JP6752148B2 - 三官能性ｔ細胞−抗原カプラ及び方法並びにこれらの使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１４年２月７日付出願の米国特許仮出願第６１／９３６，９０６号に基づく優先権を主張するものであり、その内容は全文引用により本明細書に組み込まれている。

本発明は、特定の標的細胞に対して高い細胞毒性を有し、標的外の毒性が低下したＴ細胞を操作することにより癌を処置する方法に関する。特に、本開示は、自然に起こるＴ細胞活性化過程を模倣する新規生物学的因子を発現するようにＴ細胞を操作することに関する。

癌は健康面の深刻な課題であり、カナダでは２０１３年だけでも１５０，０００症例を超える癌が診断されると見込まれている。疾患が早期の患者は従来の治療法（手術、放射線療法、化学療法）によって効果的に処置することができるが、疾患が進行した患者には利用可能な選択肢は少なく、またこうした選択肢は通常本質的に姑息的なものである。能動免疫療法は、腫瘍沈着物を取り除くために患者の免疫系を利用しようとし、従来の療法の役に立たなかった患者に心躍る選択肢を提供している（非特許文献１）。実際、いくつかの臨床研究はＴ細胞を用いた免疫療法が進行性黒色腫患者に対して治癒的であり得ることを明らかにしており、このアプローチの有用性が裏付けられている（非特許文献１）。さらに、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ：ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）に罹患している患者もＴ細胞免疫療法で効果的に処置され、治癒されている（非特許文献２）（非特許文献３）。いくつかの免疫療法アプローチがあるが、キメラ受容体を用いてＴ細胞を操作することにより、どの患者の免疫細胞も主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）非依存性に任意の所望の標的を標的とすることが可能となる。これまでのところ、Ｔ細胞を操作するために用いられるキメラ受容体は、標的ドメイン、通常単鎖可変断片（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）；膜貫通ドメイン；並びにＴ細胞受容体及び関連タンパク質からのシグナル伝達要素を含む細胞質ドメインで構成されている（非特許文献４）。このようなキメラ受容体は、「Ｔボディ（Ｔ−ｂｏｄｙ）」、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」もしくは「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」と呼ばれてきた―現在では、多くの研究者は用語「ＣＡＲ」を使用している（非特許文献４）。こうしたＣＡＲは、要素の観点から考慮されており、科学者はＣＡＲの機能に対する種々の細胞質シグナル伝達ドメインの影響を調査するのにかなりの時間を費やしてきた。第一世代のＣＡＲはＣＤ３ζもしくはＦｃεＲＩγからの単一シグナル伝達ドメインを用いた。第二世代のＣＡＲは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインと受容体のＣＤ２８もしくはＴＮＦＲファミリからの共刺激受容体の細胞質ドメインとを合わせ持っていた（非特許文献４）。第三世代のＣＡＲは複数の共刺激ドメインを合わせ持ったが、第三世代ＣＡＲは抗原特異性を失う懸念がある（非特許文献５）。臨床で試験されつつある多くのＣＡＲ操作Ｔ細胞は、ＣＤ３ζがＣＤ２８もしくはＣＤ１３７の細胞質ドメインにカップリングされている第二世代ＣＡＲを用いている（非特許文献５）（非特許文献６）（非特許文献７）。

ＣＡＲ操作Ｔ細胞は、臨床応用においてかなりの将来性を示してきたが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によってもたらされる活性化シグナルを置換するための合成方法に依存している。この合成受容体はＴＣＲと会合するシグナル伝達成分（例えば、ＣＤ３イプシロン、Ｌｃｋ）の全てを送達するわけではないので、Ｔ細胞がＣＡＲによって最適に活性化されるかどうか、又はＣＡＲ活性化がＴ細胞の分化（例えば、発達乃至記憶）にどのように影響するかは未だ不明である。さらに、ＣＡＲシグナル伝達ドメインがＣＡＲ構造の本質そのものによってその天然の調節相手から切り離されているので、ＣＡＲが標的外の毒性をもたらす恐れがある低レベルの構成的活性化につながり得る固有のリスクもある。

こうした制約を考えると、天然のＴＣＲを介して腫瘍を攻撃するようにＴ細胞を再誘導することが好ましい。そのために、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ：Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ）」と呼ばれる部類の組換えタンパク質が作製されている（非特許文献８）（非特許文献９）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞ＴＣＲ受容体を標的抗原と架橋させるために二重特異性抗体断片を用いている。このことが効率的なＴ細胞活性化をもたらし、細胞毒性を引き起こす。同様に、この目標を達成する二重特異性抗体が作製されており、一部の科学者は、単純に化学結合を用いて抗ＣＤ３抗体を腫瘍特異的抗体に連結させている（非特許文献８）。こうした二重特異性タンパク質は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）である程度の活性を示したが、癌処置においてこれらの分子の使用に成功するにはＧＭＰ製造、短い生物学的半減期及びバイオアベイラビリティが大きな課題を投げかけている。さらに、これらの分子は、ＴＣＲ共受容体（ＣＤ８及びＣＤ４）に係合しないため、自然に起こるＴＣＲシグナル伝達を適正に反復することもできない。

従って、在来型ＣＡＲと比較して活性及び安全性を高めたＴ細胞−抗原カプラに対する要望が依然として存在する。

ハンフリーズ（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ）、Ｃ．（２０１３年）、「養子細胞療法：その殺傷能の洗練（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｈｏｎｉｎｇ ｔｈａｔ ｋｉｌｌｅｒ ｉｎｓｔｉｎｃｔ．）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）５０４：Ｓ１３−５。 フライ（Ｆｒｙ）、Ｔ．Ｊ．、マッコール（Ｍａｃｋａｌｌ）、Ｃ．Ｌ．（２０１３年）、「急性リンパ芽球性白血病に対する養子Ｔ細胞療法（Ｔ−ｃｅｌｌ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）」、ヘマトロジー・アメリカン・ソサエティ・ヘマトロジー・エデュケーション・プログラム（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ）２０１３、３４８−３５３。 コヘンデルファー（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ）、Ｊ．Ｎ．、ローゼンベルク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｓ．Ａ．（２０１３年）、「抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞によるＢ細胞癌の処置（Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂ−ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉ−ＣＤ１９ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」、ネイチャー・レビューズ・クリニカル・オンコロジー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、１０：２６７−２７６。 ドッティ（Ｄｏｔｔｉ）、Ｇ．、サヴォルド（Ｓａｖｏｌｄｏ）、Ｂ．、ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）、Ｍ．（２００９年）、「キメラ抗原受容体に基づく遺伝子療法の１５年："まだ目標に近づいていない？"（Ｆｉｆｔｅｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： "ａｒｅ ｗｅ ｎｅａｒｌｙ ｔｈｅｒｅ ｙｅｔ？"）」、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）２０：１２２９−１２３９。 ハン（Ｈａｎ）、Ｅ．Ｑ．、リー（Ｌｉ）、Ｘ．及びハン、Ｓ．（２０１３年）、「癌免疫療法のためのキメラ抗原受容体操作Ｔ細胞：プロセス及び課題（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ）」、ジャーナル・オブ・ヘマトロジー・アンド・オンコロジー（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．）、６：４７。 フィニー（Ｆｉｎｎｅｙ）、Ｈ．Ｍ．、アクバル（Ａｋｂａｒ）、Ａ．Ｎ．、ローソン（Ｌａｗｓｏｎ）、Ａ．Ｄ．Ｇ．（２００４年）、「キメラ受容体を有する静止ヒト一次Ｔ細胞の活性化：ＴＣＲゼータ鎖からのシグナルと連続したＣＤ２８、誘導性共刺激因子、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７からの共刺激（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＣＤ２８， ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ， ＣＤ１３４， ａｎｄ ＣＤ１３７ ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＴＣＲ ｚｅｔａ ｃｈａｉｎ）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１７２：１０４−１１３。 ミローヌ（Ｍｉｌｏｎｅ）、Ｍ．Ｃ．、フィッシュ（Ｆｉｓｈ）、Ｊ．Ｄ．、カルペニート（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ）、Ｃ．、キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）、Ｒ．Ｇ．、ビンダー（Ｂｉｎｄｅｒ）、Ｇ．Ｋ．、ティーチェイ（Ｔｅａｃｈｅｙ）、Ｄ．、サマンタ（Ｓａｍａｎｔａ）、Ｍ．、ラハル（Ｌａｋｈａｌ）、Ｍ．、グロス（Ｇｌｏｓｓ）、Ｂ．ダネット デスノイヤーズ（Ｄａｎｅｔ−Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ）、Ｇ．ほか（２００９年）、「ＣＤ１３７シグナル伝達ドメインを含有するキメラ受容体は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるＴ細胞の生存上昇及び抗白血病効果の増強を媒介する。（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ１３７ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ）．」、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）１７：１４５３−１４６４。 チャメス（Ｃｈａｍｅｓ）Ｐ．及びバティ（Ｂａｔｙ）、Ｄ．（２００９年）、「癌療法のための二重特異性抗体：トンネルの終わりに見える明かり？（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ａｔ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｎｎｅｌ？）」、モノクロナール・アンティボディズ（ＭＡｂｓ）１：５３９−５４７。 ポーテル（Ｐｏｒｔｅｌｌ）、Ｃ．ａ．、ウェンゼル（Ｗｅｎｚｅｌｌ）、Ｃ．Ｍ．、アドバニ（Ａｄｖａｎｉ）、Ａ．Ｓ．（２０１３年）、「Ｂ細胞急性リンパ性白血病の処置におけるブリナツモマブの臨床的及び薬理学的側面（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）」、クリニカル・ファーマコロジー（Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）５：５−１１。

本発明者らは、主組織適合複合体に拘束されない標的指向性を維持しながらＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して自然に起こるシグナル伝達をよりよく模倣する三官能性Ｔ細胞−抗原カプラが在来型キメラ抗原受容体と比較して高い活性及び安全性を示すことを明らかにした。

そこで、本開示の一態様は、
ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
ｂ．ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド及び
ｃ．Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
を含む核酸を提供する。

本開示の別の態様は、上記の核酸によってコードされるポリヌクレオチドを提供する。

本開示の別の態様は、上記の核酸を含む発現ベクターを提供する。

本開示のさらに別の態様は、上記の核酸を発現するＴ細胞を提供する。本開示の別の態様は、上記Ｔ細胞及び担体を含む医薬組成物を提供する。

また、本開示は、癌を処置するためのＴ細胞のこれを必要とする対象における使用であって、前記Ｔ細胞は
ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
ｂ．ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド及び
ｃ．Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
を含む核酸を発現する、使用を提供する。

一実施態様において、前記標的特異的リガンドは癌性細胞上の抗原に結合する。

別の実施態様において、前記標的特異的リガンドは、設計されたアンキリン・リピート（ダルピン（ＤＡＲＰｉｎ：ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ））ポリペプチド又はｓｃＦｖである。

別の実施態様において、前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質はＣＤ３である。

別の実施態様において、前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドは単鎖抗体である。

別の実施態様において、前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドはＵＣＨＴ１又はその変異体である。

別の実施態様において、前記Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。

別の実施態様において、前記細胞質ドメインはＣＤ４細胞質ドメインであり、前膜貫通ドメインはＣＤ４膜貫通ドメインである。

別の実施態様において、前記第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドに融合している。

別の実施態様において、前記第二のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第一のポリヌクレオチドに融合している。

また、本開示は、
ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
ｂ．ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド、
ｃ．Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド及び
ｄ．哺乳動物細胞において機能できるプロモータ
を含むベクター構築物を提供する。

一実施態様において、前記第一のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドと融合してＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、前記Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列は前記プロモータと動作可能に結合している。

別の実施態様において、前記第二のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドは前記第一のポリヌクレオチドと融合してＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、前記Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列は前記プロモータと動作可能に結合している。

また、本開示は、前記ベクター構築物を形質移入した単離Ｔ細胞を提供する。

本開示の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかになろう。しかしながら、本開示の精神及び範囲内で様々な変更や修正を加えることができることはこの詳細な説明から当業者に明瞭に理解されるであろうから、詳細な説明及び具体例は、本開示の好ましい実施態様を示すものではあるが、もっぱら例証として示されるものであることは理解されよう。

従来の第二世代ＣＡＲと比較した三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ：ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ−ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｕｐｌｅｒ）の図式的概要図である。 Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体及び古典的ＣＡＲの表面発現分析の結果を示す図である。 種々のマーカＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＣＤ１０７ａに着目した細胞活性化の分析結果を示す図である。 古典的ＣＡＲ及びＴｒｉ−ＴＡＣの分子標的である（Ｄ２Ｆ２Ｅ２）を発現するか（Ｄ２Ｆ２）を発現しない２種の異なる細胞株の殺傷を分析した結果を示す図である。 自然に起こるＴ細胞活性化開始（Ａ）、現在用いられているＴ細胞活性化の人為的方法（Ｂ及びＣ）並びにＴＡＣ活性化技術（Ｄ）を示す図である。 （Ａ）ＴＡＣ分子の形態１及び（Ｂ）ＴＡＣ分子の形態２を示す図である。 ｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣの機能性を示す図である。（Ａ）は空のベクターと比較したｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ受容体の表面発現を示すヒストグラムであり、（Ｂ）はｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ（上段）又はｓｃＦＶ ＣＡＲ（下段）を発現するＴ細胞の抗原特異的活性化を示し、（Ｃ）はｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ及びｓｃＦｖ ＣＡＲによるＭＣＦ−７ヒト腫瘍細胞株（Ｈｅｒ２陽性）の同程度の殺傷を示す。 ＣＤ４−ＴＡＣ形態２の特性を示す図である。（Ａ）は空のベクターと比較したダルピンＣＤ４ ＴＡＣ受容体の表面発現を示すヒストグラムであり、（Ｂ）はＨｅｒ２抗原に暴露したダルピンＴＡＣ形態２で操作したＴ細胞のサイトカイン産生及び脱顆粒を示し、（Ｃ）は空ベクターの対照と比較したＣＤ４ ＴＡＣ形態２の増殖を示す。 ダルピンＣＤ４ ＴＡＣ形態１の機能性を示す図である。（Ａ）はダルピンＣＡＲ及び対照のＮＧＦＲのみと比較したダルピンＣＤ４ ＹＡＣの表面発現を示し、（Ｂ）はＣＤ４ ＴＡＣ構造１の増殖を示し、（Ｃ）及び（Ｄ）は種々の活性化及び脱顆粒マーカについて陽性の細胞のパーセンテージを示す。 ＴＡＣ及びＣＡＲの細胞毒性及び全般的活性を示す図である。ＴＡＣ、ＣＡＲ又は空のベクター対照で操作した細胞を種々のヒト腫瘍細胞株中でインキュベートした。 種々のＴＡＣ対照の受容体表面発現及び活性化を示す図である。（Ａ）は細胞表面発現（左）、脱顆粒（中央）及びサイトカイン産生（右）を示し、（Ｂ）は完全長のＣＤ４−ＴＡＣのみが細胞毒性反応を惹起することができるのを示す。 種々の膜貫通ＴＡＣ変異体の性質を示す図である。（Ａ）は種々の膜貫通ドメイン構築物の全体像であり、（Ｂ）はＣＤ８精製Ｔ細胞において操作された種々の構築物の発現の表面を示し、（Ｃ）は脱顆粒及びサイトカイン産生についての種々の変異体の試験結果を示す。 ＬｃｋのＴＡＣ変異体との相互作用を示す図である。（Ａ）は完全長ＴＡＣ及び細胞質欠損のＬｃｋ破壊能力を示し、（Ｂ）は（Ａ）のペレットにおいて検出されたＬｃｋのデンシトメトリー分析である。 ＢｉＴＥ様変異体と比較したＣＤ４ ＴＡＣ表面発現及び活性を示す図である。（Ａ）は対照であるＮＧＦＲのみ、ＣＤ４ ＴＡＣ及びＢｉＴＥ様変異体の表面発現を示し、（Ｂ）は各種細胞株における細胞毒性の比較である。 ＵＣＨＴ１のランダム突然変異原ライブラリと比較した野生型ＣＤ４ ＴＡＣを示す図である。（Ａ）は突然変異体の模式図を示し、（Ｂ）はライブラリの表面発現を示すヒストグラムであり、（Ｃ）はライブラリのＴ細胞活性化及びサイトカイン産生能を示す。 Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の表面発現の増強を示す図である。（Ａ）はＣＤ４ ＴＡＣ及びＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体間における最終的ＣＤ／ＣＤ８集団の比較であり、（Ｂ）はＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の表面発現の増強を示し、（Ｃ）はＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体においてサイトカイン産生が減少することを示す。 Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の細胞毒性及び増殖を示す図である。（Ａ）は種々の細胞株におけるＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の細胞毒性を示し、（Ｂ）は２週間にわたる培養における細胞増殖を示す。

（ｉ）定義
本明細書で用いている「細胞」という用語は、単一の細胞及び複数の細胞を含む。

本明細書で用いている「Ｔ細胞」という用語は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす１種のリンパ球のことを指している。Ｔリンパ球とも呼ばれるＴ細胞は、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することで、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞にははっきりと異なる機能を有するいくつかのサブセットがあり、これらサブセットとしては、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞及びナチュラルキラーＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で用いている「Ｔ細胞抗原カプラ」という用語は、Ｔ細胞上に発現された場合に特定の抗原を標的にしてこのＴ細胞を送達する操作された核酸構築物又はポリペプチドのことを指している。

本明細書で用いている「ポリヌクレオチド」及び／又は「核酸配列」及び／又は「核酸」という用語は、塩基、糖及び糖間（主鎖）結合からなる一連のヌクレオシド又はヌクレオチドモノマーのことを指している。また、この用語には、非天然型モノマーを含む修飾もしくは置換された配列又はそれらの部分が含まれる。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）又はリボ核酸配列（ＲＮＡ）とすることができ、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然型の塩基を含むことができる。また、こうした配列は修飾塩基を含むこともできる。そのような修飾塩基としては、例えば、アザ及びデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシル並びにキサンチン及びヒポキサンチンが挙げられる。本開示の核酸は、遺伝子組換えの実験室的方法によって形成された、又は核酸を作製するための化学合成もしくは他の既知のプロトコルによって得られた生物有機体から単離することができる。

本明細書で用いている「単離ポリヌクレオチド」又は「単離核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術で製造された場合の細胞物質もしくは培養培地、又は化学的に合成された場合の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸のことを指している。また、単離核酸は、その核酸が由来する、もともとその核酸を挟んでいる配列（即ち、その核酸の５’及び３’末端にある配列）を実質的に含まない。「核酸」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものとし、２本鎖又は１本鎖とすることができ、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、その相補性核酸配列を含む。

本明細書で用いている「組換え核酸」又は「操作核酸」という用語は、生物有機体には存在しない核酸又はポリヌクレオチドのことを指している。例えば、組換え核酸は、（分子クローニングなどの）遺伝子組換えの実験室的方法により形成され、そうでなければ自然界には存在しないはずである配列をもたらすことができる。また、組換え核酸は、化学合成又は核酸を作製するための他の既知のプロトコルによって作製することもできる。

本明細書で用いている「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、核酸によってコードされるアミノ酸に相当するアミノ酸の鎖を言い表している。本開示のポリペプチド又はタンパク質は、通常２乃至約３０個のアミノ酸のアミノ酸の鎖を言い表しているペプチドとすることができる。また、本明細書で用いている用語タンパク質は、３０個を超えるアミノ酸を有するアミノ酸鎖を言い表しており、タンパク質の断片もしくはドメイン又は完全長のタンパク質とすることができる。さらに、本明細書で用いている用語タンパク質は、アミノ酸の線状鎖のことを指すことができ、又はこれは機能性タンパク質へと加工もしくは折りたたまれたアミノ酸の鎖のことを指すことができる。但し、３０はペプチドとタンパク質を区別することに関する任意数であり、これらの用語はアミノ酸鎖に関して同じ意味で用いることができるものとする。本開示のタンパク質は、これが酵素的（タンパク質分解的）切断により天然に及び／又は本開示のタンパク質もしくは断片をコードする核酸の発現によって組み換え技術により産生される細胞からのタンパク質の単離及び精製によって得ることができる。また、本開示のタンパク質及び／又は断片は、化学合成又はタンパク質及び断片を製造するための他の既知のプロトコルによって得ることもできる。

「単離ポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって製造する場合の細胞物質もしくは培養培地又は化学的に合成する場合の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドのことを指している。

本明細書で用いている「抗体」という用語は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、単鎖抗体、キメラ抗体及び抗体融合体を含むものである。この抗体は、組換え供給源からのものとすることができ、及び／又は遺伝子導入動物において産生させることができる。本明細書で用いている「抗体断片」という用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ及びこれらのマルチマー、多特異的抗体断片並びにドメイン抗体を含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書で用いている「ベクター」という用語は、細胞の内部に核酸を送達するために用いることができるポリヌクレオチドのことを指している。一実施態様において、ベクターは、細胞内発現対象の核酸に動作可能なように連結させた発現制御配列（例えば、プロモータ）を含む発現ベクターである。当該分野で知られているベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

（ｉｉ）組成物
本発明者らは、ＭＨＣに拘束されない標的指向性を維持しながらＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して自然に起こるシグナル伝達をよりよく模倣する三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を開発した。具体的には、本発明者らは、それぞれ、脂質ラフトへ局在化し、Ｌｃｋに結合する、ＣＤ４共受容体の膜貫通及び細胞内領域がＣＤ３に結合する単鎖抗体に融合した分子を作製した。この構築物は、自然に起こるＭＨＣ結合と同様に、脂質ラフトの領域にＣＤ３分子及びＴＣＲを引き込み、ＴＣＲの近傍にＬｃｋを持ち込むように設計されている。このキメラ受容体を標的にするために、設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）をＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結させて三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を作製した。

実験的に、ヒトＴ細胞を操作して同じダルピンを有するプロトタイプＴｒｉ−ＴＡＣ又は従来型ＣＡＲを発現させた。その結果、あらゆる面で、Ｔｒｉ−ＴＡＣで操作したＴ細胞は従来型ＣＡＲと同等の機能性を示すことが明らかとなった。２つのパラメータ（ＴＮＦ−α産生及びＣＤ１０７ａ動員）に関しては、Ｔｒｉ−ＴＡＣは従来型ＣＡＲよりも活性であることが認められた。さらに、データから、１分子当たりのＴｒｉ−ＴＡＣは有意な活性の増強を示すことが分かる。さらに、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、活性化ドメインがこのタンパク質の一部ではないので、在来型ＣＡＲと比較して安全性の向上を示す。

そこで、本開示は、
標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
ＴＣＲ複合体に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド、及び
Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
を含む核酸に関する。

一実施態様において、核酸は組換え、即ち、操作核酸である。別の実施態様において、第一、第二及び／又は第三のポリヌクレオチドは組換え、即ち、操作ポリヌクレオチドである。

また、本開示は、核酸によってコードされるポリペプチド及びこの核酸を含む組成物に関する。

第一、第二及び第三のポリヌクレオチドの各々を含む核酸並びにこの核酸によってコードされるポリペプチドを本明細書では三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ又はＴｒｉ−ＴＡＣとも言う。

標的特異的リガンド
標的特異的リガンドはＴ細胞−抗原カプラを標的細胞へ誘導する。従って、標的特異的リガンドは直接的又は間接的に標的細胞に結合する任意の物質のことを指している。標的細胞は、癌を含むがこれに限定されない疾病状態に関連する任意の細胞とすることができる。一実施態様において、標的特異的リガンドは標的細胞上の抗原（免疫反応を惹起することができる細胞によって産生されるタンパク質）に結合する。この標的特異的リガンドは抗原結合ドメインと呼ぶこともできる。

一実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞である。この場合、標的特異的リガンドは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原に結合することができる。腫瘍抗原は当該分野では周知のものである。本明細書で用いている「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」という用語は、（例えば、ＭＨＣ複合体によって表すことができる）宿主において免疫反応を引き起こす腫瘍細胞中で産生される任意の抗原性物質を意味している。タンパク性である場合の腫瘍抗原は、例えば、８個以上のアミノ酸から最大完全なタンパク質、及びＭＨＣ複合体として表すことができる完全長のタンパク質の少なくとも１つの抗原性断片を含む８個と完全長タンパク質との間の任意のアミノ酸数の配列とすることができる。腫瘍抗原としては、例えば、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ−２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ：Ｂ−ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ：ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ：ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ：ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、スルビビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１：ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ−１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ：ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体並びにメソテリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

標的特異的リガンドとしては、例えば、抗体及びその断片、例えば、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体、あるいは標的細胞及び／又は抗原に結合する低分子タンパク質が挙げられる。

標的特異的リガンドの１例は、特定の細胞及び／又は抗原を標的とする設計アンキリン・リピート（ダルピン）である。一実施態様において、標的特異的リガンドはＨＥＲ２（ｅｒｂＢ−２）を標的とするダルピンである。ＨＥＲ２（ｅｒＢ−２）を標的とするダルピンの１例は、本明細書に配列番号７及び８として示されている。

標的特異的リガンドの別の例は、特定の細胞及び／又は抗原を標的としたｓｃＦｖである。一実施態様において、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ２（ｅｒＢ−２）に結合するｓｃＦｖである。ＨＥＲ２（ｅｒＢ−２）に結合するｓｃＦｖの１例は、本明細書に配列番号２２及び２３として示されている。

ＴＣＲ複合体に結合するリガンド
Ｔ細胞−抗原カプラは、共受容体刺激との組合せでＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を動員するように設計されている。従って、このＴ細胞−抗原カプラは、Ｔ細胞受容体複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドを含む。

ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）は、抗原の結合に反応してＴ細胞の活性化に関与する内在性膜タンパク質の複合体である。このＴＣＲは、通常、不変のＣＤ３（分化抗原群３：ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３）鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）及びベータ（β）鎖からなるジスルフィド結合膜固定ヘテロダイマーである。この受容体を発現するＴ細胞はα：β（又はαβ）Ｔ細胞と呼ばれるが、少数のＴ細胞は、γδＴ細胞と呼ばれる可変性のガンマ（γ）及びデルタ（δ）鎖によって形成される代替受容体を発現する。ＣＤ３は、４つの区別できる鎖で構成されるタンパク質複合体である。哺乳動物では、この複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含む。

本明細書で用いている「Ｔ細胞受容体複合体と会合するタンパク質に結合するリガンド」という用語は、直接的又は間接的にＴＣＲのタンパク質に結合する任意の物質を含む。ＴＣＲと会合するタンパク質としては、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及びＣＤ３ε鎖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施態様において、Ｔ細胞受容体複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び／又はＣＤ３ε鎖に対する抗体である。

一実施態様において、リガンドは、ＣＤ３に結合する抗体又はその断片である。ＣＤ３抗体の例は当該分野では周知されている（例えば、ムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブ）。一実施態様において、ＣＤ３に結合する抗体は、単鎖抗体、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

ＣＤ３抗体の別の例は、ＣＤ３εを標的にするＵＣＨＴ１である。ＵＣＨＴ１の配列は、本明細書に配列番号１３及び１４として示されている。

Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチド
Ｔ細胞−抗原カプラは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドを含む。本明細書で用いている「Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン」という用語は、（ａ）脂質ラフトへ局在化し、及び／又は（ｂ）Ｌｃｋに結合するポリペプチドのことを指している。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、細胞質ドメイン及び／又は膜貫通ドメインを含むがこれらに限定されない１つ以上のタンパク質ドメインを含むことができる。本明細書で用いている「タンパク質ドメイン」とは、このタンパク質鎖の残りの部分とは独立に機能し、存在することができる所与のタンパク質配列構造の保存部分のことを指している。一実施態様において、前記Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、細胞質ドメインを含む。別の実施態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。別の実施態様では、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインのいずれをも含む。

Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドとしては、ＴＣＲ共受容体及び共刺激因子並びにＴＣＲ共受容体及び共刺激因子タンパク質ドメインが挙げられる。

「ＴＣＲ共受容体」とは、抗原提示細胞とやりとりする際にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を支援する分子のことを指している。ＴＣＲ共受容体としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤｔ３７及びＣＤ１５４が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

「ＴＣＲ共刺激因子」とは、抗原に対するＴ細胞の反応に必要とされる分子のことを指している。ＴＣＲ共刺激因子としては、例えば、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球フィクション関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一実施態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体又は共刺激因子タンパク質の細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を含む。これら細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインは、同じ共受容体又は共刺激因子由来あるいは異なる共受容体又は共刺激因子由来のものとすることができる。これら細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインは、任意選択的にリンカーによって連結される。

一実施態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＣＤ４共受容体の膜貫通及び細胞質ドメイン（例えば、配列番号１７及び１８参照）を含む。

別の実施態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＣＤ８α共受容体の膜貫通及び細胞質ドメインを含む。

他の実施態様において、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドの細胞質及び／又は膜貫通ドメインは合成したものである。例えば、この膜貫通ドメインは、任意選択的に合成の高度疎水性膜ドメインである。

別の例では、膜貫通ドメインは、グリコホリン膜貫通ドメインである。さらに別の例では、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞抗原カプラをＧＰＩアンカーを用いて膜に付着させるためのＣＤ４８ ＧＰＩシグナル伝達配列を含む。

本明細書に記載したＴ細胞抗原カプラの３成分（標的特異的リガンド、ＴＣＲ複合体に結合するリガンド及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチド）の他に、他のポリペプチドも含めることができるかもしれないと考えられる。例えば、Ｔ細胞抗原カプラは、Ｔ細胞を直接又は間接的に標的にし、あるいは活性化する働きをする追加のポリペプチドを任意選択的に含む。

リンカー
前記Ｔ細胞抗原カプラの種々の成分は互いに直接融合させることができ、又はこれらは、少なくとも１つのリンカー、必要に応じてペプチドリンカー、によって連結させることができる。このペプチドリンカーは、個々の結合成分の機能を妨げない限り、任意の大きさとすることができる。一実施態様において、このペプチドリンカーは、長さが約１乃至１５アミノ酸、より具体的には約１乃至約１０アミノ酸、最も具体的には約１乃至約６アミノ酸である。

Ｔ細胞抗原カプラにおいて有用なリンカーとしては、例えば、Ｇ_４Ｓ_３リンカーが挙げられる。リンカーの他の例は、配列番号１１、１２、１５、１６、１９、２０及び２１に相当するペプチド並びにこれらの変異体及び断片である。

形態
Ｔ細胞−抗原カプラは、当業者であれば容易に理解されることであるが、種々の形態で存在することがでる。

一実施態様において、標的特異的リガンド及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは共にＴＣＲ複合体に結合するリガンドに融合させる。例えば、本明細書に記載した（形態１とも称する、配列番号１及び２の）Ｎ−ダルピンＴＡＣは、順序を追って、
ｉ）Ｎ−ダルピン Ｔｒｉ ＴＡＣリーダー配列（分泌シグナル）（配列番号５及び６）
ｉｉ）Ｈｅｒ２抗原に特異的なダルピン（配列番号７及び８）
ｉｉｉ）Ｍｙｃタグ（配列番号９及び１０）
ｉｖ）リンカー１（配列番号１１及び１２）
ｖ）ＵＣＨＴ１（配列番号１３及び１４）
ｖｉ）リンカー２（配列番号１５及び１６）
ｖｉｉ）ＣＤ４（配列番号１７及び１８）
を含む。

別の実施態様において、ダルピンはＨｅｒ２抗原に特異的なｓｃＦＶ ＳｃＦｖ（配列番号２２及び２３）で置換する。

別の実施態様において、ＴＣＲ複合体に結合するリガンド及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは共に（形態１とも称する、配列番号３及び４の）標的特異的リガンドに融合させる。別の形態については当業者には容易に明らかなはずである。

ベクター構築物
さまざまな送達ベクター及び発現ベクターを用いて本明細書に記載した核酸を細胞内に導入することができる。従って、上記のポリヌクレオチドを任意選択的にベクターに含有させることによって、本明細書ではベクターと称することもあるベクター構築物が得られる。

従って、本開示は、
ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
ｂ．ＣＤ３に結合する抗体をコードする第二のポリヌクレオチド及び
ｃ．Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
及び、任意選択的に、哺乳動物細胞において機能できるプロモータを含むベクターにも関する。

特定の核酸配列の転写を開始させるＤＮＡの領域であるプロモータについては当該分野では周知されている。「哺乳動物細胞において機能できるプロモータ」とは、哺乳動物細胞において関連する核酸配列の発現を駆動するプロモータのことを指している。核酸配列の発現を駆動するプロモータは、その核酸配列に「動作可能なように結合される」ということができる。

一実施態様において、第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドと融合してＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列はプロモータと動作可能に結合している。

別の実施態様において、第二のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは第一のポリヌクレオチドと融合してＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列はプロモータと動作可能に結合している。

任意選択的に、ベクターは、Ｔ細胞などの哺乳動物細胞において発現されるように設計される。一実施態様において、このベクターは、ウイルスベクター、必要に応じてレトロウイルスベクター、である。

有用であるベクターは、レンチウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ： Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ）、ポックスウイルス、オンコレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス由来のベクターを含む。有用である他の送達ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、トランスポゾン、ワクシニアウイルス、ヒトパピローマウイルス、サル免疫不全ウイルス、ＨＴＬＶ、ヒト泡沫状ウイルス及びこれらの変異体由来のベクターを含む。有用であるさらなるベクターは、スプマウイルス、哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス、鳥Ｃ型レトロウイルス、哺乳動物Ｄ型レトロウイルス及びＨＴＬＶ／ＢＬＶ型レトロウイルス由来のベクターを含む。本開示の組成物及び方法において有用なレンチウイルスベクターの１例はｐＣＣＬベクターである。

ポリヌクレオチド及びポリペプチドの変更
ベクター配列を初めとするポリヌクレオチド配列及び本願において開示されたポリペプチド配列に対して多くの修飾を行うことができ、こうしたことは当業者には明らかであろう。修飾としては、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換、挿入もしくは削除又はヌクレオチドもしくはアミノ酸の相対的位置もしくは順序の変更が挙げられる。

一実施態様において、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、修飾又は突然変異させてそのコードされるポリペプチドの機能及び／又はそのＴ細胞抗原カプラの機能、活性及び／又は発現を最適化することができる。

本明細書には、ＴＡＣの表面発現の増強をもたらすＵＣＨＴ１突然変異体を作製することができることが示されている（図１５乃至１７）。そこで、一実施態様では、ＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に結合する修飾又は突然変異リガンドであって、その修飾又は突然変異抗体を含むＴＡＣはＴＣＲ複合体に結合する野生型、即ち非修飾もしくは突然変異型リガンドを含むＴＡＣと比較して表面発現及び／又は活性が増加しているリガンドを含む。ＣＤ３に結合する突然変異又は修飾抗体の１例は本明細書に記載したＵＣＨＴ１ Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体である（配列番号２４及び２５）。

配列同一性
本願のポリヌクレオチドは、本願の核酸分子に対して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％もしくは９９．５％の同一性を有する核酸分子（又はそれらの断片）をも含む。また、「本願のポリペプチド類は、本願の或るポリペプチドに対して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％もしくは９９．５％の同一性を有するポリペプチド類（又はそれらの断片）をも含む。」同一性とは、最高の順序一致が得られるように位置合わせした２つのヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の類似性のことを指している。同一性は当該分野で既知の方法に従って計算する。例えば、あるヌクレオチド配列（「配列Ａ」と呼ぶ）が配列番号１のある部分に対して９０％の同一性を有するとすれば、配列Ａは、配列番号１の基準となるこの部分の１００個のヌクレオチド当たり最大１０ポイントの（他のヌクレオチドでの置換などの）突然変異を含むことができる点を除けば、配列番号１の基準となるその部分と同一であることになる。

好ましくは、配列同一性は、本明細書に示したヌクレオチド配列及び／又はその相補性配列に対して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は最も好ましい少なくとも９９％もしくは９９．５％の同一性に設定する。また、配列同一性は、好ましくは、本明細書に示したポリペプチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は最も好ましい少なくとも９９％もしくは９９．５％の同一性に設定する。配列同一性は、好ましくは、バイオインフォマティクス社（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）（ウィスコンシン大学）製のＧＣＧプログラムを用いて算出する。また、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（好ましくはデフォルトパラメータを用いる；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、ＪＤほか、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）２２：４６７３−４６８０）などの配列同一性を計算するための他のプログラムも利用できる。

ハイブリダイゼーション
本願は、本願に記載した核酸分子に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするのに十分な同一性（ハイブリダイゼーション技術は当該分野では周知のものである）を有する配列を有するＤＮＡを含む。また、本願は、本明細書に記載した配列及び／又はその相補性配列の１つ以上にハイブリダイズする核酸分子を含む。そのような核酸分子は、好ましくは高ストリンジェント条件（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか、分子クローニング：実習マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、最新版（Ｍｏｓｔ Ｒｅｃｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．）下でハイブリダイズさせる。高ストリンジェント洗浄は、好ましくは低塩（好ましくは約０．２％ＳＳＣ）及び温度約５０乃至６５℃であり、任意選択的に約１５分間実施する。

Ｔ細胞における発現
Ｔ細胞抗原カプラは、Ｔ細胞において発現するように設計されている。従って、本開示の一態様は、Ｔ細胞抗原カプラを発現するＴ細胞を提供する。本開示の別の態様は、Ｔ細胞抗原カプラ又はＴ細胞抗原カプラを含むベクターを形質導入又は形質移入したＴ細胞に関する。任意選択的に、このＴ細胞は単離Ｔ細胞である。

Ｔ細胞は、多くの供給源から得ることができ、これらの供給源としては血液（例えば、末梢血単核細胞）、骨髄、胸腺組織、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、脾臓組織及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施態様において、このＴ細胞は自己Ｔ細胞である。別の実施態様において、このＴ細胞はＴ細胞の細胞株から得る。Ｔ細胞を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養し、維持する方法は当該分野で周知されている。

得られたＴ細胞は、すぐに任意選択的に生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で濃縮する。当該分野で周知されているように、細胞集団は陽性又は陰性選択によって濃縮することができる。さらに、このＴ細胞は、任意選択的に氷結又は凍結した後、後日解凍する。

Ｔ細胞抗原カプラをＴ細胞に導入する前後に、このＴ細胞を任意選択的に当該分野で周知されている方法を用いて活性化及び／又は増殖させる。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞表面上の共刺激因子分子を刺激するリガンドをそれに結合させた表面と接触させることで増殖させることができる。

核酸配列をＴ細胞に形質導入又は形質移入し、このＴ細胞に形質導入核酸を発現させる方法は、当該分野では周知されている。例えば、核酸は物理的、化学的又は生物学的手段によって細胞に導入することができる。物理的手段としては、（微量注入、電気穿孔、粒子衝突、リポフェクション及びリン酸カルシウム沈殿）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。生物学的手段としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。

一実施態様において、レトロウイルスベクターを初めとするウイルスベクターは核酸をＴ細胞に導入し、発現させるのに用いる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス由来のベクターが挙げられる。このベクターは、任意選択的に、Ｔ細胞における形質導入核酸分子の発現を駆動するプロモータを含む。

Ｔ細胞における形質導入核酸配列及び／又はこの核酸によってコードされたポリペプチドの存在及び／又は発現を確認するために種々のアッセイを用いることができる。アッセイとしては、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法並びにウエスタンブロット法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一実施態様において、Ｔ細胞抗原カプラを発現するＴ細胞は、Ｔ細胞抗原カプラを発現しないＴ細胞に比し、及び／又は、在来型ＣＡＲを発現するＴ細胞に比し、抗原の存在下でのＴ細胞活性化が増強される。Ｔ細胞活性化の増強は、多数の方法によって確認することができ、こうした方法としては腫瘍細胞株殺傷の増加、サイトカイン産生の増加、細胞崩壊の増加、脱顆粒の増加及び／又はＣＤ１０７α、ＩＦＮγ、ＩＬ２もしくはＴＮＦαなどの活性化マーカの発現増加が挙げられるが、これらに限定されるものではない。増加は個々の細胞において、又は細胞集団において測定することができる。

本明細書に用いている「増加した」又は「増加する」という用語は、Ｔ細胞抗原カプラを発現しないＴ細胞もしくはＴ細胞集団との比較、及び／又は在来型ＣＡＲを発現するＴ細胞もしくはＴ細胞集団との比較で、Ｔ細胞抗原カプラを発現するＴ細胞もしくはＴ細胞集団では少なくとも２％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％もしくは２００％の増加であることを指している。

Ｔ細胞抗原カプラを発現するＴ細胞、必要に応じて自己Ｔ細胞、はこれを必要とする対象に投与することができる。従って、Ｔ細胞抗原カプラを形質導入した、及び／又はこれを発現するＴ細胞は、医薬組成物として製剤化することができる。好ましくは、こうしたＴ細胞は、静脈内投与用に製剤化される。

医薬組成物は、有効量のこうしたＴ細胞を医薬用として許容可能な担体と混合物として組み合わせるような、対象に投与できる医薬用として許容可能な組成物を調製するそれ自体既知の方法によって調製することができる。好適な担体については、例えば、レミングトンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（レミングトンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第２０版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルベニア州、米国、２０００年）に記載されている。これをもとに、こうした組成物としては、好適なｐＨを有し、生理液と等浸透圧の緩衝溶液に１種以上の医薬用として許容可能な担体もしくは希釈剤と共にこれらの物質を含む溶液が挙げられるが、これに限定されるものではない。

好適な医薬用として許容可能な担体としては、医薬組成物の生物活性の有効性を損なわない本来化学的に不活性で非毒性の組成物が挙げられる。好適な医薬用担体としては、例えば、水、食塩溶液、グリセロール溶液、エタノール、塩酸Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びリポソームが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような組成物は、患者へ直接投与するための形態を提供するように、治療的に有効量の化合物を好適な量の担体と共に含有するものとする。

また、医薬組成物としては、限定はされないが、凍結粉末又は水性もしくは非水性滅菌注射用溶液もしくは懸濁液が挙げられ、これらはさらに、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及びこうした組成物を対象のレシピエントの組織又は血液に対して実質的に適合性にする溶質を含有することができる。このような組成物に存在させることができる他の成分としては、例えば、水、（Ｔｗｅｅｎなどの）界面活性剤、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が挙げられる。用時調製注射用溶液及び懸濁液は、滅菌粉末剤、顆粒剤、錠剤又は濃縮溶液もしくは懸濁液から調製することができる。

（ｉｉｉ）方法及び使用
本開示の一態様は、Ｔ細胞を特定の抗原へ誘導するための三官能性Ｔ細胞抗原カプラの使用を提供する。

従って、また、本開示は、修飾Ｔ細胞の、これを必要とする対象において癌を処置するための使用であって、修飾Ｔ細胞は標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、ＴＣＲ複合体に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドを発現する、使用に関する。また、本開示は癌を処置するための方法であって、有効量の修飾Ｔ細胞をこれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。また、有効量の修飾Ｔ細胞の、これを必要とする対象において癌を処置するための使用も開示する。さらに、修飾Ｔ細胞の、これを必要とする対象において癌を処置する薬剤の調製における使用を開示する。さらに、修飾Ｔ細胞であって、これを必要とする対象において癌を処置するのに用いるための修飾Ｔ細胞を開示する。一実施態様において、標的特異的リガンドは、癌性細胞上の抗原に結合し、それによってこの癌性細胞を標的にして修飾Ｔ細胞が送達される。

処置することができる癌としては、任意の種類の腫瘍性疾患が挙げられる。処置することができる癌の例としては、乳癌、肺癌及び白血病、例えば、混合系統白血病（ＭＬＬ：ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ：ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の癌としては、上皮性悪性腫瘍、芽細胞腫、悪性黒色腫、非上皮性悪性腫瘍、血液癌、リンパ性悪性疾患、良性及び悪性腫瘍、並びに悪性疾患が挙げられる。この癌は、非固形腫瘍及び固形腫瘍を含む。処置することができる癌としては、血管が発達していないか、まだ実質的に血管が発達していない腫瘍、及び血管が発達した腫瘍が挙げられる。

本明細書に記載した修飾Ｔ細胞及び／又は医薬組成物は、ヒト及び動物を含む生命体に投与又は使用することができる。本明細書で用いている「対象」という用語は、動物界の任意の一員、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトのことを指している。

Ｔ細胞を単離し、遺伝子を組換え、これを必要としている対象に投与する手順は当該分野では既知である。具体的には、Ｔ細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離し、必要に応じて本明細書に記載したようにして増殖及び／又は活性化させ、本開示の核酸分子を用いて形質導入又は形質移入する。このＴ細胞は、対象に対して自己由来とすることができる。別の実施態様において、この細胞は、対象に対して同種異系、同系又は異種とすることができる。

上記修飾Ｔ細胞は、本明細書に記載したように、単独で、又は医薬組成物として投与することができる。本開示の組成物は、好ましくは静脈内投与用に製剤化する。

「有効量」の修飾Ｔ細胞及び／又は医薬組成物の投与とは、所望の結果を達成するのに必要な用量及び期間で有効な量と定義される。例えば、ある物質の有効量は、個体の病状、年齢、性及び体重並びに個体において所望の反応を惹起する組換えタンパク質の能力に応じて変化させることができる。用法−用量は、最適の治療反応が得られるように調整することができる。例えば、用量は１日数回に分割して投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示される場合、用量は比例的に低下させることができる。

例えば、本明細書に記載した修飾Ｔ細胞及び／又は医薬組成物は、ｋｇ体重当たり１０^４乃至１０^９個の細胞、必要に応じてｋｇ体重当たり１０^５乃至１０^８個の細胞又はｋｇ体重当たり１０^６乃至１０^７個の細胞の用量で投与することができる。この用量は、単回又は複数回投与することができる。

修飾Ｔ細胞及び／又は医薬組成物は、当該分野で既知の任意の方法によって投与することができ、このような方法としてはエアロゾル吸入、注射、摂取、注入、埋設又は移植が挙げられるが、これらに限定されるものではない。この修飾Ｔ細胞及び／又は医薬組成物は、対象に対し皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄腔内もしくは筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）注射により、又は腹腔内に投与することができる。こうした修飾Ｔ細胞及び／又は医薬組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射することができる。

本明細書で用いていて、当該分野でよく理解されている「処置する」又は「処置」とは、臨床結果を初めとする有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能であれ検出不能であれ、１つ以上の症状又は状態の緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）又は改善、疾患の程度の減少、病状の安定化（即ち、悪化ではない）、疾患の蔓延予防、疾患進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）及び（部分的であれ全般的であれ）寛解が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長させることを意味することもできる。一実施態様において、「処置」は、疾患又は状態を予防することを含む。

以上の開示は、本願を大まかに記載したものである。以下の特定の実施例を参照することにより、より一層の理解が得られよう。これらの実施例はもっぱら説明のために記載したものであり、本願の範囲を限定するものではない。状況により方策が示唆または提供されることがあるので、形態の変更と等価物の代用が想定されている。本明細書で特定の用語を使用したが、そのような用語は、説明的な意味であり、限定するためのものではない。

以下の限定されない実施例は、本願を例示するものである。

実施例１
背景及び概要
三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）は、ＭＨＣに拘束されない標的指向性を維持しながらＴＣＲを介して自然に起こるシグナル伝達をよりよく反復させるために開発した。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞上のＴＣＲ及び共受容体（ＣＤ４又はＣＤ８）がＭＨＣに結合し、同時にＭＨＣ分子内の保存領域に結合した後に起こる（イン（Ｙｉｎ）ほか、２０１２年）（クーンズ（Ｋｕｈｎｓ）及びデービス（Ｄａｖｉｓ）、２０１２年）。共受容体は、ＴＣＲシグナル複合体の形成に特に重要な膜ミクロドメイン（ヒー（Ｈｅ）及びマルゲット（Ｍａｒｇｕｅｔ）、２００８年）である「脂質ラフト」（フラゴソ（Ｆｒａｇｏｓｏ）ほか、２００３年）（アーキャロ（Ａｒｃａｒｏ）ほか、２０００年）内に特異的に局在化されている。ＴＣＲ活性化複合体の正確なミクロドメイン局在化を確実にすることに加えて、こうした共受容体は、Ｔ細胞活性化に重要なタンパク質キナーゼであるＬｃｋ（キム（Ｋｉｍ）ほか、２００３年）にも直接結合する（メチ（Ｍｅｔｈｉ）ほか、２００５年）（アクト（Ａｃｕｔｏ）及びキャントレル（Ｃａｎｔｒｅｌｌ）、２０００年）。これまでに述べたように、既存のキメラ受容体又は二官能性タンパク質のどれも共受容体分子又はＬｃｋに係合しない。脂質ラフトに局在化し、Ｌｃｋに結合するＣＤ４共受容体の膜貫通及び細胞内領域を、ＣＤ３に結合する単鎖抗体（ＵＣＨＴ１；配列番号１３及び１４；パブリックドメインにもある配列）に融合させた分子を作製した。この構築物は、自然に起こるＭＨＣ結合と同様に、脂質ラフトの領域にＣＤ３分子及びＴＣＲを引き込み、ＴＣＲの近傍にＬｃｋを持ち込むように設計されている。このキメラ受容体を標的にするために、設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）をＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結させて三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を作製した。この具体的な事例では、ダルピンは癌原遺伝子ｅｒｂＢ−２に特異的であった。

ヒトＴ細胞を操作して同じダルピンを有するプロトタイプＴｒｉ−ＴＡＣ又は従来型ＣＡＲを発現させた。その結果、あらゆる面で、Ｔｒｉ−ＴＡＣで操作したＴ細胞は従来型ＣＡＲと同等の機能性を示すことが明らかとなった。興味深いことに、２つのパラメータ（ＴＮＦ−α産生及びＣＤ１０７ａ動員）に関しては、Ｔｒｉ−ＴＡＣは従来型ＣＡＲよりも活性であることが認められた。さらに、データから、１分子当たりのＴｒｉ−ＴＡＣは有意な活性の増強を示すことが分かる。さらに、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、活性化ドメインがこのタンパク質の一部ではないので、在来型ＣＡＲと比較して安全性の向上を示す。

在来型ＣＡＲは、いくつかのシグナル伝達ドメインを合わせ持つことでＴ細胞を刺激するのに有効である（図１Ｃ）。ちなみに、Ｔｒｉ−ＴＡＣ（図１Ａ／Ｂ）は、それ自体のシグナル伝達ドメインを一切含有していない。それは、（灰色で示されている）他のキープレーヤー間の提案されている相互作用を抗原依存性に促進することにかかっている。この設計仮説を検証するために、完全長のＮ−ダルピンＴｒｉ−ＴＡＣのいくつかの変異体を作製した（図１Ｄ）。

これまでの研究によりＣＡＲ分子の一貫した有意な細胞表面発現は立証されている。ダルピンＣＡＲは強い表面発現を示すことが分かった（図２）。これに対して、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、はるかに低い表面発現を示した。このことは、ＵＣＨＴ１ドメインを有する全ての変異体で認められた。しかしながら、ＵＣＨＴ１ドメインを欠くＴｒｉ−ＴＡＣ変異体はダルピンＣＡＲと同様な表面発現を示した。

Ｔｒｉ−ＴＡＣ、Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体又はダルピンＣＡＲを発現するように操作したＴ細胞をプレートに結合させた抗原で刺激した。その結果、Ｔｒｉ−ＴＡＣ及びダルピンＣＡＲを発現するように操作したＴ細胞は、測定された全ての機能（ＴＮＦ−α産生、ＩＦＮ−γ産生及びＣＤ１０７ａ動員）を発現することができた（図３Ａ及び３Ｂ）。Ｔｒｉ−ＴＡＣがＣＤ３及び標的抗原のいずれにも結合することは、Ｔ細胞がその機能を発現するのに重要であることが分かった。図３には、ＣＤ３への結合を無効にするＵＣＨＴ１の除去によりＴｒｉ−ＴＡＣの機能が無効になることが示された。他のデータでは、Ｔｒｉ−ＴＡＣからダルピンを除去しても機能が無効になることが明らかとなった。

予想されたことだが、こうしたＴ細胞の細胞毒性を調べた時、Ｔｒｉ−ＴＡＣ−ＵＣＨＴ１−ダルピンは抗原発現細胞を殺傷する能力を示さなかった（図４）。Ｎ−ダルピンＴｒｉ−ＴＡＣは、古典的なダルピンＣＡＲと極めて類似した高レベルの選択的細胞毒性を示した。興味深いことに、ダルピンＣＡＲを発現するＴ細胞は高いＴ細胞：標的細胞比で標的外の殺傷を示すように思われる（図４のＤ２Ｆ２に対する殺傷を参照されたい）のに対して、Ｔｒｉ−ＴＡＣを発現するＴ細胞はこうした効果を示さなかった。

実験例
図１は図式的概観である。（Ａ）はＮ−ダルピンＴｒｉ−ＴＡＣを図示する。Ｈｅｒ２を標的とするアンキリン・リピート・ドメインを（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーを用いて単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）ＵＣＨＴ１に融合させる。次に、ｓｃＦｖをＣＤ４分子に連結させる。ＣＤ４はリンカー領域及び膜貫通領域並びに細胞質アンカー領域を含有する。可能な相互作用がぼやけた灰色で示されている。（Ｂ）はＣ−ダルピンＴｒｉ−ＴＡＣを図示する。この構築物では、ｓｃＦｖ ＵＣＨＴ１はダルピンドメインと取り替えられている。この場合も、可能な相互作用はぼやけた灰色で示されている。（Ｃ）は古典的な第二世代ＣＡＲのモデルである。ダルピン標的ドメインを、ＣＤ８αリンカーを介してＣＤ２８膜貫通ドメインに連結させる。次いで、３つの活性化ＩＴＡＭモチーフを有するＣＤ３ゼータドメインをＣＤ２８の細胞質部分に結合させる。（Ｄ）はダルピン標的ドメイン、ＣＤ３結合ｓｃＦｖ部分又はＣＤ４ドメインの細胞質部分を欠く種々のＴｒｉ−ＴＡＣ対照の概観である。

図２は、それぞれのＴｒｉ−ＴＡＣ変異体のヒストグラムによる形質導入Ｔ細胞の表現型表面発現解析の結果を示す。Ｔ細胞は、後にフローサイトメトリーにより検出したＨｅｒ２Ｆｃと共にインキュベートした。提示データはＣＤ８＋リンパ球に関してゲート（ｇａｔｅ）した。図示したゲートは未形質導入対照を基準として選んだ。

図３は、操作Ｔ細胞の機能解析の結果である。（Ａ）では、細胞は、ゴルジプラグ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）（商標）を含有する培地中プレート結合Ｈｅｒ２Ｆｃで４時間刺激した。先ず、細胞をＣＤ８＋について染色した後、透過処理し、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ産生について解析した。初期ゲートは、シングレットＣＤ８＋リンパ球について設定した。図示したゲートは未形質導入対照を基準として設定した。Ｂ）では、前の場合と同様に、細胞はプレート結合Ｈｅｒ２Ｆｃで刺激した。培地にはゴルジプラグ（商標）及び抗ＣＤ１０７ａ抗体を含めた。活発に脱顆粒している細胞は、より高いＣＤ１０７ａリサイクル率を有し、その後、抗ＣＤ１０７ａのより高いシグナルを示すと予想された。

図４は操作Ｔ細胞の細胞毒性を示す。２種の異なる付着性マウス腫瘍株をＴ細胞添加の２４時間前に平板培養した。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２はヒトＨｅｒ２を発現するように操作されているが、Ｄ２Ｆ２はされていない。示した割合のＴ細胞を腫瘍を含むウェルに添加した。腫瘍細胞はＴ細胞と共に６時間インキュベートした。その後、洗浄によってＴ細胞を除去した。各ウェルに１０％アラマーブルー含有培地を３時間にわたって添加した。細胞生存の指標として代謝活性をエンドポイント分析により求めた。Ｔ細胞を含まないウェルを最大生存性／代謝活性と定義して１００％とし、これに対して細胞を加えずにインキュベートした培地を０％代謝活性として設定した。提示したデータは３回の反復実験の平均である。

考察
Ｔ細胞をＭＨＣ非依存性に特定標的に再誘導するためのキメラ受容体の使用は癌を処置するための魅力的な方法であり、病原菌由来の抗原が細胞質膜に見出される感染性疾患にも適用可能であろう。キメラ受容体は、（１）標的細胞に対する特異的な細胞毒性及び（２）最小限の標的外の毒性をもたらすことになる。従来のＣＡＲは、この点で不十分である。何故なら、こうしたＣＡＲは、シグナル伝達ドメインが適切な調節を受けない恐れがあり、従って特定活性の細胞制御が低下する不自然な位置にある合成構造に依存しているからである。

Ｔｒｉ−ＴＡＣは、シグナル伝達ドメインの異所性局在化を用いないで自然のＴＣＲのシグナル伝達成分を再誘導するように設計した。Ｔｒｉ−ＴＡＣの設計は以下の原則によって行った：（１）キメラ受容体は相互作用して主要な活性化タンパク質複合体の秩序ある構築を促進しなければならない；（２）キメラ受容体はミクロドメイン環境などの既存の細胞順応を活用しなければならない；及び（３）キメラ受容体は活性化ドメインを一切有してはならない。Ｔｒｉ−ＴＡＣは、効率的に、そしてデータが示すように、第二世代ＣＡＲより良くはないが等しい活性化速度でこれを達成することができる。

従って、このＴｒｉ−ＴＡＣは、さらにＴ細胞活性化を微調整するための追加的な設計共受容体とのさらなる一体化に理想的に適している。最終的には、これは、目標となる細胞毒性に関して損なうことなく標的外の効果の相当な低下をもたらすはずである。Ｔｒｉ−ＴＡＣは、既存のＣＡＲよりも毒性が低いようである。ダルピンＣＡＲは、高い細胞対標的比で軽度の標的外の殺傷を示し、治療に用いると問題となる恐れがある。しかしながら、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、在来型ＣＡＲと同程度に機能的であるが、標的外の効果を示さなかった。ダルピンは高親和性で標的に結合するので、ダルピンを用いる高レベルのキメラ受容体を発現する細胞に対する標的外の効果は起こりやすい。従って、理論にとらわれるまでもなく、Ｔｒｉ−ＴＡＣの表面発現が低いことは、そのような標的外の効果を生じる可能性を低下させるので有利であろう。

結局のところ、Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術がモジュール方式を採用していることにより、Ｔ細胞活性化過程のはるかに精巧な微調整が可能となる。例えば、ＴＣＲ複合体の動員は、より低いＣＤ３親和性を有するＴｒｉ−ＴＡＣ分子を操作することによって調節することができた。これを用いることにより、癌標的を検出するための高親和性標的ドメインを維持しながら自然の低いＴＣＲ親和性（チェルビン（Ｃｈｅｒｖｉｎ）ほか、２００９年）を模倣することができた。古典的なＣＡＲと異なり、Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術はこれによりよく類似するように操作することができる。

結論として、提示したＴｒｉ−ＴＡＣ技術は、（１）Ｔ細胞の活性化及び細胞毒性を効率的にもたらすことができ、（２）自然に起こるＴ細胞活性化を模倣することによってこれを為すことができ、（３）それ自体の活性化ドメインを必要としない、極めて効率的な分子ツールである。

実施例２：Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術の特性化
図５にＴｒｉ−ＴＡＣ技術の概観を示した。

図５Ａは、種々の受容体とそれらの関連相手タンパク質の共集合に基づいたＣＤ８ Ｔ細胞活性化の例を示す。最初に、主組織適合複合体Ｉが抗原（らせん状物）を提示している。これはその抗原に結合できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体によって認識される。このＴＣＲ複合体はいくつかの個々のサブユニットを含有する。そのα／βドメインはＭＨＣ−Ｉ上に提示された抗原と直接相互作用することができる。次いで、α／βドメインは、他のいくつかのドメイン（ε、γ、δ及びζ）と相互作用し、これらのドメインの全てが種々の細胞内活性化ドメインを介するＴ細胞活性化に関与する。ＴＣＲ複合体は、ＣＤ８共受容体と同時にＭＨＣ−Ｉと相互作用する。このＣＤ８共受容体は抗原依存性にＭＨＣ−Ｉに結合する。ＣＤ８は、ＴＣＲ受容体複合体を活性化するための重要なタンパク質キナーゼであるＬｃｋと直接相互作用する。また、ＣＤ８とＬｃｋとの相互作用は、それらの脂質ラフト（膜部分）ミクロドメインとの会合を確実なものにし、こうしたドメインは他の関連シグナル伝達部分（暗色球形）を組織化し、封じ込めると想定されている。その後、後期の活性化がＣＤ２８の動員をもたらす。この相互作用カスケードが並行して数回起こるならば、Ｔ細胞は活性化され、それらの細胞毒性を発揮することができる。

図５Ｂは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概観を示す。ＣＡＲは、ζ及びＣＤ２８などのいくつかの重要な活性化ドメインを単一の合成操作分子として結合させることによりＴ細胞活性化の複雑な機序を再現しようとするものである。次いで、ＣＡＲは特定の結合ドメインを用いて最適の抗原と直接相互作用する。ここに示したのはアンキリン・リピートタンパク質（ダルピン）である。並行して起こるいくつかのそのような相互作用がＴ細胞活性化をもたらすと考えられる。

図５Ｃは、ＴＣＲ複合体を最適の抗原に直接架橋させることによってＴ細胞に係合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）様分子を示す。ここに示したＢｉＴＥ様分子は、２つの結合ドメインを含有する。ダルピン部分は標的抗原と相互作用する。単鎖可変断片ドメイン（ｓｃＦｖ）はそのイプシロンドメインを介してＴＣＲ複合体に結合する。並行して起こるいくつかのそのような架橋がＴ細胞活性化をもたらす。

図５Ｄは、自然に起こる活性化過程を模倣するＴＡＣ技術の概観である。Ｔ細胞抗原カプラ（ＴＡＣ）はダルピン結合ドメインを介してその抗原に結合することができる。次いで、ダルピンはＴＣＲ複合体のイプシロンドメインに結合することができるｓｃＦｖに連結する。次に、ＴＡＣは、ＣＤ４膜貫通及び細胞質ドメインと会合する。ＣＤ８と同様、ＣＤ４はＬｃｋと相互作用し、脂質ラフト内に位置する。このように、ＴＡＣはＴＣＲ動員を共受容体刺激と組み合わせる。理論にとらわれるまでもなく、並行して起こるいくつかのそのような相互作用がＴ細胞活性化をもたらすと考えられる。

ＴＡＣ分子は種々の形態が考えられる。図６Ａは、形態１のＴＡＣ分子のモデルを示す。ＣＤ４−尾部、膜貫通及びリンカードメインは、ＴＣＲ−イプシロン特異的ｓｃＦｖ（ＵＣＨＴ１）と結合する。次いで、ｓｃＦｖは抗原結合ドメインに連結される。このドメインは交換可能である。この提案では、使用される抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２抗原に特異的なｓｃＦｖ又はダルピンドメインである。図６Ｂは、形態２のＴＡＣ分子を示す。この場合、ＣＤ４ドメインは先ず抗原結合ドメインと相互作用する。次いで、このドメインはＴＣＲ動員ｓｃＦｖ（ＵＣＨＴ１）ドメインに連結される。

図７はｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣの機能性を示す。図７Ａは、空のベクターとの比較でｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ受容体の表面発現を示すヒストグラムである。細胞はＦｃＨｅｒ２抗原を用いて染色し、この抗原は蛍光標識抗体を用いて検出した。図７Ｂは、ｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ（上段）又はｓｃＦｖ ＣＡＲ（下段）を発現するＴ細胞の抗原特異的活性化を示す。ｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ（上段）又はｓｃＦｖ ＣＡＲ（下段）を発現するＴ細胞は、プレート結合Ｈｅｒ２抗原と共にインキュベートした。両修飾細胞は、抗原特異的活性化を示した。ＤＭＳＯ陰性対照は活性を示さなかった（データは示されていない）。図７Ｃは、ｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ及びｓｃＦｖ ＣＡＲによるＭＣＦ−７ヒト腫瘍細胞株（Ｈｅｒ２陽性）の同等な殺傷を示す。ｓｃＦｖ ＣＤ４ ＴＡＣ及びｓｃＦｖ ＣＡＲは、いずれもＭＣＦ−７ヒト腫瘍細胞株（Ｈｅｒ２陽性）と共にインキュベートし、空のベクター対照と比較した。

図８は、ＣＤ４−ＴＡＣ形態２の特性化である。図８Ａはベクター対照との比較におけるダルピンＣＤ４−ＴＡＣ形態２のヒストグラムである。表面発現はＦｃＨｅｒ２修飾抗原を用いて調べた。ＣＤ４−ＴＡＣ形態２を発現する細胞は受容体の高い表面発現を示すＦｃＨｅｒ２結合の明確な増加を示している。判りやすくするために、ＣＤ４ ＴＡＣ形態２のモデルを示した。図８Ｂは、プレート結合Ｈｅｒ２抗原に暴露したダルピンＴＡＣ形態２で操作したＴ細胞を示す。サイトカイン産生及び脱顆粒を測定した。データは、ダルピンＴＡＣ形態２が機能的受容体であることを示している。抗原を用いない処置ではＴ細胞の活性化は認められなかった（データは示されていない）。図８Ｃは、空のベクター対照との比較におけるＣＤ４−ＴＡＣ形態２の増殖を示す。細胞は１００ｕ／ｍｌ ＩＬ２ １０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ７中で増殖させた。１００，０００個の細胞から始めて、増殖を所定の間隔で培養試料をカウントすることによりモニターした。形態２は、対照との比較において増殖速度が著しく低い。

図９は、ダルピンＣＤ４ ＴＡＣ形態１の機能性を示す。図９Ａは、ダルピンＣＡＲ（緑色）及びＮＧＦＲのみの対照（青色）との比較におけるダルピンＣＤ４ ＴＡＣ（赤色）の表面発現を示す。細胞は受容体特異的抗原ＦｃＨｅｒ２を用いて調べた。ヒストグラムは、ダルピンＣＤ４ ＴＡＣが表面に十分発現されることを示している。しかしながら、その最大表面発現は、ＣＡＲ構築物との比較において低い。図９Ｂは、ＣＤ４−ＴＡＣ形態１の増殖を示す。２週間の培養において、細胞をサンプリングし、手動でカウントすることにより増殖をモニターした。空のベクターは、ダルピンＣＡＲと同様の増殖を示している。しかしながら、ＴＡＣの場合、比較すると増殖が低下している。図９Ｃ及び図９Ｄは、種々の活性化及び脱顆粒マーカについて陽性の細胞の割合を示す。空のベクター、ダルピンＣＤ４及びダルピンＣＡＲをプレート結合抗原Ｈｅｒ２又はＤＭＳＯ対照と共にインキュベートした。３回の別々の実験の結果を統計解析ソフトウェアＳＰＩＣＥを用いてまとめた。散布図は、１組の活性化マーカについて陽性の細胞の割合を示す。ＣＤ４−ＴＡＣは、脱顆粒マーカ陽性細胞の割合が比較的高い。ダルピンＣＡＲ細胞は様々な活性化マーカについて陽性であるが、有意に豊富な脱顆粒マーカの集団はない。円グラフは同じデータを示す。これは、ＣＤ４−ＴＡＣが脱顆粒に焦点を当てた著しく多い細胞集団を有することを示す。ＣＤ４−ＴＡＣは、種々のレベルのサイトカイン産生と共に脱顆粒する大多数の活性化細胞を有する。しかしながら、ＣＡＲは、集団全体の５０％未満を構成する脱顆粒による活性化のよりランダムな分布パターンを示す。このパターンは、ＣＡＲによる制御性の低いＴ細胞活性化を示すものであろう。

図１０は、ＴＡＣ及びＣＡＲの細胞毒性及び全般的活性を示す。ＴＡＣ、ＣＡＲ又は空のベクター対照を用いて操作した細胞を種々のヒト腫瘍細胞株と共にインキュベートした。ＭＤＡ ＭＢ ２３１、ＳＫ ＯＶ ３及びＡ５４９は全てＨｅｒ２抗原を発現する。ＬＯＸＩＭＶＩはＨｅｒ２陰性である。全ての場合において、ＴＡＣは細胞毒性の増強を示すことが認められた。抗原陰性細胞株ＬＯＣＩＭＶＩは、標的とされておらず、細胞毒性は抗原特異的であることを裏付けている。

図１１は、種々のＴＡＣ対照の受容体表面発現及び活性化を示す。図１１Ａには細胞表面発現（左）、脱顆粒（中央）及びサイトカイン産生（右）を示した。特定のドメインを欠く構築物を作製してこうしたドメインの意義を明らかにした。以下のドメイン、即ちダルピン抗原結合ドメイン及びＵＣＨＴ１ ＴＣＲ結合ドメインを完全に除去したが、下段には完全長のＴＡＣを示した。ＵＣＨＴ１ドメインを含有しないＴＡＣの表面発現は、完全長ＣＤ４ ＴＡＣとの比較において表面発現の増強をもたらした。ダルピン陰性突然変異体は、ＦｃＨｅｒ２抗原を用いて検出できなかった。脱顆粒（中央）は完全長のＴＡＣでのみ認められた。ＵＣＨＴ１及びダルピンの両方の削除は脱顆粒をもたらさなかった。同様に、サイトカイン産生は完全長のＴＡＣにおいてのみ認められた。図１１Ｂは、マウス細胞株Ｄ２Ｆ２がヒトＨｅｒ２抗原（Ｄ２Ｆ２／Ｅ２）を発現するように操作されたことを示す。いずれの細胞株も完全長ＣＤ４−ＴＡＣ又はその欠損変異体を用いて操作したＴ細胞と共にインキュベートした。データは、エフェクター対ターゲット比４：１エンドポイントを示している。完全長のＣＤ４−ＴＡＣのみが細胞毒性反応を惹起することができた。このことは、ダルピン及びＵＣＨＴ１ドメインが受容体機能に関与していることを証明するものである。

図１２は、種々の膜貫通ＴＡＣ変異体の性質を示す。図１２Ａは、そうした種々の膜貫通構築物の概観である。最初の組の変異体は細胞質ドメインを欠いている。ＣＤ４ ＴＡＣ−ｃｙｔｏｓｏｌは細胞質ドメイン全体が除去されている。この合成構築物は、ＣＤ４ ＴＭが設計された高度に疎水性の膜ドメインによって置換されている。グリコホリン変異体はＣＤ４膜貫通ドメインをグリコホリン膜貫通ドメインで置換している。ＧＰＩアンカー変異体は、ＧＰＩアンカーを用いて膜にＴＡＣを付着させるように配列したＣＤ４８ ＧＰＩシグナルを用いる。ＣＤ８Ａ ＴＡＣ変異体は膜貫通及び細胞質ＣＤ４ドメインをＣＤ８α対応物で置換した。図１２Ｂは、ＣＤ８精製Ｔ細胞が種々の構築物で操作されたことを示している。完全長ＴＡＣとの比較における種々の受容体の表面発現が示されている。全てのデータは、対照の蛍光強度の中央値と比較したものである。全ての変異体は、完全長ＣＤ４−ＴＡＣとの比較において有意に低い受容体表面発現を示す。ＧＰＩアンカーＴＡＣ変異体は、バックグラウンドを超えて検出可能ではない。図１２Ｃは、脱顆粒及びサイトカイン産生について種々の変異体を調べた結果を示す。細胞は、プレートパウンドＨｅｒ２抗原と共にインキュベートした。活性は、脱顆粒マーカＣＤ１０７ａ陽性細胞のパーセント（左棒グラフ）又はまとめて取られた全てのサイトカイン（ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ及びＴＮＦａ／ＩＦＮｇ、右棒グラフ）産生細胞のパーセントとして提示した。ＧＰＩ固定又はＣＤ８ａ変異体はバックグラウンドレベルの脱顆粒及びサイトカイン産生を示している。グリコホリン、合成及び−細胞質ゾルのＴＡＣ変異体は、適度なレベルの脱顆粒及び低レベルのサイトカイン産生を示している。全ての場合において、活性は完全長ＣＤ４−ＴＡＣより十分低い。総合すると、このことから、その細胞質ドメインを含まないＴＡＣを固定すると、活性の低い機能的受容体をもたらすことが分かる。

図１３は、ＬｃｋのＴＡＣ変異体との相互作用を示す。図１３Ａでは、Ｈｅｒ２抗原は磁気ビーズに共有結合で付着させた。２９３ＴＭ細胞は、ＴＡＣ及びＴＡＣ細胞質欠損変異体の両者並びにＬｃｋを発現するように操作した。ビーズは細胞溶解物と共に一夜インキュベートし、次いで洗浄し、ウエスタンブロットに供した。ＬｃｋはＬｃｋ抗体を用いて検出し、ＴＡＣはＭｙｃ抗体によって検出した。対照としてＢ−アクチンを使用した。Ｂ−アクチンは、沈降されず、単に上清（Ｓ）において検出した。しかしながら、完全長ＴＡＣ及び細胞質削除の場合、効率的に沈降され、ペレット画分（Ｂ）において検出された。ベクター対照及び細胞質ドメインを含有しないＴＡＣは、同等レベルのバックグラウンドＬｃｋシグナルを示している。しかしながら、完全長ＣＤ４−ＴＡＣは、全量に対して有意なレベルのＬｃｋを示している。図１３Ｂは、ペレット中に検出されたＬｃｋのデンシトメトリー分析の結果を示す。シグナルは陰性対照に対して補正した。このデータは、Ｌｃｋが完全長ＣＤ４−ＴＡＣと相互作用することができることを裏付けている。

図１４では、ＣＤ４ ＴＡＣ表面発現及び活性がＢｉＴＥ様変異体の場合と比較されている。図１４Ａは、ＮＧＦＲのみの対照（左）、ＣＤ４−ＴＡＣ（中央）及びＢｉＴＥ様変異体（右）を示す。表面発現は、形質導入マーカＮＧＦＲ及びＨｅｒ２抗原を用いて調べた。ＴＡＣは、ＢｉＴＥと比較してはるかに低い表面発現を示している。中でも注目すべきは、ＢｉＴＥは、形質導入陰性細胞（ＮＧＦＲ−）が強い受容体発現を示すのを可能にするのに十分な結合抗体を分泌するようであることである。ＴＡＣ操作細胞と比較してＢｉＴＥ様細胞ではサイトカイン産生及び脱顆粒が共に高い。図１４Ｂは、種々のＨｅｒ２陽性細胞株（ＭＤＡ ＭＢ ２３１、ＳＫ ＯＶ ３、Ａ５４９）において細胞毒性を比較したものである。サイトカイン産生とは対照的に、ＴＡＣ操作細胞は細胞毒性活性の有意な増強を示している。

図１５は、ＵＣＨＴ１のランダム突然変異原ライブラリに対するＣＤ４ ＴＡＣ ＷＴの比較を示す。ＴＡＣの性質を変化させる能力を調べるために、ＵＣＨＴ１及びＴＣＲイプシロンの結合表面に存在する２４個のアミノ酸を個々に突然変異させた。これによって理論的に４８０種の特有のクローンがもたらされ、それらの全てがこのランダムライブラリ中に示されているはずである。図１５Ａは、突然変異体の模式図である。マーキングは、全てがｓｃＦｖ−イプシロン境界面にある突然変異を示す。図５Ｂは、表面発現のヒストグラムである。操作細胞をＦｃＨｅｒ２抗原を用いて調べることにより表面発現受容体を検出した。ライブラリはこの受容体の表面発現のかなりの増強を示している。図１５Ｃは、プレート結合抗原と共にインキュベートされたＷＴ及びライブラリＣＤ４ ＴＡＣ細胞を示す。これらの活性化及びサイトカイン産生能力が提示されている。このライブラリはＷＴと比較して同様な活性を有する。理論にとらわれるまでもなく、このことは、ｓｃＦｖドメインを変更することによって元の機能的プロフィルを維持しながらＴＡＣの発現特性を改善することができるという概念を裏付けるものである。

図１６は、Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の表面発現増強を示す。ＷＴに対して有利な増殖を示す突然変異体を選ぶために長期間にわたってライブラリを増殖させた。選んだ突然変異体（Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ；番号付けはＵＣＨＴ１ドメイン断片に基づいている）を分析した。図１６Ａは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）がＷＴ ＣＤ４−ＴＡＣ又はＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体で操作されたことを示す。ＣＤ４ ＴＡＣ（左）及びＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体（右）間で最終的なＣＤ４／ＣＤ８集団を比較した。特に、ＷＴ ＣＤ４−ＴＡＣは、ＣＤ４陽性細胞の集団の減少をもたらす。この効果は突然変異体細胞では認められない。図１６Ｂは、ＮＧＦＲ形質導入マーカ及びＦｃＨｅｒ２陽性によって測定される表面発現を示し、Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の表面発現の増強を示している。図１６Ｃは、Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体のサイトカイン産生が低減することを示している（ＤＭＳＯ対照は活性を示さず、データは示されていない）。ＷＴ ＴＡＣ及びＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体間で脱顆粒は同程度である。

図１７は、Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体の細胞毒性及び増殖を示す。図１７Ａでは、ＷＴ ＣＤ４ ＴＡＣ及びＡ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体で操作したＴ細胞をＨｅｒ２抗原陽性細胞株ＳＫ ＯＶ ３、ＭＤＡ ＭＢ ２３１及びＡ５４９と共にインキュベートした。全ての場合において、突然変異体は細胞毒性レベルの低下を示し、Ａ５４９の場合では、細胞毒性は検出されなかった。図１７Ｂでは、１００，０００個の細胞から始める培養において細胞増殖を２週間にわたってモニターした。定期的に、サンプルを採取し、手動で細胞をカウントした。Ａ８５Ｖ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体は、ＷＴ変異体との比較で増殖の著しい向上を示している。総合すると、このことから、ライブラリはいくつかのＴＡＣ機能の修飾及び最適化を可能にする種々の突然変異体を含む可能性が高いことが分かる。従って、ＵＣＨＴ１は機能的調節因子として用いることができる。

本願を現在好ましい実施例であると考えられるものに関して説明してきたが、本願をこれらの開示された実施例に限定するものでないことは言うまでもない。これとは逆に、本願は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる種々の修正及び同等のアレンジメントを保護しようとするものである。

全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許もしくは特許出願がそれぞれ全体として引用により本明細書に組み込まれていることが具体的、かつ個別に示されている場合と同程度に、全文引用により本明細書に組み込まれている。

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ポーテル（Ｐｏｒｔｅｌｌ）、Ｃ．ａ．、ウェンゼル（Ｗｅｎｚｅｌｌ）、Ｃ．Ｍ．、アドバニ（Ａｄｖａｎｉ）、Ａ．Ｓ．（２０１３年）、「Ｂ細胞急性リンパ性白血病の処置におけるブリナツモマブの臨床的及び薬理学的側面（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）」、クリニカル・ファーマコロジー（Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）５：５−１１。
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Claims (51)

1. ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
   ｂ．核酸を含む細胞上のＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド及び
   ｃ．ＣＤ４細胞質ドメイン及びＣＤ４膜貫通ドメインを含むＴ細胞共受容体ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
   を含み、
   細胞内活性化ドメイン又は共刺激ドメインをコードしない、
   核酸。
2. 前記標的特異的リガンドは腫瘍抗原に結合する、請求項１に記載の核酸。
3. 前記標的特異的リガンドは設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）ポリペプチド又はｓｃＦｖである、請求項１又は２に記載の核酸。
4. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質はＣＤ３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
5. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドは単鎖抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
6. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドはＵＣＨＴ１又はその変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸。
7. 前記第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドに融合される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
8. 前記第二のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第一のポリヌクレオチドに融合される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
11. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸を発現するＴ細胞。
12. ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
    ｂ．核酸を含む細胞上のＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド、
    ｃ．ＣＤ４細胞質ドメイン及びＣＤ４膜貫通ドメインを含むＴ細胞共受容体ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド及び
    ｄ．哺乳動物細胞において機能できるプロモータ
    を含み、
    前記第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、及び第三のポリヌクレオチドは細胞内活性化ドメイン又は共刺激ドメインをコードしない、
    ベクター構築物。
13. 前記第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドに融合されてＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、前記Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列は前記プロモータと動作可能に結合される、請求項１２に記載のベクター構築物。
14. 前記第二のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第一のポリヌクレオチドに融合されてＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、前記Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列は前記プロモータと動作可能に結合される、請求項１２に記載のベクター構築物。
15. 前記標的特異的リガンドは腫瘍抗原に結合する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のベクター構築物。
16. 前記標的特異的リガンドは設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）ポリペプチド又はｓｃＦｖである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のベクター構築物。
17. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質はＣＤ３である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のベクター構築物。
18. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドは単鎖抗体である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のベクター構築物。
19. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドはＵＣＨＴ１又はその変異体である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載のベクター構築物。
20. 前記第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドに融合される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のベクター構築物。
21. 請求項１２〜２０のいずれか一項に記載のベクター構築物を形質移入した単離Ｔ細胞。
22. 請求項１１又は２１に記載のＴ細胞及び担体を含む医薬組成物。
23. 癌を処置するための医薬組成物の製造のためのＴ細胞の使用であって、前記Ｔ細胞は
    ａ．標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド、
    ｂ．Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド及び
    ｃ．ＣＤ４細胞質ドメイン及びＣＤ４膜貫通ドメインを含むＴ細胞共受容体ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
    を含む核酸を発現し、
    前記第一のポリヌクレオチド、前記第二のポリヌクレオチド、及び前記第三のポリヌクレオチドは細胞内活性化ドメイン又は共刺激ドメインをコードしない、
    使用。
24. 前記標的特異的リガンドは癌性細胞上の抗原に結合する、請求項２３に記載の使用。
25. 前記標的特異的リガンドは、設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）ポリペプチド又はｓｃＦｖである、請求項２３又は２４に記載の使用。
26. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質はＣＤ３である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の使用。
27. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドは単鎖抗体である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の使用。
28. 前記ＴＣＲ複合体と会合するタンパク質に結合するリガンドはＵＣＨＴ１又はその変異体である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の使用。
29. 前記第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドに融合される、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の使用。
30. 前記第二のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドは前記第一のポリヌクレオチドに融合される、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の使用。
31. 前記リガンドは、前記第二のポリヌクレオチドを発現するＴ細胞上のＣＤ３に結合する、請求項４に記載の核酸。
32. 前記リガンドは、前記第二のポリヌクレオチドを発現するＴ細胞上のＣＤ３に結合する、請求項１９に記載のベクター構築物。
33. 前記リガンドは、前記第二のポリヌクレオチドを発現するＴ細胞上のＣＤ３に結合する、請求項３０に記載の使用。
34. 核酸を含むＴ細胞であって、
    前記核酸は以下（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、
    （ａ）腫瘍抗原に結合する標的特異的リガンドをコードする第一のポリヌクレオチド
    （ｂ）Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体と会合する、ＣＤ３であるタンパク質に結合するリガンドをコードする第二のポリヌクレオチド
    （ｃ）ＣＤ４細胞質ドメイン及びＣＤ４膜貫通ドメインを含むＴ細胞共受容体ドメインポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド
    上記成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに直接融合しているか、又は、少なくとも１つのリンカーによって連結しており、
    前記核酸は細胞内活性化ドメイン又は共刺激ドメインをコードしない、Ｔ細胞。
35. 前記標的特異的リガンドは、設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）ポリペプチド又はｓｃＦｖを含む、請求項３４に記載のＴ細胞。
36. Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体と会合する前記タンパク質に結合するリガンドは単鎖抗体である、請求項３４に記載のＴ細胞。
37. Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体と会合する前記タンパク質に結合するリガンドはＵＣＨＴ１である、請求項３６に記載のＴ細胞。
38. 前記第一のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドは、前記第二のポリヌクレオチドに融合される、請求項３４に記載のＴ細胞。
39. 前記第二のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチドに融合される、請求項３４に記載のＴ細胞。
40. 発現ベクターが請求項１に記載の核酸を含む、請求項３４に記載のＴ細胞。
41. 前記発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能できるプロモータを含む、請求項４０に記載のＴ細胞。
42. 前記第一のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドは、前記第二のポリヌクレオチドに融合されてＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、前記Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列は前記プロモータと動作可能に結合される、請求項４１に記載のＴ細胞。
43. 前記第二のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチドに融合されてＴ細胞抗原カプラ融合体を形成し、前記Ｔ細胞抗原カプラ融合体のコーディング配列は前記プロモータと動作可能に結合される、請求項４１に記載のＴ細胞。
44. 前記標的特異的リガンドは、設計されたアンキリン・リピート（ダルピン）ポリペプチド又はｓｃＦｖを含む、請求項４１に記載のＴ細胞。
45. 前記ＴＣＲ複合体と会合する前記タンパク質に結合するリガンドは単鎖抗体である、請求項４１に記載のＴ細胞。
46. 前記ＴＣＲ複合体と会合する前記タンパク質に結合するリガンドはＵＣＨＴ１である、請求項４１に記載のＴ細胞。
47. 請求項４１に記載のＴ細胞及び担体を含む、医薬組成物。
48. 前記第一のポリヌクレオチドは、配列番号７又は２２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載のＴ細胞。
49. 前記第二のポリヌクレオチドは、配列番号１３又は２４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載のＴ細胞。
50. 前記第三のポリヌクレオチドは、配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載のＴ細胞。
51. 前記標的特異的リガンドはＨＥＲ２に結合する、請求項３４に記載のＴ細胞。