se indica en el ejemplo 5. Los mAB candidatos se purificaron mediante afinidad tal como se ha indicado y ensayado frente a recHTT610 mediante ELISA de proteínas, tal como se indica en el Ejemplo 1. El número de clones de fusión cribados era típicamente de e500 para cada fusión, respectivamente. Para la secuenciación de las regiones VL y VH, se extrajo el ARNm de los clones de fusión, se transcribieron inversamente utilizando cebadores Oligo(dT) y se amplificaron por PCR utilizando cebadores de dominio variable para amplificar tanto las regiones VH como las VL. Los productos de VH y VL se clonaron utilizando procedimientos de clonación por PCR estándares (Invitrogen, nº de cat. K4560-01), se transformaron en células TOP10 y se cribaron por PCR para los transformantes positivos. Se recolectaron las colonias seleccionadas y se analizaron mediante secuenciación del ADN en un analizador genético ABI3130x1.

Purificación por afinidad de los anticuerpos

Los mAB y los anticuerpos policlonales se aislaron a partir del sobrenadante de hibridoma (SH) y el plasma, respectivamente, utilizando perlas magnéticas activadas con yodoacetilo BcMagTM (Bioclone, FG-102) a las que se enlazaron péptidos que contenían cisteína, siguiendo el protocolo del fabricante. Tras la incubación del plasma/SH durante 2 h a TA, las perlas se lavaron con un tampón de alta concentración salina (PBS, Triton X100 al 0,2%, complementado con NaCl hasta una concentración final de 350 mM) y los anticuerpos unidos se eluyeron 4 veces con tampón de elución ácido (Thermo, nº de cat. 21004). Tras la neutralización en HEPES, pH 8 (concentración final de 75 mM), los anticuerpos eluidos se concentraron y se intercambió el tampón por PBS hasta un volumen de 100 µl utilizando tubos concentradores Spin-X UF500 (Corning, CLS431478). Se determinaron las concentraciones de los anticuerpos con el sistema Qubit (Invitrogen, nº de cat. Q32866) siguiendo el protocolo del fabricante.

Resultados:

Se generó el anticuerpo PRR13 mediante la técnica del hibridoma utilizando el péptido p6773 como inmunógeno. El péptido p6773 mostraba efectos neuroprotectores beneficiosos en la inmunización activa de los animales R6/1 transgénicos, tal como se muestra en el ejemplo 2 y se solapa con p6771. Se seleccionó PRR13 de entre 9 mAB candidatos preseleccionados que reconocían un péptido derivado de PRR, tal como se muestra en la figura 11. De entre los mAB candidatos listados en la figura 13, se seleccionó PRR13 basándose en su proporción de señal/ruido favorable al hibridarlo con HTT610 recombinante, tal como se muestra en la figura 12.

Figura 13: los sobrenadantes de hibridoma derivado de ratones inmunizados con el péptido p6773 proporcionan un fuerte reconocimiento del péptido de inmunización en 7 de entre los 9 clones candidatos cribados previamente al someterlos a ensayo mediante ELISA de péptidos.

Figura 14: en contraste con las señales antipéptido específicas (figura 11), sólo 2 de entre los 9 mAB candidatos: PRR13 y PRR18, reconocían específicamente la Huntingtina recombinante al someterla a ensayo mediante ELISA de captura de recHTT610 (tal como se explica en el Ejemplo 1). Estos dos candidatos proporcionan una proporción de señal a ruido extraordinaria (es decir >=4, señal específica de reHTT610 calculada: extractos de control de HEK) y se seleccionó PRR13 para la caracterización de los epítopos (ver el Ejemplo 4) y la secuenciación de cadenas variables (ver a continuación). Se determinó que PRR13 era IgG, subtipo IgG2a de ratón.

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aminoácidos de longitud que contiene ácido aspártico C-terminal libre. En contraste, los péptidos más cortos o los péptidos sin ácido aspártico C-terminal libre no son reconocidos o sólo son reconocidos débilmente por M1D1, demostrando de esta manera la especificidad de dicho anticuerpo monoclonal para la secuencia cortada con ácido aspártico COOH-terminal libre, tal como la posición aminoácida libre 586 de la proteína Huntingtina humana cortada (las columnas representan la OD de ELISA de péptidos a una concentración de mAB de 1 ng/µl; las denominación de los péptidos, de izquierda a derecha, son las siguientes: p7564, p7562, p7552, p7541, p7567, p7568, p7605 y p6777).

>Secuencia de aminoácidos de consenso de VH de M1D1 (SEC ID nº: 64):

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>Secuencia de aminoácidos de consenso de VL de M1D1 (SEC ID nº: 65):

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Ejemplo 6: utilización de los anticuerpos monoclonales PRR13 y C6-17 para la reducción del nivel de proteína Huntingtina de suero humano

Reducción del nivel de Huntingtina

Se incubaron 100 µg de perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads T1, nº de cat. 65601) en un volumen de tampón de 50 µl con 20 ng/µl de mAB biotinilados durante 1 h a TA. Se diluyó suero humano

1:4 con PBS y se añadieron extractos de proteínas de recHTT610 y células transfectadas con control a una concentración de extracto final de entre 50 y 100 ng/µl, obtenida respectivamente tal como se indica en el Ejemplo 1. Se acoplaron mAB biotinilados a perlas con estreptavidina y se incubaron durante la noche a TA con suero que contenía extracto celular de Huntingtina. Tras el lavado intensivo de las perlas (Tris 50 mM, NaCl 250 mM, Tween al 0,1%), para confirmar la eficacia de reducción del nivel de recHTT610 por los anticuerpos monoclonales, se sometió a ensayo el suero de entrada (que contenía recHTT610), el suero de control y el suero que contenía un nivel reducido de recHTT610 mediante ELISA de captura de recHTT610, tal como en el Ejemplo

1.

Resultados:

Con el fin de demostrar que los mAB PRR13 y C6-17 pueden utilizarse como adsorbedores específicos para la aféresis terapéutica de la Huntingtina plasmática, se añadió un exceso de Huntingtina recombinante recHTT610 a sueros humanos procedentes de donantes sanos y posteriormente se sometieron a la reducción ex vivo de la cantidad de mAB PRR13, C6-17 e IgG de control inmovilizados con biotina, respectivamente. Tal como se muestra en la figura 18, los anticuerpos monoclonales PRR13 y C6-17, pero no IgG, redujeron eficientemente el exceso de Huntingtina del plasma humano. Por lo tanto, dichos anticuerpos proporcionan adsorbedores convenientes para la aféresis terapéutica para el tratamiento de la Huntingtina. La utilidad de dichos anticuerpos para el tratamiento de aféresis terapéutica en la enfermedad de Huntington está basada en el hecho de que los mAB PRR13 y C6-17 fueron generados mediante la utilización de p6773 y p7543 como péptido de inmunización. Los péptidos de dichas regiones diana son capaces de inducir anticuerpos que reducen el fenotipo de enfermedad de Huntington en modelos de animal transgénico, tal como se muestra en los Ejemplos 2 y 3, respectivamente. Análogamente, se espera que los mAB correspondientes proporcionen un beneficio similar al reducir la cantidad de HTT, tal como se demuestra en la figura 18.

Figura 18: reducción específica de la cantidad de Huntingtina recombinante recHTT610 del suero humano utilizando los mAB PRR13 y C6-17 en comparación con el anticuerpo IgG de isotipo de control. Tal como refleja la reducción de la señal de Huntingtina en el plasma (determinada mediante ELISA de proteínas, tal como en el Ejemplo 1), dichos mAB pueden adsorber eficientemente y reducir el nivel de Huntingtina según se requiera para la aféresis terapéutica. El gráfico representa el nivel de la señal de Huntingtina (expresado como DO, medido como ELISA de captura de proteínas) detectada antes de la reducción de la cantidad (Entrada), tras la reducción de la cantidad por anticuerpos específicos (ACm PRR13 y C6-17) y tras la reducción de la cantidad por un anticuerpo de control de isotipo (IgG).

Tabla 1: usos preferentes de péptidos (nombre de péptido/región de péptido/secuencia de péptido ('C' indica acoplamiento con la proteína portadora; puede proporcionarse en el extremo N-terminal o C-terminal del péptido), excepto por p7564, p7541, p7552, p7562, p7563, p7567 o p7568, en donde se requiere un ácido

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Claims

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