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Fragmentos de union a antigenos que detectan especificamente celulas cancerosas, nucleotidos que codifican los fragmentos y el uso de los mismos para la profilaxis y deteccion de canceres.
ES2312177T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Michael D. Dan Pradip K. Maiti Howard A. Kaplan - Current Assignee
- Viventia Bio Inc
Worldwide applications
Application ES97929703T events
2009-02-16
Application granted
2009-02-16
2017-05-22
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Status
Expired - Lifetime
Description
translated from
Fragmentos de unión a antígenos que detectan
específicamente células cancerosas, nucleótidos que codifican los
fragmentos y uso de los mismos para la profilaxis y detección de
cánceres.
Esta invención se refiere a anticuerpos
específicos para un antígeno detectado en células neoplásicas pero
no en células normales. Este antígeno se denomina en la presente
memoria "antígeno C". El antígeno C se reconoce por el
anticuerpo monoclonal humano (Mab) denominado "H11". La
invención incluye una amplia diversidad de anticuerpos, y derivados
funcionales de los mismos que conservan la especificidad
inmunológica de H11 y se denominan en la presente memoria
"\alphaC". El anticuerpo ilustrativo, H11, composiciones que
comprenden el H11, e hibridomas que producen H11 están incluidos en
la presente memoria. La región V de H11 de polinucleótidos y
polipéptidos codificados de este modo y moléculas recombinantes que
contienen estos polinucleótidos también están incluidos en la
invención. También se describen en la presente memoria métodos para
el uso, incluyendo el uso terapéutico y de diagnóstico de los
anticuerpos \alphaC.
A pesar de numerosos avances en la investigación
médica, el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de muerte
en los Estados Unidos. En naciones industrializadas, aproximadamente
una de cinco personas morirá de cáncer. Los modos tradicionales de
cuidados médicos, tales como resección quirúrgica, radioterapia y
quimioterapia, tienen una tasa de fallo significativa,
especialmente para tumores sólidos. Los fallos suceden debido a que
el tumor inicial no responde, o debido a la recurrencia debido al
nuevo crecimiento en el sitio original y/o metástasis. Incluso en
cánceres tales como el cáncer de mama en el que la tasa de
mortalidad ha disminuido, la intervención exitosa se basa en la
detección temprana de las células cancerosas. La etiología, el
diagnóstico y la ablación del cáncer siguen siendo un enfoque
central de la investigación y desarrollo médicos.
La neoplasia que da como resultado tumores
sólidos se puede curar habitualmente completamente retirando
quirúrgicamente la masa. Si un tumor se convierte en maligno, como
se manifiesta por la invasión del tejido circundante, es mucho más
difícil de erradicar. Una vez que un tumor maligno metastatiza es
mucho menos probable que se
erradique.
erradique.
Los tres cánceres principales en términos de
morbilidad y mortalidad, son los de colon, mama, y pulmón. Los
nuevos procedimientos quirúrgicos ofrecen una tasa de supervivencia
aumentada para el cáncer de colon. Los métodos de exploración
mejorados aumentan la detección de cáncer de mama, permitiendo una
terapia más temprana y menos agresiva. Numerosos estudios han
mostrado que la detección temprana aumenta la supervivencia y las
opciones de tratamiento. El cáncer de pulmón continúa en gran medida
siendo resistente a tratamiento.
Excluyendo el carcinoma de células basales, hay
más de un millón de nuevos casos de cáncer por año solamente en los
Estados Unidos y el cáncer representa más de medio millón de muertes
por año en este país. En el mundo como conjunto, los cinco cánceres
más comunes son los de pulmón, estómago, mama, colon/recto, y cuello
de útero y el número total de casos nuevos por año es de más de 6
millones. Solamente aproximadamente la mitad del número de personas
que desarrollan cáncer mueren por el mismo.
El melanoma es una de las enfermedades humanas
para las que hay una necesidad aguda de nuevas modalidades
terapéuticas. Es una forma particularmente agresiva de cáncer
cutáneo y se produce con una mayor frecuencia en individuos con
exposición al sol sin protección regular. En las fases tempranas de
la enfermedad, el melanoma se caracteriza por proliferación en la
unión dermis-epidermis, que invade pronto el tejido
adyacente y metastatiza ampliamente. Una vez que ha metastatizado,
a menudo es imposible la extirpación, y como consecuencia, es fatal.
A nivel mundial se diagnostica melanoma en 70.000 pacientes y es
responsable de 25.000 muertes informadas cada año. La Sociedad
Americana contra el Cáncer prevé esto en el año 2000. Uno de cada 75
americanos será diagnosticado de melanoma.
El neuroblastoma es un tumor altamente maligno
que se produce durante la infancia y en las primeras partes de la
niñez. Excepto por el tumor de Wilm, es el tumor retroperitoneal más
común en niños. Este tumor metastatiza tempranamente, con
implicación amplia de nódulos linfáticos, hígado, hueso, pulmón y
médula ósea. Aunque el tumor primario se puede resolver por
resección, la tasa de recurrencia es elevada.
En 1997 se diagnosticarán aproximadamente
178.100 nuevos casos de cáncer de pulmón, representando el 13% de
los diagnósticos de cáncer. Un número estimado de 160.400 muertes
debido a cáncer pulmonar se producirán en 1997 representando el 29%
de todas las muertes por cáncer. La tasa de supervivencia de un año
para el cáncer del pulmón ha aumentado del 32% en 1973 al 41% en
1993, en gran medida debido a mejoras en las técnicas quirúrgicas.
La tasa de supervivencia de 5 años para todos los estadios
combinados es solamente del 14%. La tasa de supervivencia es del
48% para los casos detectados cuando la enfermedad todavía está
localizada, pero solamente el 15% de los cánceres de pulmón se
descubren tan tempranamente.
\newpage
El cáncer pulmonar microcítico es la forma más
maligna y de crecimiento más rápido de cáncer pulmonar y representa
el 20-25% de los nuevos casos de cáncer de pulmón.
Se diagnosticarán 60.000 casos en los Estados Unidos en 1996. El
tumor primario generalmente responde a quimioterapia, pero es
seguido de metástasis ampliamente distribuidas. El tiempo de
supervivencia medio desde el diagnóstico es de aproximadamente 1
año, con una tasa de supervivencia de 5 años del
5-10%.
El cáncer de mama es uno de los cánceres más
comunes y es la tercera causa principal de muerte por cánceres en
los Estados Unidos con una incidencia anual de aproximadamente
180.200 nuevos casos entre mujeres en los Estados Unidos durante
1997. Aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama se
diagnosticarán en hombres en 1997. En naciones industriales,
aproximadamente una de cada ocho mujeres puede esperar desarrollar
cáncer de mama. La tasa de mortalidad global de cáncer de mama ha
permanecido sin cambios desde 1930. Ha aumentado un promedio del
0,2% por año, pero ha descendido en mujeres por debajo de 65 años de
edad en un promedio de 0,3% por año. Los datos preliminares
sugieren que la mortalidad por cáncer de mama puede estar comenzando
a disminuir, probablemente, como un resultado de un aumento en los
diagnósticos de cáncer localizado y carcinoma in situ. Véase
por ejemplo, Marchant (1994) Contemporary Management of Breast
Disease II: Breast Cancer, in: Obstetrics and Gynecology Clinics of
North America 21:555-560; and Colditz (1993) Cancer
Suppl. 71:1480-1489. Un número estimado de 44.190
muertes (43.900 mujeres, 290 hombres) se producirán en 1997 debido a
cáncer de mama. En mujeres, es la segunda causa principal de muerte
por cáncer después del cáncer de pulmón. La tasa de supervivencia
de cinco años para el cáncer de mama localizado ha aumentado del 72%
en 1940 al 97% actual. Si el cáncer se ha dispersado regionalmente,
sin embargo, la tasa es del 76%, y para mujeres con metástasis
distantes la tasa es del 20%. La supervivencia después de un
diagnóstico de cáncer de mama continúa disminuyendo una vez
transcurridos cinco años. El sesenta y cinco por ciento de las
mujeres que tienen diagnosticado un cáncer de mama sobrevive 10
años y el 56% sobrevive 15 años.
Los linfomas de células de
no-Hodgkin son cánceres del sistema inmune que se
espera que afecten aproximadamente a 225.000 pacientes en los
Estados Unidos en 1996. Estos cánceres son diversos con respecto al
pronóstico y al tratamiento y se clasifican generalmente en uno de
tres grados. La supervivencia media del grado menor es de 6,6 años
y en los cánceres de grado superior se tiene una esperanza de vida
mucho menor. Prácticamente todos los linfomas de células B
no-Hodgkin son incurables. Los nuevos diagnósticos
de linfomas no-Hodgkin han aumentado
aproximadamente el 7% anualmente a lo largo de la última década,
estimándose 52.700 nuevos diagnósticos para 1996. El aumento se
debe en parte a la prevalencia creciente de linfomas en la población
de pacientes con SIDA.
El cáncer de colon y rectal representará un
número estimado de 131.200 casos en 1997, incluyendo 94.100 de
cáncer de colón y 37.100 de cáncer rectal. Los cánceres
colo-rectales representan aproximadamente el 9% de
nuevos diagnósticos de cáncer. En 1997 se producirá un número
estimado de 54.900 muertes debido a cáncer
colo-rectal, representado aproximadamente el 10% de
las muertes por cáncer. Las tasas de mortalidad para cáncer
colo-rectal han caído al 32% para mujeres y el 14%
para hombres durante los últimos 20 años, reflejando tasas de
incidencia decrecientes y tasas de supervivencia crecientes. Sin
embargo, la tasa de mortalidad en hombres afroamericanos continúa
aumentando. Las tasas de supervivencia relativas de 1 a 5 años para
pacientes con cáncer de colon y rectal son del 82% y del 61%,
respectivamente. Cuando se detectan cánceres
colo-rectales en un estadio temprano, localizado,
la tasa de supervivencia de 5 años es del 91%. Sin embargo,
solamente el 37% de los cánceres colo-rectales se
descubren en este estadio. Después de que se haya dispersado el
cáncer regionalmente para implicar órganos adyacentes o nódulos
linfáticos, la tasa cae al 63%. Las tasas de supervivencia para
personas con metástasis distantes es del 7%. La supervivencia
continúa disminuyendo una vez transcurridos 5 años, y el 50%
sobrevive 10 años.
A pesar de las dificultades se han investigado
curas eficaces usando fármacos anti cancerosos (solos o en
combinación con otros tratamientos) para algunos cánceres
anteriormente altamente letales. Los más notables entre los mismos
son el linfoma de Hodgkin, el cáncer testicular, el coriocarcinoma y
algunas leucemias y otros cánceres de la infancia. Para varios de
los cánceres más comunes, el diagnóstico temprano, la cirugía
apropiada y la radioterapia local permiten la recuperación a una
gran proporción de pacientes.
Los métodos actuales de tratamiento de cáncer
son relativamente no selectivos. La cirugía retira el tejido
enfermo, la radioterapia encoge los tumores sólidos y la
quimioterapia inactiva las células que se dividen rápidamente. La
quimioterapia en particular, produce numerosos efectos secundarios,
en algunos casos tan graves que impiden el uso de fármacos
potencialmente eficaces. Además, los cánceres desarrollan a menudo
resistencia a fármacos quimioterapéuticos.
Se han realizado numerosos esfuerzos para
mejorar la especificidad de la terapia del cáncer. Para una
revisión, véase Kohn y Liotta (1995) Cancer Res.
55:1856-1862. En particular, la identificación de
antígenos de superficie celular expresados exclusivamente de forma
preferente en determinados tumores permite la formulación de
estrategias de tratamiento más selectivas. Se han usado anticuerpos
dirigidos contra estos antígenos en inmunoterapia de varios tipos
de cánceres.
La unidad estructural de inmunoglobulina (Ig)
básica en sistemas vertebrados está compuesta por dos cadenas
polipeptídicas ligeras ("L") idénticas (aproximadamente 23
kDa), y dos cadenas pesadas ("H") idénticas (aproximadamente
de 53 a 70 kDa). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces
disulfuro en una configuración en "Y". En la base de la Y, las
dos cadenas H están unidas por enlaces disulfuro covalentes.
La Figura 1 muestra un esquema de una estructura
de anticuerpo. Las cadenas L y H están compuestas cada una de una
región variable (V) en el extremo N, y una región constante (C) en
el extremo C. En la cadena L, la región V (denominada
"V_{L}J_{L}") está compuesta por una región V (V_{L})
conectada por la unión de la región (J_{L}) a la región C
(C_{L}). En la cadena H, la región V (V_{H}D_{H}J_{H}) está
compuesta por una región variable (V_{H}) unida por una
combinación de la región de diversidad (D_{H}) y la región de
unión (J_{H}) a la región C (C_{H}). Las regiones V_{L}J_{L}
y las regiones V_{H}D_{H}J_{H} de las cadenas L y H,
respectivamente, se asocian en las puntas de la Y para formar la
parte de unión a antígeno y determinar la especificidad de unión a
antígeno.
La región (C_{H}) define el isotipo, es decir,
la clase o subclase del anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes
isotipos difieren significativamente en sus funciones efectoras,
tales como la capacidad de activar complemento, unirse a receptores
específicos (por ejemplo, receptores Fc) presentes en una amplia
diversidad de tipos celulares, cruzar barreras de mucosa y
placentarias y formar polímeros de la molécula IgG básica de cuatro
cadenas.
Los anticuerpos se clasifican en "clases"
de acuerdo con el tipo C_{H} utilizado en la molécula de
inmunoglobulina (IgM, IgG, IgD, IgE, o IgA). Hay al menos cinco
tipos de genes de C_{H} (C\mu, C\gamma, C\delta,
C\varepsilon, y C\alpha), y algunas especies tienen múltiples
subtipos C_{H} (por ejemplo, C\gamma_{1}, C\gamma_{2},
C\gamma_{3}, y C\gamma_{4}, en seres humanos). Hay un total
de nueve genes C_{H} en el genoma haploide de seres humanos, ocho
en ratón y rata y varios menos en muchas otras especies. Por el
contrario, normalmente hay solamente dos tipos de regiones C de
cadena L (C_{L}), kappa (\kappa) y lambda (\lambda), y
solamente una de estas regiones C está presente en una proteína de
cadena L única (es decir, solamente hay una región C de cadena L
posible para cada V_{L}J_{L} producida). Cada clase de cadena H
se puede asociar con las clases de cadena L (por ejemplo, una
región C_{H}\gamma puede estar presente en el mismo anticuerpo
como una cadena L \kappa o \lambda), aunque las dos regiones C
de las cadenas H y L dentro de una clase particular no variarán con
la especificidad del antígeno (por ejemplo, un anticuerpo IgG tiene
siempre una región C de cadena H C\gamma independientemente de la
especificidad del antígeno).
Cada una de las regiones V, D, J y C de las
cadenas H y L están codificadas por diferentes secuencias genómicas.
Se genera la diversidad de anticuerpos por recombinación entre los
diferentes segmentos génicos V_{H}, D_{H}. y J_{H} en la
cadena H y segmentos génicos V_{L} y J_{L} en la cadena L. La
recombinación de los diferentes genes V_{H}, D_{H}. y J_{H},
se consigue por recombinación de ADN durante la diferenciación de
células B. En resumen, la secuencia de cadena H se recombina en
primer lugar para generar un complejo de D_{H}, J_{H} y después
un segundo suceso de recombinación produce un complejo
V_{H}D_{H}J_{H}. Se produce una cadena H funcional después de
la transcripción seguido por corte y empalme del transcrito de ARN.
La producción de una cadena H funcional desencadena la
recombinación de las secuencias de cadena L para producir una región
V_{L}J_{L} redispuesta, que a su vez, forma una región
V_{L}J_{L}C_{L} funcional, es decir, la cadena funcional
L_{.}
El valor y el potencial de anticuerpos como
reactivos de diagnóstico y terapéuticos se han reconocido durante
largo tiempo en la técnica. Desafortunadamente, el campo se ha
ralentizado por los lentos procesos tediosos requeridos para
producir grandes cantidades de un anticuerpo de una especificidad
deseada. Las técnicas de fusión celular clásicas permitidas para la
producción eficaz de Mab fusionando la célula que produce el
anticuerpo con una línea celular inmortalizada. La línea celular
resultante es una línea celular de hibridoma.
Los anticuerpos y los derivados funcionales de
los mismos se han usado en una diversidad de escenarios clínicos.
Por ejemplo, se usaron fragmentos de anticuerpo Mab específicos para
digoxina para tratar intoxicación por digitales con riesgo para la
vida. Los anticuerpos cada vez son más útiles de forma rutinaria en
técnicas de diagnóstico tales como radio inmuno diagnóstico de
cánceres de colon. Koda et al. (1995) Am. J. Gastroenterol.
90:1644. Varios usos de Mab, que anteriormente se pensaban que no se
podían usar, se han puesto en práctica recientemente. Por ejemplo,
véase Hall (1995) Science 279: 915-916.
Se encuentran varios autoanticuerpos
(anticuerpos que reconocen y se unen a auto antígenos) en seres
humanos. Muchos de los mismos se asocian a enfermedades
particulares tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso
sistémico, miastenia grave, cirrosis biliar primaria, polimiositis,
vasculitis sistémica, glomérulo nefritis necrotizante idiopática y
esclerosis lateral amiotrófica. Para una revisión, véase Shattner
(1986/1987) Immunol. Lett. 14:143-153. Otros
autoanticuerpos son de origen natural. Lutz y Wipp (1982) J.
Immunol. 128:1965; y Guilbert et al. (1982) J. Immunol.
128:2889-2787. Recientemente se han detectado
autoanticuerpos humanos para antígenos de cáncer específicos, y en
algunos casos, se han producido por la tecnología de hibridoma.
Estos anticuerpos también se han producido por inmunización activa.
Patente de Estados Unidos Nº 5.474.755. De forma original, las
células B humanas se inmortalizaron usando Virus de
Epstein-Barr o mielomas de ratón. Para una
revisión, véase Buck et. al. (1984) "Monoclonal
Antibodies" NY, Plenum Press. Técnicas más recientes han
permitido la inmortalización sin el uso de este virus
potencialmente dañino. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados
Unidos Nº 4.618.477; y Glassy (1987) Cancer Res.
47:5181-5188. En la mayoría de los casos, los
anticuerpos son específicos para uno, o en algunos casos, unos
pocos tipos de cáncer. Por ejemplo, se ha descrito un Mab que
reconoce específicamente células de glioma pero no otras células
tumorales o normales. Estos anticuerpos se usaron para formar las
imágenes del glioma en el cerebro del paciente. Fischer et
al. (1991) Immunobiol. Prot. Pep. VI (M. Atassi, ed.) Plenum
Press, NY págs. 263-270. No se ha descrito ningún
anticuerpo que sea capaz de reconocer una amplia diversidad de
tumores al mismo tiempo que no reconoce, o reconoce de forma
deficiente, células normales no cancerosas.
Las técnicas genéticas recombinantes han
permitido la clonación y expresión de anticuerpos, fragmentos
funcionales de los mismos y los antígenos reconocidos. Estos
anticuerpos modificados por ingeniería genética proporcionan
métodos de producción y modalidades de tratamiento novedosos. Por
ejemplo, se han expresado fragmentos de inmunoglobulina funcionales
en bacterias y semillas y plantas transgénicas de tabaco. Skerra
(1993) Curr. Opin. Immunol. 5:256-262; Fiedler and
Conrad (1995) Bio/Technology 13: 1090-1093; Zhang
et al. (1993) Cancer Res. 55:3384-3591; Ma
et al. (1995) Science 268:916; y, para un revisión de los
anticuerpos sintéticos, véase Barbas (1995) Nature Med
1:836-839.
Se han producido y caracterizado varios Mab
humanos contra antígenos asociados a tumores. Los antígenos
asociados a tumores reconocidos por Mab humanos incluyen antígenos
de superficie celular, citoplásmicos y nucleares. Yoshikawa et
al. (1989) Jpn. J. Cancer Res. (Gann)
80:546-553; Yamaguchi et al. (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:2416-2420; Haspel et
al. (1985) Cancer Res. 45:3951-3961; Cote et
al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:2959-2963; Glassy (1987) Cancer Res.
47:5181-5188; Borup-Christensen
et al. (1987) Cancer Detect. Prevent. Suppl.
1:207-215; Haspel et al. (1985) Cancer Res.
45:3951-3961; Kan-Mitchell et
al. (1989) Cancer Res. 49:4536-4541; Yoshikawa
et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res.
77:1122-1133; and McKnight et al. (1990)
Human Antibod. Hybridomas 1:125-129.
Se han usado Mab humanos e información de
imágenes, diagnóstico y terapia de cáncer. Olsson (1985) J. Nat.
Cancer Inst. 75:397-404; Larrick and Bourla (1986) J
Biol. Resp. Mod. 5:379-393; McCabe et al.
(1988) Cancer Res. 48:4348-4353; Research News
(1993) Science 262:841; Ditzel et al. (1994) Cancer 73
:858-863; and Alonso (1991) Am. J. Clin. Oncol.
4:463-471. Se ha informado de un anticuerpo
bioespecífico de cadena única recombinante que tiene una alta
toxicidad para celulares tumorales. Esta molécula reconoce tanto el
antígeno CD3 de las células T humanas como EpCAM, que se asocia a
células tumorales diseminadas en pacientes con cáncer
colo-rectal residual mínimo. Mack et al.
(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025.
Se informaron varios anticuerpos
anti-GD2 monoclonales murinos que suprimían el
crecimiento de tumores de origen neuroectodérmico en ratones
atímicos (nu/nu) o que provocaban remisión en pacientes con melanoma
metastático. Un anticuerpo anti-GD2 quimérico
anti-ratón provocó remisión en pacientes con
neuroblastoma metastático. El mecanismo de acción de los
anticuerpos se considera que implica la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad mediada por
complemento (CMC). Se han obtenido respuestas clínicas tratando
melanoma con Mab contra GM2, GD2 y GD3. Cheresh et al.
(1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:5155-5159. La
inmunización activa con una vacuna de gangliósido que comprende GM2
produjo anticuerpos anti-GM2 en 50/58 pacientes, que
sobrevivieron más tiempo que la media de los pacientes sin
anticuerpo anti-GM2 detectable.
También se ha observado que los Mab de GD2
reaccionan específicamente con carcinoma pulmonar microcítico.
Cheresh et al. (1986) Cancer Res.
46:5112-5118. También se han producido Mab humanos
específicos para otros cánceres incluyendo de pulmón, melanoma,
estómago, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cuello de
útero y carcinoma mamario. Murakami (1985) in Vitro Cell. Dev
Biol. 21:593; Schadendorf (1989) J. Immunol.
142:1621-1625; Yoshikawa et al. (1986) Jpn.
J. Cancer Res. 77:1122-1133; Pickering and Misra
(1984) Clin. Immunol. Immunopathol. 32:253-260;
Hagiwara and Sato (1983) Mol. Biol Med 1:245-252;
and Schlom et al. (1980) Proc. Natl. Acad Sci. USA
77:6841-6845. También se han sugerido Mab
anti-cáncer humanos y los antígenos que reconocen
para el uso en vacunas. Véase, por ejemplo, Finn et al.
(1995) Immunol. Rev. 145:61-89. Se usó un Mab
humano para tumores cerebrales malignos en un ensayo clínico de fase
I sin efectos secundarios adversos. Matsumoto et al. (1994)
The Clinical Report 28:118-126. También se han
informado resultados de ensayo de Fase II de tratamiento combinado
con Mab murino y factor estimulante de colonias en cáncer
gastrointestinal metastático. Saleh et al. (1995) Cancer
Res. 55:4339-4346. También se ha observado que una
inmuno toxina de cadena única cura meningitis carcinomatosa en un
modelo de rata. Pastan et al. (1995) Proc. Nail. Acad Sci.
USA 92:2765-2769. Se ha demostrado que Mab humanos
que reconocen específicamente células de cáncer ovárico forman de
forma eficaz las imágenes de este cáncer. Chaudhuri et al.
(1994) Cancer 73: 1098-1104.
Si hubiera una estrategia simple y fiable para
proporcionar reactividad inmune contra un antígeno común para estos
cánceres en vez de una inmunidad específica de cáncer, las
previsiones clínicas de cánceres mejorarían en general.
Esta invención incluye composiciones que
contienen fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo, donde
el anticuerpo reconoce específicamente el antígeno reconocido por un
anticuerpo que comprende una región V de cadena H que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, y una región V de cadena
L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 5. Los
fragmentos de unión a antígeno comprenden al menos siete restos de
aminoácidos consecutivos de la región CDR3 de la cadena pesada de la
SEC ID Nº 2. Preferiblemente, el anticuerpo es H11. La invención
incluye adicionalmente anticuerpos que comprenden las regiones V de
la cadenas H y L de la cadena H11 (SEC ID Nº 2 y 5,
respectivamente). El H11 reconoce específicamente células
cancerosas de una amplia diversidad de cánceres pero no reconoce
células normales no cancerosas. Por "no reconoce" se quiere
decir que las células no cancerosas no se unen específicamente a H11
o se reconocen sólo de forma deficiente por el anticuerpo. Los
anticuerpos se denominan \alphaC e incluyen H11 y cualquier
anticuerpo con la "especificidad inmunológica" de H11, es
decir, que reconocen el antígeno reconocido por H11, y que es
específico para al menos un tipo de célula cancerosa pero que no
reconoce células normales. Estos fragmentos de unión al antígeno
incluyen, pero sin limitación, anticuerpos nativos completos,
ilustrados por H11; anticuerpos biespecíficos; anticuerpos
quiméricos; Fab, Fab', fragmentos de región V de cadena única (scFv)
y polipéptidos de fusión.
La invención incluye adicionalmente moléculas de
fusión de anticuerpo H11 que comprenden una región de polipéptidos
con una molécula antigénica, terapéutica, tóxica o de marcado unida
a la región C de la cadena H, una región
V_{H}-V_{L} o V_{L}-V_{H} V
de cadena única y polinucleótidos que codifican tales
polipéptidos.
También se describen en la presente memoria
polipéptidos que tienen la especificidad inmunológica de H11, donde
el polipéptido comprende al menos 5 aminoácidos consecutivos de una
región V de un anticuerpo \alphaC. La región V puede ser de una
cadena L o una cadena H. Los 5 aminoácidos consecutivos juegan
preferiblemente un papel en la especificidad inmunológica, y pueden
ser de una CDR (Región Determinante de Complementariedad de un
anticuerpo). Se incluyen H11 intacto, fragmentos funcionalmente
activos de H11, proteínas de fusión, anticuerpos quiméricos,
proteínas antigénicas múltiples, y otros derivados de polipéptidos
de anticuerpos \alphaC. Son de especial interés las regiones V de
cadena única y las proteínas de fusión.
Los compuestos y las composiciones de esta
invención se pueden usar, entre otras cosas, para detectar o tratar
un cáncer; incluyendo la terapia de dicho cáncer, y cuidados
profilácticos, particularmente para disminuir el riesgo de
recurrencia.
La invención incorpora adicionalmente células y
líneas celulares que producen los fragmentos de unión al antígeno
\alphaC.
También se describe en la presente memoria un
polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un
polipéptido con la especificidad inmunológica de H11, donde el
polipéptido codificado comprende al menos 5 aminoácidos
consecutivos de una región V de H11. La región V puede ser de la
cadena L o la cadena H de H11. Los 5 aminoácidos consecutivos
juegan preferiblemente un papel en la reactividad inmunológica de
H11 y pueden ser de una CDR. La región V de H11 se ha observado que
tiene una región pequeña de homología con un anticuerpo denominado
A6. Los péptidos comprendidos solamente en esta región de homología
y que carecen de otros restos de aminoácidos específicos para H11
están específicamente excluidos de la invención reivindicada. Se
describe A6 en el documento WO953574.
En la presente memoria se describen
polinucleótidos aislados de al menos 20 nucleótidos consecutivos
capaces de formar un dúplex estable con las secuencias codificadas
desde cadena L o H de H11, pero no con secuencias de otras
moléculas de inmunoglobulina que se han descrito previamente.
Cualquiera de estos polinucleótidos puede estar en la forma de
vectores de clonación, vectores de expresión, o se puede transfectar
en células hospedadoras.
Una realización adicional de esta invención se
refiere al tratamiento profiláctico de un paciente con cáncer con
al menos un fragmento de unión al antígeno \alphaC. En particular,
la invención proporciona el uso de un fragmento de unión a un
antígeno de la invención para la fabricación de un medicamento para
tratar neoplasia. Preferiblemente, se fusiona \alphaC a una
molécula terapéutica para realizar el suministro de la molécula
terapéutica a la célula cancerosa. El individuo puede tener un tumor
clínicamente detectable, o el tumor puede haberse tratado
previamente y haberse convertido en indetectable. El uso puede ser
para paliar la enfermedad, o para disminuir el riesgo de
recurrencia.
También se describe en la presente memoria un
kit para la detección o cuantificación del antígeno reconocido por
\alphaC (en lo sucesivo en la presente memoria, el "antígeno
C") en una muestra, que comprende H11 o un polipéptido de esta
invención en un envase adecuado. También se realizan en la invención
métodos para detectar el antígeno C o células que expresan el
antígeno C empleando un reactivo o un kit realizado en esta
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 ilustra un esquema de la estructura
general de anticuerpo.
La Figura 2 ilustra análisis citrométricos de
flujo de células reconocidas por H11.
La Figura 3 ilustra análisis citrométricos de
flujo de células reconocidas por H11.
La Figura 4 ilustra análisis citrométricos de
flujo de células reconocidas por H11. A es A-375
(melanoma), B es SKMG-1 (glioma), C es
SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama), D
es HT-29 (adenocarcinoma de colon), E es
MB-468 (carcinoma de mama) y F es T47D (carcinoma
de mama).
La Figura 5 ilustra la unión de H11 a extractos
de células tumorales. Las barras claras representan H11 y las
barras oscuras representan el anticuerpo de control.
La Figura 6 ilustra la unión de H11 a extractos
de células tumorales.
La Figura 7 ilustra la unión de H11 a líneas de
células tumorales humanas por ELISA de célula fijada. Las barras
claras son IgM H11 y las barras oscuras son IgM de control.
La Figura 8 ilustra un esquema del vector de
expresión pSJF1.
La Figura 9 ilustra la determinación de las
similitudes antihigiénicas entre el Mab H11 y
H11-scFv por ELISA fijado por células. Se determinó
la reactividad por anticuerpos de conejo para H11 scFv.
La figura 10 ilustra la intensidad de
fluorescencia relativa de H11-scFv biotinilado
(línea gruesa) y BGA scFv (línea delgada) de células de
linfoma.
La figura 11 ilustra la titulación de la
reactividad de H11-scFv biotinilado para la unión a
células de linfoma, RAMOS, Daudi, CA-46 y células
CCRF-CM como se determinan por ELISA de células
fijadas. Las concentraciones de anticuerpos disminuyen de unos 10
\mug/ml iniciales (barra abierta) a 5 \mug/ml, después 2,5
\mug/ml y finalmente 1,25 \mug/ml (línea sombreada con dobles
cruces).
La Figura 12 ilustra la intensidad de
fluorescencia relativa de H11-scFv y scFv de control
que se une a líneas de células tumorales. A es
A-375 (melanoma) B es
SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama), C
es HT-29 (adenocarcinoma de colon), D es
CA-46 (linfoma de Burkitt), E es RAMOS (linfoma de
Burkin), F es H9 (linfoma de células T) y G es
CCRF-CEM (linfoma linfoblastoide agudo).
La Figura 13 ilustra la unión de
^{125}I-H11-scFv a células
LS174T.
La Figura 14 ilustra la unión de
^{111}I-H11-scFv a A375.
La Figura 15 ilustra el vector de expresión de
mamífero pNB2 usado para transfectar y expresar
H11-IgG recombinante.
La Figura 16 ilustra el vector de expresión de
mamífero pNB3 usado para transfectar y expresar
H11-IgG recombinante.
La Figura 17 ilustra la purificación de
^{125}I-H11-scFv en una mini
columna de P-2 (A) y análisis de
^{125}I-H11-scFv por
cromatografía de papel en metanol al 85% (B).
La Figura 18 ilustra la purificación
^{125}I-H11 IgM en una mini columna de Sephadex
G-25 (A) y análisis de
^{125}I-H11 IgM por cromatografía de papel en
metanol al 85% (B).
La figura 19 ilustra la purificación de
^{111}In-DTPA-H11-scFv
en una mini columna Sephadex G-50 (A) y análisis de
^{111}In-DTPA-H11-scFv
por ITLC-SG/citrato 0,1 M (B).
La figura 20 ilustra la unión in vivo de
^{111}In-H11-scFv a tumores de
xenoinjerto de A375 en ratones desnudos.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención incluye fragmentos de unión a
antígeno ilustrados por Mab humano identificado recientemente que
reconoce específicamente células cancerosas. Esta especificidad se
extiende solamente a células cancerosas, y el anticuerpo no
reconoce células no cancerosas. El anticuerpo ejemplar se denomina
H11 y las regiones variables se codifican por la SEC ID Nº 1 y 4
(siendo las SEC ID Nº 3 y 6 las cadenas complementarias de 1 y 4
respectivamente.) y reconoce el antígeno denominado "antígeno
C". La especificidad de H11 incluye, pero sin limitación,
glioblastoma, neuroblastoma, melanoma maligno, adenocarcinoma de
mama, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón,
adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de próstata.
Como se muestra en los ejemplos de la presente
memoria, H11 y H11-scFv no reconocen células no
cancerosas de todos los tejidos normales ensayados. H11 y los
fragmentos de unión al antígeno \alphaC, por lo tanto, son útiles
para paliar las afecciones clínicas relacionadas con una amplia
diversidad de cánceres. La invención comprende elementos de unión
al antígeno que reconoce el antígeno H11 para el que es específico
(denominado antígeno C). La invención comprende adicionalmente
derivados polipeptídicos de H11. Estas composiciones se pueden usar
en el diagnóstico, el tratamiento, y la fabricación de reactivos
novedosos. La invención incluye adicionalmente polinucleótidos que
codifican \alphaC H11 y derivados de los mismos. También se
describen en la presente memoria métodos para el uso de los
mismos.
La invención incluye adicionalmente derivados de
\alphaC con especificidad inmunológica para el antígeno C. Estos
derivados comprenden regiones de una secuencia polipeptídica que
comprende parte de la unión VDJ de H11. También se incluyen
regiones que abarcan al menos una, preferiblemente 2, y más
preferiblemente 3 o más de las secuencias de aminoácidos de CDR
H11.
Las secuencias completas de las regiones C de
cadena L y H de H11 todavía no se han determinado, pero se espera
que sean idénticas o prácticamente idénticas a las de otras
moléculas de inmunoglobulinas humanas. Además, el conocimiento de
las secuencias de aminoácidos de la región V permite la subclonación
con cualquier región C. Tales técnicas de subclonación se conocen
bien en la técnica. Las moléculas quiméricas producidas por estas
técnicas de clonación también están incluidas en la invención.
La exploración de una biblioteca de fagos de
heptapéptidos disponible en el mercado con H11 IgM y clones de
anticuerpos scFv han mostrado una secuencia consenso muy fuerte en
el extremo N que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
Phe-His-Arg-Tyr-Ser/Thr.
Los resultados se muestran en la Tabla 1
Las secuencias de ADN usan múltiples codones,
indicando origines de fagos muy diferentes. Por ejemplo, la Arg
está codificada por las familias de tripletes CGx y AGx. Además, la
comparación del pentapéptido de H11 consenso con bases de datos de
secuencias mostró homología con la familia S100 de proteínas de
unión a Ca^{2+}. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Determinados compuestos, composiciones y métodos
que se describen en esta solicitud se refieren generalmente a
\alphaC y derivados que se generan de forma rutinaria mediante
técnicas clásicas de inmunoquímica. Esto incluye \alphaC que se
ha acoplado a otro compuesto por conjugación química, o por mezcla
con un excipiente o un adyuvante. La expresión de fragmentos de
unión al antígeno incluye cualquier péptido que se une al antígeno
C de un modo específico para célula cancerosa. Típicamente, esos
derivados incluyen fragmentos de inmunoglobulinas tales como Fab
(Fab')_{2}, Fab', scFv (tanto formas monoméricas como poliméricas)
y cadenas H y L aisladas. Un fragmento de unión antígeno conserva
la especificidad de H11, aunque la avidez y/o la afinidad pueden
estar alteradas. Se prefiere especialmente el
H11-scFv que se describe en la presente memoria.
Los fragmentos de unión a antígeno (también
denominados "derivados") en la presente memoria) se generan
típicamente por ingeniería genética, aunque se pueden obtener
alternativamente mediante otros métodos y combinaciones de métodos.
Esta clasificación incluye, pero sin limitación, fragmentos de
péptidos modificados genéticamente y péptidos de fusión. Los
compuestos preferidos incluyen fragmentos polipeptídicos de las CDR
de H11, proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden
componentes efectores de citocinas, proteínas de fusión de
anticuerpos que comprenden adyuvantes o fármacos, y proteínas de
región V de cadena única.
La invención comprende adicionalmente
polinucleótidos que codifican las regiones V del anticuerpo H11 y
derivados del mismo. Los mismos incluyen fragmentos de
polinucleótidos aislados, polinucleótidos recombinantes, y plásmidos
y vectores terapéuticos, tales como vectores vaccinia, que
comprenden los polinucleótidos. Estos polinucleótidos se ilustran
por las SEC ID Nº 1, 3, 4, 6, 13, 15, 16 y 18.
Las composiciones farmacéuticas y las
modalidades de tratamiento de esta invención son adecuadas para
suscitar una respuesta inmune contra neoplasia. Los pacientes
humanos con cáncer, incluyendo, pero sin limitación, glioblastoma,
melanoma, neuroblastoma, adenocarcinoma, glioma, sarcoma de tejidos
blandos, y diversos carcinomas (incluyendo el cáncer microcítico de
pulmón) son sujetos especialmente apropiados.
Ya que H11 se ha demostrado que reconoce
específicamente una diversidad de carcinomas, es particularmente
útil en el diagnóstico, la formación de imágenes y el tratamiento de
carcinomas. Los carcinomas adecuados, incluyen cualquiera conocido
en el campo de la oncología, incluyendo, pero sin limitación,
astrocitoma, oligodendroglioma, ependimoma, meduloblastoma, tumor
ectodérmico neural primitivo (PNET), adenocarcinoma ductal
pancreático, adenocarcinomas pulmonares microcíticos y no
microcíticos, carcinoma de células escamosas, carcinoma bronqueo
alveolar, adenocarcinoma epitelial, y metástasis hepáticas de los
mismos, hepatoma, colangiocarcinoma, tumores de mama tales como
adenocarcinoma ductal y lobular, carcinomas escamosos y
adenocarcinomas del cuello del útero, carcinomas epiteliales
uterinos y ováricos, adenocarcinomas prostáticos, carcinoma de
células escamosas transicionales de la vejiga, linfomas de células
B y T (nodular y difuso) plasmocitoma, leucemias aguas y crónicas,
melanoma maligno, sarcomas de tejidos blandos y leiomiosarcomas.
Los sujetos pueden tener una forma avanzada de
la enfermedad, en cuyo caso el objetivo del tratamiento puede
incluir mitigación o inversión de la progresión de la enfermedad, y
mitigación de los efectos secundarios. Los sujetos pueden tener un
historial de la afección para la que ya se han tratado, en cuyo caso
el objetivo incluirá típicamente una disminución o demora del
riesgo de recurrencia.
Adicionalmente, los fragmentos de unión al
antígeno de esta invención se pueden usar como reactivos de
diagnóstico y de formación de imágenes. Estas aplicaciones se
describen con más detalle en las siguientes secciones.
"H11" es un anticuerpo obtenido por la
fusión de linfocitos de sangre periférica de un hombre de 64 años de
edad con un glioma de grado bajo y fusionada a una línea celular de
mieloma humana para producir un hibridoma denominado NBGM1/H11. La
generación y caracterización de H11 se describe en el Ejemplo 1.
"\alphaC" representa cualquier anticuerpo o fragmento de
unión a antígeno del mismo, monoclonal, policlonal o derivado del
mismo que reconoce específicamente el antígeno C y distingue entre
células cancerosas y no cancerosas. \alphaC incluye H11.
"Actividad inmunológica" de \alphaC se
refiere a la capacidad de unirse específicamente al anfígeno C. Tal
unión puede suscitar o no una respuesta inmune. Una respuesta inmune
específica puede comprender anticuerpos, células B, células T y
cualquier combinación de las mismas y las funciones efectoras que se
producen a partir de los mismos. Se incluyen las funciones medidas
por anticuerpos DAC y citolisis mediada por complemento (CDC). La
respuesta de células T incluye la función de célula T auxiliar, la
función de células T citotóxicas, la función de células T de
inflamación/inducción, y la supresión mediada por células T. Un
compuesto capaz de suscitar una respuesta inmune especifica de
acuerdo con cualquiera de estos criterios se denomina
"inmunogénica".
La "actividad" o "función" de
\alphaC se refiere a cualquiera de las actividades inmunológicas
de \alphaC o a cualquier otra actividad biológica adscrita a H11
en esta descripción, incluyendo el papel de H11 en la detección,
mitigación o paliación de cáncer.
La "región V" de H11 se refiere a la región
V de la cadena H de H11 o la región V de la cadena L de H11, sola o
en combinación. Estas regiones V se ilustran en las SEC ID Nº 2 y 5;
el ADN que codifica estas regiones se ilustra en las SEC ID Nº 1 y
4 respectivamente.
GM-CSF, IL-2, y
otras moléculas biológicamente activas a las que se hace referencia
en la presente memoria quieren decir que incluyen fragmentos y
derivados basados en la respectiva molécula parental que tiene la
misma función biológica o fisiológica.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se usan de forma intercambiable en la presente
memoria para referirse a polímeros de restos de aminoácidos de
cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado,
puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos y
puede estar interrumpido por restos químicos diferentes de
aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácido
que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo,
formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación,
acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o
modificación, tal como conjugación con un componente bien de
marcado o bioactivo. A menos que se indique o esté implicado de otro
modo, el término \alphaC o H11 incluye cualquier monómero o
polímero polipeptídico con especificidad inmunológica de H11,
incluyendo el anticuerpo \alphaC intacto, y polipéptidos
funcionalmente equivalentes más pequeños y más grandes.
Un "polipéptido de fusión" es un
polipéptido que comprende regiones en una posición diferente en la
secuencia de lo que sucede en la naturaleza. Las regiones pueden
existir normalmente en proteínas separadas y se juntan en el
polipéptido de fusión; pueden existir normalmente en la misma
proteína pero se ponen en una nueva posición en el polipéptido de
fusión; o se pueden disponer sintéticamente. Por ejemplo, como se
describe a continuación, la invención incluye proteínas
recombinantes (y los polinucleótidos que codifican las proteínas)
que comprenden una parte funcional de \alphaC y una toxina. Los
métodos para hacer estas proteínas de fusión se conocen en la
técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO93/07286.
Un "fragmento funcionalmente equivalente"
de un polipéptido \alphaC varía de la secuencia nativa por
cualquier combinación de adiciones, deleciones, o sustituciones
mientras que se conserva al menos una propiedad funcional del
fragmento para el contexto en el que usa. Un fragmento
funcionalmente equivalente de un polinucleótido \alphaC codifica
un polipéptido que es funcionalmente equivalente a H11 cuando se
produce por un sistema de expresión, o tiene una especificidad de
hibridación similar que un polinucleótido H11 cuando se usa en un
ensayo de hibridación. Un fragmento funcionalmente equivalente de un
polipéptido \alphaC tiene típicamente una o más de las siguientes
propiedades: capacidad de unirse al antígeno C; capacidad de unirse
al menos a un tipo de célula cancerosa de un modo específico; y una
capacidad de suscitar una respuesta inmune con una especificidad de
antígeno similar a la suscitada por H11.
Un "polinucleótido" es una forma polimérica
de nucleótidos de cualquier longitud, que contienen
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier
análogo de combinación. Los polinucleótidos pueden tener cualquier
estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función
conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye
moléculas de doble cadena, monocatenarias y de triple hélice. A
menos que se especifique o requiera de otro modo, cualquier
realización de la invención descrita en la presente memoria que sea
un polinucleótido incluye tanto la forma bicatenaria y cada una de
las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o predichas
que establecen la forma bicatenaria del ADN, RNH o moléculas
híbridas.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de
polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm,
ARNt, ARNr, ribocimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes,
polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de
cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, muestras de
ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender
nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y
análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos
enlazadores tales como fluororibosa y tioato, y ramas de
nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida
por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede estar
modificado adicionalmente después de la polimerización, tal como por
conjugación con un componente de marcado. Otros tipos de
modificaciones incluidas en esta definición son capuchones,
sustitución de uno más de los nucleótidos de origen natural con un
análogo e introducción de medios para unir el polinucleótido a
proteínas, a iones metálicos, componentes de marcado, otros
polinucleótidos, o un soporte sólido.
El término polinucleótido "recombinante" se
refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc, de origen
semisintético, o sintético que no sucede en la naturaleza o está
unido a otro polinucleótido en una disposición no natural.
Un "vector" se refiere a un plásmido o
virus de ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleótido
heterólogo que se tiene que suministrar a una célula diana, in
vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede
comprender una secuencia de interés para propósitos de terapia, y
puede estar opcionalmente en la forma de un casete de expresión.
Como se usa en la presente memoria, un vector no necesita ser capaz
de replicación en la célula o sujeto diana final. El término
incluye detectores de clonación para la replicación de un
polinucleótido, y vectores de expresión para la traducción de una
secuencia que codifica un polinucleótido. También están incluidos
vectores virales, que comprenden un polinucleótido encapsidado o
envuelto en una partícula viral.
Una "línea celular" o un "cultivo
celular" se refieren a células bacterianas, vegetales, de insecto
o de eucariotas superiores que crecen o se mantienen in
vitro. Los descendientes de una célula pueden no ser
completamente idénticos (morfológicamente, genotípicamente, o
fenotípicamente) a la célula parental. Se puede producir un Mab por
un hibridoma u otra célula. Los métodos para hacer hibridomas, tanto
murinos como humanos, se conocen en la técnica. Se describen
métodos particulares para producir hibridomas humanos y se hace
referencia a los mismos a lo largo de la memoria descriptiva.
Una "célula hospedadora" indica una célula
procariota o eucariota que se ha alterado genéticamente, o es capaz
de ser alterada genéticamente por administración de un
polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante.
Cuando se hace referencia a células genéticamente alteradas, el
término se refiere tanto a la célula alterada originalmente como a
la progeniedad de la misma.
"Heterólogo" significa obtenido de una
entidad genotípicamente diferente del resto de la entidad con la
que se compara. Por ejemplo, un polinucleótido se puede poner por
técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector obtenido de
una fuente diferente, y ser un polinucleótido heterólogo. Un
promotor retirado de esta secuencia codificante relativa y unido de
forma funcional a una secuencia codificante diferente de la
secuencia nativa es un promotor heterólogo.
Un "péptido señal" o " secuencia
líder" es una secuencia de aminoácidos corta que se dirige a una
proteína sintetizada recientemente a través de una membrana
celular, habitualmente el retículo endoplásmico en células
eucariotas, y la membrana interna, tanto las membranas internas como
externas de bacterias. Los péptidos señal están típicamente en la
parte N-terminal de un polipéptido y se retiran
típicamente enzimáticamente entre la biosíntesis y la secreción
del polipéptido de la célula. El péptido señal no está presente en
la proteína secretada, solamente durante la producción de
proteínas.
Un polinucleótido o polipéptido "aislado"
es uno que está sustancialmente libre de los materiales con los que
se asocia en su entorno nativo. Por sustancialmente libre se quiere
decir al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70%, más
preferiblemente al menos el 80% e incluso más preferiblemente al
menos el 90% libre de estos materiales.
Un "dúplex estable" de polinucleótidos, o
un "complejo estable" formado entre cualquiera de dos o más
componentes en una reacción bioquímica, se refiere a un dúplex o un
complejo que tiene una durabilidad suficiente para persistir entre
la formación del dúplex o complejo y la detección posterior,
incluyendo cualquier etapa de lavado opcional u otra manipulación
que pueda producirse entre medias.
Una "muestra biológica" incluye una
diversidad de tipos de muestras, incluyendo muestras sanguíneas y de
otros líquidos de origen biológico, muestras de tejidos sólidos
tales como muestras de biopsia o de cultivos tisulares o células
obtenidas de los mismos y la progenie de las mismas. La definición
también incluye muestras que se han manipulado de cualquier modo
después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos,
solubilización, o acumulación de determinados componentes, tales
como proteínas o polinucleótidos. El término incluye diversos tipos
de muestras clínicas obtenidas de cualquier especie, y también
incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, y lisados
celulares. Particularmente, para los propósitos descritos en la
presente memoria, las muestras biológicas comprenden tejido tumoral
o tejido que se piensa que es tumoral y que se obtienen, por
ejemplo, por resección quirúrgica, biopsia, aspiración o cualquier
método conocido en la técnica.
Un "inmunógeno" se refiere a una
composición para uso humano o animal, que se administra con la
intención de conferir al receptor un grado de reactividad
inmunológica específica contra un antígeno particular. La
reactividad inmunológica se puede realizar por anticuerpos o células
(particularmente células B, células plasmáticas, células auxiliares
T y linfocitos T citotóxicos, y sus precursores) que son
inmunológicamente reactivos contra la diana, o cualquier
combinación de los mismos. Para los propósitos de esta invención, la
diana es principalmente antígeno C asociado al tumor o una parte
específica del tumor del mismo. La reactividad inmunológica se puede
desear para propósitos experimentales, para el tratamiento de una
afección particular, para la eliminación de una sustancia
particular, o para la profilaxis. Un inmunógeno activo tiene por
objeto suscitar una respuesta inmune que persista en la ausencia de
los componentes de la vacuna.
"Adyuvante" como se usa en la presente
memoria tiene varios significados, que dependerán todos claramente
del contexto en el que se usa el término. En el contexto de una
preparación farmacéutica, un adyuvante es un agente químico o
biológico dado en combinación con o fusionado recombinantemente con
un antígeno para mejorar la inmunogenecidad del antígeno. En el
contexto de diagnóstico o el tratamiento de cáncer, adyuvante se
refiere a una clase de pacientes con cáncer sin masa tumoral
clínicamente detectable, pero de los que se sospecha que están en
riesgo de recurrencia.
Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer
que se manifiesta normalmente como un tumor sólido, un tumor
"clínicamente detectable" es uno que es detectable en la base
de la masa tumoral; es decir, por procedimientos tales como
exploración TAC, rayos X o palpación. Los hallazgos bioquímicos,
histológicos o inmunológicos solos pueden ser insuficientes para
cumplir esta definición.
Como se usa en la presente memoria,
"tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un
intento de alterar el curso natural del individuo o la célula que
se está tratando, y se puede realizar para la profilaxis o durante
el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del
tratamiento incluyen evitar el inicio o recurrencia de la
enfermedad, la mitigación de los síntomas, la disminución de
cualquier consecuencia patológica, directa o indirecta de la
enfermedad, la evitación de la metástasis, la disminución de la
velocidad de la progresión de la enfermedad, la mitigación o
paliación de la patología, y la remisión o pronóstico mejorado.
La "patología" asociada con una patología
es cualquier afección que comprometa el bienestar, la fisiología
normal, o la calidad de vida del individuo afectado. Esto puede
implicar, pero sin limitación, invasión destructiva de los tejidos
afectados en áreas previamente no afectadas, crecimiento a costa de
la función tisular normal, actividad biológica irregular o
suprimida, agravamiento o supresión de una respuesta inflamatoria o
inmunológica, susceptibilidad aumentada a otros organismos o
agentes patógenos, síntomas clínicos indeseables tales como dolor,
fiebre, náuseas, fatiga, alteraciones del ánimo, y otras
características tales como se pueden determinar por un médico a
cargo del
caso.
caso.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad
suficiente para realizar un resultado clínico beneficioso o deseado.
Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más dosis. En
términos de tratamiento, una cantidad eficaz es una cantidad
suficiente para paliar, mitigar, estabilizar, invertir o ralentizar
la progresión de la enfermedad, o disminuir de otro modo las
consecuencias patológicas de la enfermedad. En términos de un
adyuvante, una cantidad eficaz es una suficiente para mejorar la
respuesta inmune al inmunógeno. La cantidad eficaz se determina
generalmente por el médico en una base de caso por caso y está
dentro del conocimiento de la técnica. Cuando se determina una
dosificación apropiada, típicamente se tienen en cuenta varios
factores. Estos factores incluyen edad, sexo y peso del paciente,
la afección que se está tratando, la gravedad de la afección y la
forma del anticuerpo que se están administrando. Por ejemplo, la
concentración de scFv no necesita ser tan alta como la de
anticuerpos nativos para ser terapéuticamente eficaz.
Un "individuo", "paciente" o
"sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más
preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin
limitación, seres humanos, animales de granja, animales deportivos,
y mascotas.
La práctica de la presente invención emplea, a
menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes),
microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que
están dentro de la especialidad de la técnica. Tales técnicas se
explican completamente en la bibliografía, tal como en "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et
al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed.,
1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987);
"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of
Experimental Immunology" (D.M. Wei&C.C. Blackwell, eds.);
"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller &
M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular
Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The
Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994);
"Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al.,
eds., 1991). Estas técnicas se pueden aplicar a los polinucleótidos
y polipéptidos de la invención y, como tales, se pueden considerar
para realizar y practicar la invención. Se discutirán técnicas
particularmente útiles para realizaciones particulares en las
siguientes secciones.
La invención también incluye \alphaC conjugado
con un resto químicamente funcional. Típicamente, el resto es un
marcador capaz de producir una señal detectable. Estos \alphaC
conjugados son útiles, por ejemplo, en sistemas de detección, tales
como cuantificación de carga tumoral, y formación de imágenes de
focos metastáticos y formación de imágenes de tumor. Tales
marcadores se conocen la técnica e incluyen pero sin limitación,
radioisótopos, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, con factores de
sustrato e inhibidores. Véase, para ejemplos de patentes que
describen el uso de tales marcadores, las Patentes de Estados
Unidos Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437;
4.275.149; y 4.366.241. Los restos se pueden unir covalentemente a
\alphaC, unir recombinantemente o conjugar al \alphaC por un
reactivo secundario, tal como un anticuerpo secundario, proteína A o
un complejo de biotina-avidina.
Otros restos funcionales incluyen péptidos
señal, agentes que mejoran la reactividad inmunológica, agentes que
facilitan el acoplamiento a un soporte sólido, soporte de vacunas,
modificadores de respuesta biológica, marcadores y fármacos
paramagnéticos. Los péptidos señal se han descrito anteriormente e
incluyen formas procariotas y eucariotas. Los agentes que mejoran
la reactividad inmunológica incluyen, pero sin limitación,
superantígenos bacterianos. Los agentes que facilitan el
acoplamiento a un soporte sólido incluyen, pero sin limitación,
biotina o avidina. Los soportes inmunogénicos incluyen, pero sin
limitación, cualquier tampón fisiológicamente aceptable. Los
modificadores de la respuesta biológica incluyen citocinas,
particularmente el factor de necrosis tumoral (TNF),
interleucina-2, interleucina-4,
factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos e
interferones \gamma.
Los restos de fármacos adecuados incluyen
agentes antineoplásicos. Los mismos incluyen pero sin limitación,
radioisótopos, alcaloides de la vinca, tales como la vinablastina,
vincristina y sulfatos de vindesina, adriamicina, sulfato de
bleomicina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina,
decarbazina, dactinomicina, clorhidrato de duanorrubicina,
clorhidrato de doxorrubicina, etopósido, fluorouracilo, lomustina,
clorhidrato de meclororetamina, melfalano, mercaptopurina,
metotrexato, mitomicina, mitotano, pentozapina, pipobromano,
clorhidrato de procarbazo, estreptozotocina, taxol, tioguanina, y
mostaza de uracilo.
Se pueden producir inmunotoxinas, incluyendo
moléculas de cadena única, mediante medios recombinantes. La
producción de diversas inmunotoxinas se conocen bien la técnica, y
se puede encontrar métodos, por ejemplo, en "Monoclonal
Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic
Bullet", Thorpe et al. (1982) Monoclonal Antibodies in
Clinical Medicine, Academic Press, págs. 168-190;
Vitatta (1987) Science 238:1098-1104; y Winter y
Milstein (1991) Nature 349:293-299. Las toxinas
adecuadas incluyen, pero sin limitación, ricina, radionúclidos,
proteína antiviral de fitolaca americana, exotoxina A de
Pseudomonas, toxina diftérica, cadena A de ricina, toxinas fúngicas
tales como restrictocina y enzimas fosfolipasa. Véase, de forma
general, "Chimeric Toxins", Olsnes and Pihl, Pharmac. Ther.
15:355-381 (1981); y "Monoclonal Antibodies for
Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin and Byers, págs..
159-179, 224-266, Academic Press
(1985).
Los restos químicamente funcionales se pueden
hacer recombinantemente, por ejemplo, creando un gen de fusión que
codifique el fragmento de unión a antígeno y regiones funcionales de
otros genes (por ejemplo, enzimas). En el caso de fusiones de
genes, los dos componentes están presentes dentro del mismo gen de
polipéptido. Alternativamente, los fragmentos de unión a antígeno
\alphaC se pueden unir químicamente al resto mediante una
diversidad de procedimientos químicos bien conocidos. Por ejemplo,
cuando el resto es una proteína, la unión puede ser mediante
agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales, por ejemplo, SPDP,
glutaraldehído de carbodiimida o similares. Los restos pueden
unirse covalentemente o conjugarse, por un reactivo secundario, tal
como un anticuerpo secundario, proteína A o un complejo de
biotina-avidina. Los restos paramagnéticos y la
conjugación de los mismos con anticuerpos se conocen bien en la
técnica. Véase, por ejemplo, Miltenyi et al. (1990)
Cytometry 11:231-238.
El anticuerpo \alphaC de esta invención se
puede preparar de varias maneras. Se obtiene de la forma más
práctica a partir de células modificadas genéticamente para expresar
un fragmento de unión a antígeno que contiene la SEC ID Nº 5 y
otros polinucleótidos que codifican fragmentos de unión a \alphaC.
Por ejemplo, las células se pueden cultivar en un medio adecuado, y
se puede usar el medio consumido como una fuente de anticuerpos.
Opcionalmente se pueden incluir canales o perlas recubiertas con
matriz y co-cultivos celulares para mejorar el
crecimiento de células productoras de anticuerpos. Para la
producción de grandes cantidades de anticuerpos, generalmente es
más práctico obtener un fluido de ascitis. El método para generar
ascitis comprende generalmente inyectar células de hibridoma en un
mamífero histocompatible o inmunotolerante inmunológicamente
virgen, especialmente un ratón. El mamífero se puede sensibilizar
para la producción de ascitis mediante administración previa de una
composición adecuada; por ejemplo, Pristano.
Alternativamente, \alphaC se puede sintetizar
químicamente usando datos de secuencia y otra información
proporcionada en esta descripción, junto con métodos convencionales
de síntesis de proteínas. Un método adecuado es la técnica de
Merrifield de fase sólida. Los sintetizadores de péptidos
automatizados están disponibles en el mercado tales como los
fabricados por Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA).
\alphaC También se puede obtener empleando
métodos recombinantes rutinarios tales como los que se describen en
Sambrook et al. (1989). Por ejemplo, usando las secuencias
de aminoácidos y polinucleótidos (SEC ID Nº 1-6, y
13-18) y la información proporcionada en la presente
memoria, se puede clonar un polinucleótido que codifica la cadena H
o L de \alphaC en un vector de expresión adecuada (que contiene
secuencias de control para la transcripción, tales como un
promotor). El vector de expresión se introduce a su vez en una
célula hospedadora. La célula hospedadora se hace crecer en
condiciones adecuadas de tal forma que el polinucleótido se
transcribe y se traduce en una proteína. Se pueden producir las
cadenas H y L de \alphaC de forma separada y después combinar por
redisposición de enlaces disulfuro. Alternativamente se pueden
transfectar vectores con polinucleótidos separados que codifiquen
cada cadena \alphaC o de un vector con un único polinucleótido
que codifica ambas cadenas como transcritos separados, en una única
célula hospedadora que después puede producir y ensamblar la
molécula entera. Preferiblemente, la célula hospedadora se obtiene
de un eucariota superior que puede producir el complemento de
carbohidrato normal de la molécula. El \alphaC producido de este
modo se puede modificar usando técnicas convencionales en la
técnica. Los polinucleótidos que codifican \alphaC para usar en
la producción de \alphaC se pueden obtener, a su vez, por un
hibridoma que produzca un anticuerpo \alphaC o se pueden producir
sintéticamente o recombinantemente a partir de las secuencias de ADN
proporcionadas en la presente memoria.
Otro método para obtener \alphaC es inmunizar
animales hospedadores adecuados con antígeno C y seguir
procedimientos convencionales para la producción policlonal o de
Mab. Los Mab producidos desde este modo se pueden "humanizar"
mediante métodos conocidos en la técnica. Se proporcionan ejemplos
de anticuerpos humanizados, por ejemplo, en las Patentes de Estados
Unidos Nº 5.530.101 y 5.585.089.
Los anticuerpos "humanizados" son
anticuerpos en los que al menos parte de las secuencias se ha
alterado a partir de su forma inicial para convertirla en más
similar a inmunoglobulinas humanas. En una versión, las regiones C
de cadena H y cadena L se sustituyen por la secuencia humana. Esto
es un polipéptido de fusión que comprende una región V de H11 y una
región C de inmunoglobulina heteróloga. En otra versión, las
regiones de CDR comprenden secuencias de aminoácidos de H11
mientras que las regiones flanqueantes V también se han convertido
en secuencias humanas. Véase, por ejemplo, el documento EP 0329400.
En una tercera versión, las regiones V se humanizan diseñando
secuencias consenso de regiones V humanas y de ratón, y convirtiendo
los restos en el exterior de las CDR que son diferentes fuera de
las secuencias consenso. La invención incluye Mab humanizados.
Al producir anticuerpos humanizados, la
selección de los restos flanqueantes puede ser crítica para
conservar la alta afinidad de unión. En principio, una secuencia
flanqueante de cualquier HuAb puede servir como la plantilla para
el injerto de CDR; sin embargo, se ha demostrado que la sustitución
lineal de CDR en una secuencia flanqueante de este tipo puede
conducir a una pérdida significativa de la afinidad de unión al
antígeno. Glaser et al. (1992) J. Immunol. 149:2606; Tempest
et al. (1992) Biotechnology 9:266; and Shalaby et al.
(1992) J. Exp. Med 17:217. Cuanto más homólogo sea un HuAb al muAb
original, con menor probabilidad introducirán las secuencias
flanqueantes humanas distorsiones en las CDR murinas que podrían
disminuir la afinidad. Basándose en una búsqueda de homología de
secuencia frente a una base de datos de secuencia de anticuerpos, el
HuAb IC4 proporciona una buena homología de secuencia flanqueante
con muM4TS.22, aunque también serían adecuados otros HuAb altamente
homólogos, especialmente en las cadenas L kappa del subgrupo humano
I o cadenas H del subgrupo humano III. Kabat et al., (1987).
Están disponibles diversos programas informáticos tales como ENCAD
(Levitt et al. (1983) J. Mol. Biol. 168:595) para predecir la
secuencia ideal para la región V. La invención, por tanto, incluye
HuAb con diferentes regiones V. Está dentro del conocimiento del
especialista de la técnica determinar secuencias de región V
adecuadas y optimizar estas secuencias. Los métodos para obtener
anticuerpos con inmunogenicidad disminuida también se describen en
la Patente de Estados Unidos Nº 5.270.202 y EP 699.755.
Los métodos para la producción y el aislamiento
de anticuerpos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo,
Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York. El anticuerpo H11 es una
inmunoglobulina humana de la subclase IgM y se puede aislar mediante
cualquier técnica adecuada para inmunoglobulinas de este isotipo.
Los métodos de purificación pueden incluir precipitación con sales
(por ejemplo, con sulfato de amonio), cromatografía de intercambio
iónico (por ejemplo, en una columna de intercambio catiónica o
aniónica) procesada a pH neutro y eluida con gradientes graduables
con fuerza iónica creciente, cromatografía de filtración en gel
(incluyendo filtración en gel de PLC), y cromatografía sobre
resinas de afinidad tales como proteína A, proteína G,
hidroxiapatita, y anti-inmunoglobulina. H11 también
se puede purificar en columnas de afinidad que comprenden el
antígeno C; por ejemplo, en la forma de un AbI o Ab3 purificado.
Preferiblemente, H11 se purifica usando cromatografía Proteína
A-CL-Sepharose^{TM} 4B seguido
sobre cromatografía sobre una columna de intercambio iónico DEAE-
Sepharose^{TM} 4B.
La invención también incluye anticuerpos
híbridos, en los que un par de cadenas H y L se obtiene a partir de
un anticuerpo, mientras que otro par de cadenas H y L se obtiene de
un segundo anticuerpo diferente. Para los propósitos de este
invención, un par de cadenas L y H es de \alphaC. En un ejemplo,
cada par de cadena L-H se une a diferentes epítopos
sobre el antígeno C. Tales híbridos también se pueden formar usando
cadenas H o L humanizadas.
Otro \alphaC considerado por esta invención es
un anticuerpo en donde la cadena H o L se ha modificado para
proporcionar propiedades adicionales. Por ejemplo, un cambio en la
secuencia de aminoácidos puede dar como resultado una
inmunogenicidad disminuida del polipéptido resultante. Los cambios
varían del cambio de uno o más aminoácidos hasta el rediseño
completo de una región tal como un dominio de región C. Los cambios
típicos incluyen, pero sin limitación, los relacionados con la
fijación de complemento, interacción con receptores de membrana, y
otras funciones efectoras. Un anticuerpo recombinante también se
puede diseñar para ayudar al suministro específico de una sustancia
(tal como una citocina) a una célula tumoral. También se incluyen
en la invención péptidos en los que diversos dominios de
inmunoglobulinas se han puesto en un orden diferente del que sucede
en la naturaleza.
Si se tiene que administrar \alphaC a un
individuo, tiene preferiblemente al menos un 80% de pureza, más
preferiblemente tiene al menos un 90% de pureza, aún más
preferiblemente tiene al menos un 95% de pureza y está libre de
pirógenos y otros contaminantes. En este contexto, el porcentaje de
pureza se calcula como un porcentaje en peso del contenido total de
proteína para la preparación, y no incluye constituyentes que se
añaden de forma deliberada a la composición después de que se haya
purificado el \alphaC.
Los anticuerpos \alphaC se pueden usar para
varios propósitos. Los mismos incluyen suscitar una respuesta de
anticuerpos para producir \alpha\alphaC que se puede usar para
suscitar una respuesta de células T para \alphaC o el antígeno C
y tratar diversos tipos de cáncer. Los usos se elaboran más
concretamente en una sesión posterior.
La invención incluye fragmentos de polipéptidos
de \alphaC que contienen al menos una parte de una región V de
\alphaC. Los fragmentos preferidos son los que tienen la actividad
inmunológica de H11. También se prefieren fragmentos que comprenden
secuencias de aminoácidos sustancialmente diferentes de otras
inmunoglobulinas, y fragmentos que comprenden una CDR. En una
realización, la invención incluye un fragmento polipeptídico de la
región V de la cadena H de \alphaC, que comprende al menos 25
aminoácidos consecutivos, más preferiblemente 30 aminoácidos
consecutivos de la SEC ID Nº 2, ó 5 aminoácidos consecutivos de la
CDR1 de la misma, o al menos 7 aminoácidos consecutivos,
preferiblemente al menos 9 aminoácidos consecutivos de la CDR2 o
CDR3 de la misma. La invención también incluye un fragmento de
polipéptido de la región V de la cadena L de \alphaC, que
comprende al menos 25 aminoácidos consecutivos, más
preferiblemente 30 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 5 ó 7
aminoácidos consecutivos de la CDR2 de la misma, o al menos 8
aminoácidos consecutivos, preferiblemente 10 aminoácidos
consecutivos de la CDR1 o CDR3 de la misma.
El tamaño de los polipéptidos de \alphaC puede
ser solamente el tamaño mínimo requerido para proporcionar una
función deseada. Los polipéptidos pueden comprender opcionalmente
una secuencia adicional, virgen para \alphaC o de una fuente
heteróloga si se desea. Los péptidos de \alphaC pueden contener
solamente 5 aminoácidos consecutivos de una secuencia de región V
de H11 que no sea igual que la región homóloga de A6. También están
incluidos los polipéptidos que comprenden 7 aminoácidos, más
preferiblemente aproximadamente 10 aminoácidos, más preferiblemente
aproximadamente 15 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente
25 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 50 aminoácidos,
más preferiblemente aproximadamente 75 aminoácidos de la región V
de la cadena L o H de \alphaC. Incluso más preferible son
polipéptidos que comprenden toda la región V de la cadena L o H de
\alphaC. Preferiblemente, los polipéptidos se obtienen de H11.
Preferiblemente, los polipéptidos son los scFv ilustrados en las
SEC ID Nº 14 y 17.
La invención incluye polipéptidos \alphaC
modificados que son funcionalmente equivalentes a H11, o tiene
actividad inmunológica de H11 alterada pero medible. Se prefieren
polipéptidos modificados con actividad inmunológica de H11
mejorada. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen los que
tienen sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, y una
o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran de forma
significativamente perjudicial la actividad inmunológica.
Un ejemplo de esto son los polipéptidos de H11
que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en comparación
con la secuencia de H11 prototipo. La sustituciones pueden variar
de cambiar o modificar uno o más restos de aminoácidos hasta el
rediseño completo de una región, tal como la región V. Las
sustituciones de aminoácidos, si están presentes, son
preferiblemente sustituciones conservativas que no afectan de forma
perjudicial a las propiedades de plegado o funcionales del péptido.
Los grupos de aminoácidos funcionalmente relacionados dentro de los
que se pueden realizar sustituciones conservativas son
glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina;
ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina;
lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano. Los
polipéptidos de esta invención pueden estar en forma glicosilada o
no glicosilada, se pueden modificar
pos-transduccionalmente (por ejemplo, acetilación y
fosforilación) o se pueden modificar sintéticamente (por ejemplo,
la unión de un grupo de marcado).
Los derivados de polipéptidos H11 que comprenden
tanto una cadena L de H11 como una cadena H de H11 se pueden formar
como cadenas L y H separadas y después se pueden ensamblar o se
pueden ensamblar in situ con un sistema de expresión para
ambas cadenas. Tales sistemas de expresión se pueden crear
transfectando una célula adecuada con un plásmido que comprende
regiones que se pueden transcribir separadas para la cadena L y H,
o co-transfectando la misma célula con plásmidos
para cada cadena. En un tercer método, un plásmido adecuado con una
región que codifica una cadena H se transfecta en un mutante que ha
perdido la cadena H.
Los mutantes que han perdido la cadena H se
pueden obtener tratando aproximadamente 2x10^{7} células
productoras de H11 con IgG de conejo anti-ratón
marcada con fluoresceína (específica para cadena H, DAKO
Corporation, Carpinteria, CA) de acuerdo con las instrucciones del
proveedor. Las poblaciones celulares teñidas y no teñidas se
analizan en un clasificador de células activado por fluorescencia.
Las células no teñidas se recogen en un tubo esterilizado y se
ponen en placas de 96 pocillos con una célula/pocillo por dilución
limitante. Después, los sobrenadantes de cultivo se ensayan por
ELISA usando IgG de cabra anti-ratón (específica
para cadena H) y kappa de cabra anti-ratón. Los
clones con genotipo positivo para kappa y negativo para IgG se
subclonan al menos 3 veces para obtener mutantes H11^{(-H)}
estables. Se puede aislar el ARNm de clones H11^{(-H)} mutantes
con pérdida de cadena H supuestos y se puede determinar la secuencia
del ADNc de la región V de la cadena L. Se realiza una PCR inversa
del ARNm para la V_{H} de H11 con 2 conjuntos de cebadores 3' y
5', usados para la clonación de ADNc de H11^{(-H)} (Ejemplo 7).
Un mutante con pérdida de cadena H no produce ninguna banda de ADN
detectable. La transfección de las células se produce con un
plásmido de cadena H adecuado.
Otro derivado de \alphaC incluido en esta
invención es un anticuerpo en el que la cadena H o L de \alphaC
se ha modificado para proporcionar propiedades adicionales. Por
ejemplo, un cambio en la secuencia de aminoácidos puede dar como
resultado una mayor inmunogenicidad del polipéptido resultante. Los
cambios varían de cambiar uno o más aminoácidos hasta el completo
rediseño de una región tal como un dominio de la región C. Los
cambios contemplados afectan a la fijación de complementos,
interacción con receptores de membrana y otras funciones efectoras.
Un anticuerpo H11 recombinante también se puede diseñar para ayudar
al suministro específico de una sustancia (tal como una linfocina)
a una célula efectora. También se incluyen en la invención proteínas
en las que se han puesto diversos dominios de inmunoglobulina en un
orden diferente al que se produce en la naturaleza.
La invención también incluye fragmentos de
región V de cadena única ("scFv") de H11. Los fragmentos de
región V de cadena única se producen uniendo regiones de cadena L
y/o H usando un péptido enlazador corto. Bird et al. (1988)
Science 242:423-426. Se puede usar cualquier péptido
que tenga una flexibilidad y longitud suficientes como un enlazador
en un scFv. Habitualmente, el enlazador se selecciona para que tenga
de poca a ninguna inmunogenicidad. Un ejemplo de un péptido
enlazador es (GGGGS)_{3}, que abarca aproximadamente 3,5 nm
entre el extremo carboxi de una región V y el extremo amino de otra
región V. También se pueden usar otras secuencias enlazadoras y
pueden proporcionar funciones adicionales, tales como un medio para
unirse a un fármaco o un soporte sólido.
Se puede usar toda o cualquier parte de la
cadena H o L en cualquier combinación. Típicamente, las regiones V
completas están incluidas en las scFv. Por ejemplo, la región V de
cadena L se puede unir a la región V de cadena H. Alternativamente,
una parte de la región V de cadena L se puede unir a la región V de
cadena H o una parte de la misma. También se contemplan scFv en los
que la región V de cadena H es de H11, y la región V de la cadena L
es de otra inmunoglobulina. También es posible construir un scFv
bifásico, en el que un componente sea un polipéptido H11 y otro
componente sea un polipéptido diferente, tal como un epítopo de
célula T.
Los scFv se pueden ensamblar en cualquier orden,
por ejemplo, V_{H}-(enlazador)-V_{L} o
V_{L}-(enlazador)-V_{H}. Por ejemplo, las SEC
ID Nº 13 y 16 muestran construcciones de H11-scFv2
que tienen la forma V_{L}-(enlazador)-V_{H}.
Sin embargo, la construcción mostrada en la SEC ID Nº 13 forma
monómeros, mientras que la construcción mostrada de la SEC ID Nº 16
forma dímeros. Puede haber una diferencia en el nivel de expresión
de estas dos configuraciones en sistemas de expresión particulares,
en cuyo caso puede preferirse una de estas formas. También se pueden
realizar scFv en tándem, tal como
(X)-enlazador)-(X)-enlazador, en los
que X son polipéptidos \alphaC, o combinaciones de polipéptidos
\alphaC con otros polipéptidos. En otra realización, los
polipéptidos de anticuerpos de cadena única no tienen polipéptido
enlazador, o solamente un enlazador corto e inflexible. Las
configuraciones ilustrativas incluyen
V_{L}-V_{H} y V_{H}-V_{L}.
La unión es demasiado corta para permitir la interacción entre
V_{L} y V_{H} dentro de la cadena, y las cadenas forman
homodímeros con un sitio de unión a antígeno V_{L}/N_{H} en
cada extremo. Tales moléculas se denominan en la técnica
"diacuerpos".
Se pueden producir scFv recombinantemente o
sintéticamente. Para la producción sintética de scFv se puede usar
un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv
se puede introducir un plásmido adecuado que contenga un
polinucleótido que codifique el scFv en una célula hospedadora
adecuada, eucariota, tales como células de levadura, vegetales, de
insecto o de mamífero, o procariota, tal como Escherichia
coli, y la proteína expresada por el polinucleótido se puede
aislar usando técnicas de purificación de proteínas
convencionales.
Un sistema particularmente útil para la
producción de scFv es el plásmido pET-22b(+)
(Novagen, Madison, WI) en E. coli. El
pET-22b(+) contiene un dominio de unión a ión níquel
que consiste en 6 restos de histidina secuenciales, que permite que
la proteína expresada se purifique sobre una resina de afinidad
adecuada. Otro ejemplo de un vector adecuado es pcDNA3 (Invitrogen,
San Diego, CA) que se ha descrito anteriormente.
Las condiciones de expresión deben garantizar
que el scFv asuma la estructura terciaria funcional, y,
preferiblemente, óptima. Dependiendo del plásmido usado
(especialmente la actividad del promotor) y la célula hospedadora,
puede ser necesario modular la velocidad de producción. Por ejemplo,
usando un promotor más débil, o expresión a temperaturas menores,
puede ser necesario optimizar la producción de scFv plegados de
forma apropiada en sistemas procariotas; o, puede ser preferible
expresar scFv en células eucariotas.
Los scFv preferidos comprenden al menos 10
aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 2, y al menos 10
aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 5, especialmente donde los
aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y los aminoácidos de la SEC ID Nº 5
están unidos por un polipéptido enlazador de 5 a 20 aminoácidos, o
que comprenden la región V de cadena L y la región V de cadena H de
H11.
La invención también incluye formas poliméricas
de los polipéptidos \alphaC, que contienen una pluralidad de
polipéptidos \alphaC. Una realización es un polímero lineal de
polipéptidos \alphaC, conjugados opcionalmente a un soporte.
Estos polímeros lineales pueden comprender múltiples copias de un
único polipéptido uC o combinaciones de diferentes polipéptidos
\alphaC, y pueden tener polipéptidos \alphaC en tándem o
polipéptidos \alphaC separados por otras secuencias de
aminoácidos. Otra realización son péptidos de antígenos múltiples
\alphaC (MAP). Los MAP tienen un núcleo inmunológicamente inerte
pequeño que tiene dendritas de lisina que se ramifican radialmente,
sobre las que se unen varios polipéptidos \alphaC covalentemente.
Véase, por ejemplo, Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem.
263: 1719-1725; y Tarn (1989) Meth. Enz.
168:7-15. El resultado es una gran macromolécula
que tiene una alta proporción molar de polipéptidos \alphaC a
núcleo. Los MAP son inmunogenes eficaces y antígenos útiles para
inmunoensayo. El núcleo para crear un MAP de \alphaC se puede
obtener mediante técnicas de síntesis de péptidos convencionales, o
se puede obtener en el mercado, por ejemplo, de Quality Controlled
Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA. Se produce una matriz de núcleo
típica de tres niveles de lisina y ocho aminoácidos.
Cuando se usan polipéptidos \alphaC como
inmunógenos, los polipéptidos se suministran preferiblemente junto
con un soporte. Se puede usar cualquier soporte que no sea dañino
para el hospedador. Los soportes adecuados son típicamente grandes,
macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas;
polisacáridos (tales come Sepharose funcionalizada con látex,
agarosa, celulosa, perlas de celulosa y similares); aminoácidos
poliméricos (tales como ácido poliglutámico, polilisina y
similares); copolímeros de aminoácidos y partículas de virus
inactivos o bacterias atenuadas, tales como Salmonella. Son
proteínas de soporte especialmente útiles las albúmina séricas, la
hemacianina de lapa californiana (KLH), determinadas moléculas de
Ig, tiroglobulina, olvalbúmina, y toxoide tetánico. Se prefiere
especialmente KLH.
Los polipéptidos \alphaC de la invención se
pueden identificar de varios modos. Por ejemplo, las regiones V de
las cadenas L y H se pueden identificar preparando una serie de
polipéptidos cortos que abarcan conjuntamente toda la secuencia de
aminoácidos de la región V. Usando una serie de polipéptidos de 20
ó 50 aminoácidos de longitud, cada región V de \alphaC se puede
supervisar para propiedades funcionales útiles. También es posible
realizar un análisis de ordenador de una secuencia de proteínas para
identificar polipéptidos potencialmente interesantes, tales como
unos que lleva la forma de D2 o los implicados en contacto
idiotipo-anti-idiotipo.
La invención incluye adicionalmente diversas
adaptaciones de \alphaC descritas en esta sección combinadas de
diversas maneras para proporcionar otros polipéptidos \alphaC con
propiedades deseables. Por ejemplo, los polipéptidos \alphaC con
restos de aminoácidos modificados pueden estar comprendidos en un
MAP. En otro ejemplo, un scFv de \alphaC se fusiona con una
citocina tal como IL-2. Todas estas combinaciones
están contempladas en esta invención.
Los polipéptidos de esta invención se pueden
obtener mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo
proteolisis del anticuerpo \alphaC, mediante métodos recombinantes
o mediante síntesis química. Los métodos se conocen en la técnica
y no necesitan ser descritos con detalle en la presente memoria. Los
ejemplos de enzimas proteolíticas incluyen, pero sin limitación,
tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, proteasa V8,
subtilisina, plasmina, y trombina. Se puede incubar \alphaC
intacto con una o más proteinasas de forma simultánea o de forma
secuencial. Alternativamente, o adicionalmente, se puede tratar el
anticuerpo intacto con agentes reductores de disulfuro. Después,
los péptidos se puede separar entre sí mediante técnicas conocidas
en la técnica incluyendo, pero sin limitación, cromatografía de
filtración en gel, electroforesis en gel, y HPLC de fase
inversa.
Los polipéptidos \alphaC también se pueden
producir mediante expresión a partir de un polinucleótido que
codifica el péptido de acuerdo con la información proporcionada a lo
largo de esta solicitud, en un sistema de expresión adecuado.
Típicamente, los polinucleótidos que codifican un polipéptido
\alphaC se ligan en un vector de expresión bajo el control de un
promotor adecuado y se usan para alterar genéticamente la célula
hospedadora pretendida. Se pueden usar sistemas de hospedador tanto
eucariotas como procariotas. Después, el polipéptido se aísla de
células lisadas o del medio de cultivo y se purifica hasta el nivel
necesitado para su uso pretendido. Los ejemplos de células
hospedadoras procariotas apropiadas para el uso con esta invención
incluyen E. coli. Los ejemplos de células hospedadoras
eucariotas incluyen células aviares, de insecto, vegetales y de
animales incluyendo, pero sin limitación, células COS7, HeLa
y
CHO.
CHO.
En determinadas aplicaciones, tal como cuando se
expresa un polipéptido H11 en un medio de almacenamiento adecuado
tal como una semilla de planta, el polipéptido H11 se puede usar sin
purificación. Fiedler et al. (1995) Biotechnology
13:1090-1093. Para la mayoría de las aplicaciones,
generalmente se prefiere que el polipéptido se purifique al menos
parcialmente a partir de otros constituyentes celulares.
Preferiblemente, el polipéptido tiene al menos aproximadamente el
50% de pureza como porcentaje en peso de proteína total. Más
preferiblemente, la proteína tiene al menos aproximadamente un
50-75% de pureza. Para uso clínico, el polipéptido
tiene preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de
pureza.
La invención también incluye métodos para
detectar antígeno C en una muestra biológica. Los métodos incluyen
obtener una muestra biológica, poner en contacto la muestra con
\alphaC en condiciones que permitan la unión del anticuerpo al
antígeno y detectar la unión, si la hay, del anticuerpo al
antígeno.
Se pueden usar métodos para detectar
anti-H11 o anti-\alphaC en una
muestra biológica. Se puede detectar anti-\alphaC
si tiene reactividad cruzada con H11. Anti-\alphaC
con esta actividad puede surgir de forma espontánea durante el
desarrollo de una enfermedad asociada a tumor.
Anti-\alphaC con esta actividad es especialmente
probable en individuos que han recibido una terapia con \alphaC.
Estos métodos se pueden aplicar en un entorno clínico, por ejemplo,
para controlar niveles de anticuerpos en un individuo, así como en
un entorno industrial, como en la producción comercial de
anti-H11 o anti-\alphaC.
Los métodos de ensayo incluyen poner en contacto
cualquier anticuerpo diana de anti-H11 o
anti-\alphaC en la muestra con un anticuerpo o
polipéptido H11 en condiciones adecuadas para permitir la formación
de un complejo estable entre la diana y H11, y detectar cualquier
complejo estable formado. La muestra se prepara de forma adecuada
antes de realizar el ensayo, opcionalmente enriqueciendo la
concentración de anticuerpos. Cuando se usa \alphaC murino
intacto, generalmente es preferible agotar la muestra de cualquier
actividad de inmunoglobulina anti-ratón que pueda
estar presente. Se puede retirar el anticuerpo inmunoglobulina
anti-ratón de una muestra, por ejemplo, por
precipitación con una IgG de ratón normal o adsorción con un
adsorbente de Ig de ratón. La unión del anticuerpo de
inmunoglobulina anti-ratón, particularmente el
específico para la región Fc, se puede minimizar por la selección
razonable de los reactivos del ensayo. Son apropiados fragmentos
F(ab')_{2} o Fab de \alphaC murino y otros reactivos
tales como \alphaC o H11 humanizados con menos determinantes de
ratón.
Después de que se haya preparado la muestra de
forma adecuada, se mezcla con un exceso de \alphaC en condiciones
que permitan la formación de un complejo entre \alphaC y cualquier
anticuerpo diana que pueda estar presente. La cantidad de complejo
después se determina, y se compara con los complejos formados con
muestras convencionales que contienen cantidades conocidas de
anticuerpo diana en el intervalo esperado. Se puede observar la
formación de complejo mediante cualquier método conocido en la
técnica tal como inmunoprecipitación o nefelometría, pero
generalmente es más sensible emplear un reactivo marcado con
marcadores tales como radioisótopos tales como ^{125}I, enzimas
tales como peroxidasa y \beta-galactosidasa, o
fluorocromos tales como fluoresceína.
La invención proporciona diversos
polinucleótidos que codifican el anticuerpo H11 o fragmentos de H11,
basándose en las secuencias de polinucleótidos proporcionados en la
presente memoria (SEC ID Nº 1 y 4). Se describen diversas
realizaciones en esta sección, que comprenden varias combinaciones
diferentes de las secuencias de región V de cadena H o L de H11. En
general, un polinucleótido H11 de esta invención codifica al menos
una característica que sea única para la molécula de H11 (en
comparación con otras inmunoglobulinas y, en particular, el
anticuerpo A6). Preferiblemente, esta característica está
relacionada de algún modo con una reactividad inmunológica de
H11.
La invención incluye polinucleótidos que
codifican una parte de la región V de cadena L de H11 que comprende
al menos aproximadamente 70 nucleótidos consecutivos,
preferiblemente al menos aproximadamente 80 nucleótidos
consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 100
nucleótidos consecutivos, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 150 nucleótidos de la SEC ID Nº 4. La invención
también incluye un polinucleótido que decodifica una parte de la
región V de la cadena L de H11 que comprende al menos
aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al
menos aproximadamente 30 nucleótidos consecutivos, y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos
consecutivos de la secuencia que codifica CDR1 de la misma. La
invención también incluye un polinucleótido que codifica una parte
de la región V de la cadena L de H11 que comprende al menos
aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al
menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos
de la secuencia que codifica CDR2 o CDR3 del mismo.
La invención también incluye polinucleótidos que
codifican una parte de la región V de la cadena H de H11, que
comprende al menos aproximadamente 70 nucleótidos consecutivos,
preferiblemente al menos aproximadamente 80 nucleótidos
consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 100
nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 150 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº 1. La
invención también incluye un polinucleótido que codifica una parte
de la región V de la cadena L de H11 que comprende 15 nucleótidos
consecutivos de la secuencia codificante de CDR1 del mismo. La
invención también incluye un polinucleótido que codifica una parte
de la región V de la cadena L de H11, que comprende al menos
aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al
menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos
de la secuencia codificante de CDR2 o CDR3 de la misma.
La invención incluye polinucleótidos H11
aislados que codifican un polipéptido que tiene actividad
inmunológica de H11, donde el polipéptido codifica al menos 5
aminoácidos de una cadena V L de H11 como se ilustra en la SEC ID
Nº 5. La invención también incluye polinucleótidos H11 aislados que
codifican un polipéptido que tiene actividad inmunológica de H11,
donde el polipéptido codifica al menos 5 aminoácidos de una cadena V
H de H11 como se ilustra en la SEC ID Nº 2. La secuencia de
polinucleótidos puede ser similar a la ilustrada en la SEC ID Nº 1
o la SEC ID Nº 4 con cambios diseñados para optimizar el uso de
codón, estabilidad, facilitar la clonación, o cualquier otro
propósito. Está dentro del conocimiento de la técnica, dada la
secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 5,
diseñar tales polinucleótidos. Los polinucleótidos preferidos
codifican al menos cinco aminoácidos de una CDR de H11.
La invención también incluye polinucleótidos que
codifican variantes funcionalmente equivalentes y derivados de H11
y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden
mejorar, disminuir o no afectar de forma significativa a las
propiedades de los polipéptidos codificados de este modo. Estas
variantes, derivados y fragmentos funcionalmente equivalentes
muestran la capacidad de reconocer específicamente el antígeno C.
Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no cambian la
secuencia de aminoácidos codificada, así como los que dan como
resultado sustituciones conservativas de restos aminoacídicos, una o
unas pocas deleciones o adiciones de aminoácidos, y sustitución de
restos de aminoácidos por análogos de aminoácidos son los que no
afectarán de forma significativa a las propiedades del polipéptido
codificado. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son
glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina;
ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina;
lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano.
Los polinucleótidos de la invención pueden
comprender secuencias adicionales, tales como secuencias
codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transición,
elementos de control tales como promotores, sitios de unión a
ribosomas, y sitios de poliadenilación, unidades de transcripción
adicionales bajo el control del mismo promotor o uno diferente,
secuencias que permiten la clonación, expresión y transformación de
una célula hospedadora, y cualquiera de tales construcciones como
puede ser deseable para proporcionar la realización de esta
invención.
La invención incluye un polinucleótido de al
menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente
al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más preferiblemente al
menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, más
preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos
consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50
nucleótidos consecutivos, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 75 nucleótidos, todavía más preferiblemente al
menos aproximadamente 100 nucleótidos, todavía más preferiblemente
al menos aproximadamente 200 nucleótidos, y aún más preferiblemente
al menos aproximadamente 300 nucleótidos que forman un híbrido
estable con un polinucleótido que codifica la región V de cadena L o
cadena H de H11, pero sin otras regiones codificantes de
inmunoglobulinas conocidas en el momento de presentar esta
solicitud. Se puede usar cualquier conjunto de condiciones para
este ensayo, siempre que exista al menos un conjunto de condiciones
en el que el polinucleótido de ensayo demuestre la especificidad
requerida. Preferiblemente, las secuencias que codifican H11 a las
que se une el polinucleótido de ensayo son las mostradas en la SEC
ID Nº 4. Ya que las secuencias de inmunoglobulina conocidas entran
dentro de una jerarquía de similitud con H11, el ensayo se puede
realizar comparando la hibridación del polinucleótido de ensayo con
la secuencia de H11 con la hibridación con las secuencias más
claramente relacionadas. Se prefiere un panel de aproximadamente 10
de las secuencias más claramente relacionadas con las SEC ID Nº: 1,
3, ó 5.
Se pueden realizar reacciones de hibridación en
condiciones de "rigurosidad" diferente. Se conocen bien
condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de
hibridación. Véase, por ejemplo, Sambrook y Maniatis. Los ejemplos
de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad
creciente): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC;
concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC
(donde SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y su equivalente
usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida del
0%, del 25%, del 50% y del 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a
24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempo de incubación de
lavado de 1, 2 ó 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x
SSC, 0,1 x SCC o agua
desionizada.
desionizada.
Se pueden identificar polinucleótidos H11 útiles
que codifican fragmentos de H11 generando fragmentos de
polinucleótidos de H11 (basándose en la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 4;
por ejemplo) y ensayando los polipéptidos codificados de este modo
para una función de interés. Alternativamente, el fragmento
polipeptídico codificado por un polinucleótido particular se puede
preparar y ensayar para una función de interés. Alternativamente,
dado un polipéptido \alphaC con propiedades deseables, se pueden
diseñar polinucleótidos que codifiquen el polipéptido.
Incluidos en todas estas realizaciones están
polinucleótidos con regiones codificantes para polímeros H11,
proteínas de fusión, inmunoglobulinas humanizadas, regiones V de
cadena única, y otros polipéptidos particulares de interés. Estos
polipéptidos se han descrito anteriormente.
La invención también proporciona polinucleótidos
unidos covalentemtente a un marcador detectable. Tales
polinucleótidos son útiles, por ejemplo, como sondas para la
detección de secuencias de nucleótidos relacionadas.
Los polinucleótidos de esta invención se pueden
obtener usando síntesis química, métodos de clonación recombinante,
PCR, o cualquier combinación de los mismos. Los métodos de síntesis
de polinucleótidos química se conocen en la técnica y no se
necesitan describir con detalle la presente memoria. Un especialista
en la técnica puede usar los datos de secuencia proporcionados en
la presente memoria para obtener un polinucleótido deseado empleando
un sintetizador de ADN o haciendo un pedido de un servicio
disponible en el mercado.
Alternativamente se pueden obtener secuencias de
polinucleótidos \alphaC a partir de una línea celular productora
de anticuerpo \alphaC, vector de clonación de \alphaC, o vector
de expresión de \alphaC. Se pueden aislar, amplificar, y procesar
ARN o ADN que codifiquen la secuencia deseada mediante técnicas
recombinantes convencionales. Tales técnicas incluyen digestión con
nucleasas de restricción, y amplificación por reacción en cadena de
polimerasa (PCR) o una combinación adecuada de las mismas. La
tecnología de PCR se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº
4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202, así como en PCR: The
Polymerase Chain Reaction. Mullis et al. eds., Birkauswer
Press, Boston (1994).
Se pueden insertar polinucleótidos que
comprenden una secuencia deseada en un vector adecuado y el vector,
a su vez, se puede introducir en una célula hospedadora adecuada
para la replicación y amplificación. Se pueden introducir
polinucleótidos en células hospedadoras mediante cualquier medio
conocido en la técnica. Se transforman las células introduciendo un
polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis,
transfección, apareamiento f o electroporación. Una vez
introducido, el polinucleótido exógeno se puede mantener dentro de
la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o
integrado en el genoma de la célula hospedadora. Se puede aislar
ADN amplificado de la célula hospedadora mediante métodos
convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989).
También se puede obtener ARN de la célula hospedadora transformada,
o se puede obtener directamente del ADN usando una polimerasa de
ARN dependiente de ADN.
La presente invención incluye adicionalmente una
diversidad de vectores que comprenden un polinucleótido H11. Estos
vectores se pueden usar para expresión de polipéptidos
recombinantes, también son una fuente de polinucleótidos H11. Se
pueden usar vectores de clonación para obtener copias por duplicado
de los polinucleótidos H11 que contienen, o como un medio para
almacenar los polinucleótidos en un depósito para la recuperación
futura. Se pueden usar vectores de expresión (y células
hospedadoras que contienen estos vectores de expresión) para
obtener polipéptidos producidos a partir de los polinucleótidos que
contienen. También se pueden usar cuando sea deseable expresar H11
en un individuo, y por tanto, tenga células intactas capaces de
sintetizar el polipéptido, tal como en terapia génica. Los vectores
de clonación y expresión adecuados incluyen cualquiera conocido en
la técnica, por ejemplo, aquellos para el uso de sistemas de
expresión bacterianos, de mamífero, de levadura y de insecto. Se
conocen vectores específicos y células hospedadoras adecuadas en la
técnica y no se describen con detalle en la presente memoria.
Véase, por ejemplo, Gacesa y Ramji, Vectors, John Wiley & Sons
(1994).
Los vectores de clonación y expresión contienen
típicamente un marcador de selección (por ejemplo, un gen que
codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el
crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector),
aunque un gen marcador de este tipo se puede llevar sobre otra
secuencia polionucleotídica co-introducida en la
célula hospedadora. Solamente estas células hospedadoras en las que
se ha introducido un gen de selección crecerán en condiciones de
selección. Los genes de selección típicos: (a) confieren resistencia
a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina,
metotrexato; (b) complementan las deficiencias autotróficas; o (c)
suministran nutrientes críticos no disponibles a partir del medio
complejo. La selección del gen marcador apropiado dependerá de la
célula hospedadora, y se conocen genes apropiados para diferentes
hospedadores en la técnica. Los vectores también contienen
típicamente un sistema de replicación reconocido por el
hospedador.
Se pueden construir vectores de clonación
adecuados de acuerdo con técnicas convencionales, o se pueden
seleccionar de un gran número de vectores de clonación disponibles
en la técnica. Mientras que el vector de clonación seleccionado
puede variar de acuerdo con la célula hospedadora cuyo uso se
pretende, los vectores de clonación tendrán generalmente la
capacidad de autoreplicación, pueden poseer una única diana para una
endonucleasa de restricción particular, o pueden llevar genes
marcadores. Los ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus
bacterianos, por ejemplo, pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1,
pCR1, RP4, AND de fagos, y vectores lanzadera tales como pSA3 y
pAT28. Estos y otros vectores de clonación están disponibles de
distribuidores comerciales tales como BioRsd, Stratagene, e
Invitrogen.
Los vectores de expresión generalmente son
construcciones polinucleotídicas de réplica que contienen un
polinucleótido que codifica un polipéptido \alphaC de interés. El
polinucleótido que codifica el polipéptido \alphaC está unido de
forma funcional a elementos controladores de la transcripción
adecuados, tales como promotores, potenciadores y terminadores.
Para la expresión (es decir, traducción), también se requieren
habitualmente uno o más elementos de control de la traducción,
tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de inicio de la
traducción, y codones de terminación. Estos elementos de control
(transcripcionales y transducionales) se pueden obtener del gen H11
o ser heterólogos (es decir, obtenerse de otros genes u otros
organismos). Una secuencia polionucleotídica que codifica un
péptido señal también se puede incluir para permitir que un
polipéptido \alphaC atraviese o se aloje en membranas celulares o
se secrete de la célula. En la técnica se conocen varios vectores
de expresión adecuados para la expresión en células eucariotas
incluyendo células de levadura, aviares, y de mamífero. Un ejemplo
del vector de expresión es pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), en el
que la transcripción se dirige por el promotor/potenciador temprano
de citomegalovirus (CMV). Este vector también contiene sitios de
reconocimiento para múltiples enzimas de restricción para la
inserción de un polinucleótido \alphaC de interés. Otro ejemplo
de un vector de expresión (sistema) es el sistema de
baculovirus/insecto.
También se incluyen en la invención sistemas de
expresión adecuados para usar en la terapia génica dirigida a
anticuerpos que comprenden un polinucleótido \alphaC. Se describen
sistemas adecuados, por ejemplo, por Brown et al. Virol.
198:477-48 8; y Miyamura et al. (1994) Proc.
Natl. Acad Sci. USA 91:8507-8511.
Los vectores que contienen los polinucleótidos
de interés se pueden introducir en la célula hospedadora mediante
cualquiera de varios medios apropiados, incluyendo electroporación,
transfección empleando cloruro cálcico, cloruro de rubidio, fosfato
cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo
con microproyectiles; lipofección; e infección (donde el vector es
un agente infeccioso, tal como virus vaccinia, que se describe a
continuación). La selección de introducir vectores o
polinucleótidos \alphaC dependerá a menudo de las características
de la célula hospedadora.
Una vez introducida en una célula hospedadora
adecuada, la expresión de un polipéptido \alphaC se puede
determinar usando cualquier ensayo conocido en la técnica. Por
ejemplo, la presencia del polipéptido \alphaC se puede detectar
por RIA o ELISA del sobrenadante de cultivo (si se secreta el
polipéptido H11) o lisados celulares.
Un vector de expresión particularmente útil para
los polinucleótidos H11 es un virus vaccinia que comprende una
secuencia polionucleotídica de H11, que también se puede usar en
preparaciones de vacunas. Moss (1991) Science
252:1662-1667. Para introducir secuencias
polionucleotídicas que codifican en el polipéptido H11, incluyendo
los fragmentos de polipéptido H11, en vacunas, la secuencia
polionucleotídica de interés se inserta en primer lugar en un
plásmido que contiene un promotor del virus vaccinia con secuencias
flanqueantes homólogas al ADN vaccinia no requerido para la
aplicación. Después, las células que contienen plásmido se infectan
con vaccinia, que conduce a un bajo nivel de recombinación homóloga
entre los plásmidos y el virus, con transferencia resultante del
promotor de vaccinia y la secuencia polionucleotídica que codifica
el polipéptido H11 en el genoma del virus vaccinia. Típicamente, el
polionucleótido H11 se inserta en el gen TK (timidina kinasa) viral.
La inserción en el sitio TK atenúa el virus en más de 10.000 veces
en comparación con el tipo silvestre. Flexner et al. (1980)
Vaccine 88 (Cold Spring Harbor Laboratory), págs.
179-184. Se identifica el virus recombinante por el
fenotipo TK. Preferiblemente, la expresión del polinucleótido H11
está bajo control del promotor temprano/tardío de vaccinia (7,5 K),
por lo que los polipéptidos H11 resultantes se pueden expresar en
células infectadas a lo largo del ciclo de vida del virus. Sin
embargo, se pueden usar otros promotores conocidos en la técnica,
tales como pH6, o promotores sintéticos. La expresión del
polipéptido H11 se produce en células infectadas con el virus
vaccinia recombinante o individuos inmunizados con el virus vaccinia
recombinante vivo. Se pueden usar una cualquiera de varias cepas de
vaccinia, incluyendo, pero sin limitación, WR, ALVAC, y NYVAC.
Un vector de esta invención puede contener uno o
más polinucleótidos que codifican un polipéptido \alphaC. También
puede contener secuencias polionucleotídicas que codifican otros
polipéptidos que mejoran, facilitan, o modulan el resultado
deseado, tales como linfocinas, incluyendo, pero sin limitación
IL-2, IL-4, GM-CSF,
TNF-\alpha, e IFN-\gamma. Una
linfocina preferida es GM-CSF. Las construcciones
GM-CSF preferidas son las que se han delecionado
para los elementos ricos en AU de las regiones no traducidas 3' y
las secuencias en la región no traducida 5' que son capaces de
formar un bucle. También se realizan en esta invención vectores
vaccinia que codifican para variantes \alphaC recombinantes, tales
como scFv, quimeras y polímeros.
Otras realizaciones de esta invención son
células hospedadoras transformadas con polinucleótidos \alphaC y
vectores que comprenden secuencias polionucleotídicas de \alphaC
como se han descrito anteriormente. Se pueden usar tanto células
hospedadoras procariotas como eucariotas. Los hospedadores
procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo, E.
coli y Mycobacteria. Entre los hospedadores eucariotas
están las células de levadura, de insecto, aviares, vegetales y de
mamífero. Los sistemas hospedadotes se conocen en la técnica y no
necesitan ser descritos con detalle en la presente memoria. Los
ejemplos de células hospedadoras de mamífero incluyen CHO y NSO,
que se pueden obtener de la Colección Europea de Cultivos Celulares
(Inglaterra). La transfección de células NSO con un plásmido, por
ejemplo, que se dirige por un promotor de CMV seguido por
amplificación desde el plásmido usando glutaminas sintetasa
proporciona un sistema útil para la producción de proteínas.
Cockett et al. (1990) Bio/Technology
8:662-667.
Las células hospedadoras de esta invención se
pueden usar, entre otras cosas, como depósitos de polinucleótidos
\alphaC o como vehículos para la producción de polinucleótidos y
polipéptidos \alphaC. También se pueden usar como vehículos para
la expresión in vivo de polipéptidos \alphaC. Los
polinucleótidos H11 de esta invención se pueden usar en sistemas de
expresión para producir polipéptidos H11, H11 intacto o formas
recombinantes de H11, tal como se describe a continuación.
Los polinucléotidos de esta invención tienen
varios usos. Son útiles, por ejemplo, en sistemas de expresión para
la producción de \alphaC. También son útiles en sondas de
hibridación para ensayar para la presencia de polinucleótidos
\alphaC o secuencias relacionadas en una muestra usando métodos
bien conocidos por los especialistas en la técnica. Además, los
polinucleótidos también son útiles como cebadores para realizar la
amplificación de polinucleótidos deseados. Los polinucleótidos de
esta invención también son útiles en composiciones farmacéuticas
incluyendo vacunas y para la terapia génica.
Los polinucleótidos también se pueden usar como
sondas de hibridación para la detección de secuencias que codifican
\alphaC. Las muestras adecuadas incluyen células transformadas
ex vivo para el uso en terapia génica. En una ilustración,
se extrae ADN o ARN de una muestra, y se procesa opcionalmente sobre
un gel y/o se digiere con endonucleasas de restricción. El
polinucleótido de muestra procesado se transfiere típicamente a un
medio adecuado para lavado. El polinucleótido de muestra se pone
después en contacto con la sonda de polinucleótido H11 en
condiciones que permiten que se forme un dúplex estable si la
muestra contiene una secuencia \alphaC coincidente. Se detecta
cualquier dúplex que está deformado mediante cualquier medio
adecuado. Por ejemplo, la sonda de polinucleótido \alphaC se
puede suministrar de forma marcada, y el marcador remanente con la
muestra después de lavado reflejará directamente la cantidad de
dúplex estable formado. En una segunda ilustración, la hibridación
se realiza in situ. A una muestra tisular preparada de forma
adecuada se superpone una zona marcada para indicar la localización
de secuencias que codifican \alphaC.
También se puede usar un polinucleótido
\alphaC corto como un cebador para una reacción de PCR,
particularmente para amplificar una secuencia más larga que
comprende una región que hibrida con el cebador. Esto se puede
realizar de forma preparativa, para producir polinucleótidos para la
manipulación genética adicional. También se puede realizar de forma
analítica, para determinar si está presente un polinucleótido que
codifica \alphaC, por ejemplo, en una muestra de interés
diagnóstico.
Otro uso de los polinucleótidos es en vacunas y
en terapia génica. El principio general es administrar el
polinucleótido de tal forma que promueva o atenúe la expresión del
polipéptido codificado en el mismo. Por tanto, la presente
invención incluye métodos para inducir una respuesta inmune y
métodos para el tratamiento que comprende la administración de una
cantidad eficaz de polinucleótidos \alphaC a un individuo. En
estos métodos, un polinucleótido \alphaC que codifica un
polipéptido \alphaC se administra a un individuo directamente o
por células transfectadas con el polinucleótido \alphaC.
Preferiblemente, el polinucleótido \alphaC está en la forma de un
plásmido circular, preferiblemente en una configuración súper
enrollada. Preferiblemente, el polinucleótido \alphaC se replica
en el interior de una célula. Por tanto, el polinucleótido \alphaC
está unido de forma funcional a un promotor adecuado, tal como un
promotor heterólogo que es intrínsecamente activo en células del
tipo tisular diana. Preferiblemente, una vez que están en los
núcleos de las células, los plásmidos persisten como moléculas
episódicas circulares sin replicación. Se puede realizar la mutación
in vitro con construcciones de plásmido para codificar, por
ejemplo, moléculas con mayor afinidad y/o avidez.
Para determinar si los plásmidos que contienen
polinucleótidos \alphaC son capaces de la expresión \alphaC en
células eucariotas, las células, tales como COS-7,
CHO, o HeLa se pueden transfectar con los plásmidos. Después se
determina la expresión \alphaC por inmunoensayo; por ejemplo, por
transferencia de Western. Se pueden detectar polipéptidos \alphaC
más pequeños, por ejemplo, construyendo el plásmido de tal forma que
el polipéptido \alphaC resultante se fusione con un marcado, tal
como un epítopo diana o un marcador enzimático. Se puede conseguir
la caracterización adicional del polipéptido \alphaC expresado
purificando el péptido y realizando después uno de los ensayos
funcionales que se describen en la presente memoria.
En un modo de terapia génica, los
polinucleótidos de esta invención se usan para alterar genéticamente
células ex vivo. En esta estrategia, las células retiradas
de un donante u obtenidas de una línea celular se transfectan o
transducen con vectores que codifican un polipéptido \alphaC y
después se administran a un receptor. Las células adecuadas para la
transfección incluyen células mononucleares de sangre
periférica.
En otro modo de terapia génica, los
polinucleótidos de esta invención se usan para alterar genéticamente
células in vivo. El propósito incluye pero sin limitación,
tratar diversos tipos de cáncer.
Los polipéptidos \alphaC se pueden
caracterizar de varios modos. Por ejemplo, un polipéptido \alphaC
se puede ensayar para su capacidad de unirse específicamente a
células cancerosas y para su capacidad de inhibir específicamente
la unión entre células cancerosas y H11 intacto. Un polipéptido
\alphaC también puede reaccionar con polipéptidos
anti-CDR3. Los polipéptidos \alphaC también se
pueden ensayar para su capacidad de paliar o mitigar enfermedades
neoplásicas, tales como carcinomas. Se entiende que solamente
necesita estar presente una de estas propiedades para que un
polipéptido entre dentro del alcance de esta invención, aunque
preferiblemente están presentes más de una de estas
propiedades.
La capacidad de un polipéptido \alphaC para
unirse a células cancerosas o fracciones antigénicas de las mismas
se puede ensayar mediante inmunoensayo. Es adecuada cualquier forma
de ensayo de unión directa. En uno de tales ensayos, la célula
cancerosa o el supuesto polipéptido \alphaC se marca. Los
marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{125}I,
enzimas tales como peroxidasa, marcadores fluorescentes tales como
fluoresceína y marcadores quimioluminiscentes. Típicamente, el otro
compañero de unión se insolubiliza (por ejemplo, por recubrimiento
sobre una placa de microtitulación) para facilitar el lavado.
Después de combinar el componente marcado con el componente
insolubilizado, la fase sólida se lava y se determina la cantidad
del marcador unido. Otro de tales ensayos es un ensayo de tipo
sándwich, en el que se captura el supuesto polipéptido \alphaC
por una primera anti-inmunoglobulina sobre una fase
sólida y se desarrolla con un anticuerpo \alphaC. En cada uno de
sus ejemplos, el alcance de la unión de \alphaC está directamente
relacionado con la cantidad de marcador unido a la fase sólida.
Para realizar los ensayos de inhibición, el
supuesto polipéptido \alphaC se titula para su capacidad de
disminuir la unión de H11 a células cancerosas. Cada una de las
parejas de unión en la reacción que se tiene que inhibir está
marcada, mientras que la otra se insolubiliza típicamente para
facilitar el lavado. El supuesto polipéptido \alphaC se mezcla
típicamente con el componente marcado y después se combina la mezcla
con la fase sólida. Los polipéptidos con las características de H11
disminuirán de forma proporcional la cantidad de marcador unido a
la fase sólida, en comparación con los polipéptidos de control. Este
ensayo puede ser más sensible que la medición de la unión directa,
ya que la menor interacción de afinidad entre \alphaC y antígeno
C puede ser demasiado débil para formar un enlace estable, pero
adecua-
da para interferir con la unión del otro par de ligando-receptor cuando está presente en una concentración suficiente.
da para interferir con la unión del otro par de ligando-receptor cuando está presente en una concentración suficiente.
La presente invención incluye composiciones
farmacéuticas y composiciones inmunogénicas que contienen \alphaC
solo o en combinación. Tales composiciones farmacéuticas y vacunas
son útiles para suscitar una respuesta inmune y tratar enfermedades
neoplásicas, solas o junto con otras formas de terapia, tales como
quimioterapia o radioterapia.
La preparación de composiciones farmacéuticas
que contienen anticuerpo \alphaC, o un polinucleótido o un
polipéptido obtenido del mismo como un ingrediente activo se realiza
de acuerdo con procedimientos generalmente aceptados para la
preparación de preparaciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª Edición (1990), E.W. Martin
ed., Mack Publishing Co., PA. Dependiendo del uso pretendido y del
modo de administración, puede ser deseable procesar el ingrediente
activo de forma adicional en la preparación de composiciones
farmacéuticas. El procesamiento adecuado puede incluir
esterilización, mezclado con componentes apropiados no tóxicos y
que no interfieren, división en dosis unitarias, e inclusión en un
dispositivo de suministro.
Las composiciones líquidas farmacéuticamente
aceptables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo y
dispersando un polipéptido realizado en la presente memoria en un
excipiente líquido, tal como agua, solución salina, dextrosa
acuosa, glicerol o etanol. La composición también puede contener
otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, adyuvantes,
soportes, y sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o
emulsionantes, y agentes de tamponamiento del pH.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se suministran por un modo apropiado para la forma de la
composición. Las vías típicas incluyen la subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal, intradérmica, oral, intranasal e intrapulmorar (es
decir, por aerosol). Las composiciones farmacéuticas de esta
invención para uso humano se administran típicamente por una vía
parenteral, más típicamente intracutánea, subcutánea e
intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas para
administración oral, o administración tópica se pueden suministrar
en forma sólida, semi sólida o líquida, incluyendo comprimidos,
cápsulas, polvos, líquidos y suspensiones. Las composiciones para
inyección se pueden suministrar como soluciones o suspensiones
líquidas, como emulsiones o como formas sólidas adecuadas para la
disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. Para la
administración por el tracto respiratorio, una composición preferida
es una que proporcione un aerosol sólido, en polvo o líquido,
cuando se usa en un dispositivo de aerosol apropiado. Aunque no se
requiere, las composiciones farmacéuticas se suministran
preferiblemente en una forma de dosificación unitaria adecuada para
la administración de una cantidad precisa. Esta invención también
contempla formas de liberación lenta o de liberación sostenida, por
las que se proporciona un nivel relativamente uniforme del compuesto
activo a lo largo de un periodo prolongado.
Las composiciones realizadas en esta invención
se pueden evaluar para su capacidad de reconocer específicamente
una neoplasia. En consecuencia, se preparan compuestos de ensayo
como una composición farmacéutica adecuada y se administran a
sujetos de ensayo. Se realizan estudios iniciales preferiblemente en
animales pequeños tales como ratones o conejos, opcionalmente en
siguiente lugar en primates no humanos y finalmente en seres
humanos. La inmunogenecidad se ensaya preferiblemente en individuos
sin una respuesta de anticuerpos previa. Se administra una
composición de ensayo en una dosis apropiada en un protocolo de
tratamiento apropiado. Puede ser apropiado comparar diferentes
dosis y protocolos dentro del intervalo predicho. Tal ensayo está
dentro del conocimiento de la técnica.
Las composiciones de esta invención son
particularmente adecuadas para la administración a seres humanos con
una enfermedad neoplásica. Son especialmente relevantes melanoma,
neuroblastoma, glioma, sarcoma, linfoma y cáncer pulmonar
microcítico.
También se incluyen en esta invención métodos
para tratar el cáncer. Los métodos comprenden administrar una
cantidad de una composición farmacéutica que contiene \alphaC para
conseguir el efecto deseado, para la paliación de una masa tumoral
existente o para prevenir la recurrencia. Para el tratamiento del
cáncer, la cantidad de una composición farmacéutica administrada es
una cantidad eficaz para producir el efecto deseado. Se puede
proporcionar una cantidad eficaz en una o en una serie de
administraciones.
La cantidad eficaz de fragmentos de unión a
antígeno de \alphaC que se tiene que administrar dependerá de
varios factores, tales como la vía de administración, el estado del
individuo y el objetivo deseado. La expresión "terapéuticamente
eficaz" quiere decir que la cantidad de fragmento de unión a
antígenos usada, es una cantidad suficiente para mitigar el cáncer.
"Mitigar" indica una disminución del efecto perjudicial del
cáncer sobre el individuo. Típicamente si se administra
directamente, la cantidad por administración es de aproximadamente
10 \mug a 20 mg, preferiblemente de 250 \mug a 10 mg, más
preferiblemente de 300 \mug a 5 mg, aún más preferiblemente de
500 \mug a 2,5 mg. Las administraciones se realizan típicamente en
una base semanal o bisemanal hasta que se detecte un parámetro
deseado medible, tal como disminución de los síntomas de la
enfermedad. Entonces se puede continuar la administración en una
base de menor frecuencia, tal como quincenalmente o mensualmente,
si es apropiado.
Las diversas composiciones de esta invención se
pueden usar solas o junto con otros agentes activos que promuevan
el objetivo deseado o proporcionen una terapia de adyuvante. Los
agentes activos deseados incluyen los fármacos
anti-neoplásicos y modificadores de respuesta
biológica que se han descrito anteriormente y células efectoras
como las descritas por Douillar et al. (1986) Hybridomas
(Supp. 1:5139).
Cuando se usa para la inmunoterapia, \alphaC
puede estar no marcado o marcado con un agente terapéutico como se
ha descrito anteriormente. Esos agentes se pueden acoplar directa o
indirectamente a los polipéptidos de la invención. Un ejemplo de
acoplamiento indirecto es por el uso de un resto espaciador. Estos
restos espaciadores, a su vez, pueden ser insolubles o solubles
(Diener et al. (1986) Science 231:148) y se pueden
seleccionar para permitir la liberación del fármaco de \alphaC al
sitio diana. Alternativamente, se pueden traducir, sintetizar,
ligar o producir de otro modo un \alphaC y un agente terapéutico
como una molécula única que tenga funciones tanto de \alphaC como
de agente terapéutico. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se
pueden acoplar a \alphaC para la inmunoterapia, incluyen pero sin
limitación, modificadores de la respuesta biológica, fármacos,
radioisótopos, lectinas y toxinas. Los modificadores de la respuesta
biológica incluyen linfocinas que incluyen, pero sin limitación,
factor de necrosis tumoral, interleucinas 1, 2, y 3, linfotoxina,
factor de activación de macrófagos, factor de inhibición de
migración y factor de estimulación de colonias e interferón. Los
interferones con los que se pueden marcar \alphaC incluyen
interferón \alpha, interferón \beta e interferón \gamma
(IFN-\gamma) y sus subtipos.
Al usar \alphaC conjugado de forma
radioisotópica para la inmunoterapia, determinados isotipos pueden
ser más preferibles que otros dependiendo de factores tales como la
distribución de leucocitos así como la estabilidad y emisión de
isotipos. Si se desea, se puede evaluar la distribución de células
malignas por las técnicas de diagnóstico in vivo que se
describen a continuación. Dependiendo de la malignidad, algunos
emisores pueden ser preferibles con respecto a otros. En general,
se prefieren radioisótopos emisores de partículas alfa y beta en
inmunoterapia. Por ejemplo, si un animal tiene focos de tumor
salida, como en un carcinoma, puede ser preferible un emisor beta
de alta energía capaz de penetrar varios milímetros en el tejido,
tal como ^{90} Y. Por otro lado, si la malignidad consiste en
células diana simples, como el caso de la leucemia, puede ser
preferible un emisor alfa de alta energía de intervalo corto, tal
como ^{212}Bi. Los radioisótopos que se pueden unir a los
fragmentos de unión a antígeno de la invención para propósitos
terapéuticos, incluyen pero sin limitación, ^{125}I, ^{131}I,
^{90}Y, ^{67}Cu, ^{212}Bi, ^{211}At, ^{212} Pb, ^{47}Sc,
^{109}Pd, y ^{188}Re.
Las lectinas son proteínas, aisladas
habitualmente de material vegetal, que se unen a restos de azúcares
específicos. Muchas lectinas también son capaces de aglutinar
células y estimular linfocitos. Sin embargo, la ricina es una
lectina tóxica que se ha usado inmunoterapéuticamente. Esto se
consigue preferiblemente uniendo la cadena de péptido alfa de la
ricina, que es responsable de la toxicidad, a la molécula de
anticuerpo para permitir el suministro específico de sitio del
efecto tóxico.
Las toxinas son sustancias venenosas producidas
por plantas, animales, o microorganismos que, en una dosis
suficiente a menudo son letales. La toxina diftérica es una
sustancia producida por Corynebacterium diphtheria que se
puede usar terapéuticamente. Esta toxina consiste en una subunidad
alfa y beta que se pueden separar en condiciones apropiadas. El
componente de cadena A tóxico se puede unir a un anticuerpo y se
puede usar para el suministro específico de sitio a una célula
neoplásica.
Por tanto, por ejemplo, se puede usar \alphaC
en combinación con interferón-alfa. Esta modalidad
de tratamiento mejora la dirección de Mab de melanomas aumentando
la expresión de antígeno reactivo a Mab por la célula de melanoma.
Greiner et al. (1987) Science 235:895. Alternativamente, se
podría usar \alphaC, por ejemplo, en combinación con
IFN-\alpha para activar e incrementar de este
modo la expresión de receptores Fc por células efectoras, que a su
vez, da como resultado una unión mejorada de los fragmentos de unión
a antígeno a la célula efectora y la inactivación de células
malignas diana. Los especialistas en la técnica serán capaces de
seleccionar los diversos modificadores de la respuesta biológica
para crear una función efectora deseada que mejore la eficacia de
\alphaC.
Cuando se usa \alphaC con diversos agentes
terapéuticos, tales como los que se describen en la presente
memoria, la administración de ambos se produce habitualmente de
forma sustancialmente simultánea. La expresión "de forma
sustancialmente simultánea" quiere decir que se administran
razonablemente juntos entre sí con respecto al tiempo.
Habitualmente se prefiere administrar el agente terapéutico antes
que \alphaC. Por ejemplo, el agente terapéutico se puede
administrar 1 a 6 días antes del \alphaC. La administración del
agente terapéutico puede ser diaria, o en cualquier otro intervalo
adecuado, dependiendo de factores tales como, por ejemplo, la
naturaleza de la neoplasia, el estado del paciente y la vida media
del agente.
Al usar \alphaC es posible diseñar terapias de
combinación. Puede ser deseable administrar un agente terapéutico o
agentes antes de la administración de \alphaC en combinación con
células efectoras y los mismos agentes terapéuticos o diferentes.
Por ejemplo, se pueden tratar pacientes administrando en primer
lugar IFN-\alpha e interleucina-2
(IL-2) diariamente durante 3 a 5 días, y administrar
\alphaC el día 5 en combinación con células efectoras,
IFN-\alpha e IL-2.
La presente invención también incluye el uso de
liposomas con \alphaC unido a membrana para suministrar
específicamente el liposoma al área de las células tumorales o
neoplásicas que expresan el antígeno \alphaC. Estos liposomas se
pueden producir de tal forma que contengan, además de \alphaC
agentes inmuno terapéuticos tales como los que se han descrito
anteriormente que, después se liberarían en el sitio de la de
neoplasia. Wolff et al. (1984) Biochem. Biophys. Acta
802:259. Otro de tales sistemas de suministro de este tipo descrito
por Brown et al. (1994) Virology 198:477-488;
y Miyamura et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:
8507-8511 utiliza cápsidas de parvovirus de B19
quiméricas para la presentación de los fragmentos de unión a
antígeno. Tales sistemas quiméricos están incluidos para el uso en
los métodos reivindicados.
Los intervalos de dosificación para la
administración de \alphaC son los que son suficientemente grandes
para producir el efecto deseado para que se mitiguen los síntomas de
la enfermedad neoplásica sin provocar efectos secundarios
innecesarios tales como reacciones cruzadas indeseadas, reacciones
anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosificación variará
con la edad, el estado, el sexo del paciente y el alcance de la
enfermedad y se puede determinar por el especialista en la técnica.
La dosificación se puede ajustar por el médico individual en el
caso de cualquier complicación. La dosificación puede variar de
aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2.000 mg/kg,
preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 500
mg/kg, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante
uno o varios días. Generalmente, cuando se administra \alphaC
conjugado con agentes terapéuticos, se pueden usar dosificaciones
menores, en comparación con las usadas para la formación de
imágenes de inmunodiagnóstico in vivo.
Las composiciones terapéuticas de \alphaC se
pueden administrar por inyección o por perfusión gradual. Los
fragmentos de unión a antígeno de \alphaC se pueden administrar
por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía
intramuscular, por vía subcutánea, por vía intracavitaria, por vía
intratecal o por vía transdérmica solos o en combinación con
células efectoras.
Otro método de administración es por vía
intralesional, por ejemplo por inyección directa directamente en
el tumor. La administración intralesional de diversas formas de
inmunoterapia con pacientes con cáncer no provoca la toxicidad
observada con la administración sistémica de agentes inmunológicos.
Fletcher et al. (1987) Lymphokine Res. 6:45; Rabinowich
et al. (1987) Cancer Res. 47:173; Rosenberg et al.
(1989) Science 233:1318; y Pizz et al. (1984) Int. J. Cancer
34:359.
\alphaC es particularmente adecuado para el
uso para el tratamiento y la formación de imágenes de cáncer
cerebral. Cuando el sitio de suministro está en el cerebro, el
agente terapéutico tiene que ser capaz de ser suministrado al
cerebro. La barrera hematoencefálica limita la captación de muchos
agentes terapéuticos al cerebro y la médula espinal desde la
circulación general. Las moléculas que cruzan la barrera
hematoencefálica usan dos mecanismos principales: difusión libre; y
transporte facilitado. Debido a la presencia de la barrera
hematoencefálica, la consecución de concentraciones beneficiosas de
un agente terapéutico dado en el SNC puede requerir el uso de
estrategias de suministro de fármaco específicas. El suministro de
agentes terapéuticos al SNC se puede conseguir mediante varios
métodos.
Un método se basa en técnicas neuroquirúrgicas.
En el caso de pacientes gravemente enfermos, la intervención
quirúrgica está garantizada a pesar de sus riesgos anexos. Por
ejemplo, se pueden suministrar agentes terapéuticos por
introducción física directa en el SNC, tal como por inyección
intraventricular, intralesional, o intratecal. La inyección
intraventricular se puede facilitar por un catéter intraventricular,
por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya.
También se proporcionan métodos de introducción por dispositivos
recargables o biodegradables. Otra estrategia es la interrupción de
la barrera hematoencefálica por sustancias que aumentan la
permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Los ejemplos incluyen
infusión intra-arterial de agentes que difunden
mal, tales como manitol, agentes farmacéuticos que aumentan la
permeabilidad cerebrovascular tales como etopósido, o agentes
vasoactivos tales como leucotrienos. Neuwelt and Rappoport (1984)
Fed. Proc. 43:214-219; Baba et al. (1991) J.
Cereb. Blood Flow Metab. 11:638-643; y Gennuso et
al. (1993) Cancer Invest. 11:638-643.
Además, puede ser deseable administrar las
composiciones localmente al área que necesita tratamiento: esto se
puede conseguir, por ejemplo, por infusión local durante la cirugía,
por inyección, mediante un catéter, o mediante un implante, siendo
dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso,
incluyendo membranas, tales como membranas silásticas o fibras. Una
membrana de ese tipo adecuada es Gliadel® proporcionada por
Guilford Pharmaceuticals Inc.
Otro método implica técnicas farmacológicas
tales como modificación o selección del \alphaC para proporcionar
un análogo que cruzará la barrera hematoencefálica. Los ejemplos
incluyen aumentar la hidrofobia de la molécula, disminuir la carga
neta o el peso molecular de la molécula, o modificar la molécula,
tal como para que se parezca a una transportada de forma normal a
través de la barrera hematoencefálica. Levin (1980) J. Med Chem.
23:682-684; Pardridge (1991) in: Peptide Drug
Delivery to the Brain; and Kostis et al. (1994) J. Clin.
Pharmacol. 34:989-996.
La encapsulación de \alphaC en un entorno
hidrófobo tal como liposomas también es eficaz para suministrar
fármacos al SNC. Por ejemplo, el documento WO 91/04014 describe un
sistema de suministro liposomal en el que se encapsula el fármaco
dentro de liposomas a los que se han añadido moléculas que se
transportan normalmente a través de la barrera
hematoencefálica.
Otro método para formular \alphaC para que
pase a través de la barrera hematoencefálica es encapsulación en
ciclodextina. Se puede emplear cualquier ciclodextrina adecuada que
pase a través de la barrera hematoencefálica, incluyendo, pero sin
limitación, \beta-ciclodextrina,
\gamma-ciclodextrina y derivados de las mismas.
Véase, de forma general, las Patentes de Estados Unidos Nº
5.017.566, 5.002.935 y 4.983.586. Tales composiciones también
pueden incluir un derivado de glicerol como se describe en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.153.179.
Otro método más usa la ventaja de técnicas
fisiológicas tales como conjugación de \alphaC con un agente
transportable para producir un \alphaC transportable quimérico
nuevo. Por ejemplo el análogo de tejido intestinal vasoactivo
(VIPa) ejerce sus efectos vasoactivos solamente después de la
conjugación con un Mab con el receptor de transferrina de molécula
de soporte específica, que facilita la captación del conjugado
VIPa-Mab a través de la barrera hematoencefálica.
Pardridge (1991); and Bickel et al. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:2618-2622. Se han identificado varios
sistemas de transporte específicos adicionales, los mismos incluyen,
pero sin limitación, aquellos para transferir insulina, o factores
de crecimiento similares a insulina I y II. Otros soportes adecuados
no específicos incluyen, pero sin limitación, piridinio, ácidos
grasos, inositol, colesterol, y derivados de glucosa. Se han
descrito determinados profármacos por los que, después de entrar en
el sistema nervioso central, se escinde el fármaco del soporte para
liberar el fármaco activo. Patente de Estados Unidos Nº
5.017.566.
Los sujetos adecuados incluyen aquellos de los
que se sospecha que están en riesgo de un efecto patológico de
cualquier neoplasia, particularmente carcinoma, y son adecuados para
el tratamiento con las composiciones farmacéuticas de esta
invención. Aquellos con un historial de cáncer son especialmente
adecuados. Los sujetos humanos adecuados para la terapia comprenden
dos grupos, que se pueden diferenciar por criterios clínicos. Los
pacientes con "enfermedad avanzada" o "alta carga de
tumor" son los que llevan un tumor clínicamente medible. Un
tumor clínicamente medible es uno que se puede detectar en base a la
masa tumoral (por ejemplo, por palpación, exploración TAC o Rayos
X; marcadores positivos bioquímicos o histopatológicos que por sí
mismo pueden ser insuficientes para identificar esta población).
Una composición farmacéutica realizada en esta invención se
administra a estos pacientes para suscitar una respuesta
anti-tumor con el objetivo de paliar su afección.
De forma ideal, la disminución de la masa tumoral se produce como un
resultado, pero una mejora clínica constituye un beneficio. La
mejora clínica incluye un riesgo o tasa de progresión disminuido o
disminución de consecuencias patológicas del tumor.
Un segundo grupo de sujetos adecuados se conoce
en la técnica como el "grupo adyuvante". Los mismos son
individuos que han tenido una historia de cáncer, pero que han
respondido a otro modo de terapia. La terapia anterior puede haber
incluido, pero sin restricción, resección quirúrgica, radioterapia,
y quimioterapia tradicional. Como un resultado, estos individuos no
tienen tumor clínicamente medible. Sin embargo, se sospecha que
están en riesgo de progresión de la enfermedad, cerca del sitio
original del tumor o por metástasis.
Este grupo se puede subdividir adicionalmente en
individuos de alto riesgo y bajo riesgo. La subdivisión se realiza
en la base de características observadas antes o después del
tratamiento inicial. Estas características se conocen en las
especialidades clínicas, y se definen de forma adecuada para cada
cáncer diferente. Las características típicas de subgrupos de alto
riesgo son aquéllas en las que el tumor ha invadido tejidos vecinos
y muestra implicación de nódulos linfáticos.
Otro grupo adecuado de sujetos es el que tiene
una predisposición genética a cáncer pero todavía no tiene signos
clínicos evidentes de cáncer. Por ejemplo, las mujeres que dan
positivo para una mutación genética asociada a cáncer de mama, pero
todavía están en edad reproductiva, pueden desear recibir de forma
profiláctica un tratamiento de \alphaC para evitar la aparición
de cáncer hasta que sea adecuado realizar cirugía preventiva.
Una composición farmacéutica realizada en esta
invención se administra a pacientes en el grupo adyuvante, como en
cada grupo de estos subgrupos para suscitar una respuesta
anti-cáncer. De forma ideal, la composición retrasa
la recurrencia del cáncer, o incluso mejor, disminuye el riesgo de
recurrencia (es decir, mejora la tasa de curación). Tales
parámetros se pueden determinar en comparación con otras poblaciones
de pacientes y otros modos de terapia.
Por supuesto, pueden suceder entrecruzamientos
entre estos dos grupos de pacientes, y las composiciones
farmacéuticas de esta invención se pueden administrar en cualquier
momento que sea apropiado. Por ejemplo, se puede realizar terapia
con \alphaC antes o durante la terapia tradicional de un paciente
con una alta carga de tumor, y se puede continuar después de que el
tumor se haya convertido en clínicamente indetectable. La terapia
con \alphaC se puede continuar con un paciente que ha entrado
inicialmente en el grupo adyuvante, pero que muestra signos de
recurrencia. El médico a cargo del caso tiene la decisión de
terminar cómo o cuándo se tienen que usar las composiciones de esta
invención.
Diversos compuestos y composiciones de esta
invención tienen otras indicaciones clínicas, de las cuales la
siguiente sección proporciona solamente una visión de conjunto.
Una indicación es el tratamiento de células
ex vivo. Esto puede ser deseable para propósitos
experimentales, o para el tratamiento de un individuo con una
enfermedad neoplásica. En un ejemplo se administra \alphaC a un
cultivo de células, tales como células de sangre periférica
obtenidas de un donante, o una línea celular adecuada.
Aproximadamente de 0,5 a 2 g/ml de H11 es una dosis eficaz para
este propósito. En un segundo ejemplo, se alteran genéticamente
células de donante con un vector de expresión de esta invención para
proporcionar la secreción continúa de \alphaC después de la
administración de las células al receptor.
Se pueden usar métodos para la detección in
vivo de células cancerosas. Se administra una cantidad
diagnósticamente eficaz de \alphaC marcado de forma detectable al
sujeto que necesita la formación de imágenes tumorales. La
expresión "diagnósticamente eficaz" quiere decir que la
cantidad de \alphaC marcado de forma detectable se administra de
forma suficiente para permitir la detección de la neoplasia.
La concentración de \alphaC marcado de forma
detectable que se administra debe ser suficiente de tal forma que
la unión a las células que tienen antígeno \alphaC sea detectable
comparado con el fondo. Además, es deseable que el \alphaC
marcado de forma detectable se elimine de forma rápida del sistema
circulatorio para proporcionar la mejor proporción de señal de
diana con respecto al fondo.
Como norma, la dosificación de \alphaC marcado
de forma detectable para el diagnóstico in vivo es
ligeramente específico para cada paciente y depende de factores
tales como la edad, el sexo, y el alcance de la enfermedad. La
dosificación de \alphaC puede variar de aproximadamente 0,01
mg/m^{2} a aproximadamente 500 mg/m^{2}, preferiblemente de
0,01 mg/m^{2} a aproximadamente 200 mg/m^{2}, más
preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/m^{2} a aproximadamente
10 mg/m^{2}. Tales dosificaciones pueden variar, por ejemplo,
dependiendo del número de inyecciones dadas, la carga de tumor, y
otros factores conocidos por los especialistas de la técnica. Por
ejemplo, se han marcado tumores in vivo usando Mab conjugados
con cianina. Ballou et al. (1995) Cancer Immunol.
Immunother. 41:257-263.
Para la formación de imágenes de diagnóstico
in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un
factor principal en la selección de un radioisótopo dado. El
radioisótopo seleccionado tiene que tener un tipo de
desintegración que sea detectable para un tipo dado de instrumento.
Otro factor importante más para seleccionar un radioisótopo para el
diagnóstico in vivo es que la vida media del radioisótopo
tiene que ser lo suficientemente larga de tal forma que todavía sea
detectable en el momento de la máxima captación por la diana, pero
lo suficientemente corta de tal forma que se minimice la radiación
perjudicial con respecto al individuo. De forma ideal, un
radioisótopo usado para la formación de imágenes in vivo
carece de emisión de partículas, pero produce un gran número de
fotones en el intervalo de 140-250 keV, para ser
rápidamente detectado por cámaras gamma convencionales. Para la
formación de imágenes, el intervalo de dosis de
^{111}ln-H11-scFv (por ejemplo, 2
mg de scFv marcado con 5 mCi de ^{111}Indio) administrado es de
aproximadamente 0,01 mg a 20 mg, más preferiblemente de
aproximadamente 0,1-10 mg y aún más preferiblemente
de aproximadamente 1-5 mg por paciente.
Para el diagnóstico in vivo, se pueden
unir radioisótopos a \alphaC directamente o indirectamente usando
un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios
que se usan a menudo para unirse a radioisótopos de iones metálicos
a inmonuglobulinas son agentes quelantes bifuncionales tales como el
ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) y el ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) y moléculas similares. Los ejemplos
típicos de iones metálicos que se pueden unir a \alphaC son
^{111}ln, ^{97}Ru, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr,
^{90}Y, y ^{201}TI.
\alphaC también se puede marcar con un isótopo
paramagnético para propósitos de diagnóstico in vivo, como
en formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o resonancia
de spin de electrones (ESR). En general, se puede utilizar
cualquier método convencional para visualizar la formación de
imágenes de diagnóstico. Habitualmente, se usan radioisótopos
emisores de gamma y positrones para la formación imágenes en cámara
e isótopos paramagnéticos para MRI. Los elementos que son
particularmente útiles en tales técnicas incluyen ^{157}Gd,
^{55}Mn, ^{162}DY, ^{52}Cr, y ^{56}Fe. \alphaC también se
puede marcar con un colorante fluorescente para los propósitos del
diagnóstico in vivo.
\alphaC también se puede usar para detectar
neoplasias usando ensayos in vitro. Se toman muestras del
paciente y se someten a cualquier inmunoensayo adecuado con
\alphaC para detectar la presencia del antígeno \alphaC. Esto
es particularmente útil para detectar linfomas y leucemias donde las
células tumorales que llevan antígeno \alphaC circulan en la
corriente sanguínea del paciente.
\alphaC también se puede usar para controlar
el curso de la mitigación de la neoplasia en un individuo. Por
tanto, midiendo el aumento o la disminución del número de células
que expresan el antígeno \alphaC o cambios en la concentración
del antígeno \alphaC presente en diversos fluidos corporales, es
posible determinar si un protocolo terapéutico particular que
pretende mitigar la neoplasia es eficaz.
En la presente memoria se describen kits que
contienen \alphaC. se pueden realizar procedimientos diagnósticos
usando \alphaC por laboratorios de diagnóstico, laboratorios
experimentales, facultativos o individuos privados. La muestra
clínica se pre-trata opcionalmente para el
enriquecimiento de la diana a ensayar. Después, el usuario aplica
un reactivo contenido en el kit para detectar el nivel cambiado o la
alteración en el componente de diagnóstico.
Cada kit comprende \alphaC usado para detectar
el antígeno C en la muestra. Opcionalmente, el reactivo se puede
conjugar con un marcador para permitir la detección de cualquier
complejo formado con la diana en la muestra. En otra opción, se
proporciona un segundo reactivo que es capaz de combinarse con el
primer reactivo después de que haya encontrado su diana y
suministra de este modo el marcador detectable. Por ejemplo, se
puede proporcionar IgG anti-ratón marcada como un
reactivo secundario para el uso con \alphaC intacto. Se puede
proporcionar avidina marcada como un reactivo secundario cuando el
reactivo primario se ha conjugado con biotina.
Los kits se pueden emplear para ensayar una
diversidad de muestras biológicas, incluyendo tanto muestras
líquidas, suspensiones celulares o muestras tisulares. Los ensayos
adecuados que usan \alphaC que se pueden suministrar en forma de
kit incluyen los que se describen en la presente memoria. Cada
reactivo se suministra en una forma sólida o disuelto/suspendido en
un tampón líquido adecuado para el almacenamiento del contenido y,
posteriormente para el intercambio o adición al medio de relación
en el que se realiza el ensayo. Se proporciona un envase adecuado.
El kit puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que
son útiles en el procedimiento. Estos componentes adicionales
incluyen, pero sin limitación, tampones, reactivos de captura,
reactivos de desarrollo, marcadores, superficies de reacción,
medios para la detección, muestras de control, instrucciones, e
información de interpretación.
La anterior descripción proporciona, entre otras
cosas, métodos detallados para preparar H11, en conjunto con
polinucleótidos que codifican H11, fragmentos de polipéptidos H11 y
otros derivados. Un especialista en la técnica puede practicar
realizaciones de esta invención refiriéndose a los datos de
secuencia para H11, que se proporciona en la presente memoria. Los
siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no para
limitar la invención reivindicada.
El Mab NBGM1/H11 ("H11") es un anticuerpo
IgM monoclonal humano que reacciona contra los siguientes tejidos
tumorales humanos y correspondientes líneas de células tumorales:
glioma, melanoma maligno, adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma
de mama. La caracterización in vitro del Mab NBGM1/H11 se
muestra en el Ejemplo 2.
La fusión de H11 se consiguió fusionando 8 x
10^{6} linfocitos de sangre periférica obtenidos de un hombre de
64 años de edad con un glioma de bajo grado con la línea celular de
mieloma humana TM-H2-SP2. La línea
celular TM-H2-SP2 es la sublínea no
secretora de inmunoglobulina de la línea celular parental de
IgG(\kappa) TM-H2, un derivado deficiente
en hipoxantina guanina fosforribositransferasa (EC 2.4.2.8) de una
línea similar a mieloma humano desconocida seleccionada en
metilcelulosa al 0,8% por su resistencia a
6-tioguanina (6 \mug/ml) y que no crece en medio
de hipo
xantina-aminopterina-timidina. El
cariotipo de TM-H2-SP2 es 46\pm2,
XX.
Las células viables de hibridoma resultantes se
distribuyeron entre 40 micropocillos con una densidad de 2 x
10^{5} células/ml y 0,2 ml/pocillo. La frecuencia de crecimiento
del H11 de fusión fue de 12 de 40 (30%) de pocillos que contenían
potencialmente hibridoma. La extensión resultante por el crecimiento
sostenido se define como el crecimiento prolongado con la expansión
del cultivo durante periodos más largos de 3 meses; no se
observaron casos de fallo de crecimiento de hibridoma que sucedían
más tarde de 3 meses después de la fusión.
Se realizó la identificación de clones de
hibridoma por ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas de captura de
antígenos (ELISA) en placas de microtitulación usando anticuerpo
policlonal IgM o IgG anti-humano como antígeno de
recubrimiento. Un sobrenadante de cultivo de hibridoma era positivo
si el valor de densidad óptica medida (D.O.) superaba el nivel de
fondo medio de un sobrenadante de cultivo de control en más de dos
desviaciones típicas.
La selección del clon de hibridoma NBGM1/H11 se
realizó por ELISA de células fijas. Los sobrenadantes de cultivo de
6 pocillos de microtitulación, que dieron un valor alto en el ensayo
de secreción de IgM o IgG, se identificaron frente a líneas de
células tumorales humanas unidas y fijadas previamente: Glioblastoma
(SKMG-1 y D-54MG); melanoma
(A-375); y adenocarcinoma de colon
(SK-CO-1). Se consideró que un
sobrenadante de hibridoma era positivo si el valor de D.O. medido
superaba el nivel de fondo medio de los sobrenadantes de cultivo de
control en más de dos desviaciones típicas. El Mab producido por el
hibridoma NBGM1/H11 continúa siendo reactivo contra estas líneas de
células tumorales. Los anticuerpos "H11" son IgM_{(K)}.
La caracterización del banco de siembra de
hibridoma NBGM1/H11 se realizó por Microbiological Associates
(Rockville, MD). Las células fueron negativas para (1)
contaminación bacteriana y fúngica, (2) contaminación por
micoplasmas, (3) antígenos de HIV-1 y
HIV-2 y (4) antígenos de HTLV-1 y
HTLV-2.
Los métodos usados para la caracterización de
Mab NBGM1/H11 incluyen: ELISA de captura de antígenos, ELISA de
antígenos, ELISA de células fijas, citometría de flujo, tinción de
inmunoperoxidasa de líneas de células tumorales humanas e
inmunohistoquímica para tejidos tumorales y normales humanos (véanse
los siguientes ejemplos).
Las características de unión de este Mab humano
a líneas de células tumorales humanas como se determinó por
citometría de flujo, tinción con inmunoperoxidasa, ELISA de células
fijas, y ELISA de antígenos (es decir, extractos de células
tumorales congelados-descongelados) se presentan a
continuación.
Para determinar la unión de Mab H11 a células
tumorales, se desprendieron células tumorales que crecían en
matraces en T por incubación con PBS-EDTA. Las
células se recogieron por centrifugación a baja velocidad, se
lavaron con PBS/FBS al 1% frío, se centrifugaron y se aspiró el
sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en medio de
cultivo con adiciones de uno de los siguientes: una IgM de melanoma
humano de control; sobrenadante de cultivo de hibridoma NBGM1/H11;
o PBS que contenía Mab H11 purificado; y se incubó sobre hielo
durante 30 min. Después de la incubación, se recogieron las células
por centrifugación, se lavaron por resuspensión en
PBS-FBS y se centrifugaron. El sedimento celular
después se incubó durante 30 min con IgM de cabra
anti-ser humano conjugada con FITC. Después de la
incubación, se lavaron las células con PBS-FBS.
Finalmente, se resuspendieron las células en
PBS-FBS, se añadió yoduro de propidio (PI) y se
lavaron las células. Se analizaron las células positivas para PI y
positivas para FITC por citometría de flujo.
Los resultados de los análisis citométrico de
flujo se muestran en las Figuras 2, 3 y 4. Estos resultados indican
que las formas sin procesar y purificadas de Mab H11 se unen a un
antígeno o antígenos asociados a la superficie celular expresados
sobre líneas de células tumorales humanas vivas incluyendo
glioblastoma, melanoma, adenocarcinoma de mama y adenocarcinoma de
colon.
Para determinar la capacidad de H11 de unirse
específicamente a antígeno o antígenos tumorales humanos, se
recubrieron placas ELISA con extractos de células tumorales humanas
preparadas por congelación y descongelación repetida de células de
glioblastoma (SKMG-1), adenocarcinoma de mama
(BT-20, MB-468 y
MB-453) y adenocarcinoma de colon
(SK-CO-1 y
HT-29).
Las placas de ELISA recubiertas se incubaron
durante 16-18 horas a 2-8ºC. Las
placas se bloquearon con PBS-BSA al 3% durante 1 h
a temperatura ambiente. Después se incubaron las placas con Mab H11
en PBS o IgM de control en PBS o medio de cultivo durante 2 h a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron e incubaron con IgM
anti-ser humano biotinilada, seguido de incubación
con IgM anti-ser humano biotinilada y seguido de
incubación con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina
durante 1 h. Después del lavado se añadió sustrato de fosfato de
p-nitrofenilo a cada placa y, después de la
incubación, se leyeron las placas a 405 nm en un lector de placas
ELISA.
La unión del Mab H11 a los extractos de células
tumorales se muestra en las Figuras 5 y 6. Estos resultados indican
que el Mab H11 se une a extractos de células tumorales preparados a
partir de células de glioblastoma, adenocarcinoma de mama y
adenocarcinoma de colon de un modo dependiente de dosis.
Para determinar la inmunorreactividad de H11, se
realizó el siguiente experimento. Se dejaron crecer células
tumorales en placas de 24 pocillos con cubreobjetos durante
48-96 h. Las células se lavaron con PBS, se fijaron
con formaldehído y se incubaron con suero normal de cabra al 5% en
PBS durante 30 min. Después del lavado, se incubaron las células
durante 2 h con sobrenadantes de cultivo de hibridoma NBGM1/H11 o
Mab H11 purificado (10 \mug/ml) en PBS o medio de cultivo con
adiciones de IgM de mieloma humano de control (10 \mug/ml)
durante 2 h. Después se lavaron las células y se incubaron con IgM
anti-ser humano conjugada con HRP. Finalmente, se
lavaron las células, se incubaron con sustrato de DAB para
visualizar la unión de Mab H11, se realizó una tinción de contraste
con hematoxilina y se montaron en GVA.
Los resultados de la inmunorreactividad del Mab
H11 se muestran en la Tabla 3 donde la reactividad se indica como
negativa (--), débilmente positiva (+), positiva (++) y fuertemente
positiva (+++). Estos resultados indican que, como se determina por
la tinción con inmunoperoxidasa, el epítopo reconocido por el Mab
H11 se expresa por varios tipos diferentes de células tumorales y
líneas celulares humanas.
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La unión de H11 a líneas celulares y células
tumorales humanas también se determinó por ELISA de células fijas.
Las células tumorales en crecimiento se desprendieron de la
superficie del matraz en T por incubación con
EDTA-PBS. Las células se recogieron por
centrifugación, se lavaron con PBS, se resuspendieron en medio de
cultivo, se contaron y se pusieron 50 \mul de suspensión celular
que contenía 5.000-10.000 células en cada pocillo
de placas ELISA de 96 pocillos. Después de dejar que las células se
unieran a las placas, se retiraron los sobrenadantes de cultivo y
se bloquearon las placas con PBS-BSA. Después se
incubaron las células con diferentes concentraciones
(1-20 \mug/ml) de Mab H11 o de IgM de mieloma
humano de control durante 2 h. Después de la incubación, se lavaron
las placas, se incubaron con IgM anti-ser humano de
cabra conjugada con biotina, se volvieron a lavar y se incubaron
con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. Finalmente,
las placas se lavaron, se incubaron con sustrato de
p-nitrofenil fosfato y se leyeron a 405 nm en un
lector de placas ELISA.
Los resultados de la reactividad del Mab H11 con
líneas de células tumorales humanas por ELISA de células fijas se
muestran en la Tabla 4 y en la Figura 7. En la Tabla 4, se usaron la
IgM de control a 10 \mug/ml y H11 a 10 \mug/ml para ensayar la
reactividad, y los valores se dan como absorbancia a 405 nm \pm
desviación típica. Estos resultados indican que: 1) Mab H11
relaciona fuertemente con células de glioblastoma
(SKMG-1), incluso a una concentración baja de 1
\mug/ml, mientras que la IgM de control a 20 \mug/ml no
reacciona con células SKMG-1; y 2) Mab H11 reconoce
el o los antígenos de tumor presentes en numerosas líneas de células
tumorales (adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de colon,
melanoma maligno, neuroblastoma, glioblastoma, adenocarcinoma de
pulmón, carcinoma pulmonar microcítico y adenocarcinoma de
próstata). El grado de reactividad de Mab varía tanto con el tipo
de cáncer como con las líneas de células tumorales. La reactividad
del Mab H11 para células cancerosas y tumorales era entre tres y
diez veces superior que la de la IgM de control.
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Se usó inmunohistoquímica para determinar la
especificidad de H11 para el detalle micro-anatómico
y la heterogeneidad en tejidos y tumores. Las limitaciones de esta
técnica incluyen posibles resultados falsos negativos debido a
niveles bajos de expresión de la molécula en estudio, así como
resultados de falsos positivos (reactividad cruzada) debido a la
unión del anticuerpo a epítopos similares o epítopos compartidos por
otros antígenos. Para abordar estas limitaciones, este estudio se
realizó a la mayor concentración de anticuerpo que no mostraba
unión no específica. Esto permitió una detección de todos los
niveles de reactividad cruzada en diferentes tejidos. Además, los
análisis de fijación establecieron la mejor combinación de
intensidad de tinción antigénica y conservación morfológica. El
presente ejemplo presenta resultados obtenidos a partir de IMPATH
Inc., Nueva York, retenidos para estudiar la especificidad celular
y expresión de antígeno de H11 en un panel seleccionado de
secciones congeladas cortadas por criostato de tejidos normales y
tumorales. El estudio usó una técnica de inmunoperoxidasa
indirecta.
Se obtuvieron tejidos humanos histológicamente
normales a partir de muestras quirúrgicas y de autopsia. Estos
tejidos frescos se incluyeron en OCT (Miles Laboratories, Inc.,
Naperville, IL) en criomoldes, se congelaron inmediatamente en
isopentano y se enfriaron con nitrógeno líquido. Los tejidos del
banco tisular congelado de IMPATH se cortaron con 5 micrómetros, se
pusieron en portaobjetos recubiertos con
poli-L-lisina, se secaron al aire y
se almacenaron a -70ºC.
H11, recibido sobre hielo seco y almacenado a
2-8ºC, se suministró no biotinilado a una
concentración de 200 \mug/ml, con un volumen total de 3,0 ml. Una
IgM de mieloma humana (Pierce, Nº Cat 311476) también suministrada
por Novopharm, se usó como control negativo. Ambos anticuerpos se
diluyeron en solución salina tamponada con fosfato hasta las mismas
concentraciones de trabajo dictadas por el análisis de titulación
del anticuerpo H11. El anticuerpo secundario marcado con peroxidasa
era una IgM anti-ser humano de cabra (American
Qualex, San Clemente, CA, nº lote A112PN) diluida en PBS 1:500.
\newpage
Técnicas con inmunoperoxidasa: se realizaron
estudios inmunohistoquímicos usando método de inmunoperoxidasa
indirecto. Las secciones cortadas con criostato se retiraron del
congelador a -70ºC, se secaron al aire y se fijaron de acuerdo con
el protocolo de fijación (detalles de fijación, proporcionados a
continuación). Las secciones tisulares se bloquearon durante 10
minutos con suero de cabra normal al 5% diluido en PBS, y después
se incubaron con el anticuerpo primario durante una noche a 4ºC. Los
portaobjetos se lavaron en PBS, seguido de un lavado con solución
de Tween al 0,5%/PBS, y después de nuevo con PBS. La actividad de
peroxidasa endógena se bloqueó con una incubación durante 30
minutos de peróxido de hidrógeno al 3%/metanol, seguido de 3
lavados de PBS. Después, las secciones se incubaron con anticuerpo
secundario de cabra IgM anti-humana (marcado con
peroxidasa), durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron
en PBS como se ha descrito anterior-
mente.
mente.
La reacción de peroxidasa se visualizó incubando
secciones tisulares durante 2-5 minutos con
tetraclorhidrato de 3,3-diaminobencidina (DAB)
(Sigma Chemical Co., St. Louis. MO). Las secciones tisulares se
lavaron de forma concienzuda, se realizó la tinción de contraste
con una hematoxilina de Harris modificada (Fischer Scientific,
Fairlawn, NJ) deshidratada por alcoholes graduados, se aclararon en
xileno y se cubrieron con el cubreobjetos. Los tejidos que
mostraban niveles elevados de tinción del fondo con el anticuerpo de
control negativo se repitieron con un lavado más amplio. El
carcinoma de mama humano (F95-036), suministrado por
IMPATH, fue el control positivo para H11. Los controles negativos
sustituyeron el anticuerpo de ensayo primario con IgM de mieloma
humano
purificada.
purificada.
El propósito del análisis de fijación fue
establecer las condiciones que proporcionan la combinación óptima
de intensidad de tinción antigénica y conservación morfológica. El
tejido de control positivo se ensayó con cinco protocolos de
fijación, incluyendo sin fijación. Los protocolos de fijación
ensayados eran formalina tamponada neutra al 10%
(23-25ºC), acetona (2-8ºC),
metilo/acetona (1:1 V/V, 2-8ºC) y etanol al 95%
(23-25ºC). Para este estudio, la formalina
tamponada neutra al 10% (NBF) proporciona resultados óptimos para
H11.
Usando NBF al 10% como agente de fijación, se
ensayaron diluciones de anticuerpo seriadas (de 20,0 \mug/ml a
0,1 \mug/ml) en el control positivo, carcinoma de mama humano. Una
concentración de 10,0 \mug/ml de anticuerpo H11 proporcionó
resultados óptimos-máxima intensidad de tinción sin
tinción de fondo significativa del control
negativo.
negativo.
Los resultados obtenidos se representan en las
Tablas 5 y 6. La Tabla 5 ilustra la reactividad de H11 en tejidos
normales y la Tabla 6 ilustra la reactividad de H11 en tumores
humanos.
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Los resultados obtenidos indican que se observó
reactividad débil (1+) a fuerte (3+) en más del 70% de la muestra
de control positivo. El antígeno reconocido por H11 tiene un patrón
restringido de distribución. H11 era principalmente no reactivo con
tejidos humanos normales ensayados en el sistema IMPATH. Se observó
que todas las células epiteliales simples, así como los epitelios
estratificados y los epitelios escamosos de diferentes órganos eran
no reactivos. Tampoco se observó reactividad en células
neuroectodérmicas, incluyendo las del cerebro, médula espinal y
nervios periféricos. Los elementos mesenquimales tales como células
esqueléticas y de músculo liso, fibroblastos y células endoteliales
fueron negativos. Los tejidos de origen linfoide, incluyendo médula
ósea, ganglio linfático, bazo y timo eran en gran medida no
reactivos con el anticuerpo H11. Se observó reactividad débil (1+)
en células esporádicas en una muestra de médula ósea y en los
centros germinales de una de tres muestras de amígdala
ensayada.
ensayada.
Se observó inmunorreactividad positiva en casi
todas las muestras de tumor ensayadas incluyendo mama, colon,
glioma, gástrico, pulmonar (adeno, escamoso y microcítico), linfoma,
melanoma, ovárico y próstata. Se observó reactividad en el 10% a
más del 95% de las células tumorales presentes en estas muestras; la
intensidad de tinción varió de débil (1+) a fuerte (3+). Sin
embargo, el anticuerpo H11 no era reactivo con las tres muestras de
sarcoma ensayadas. Algunos pero no todos los homólogos de las
células tumorales, cuando estaban presentes en las muestras, eran
reactivos con H11. Unas pocas células normales presentes en
carcinoma de mama, gástrico y de próstata eran reactivas con el
anticuerpo H11. Se cree que las células granulares grandes que eran
reactivas con el anticuerpo H11 son células inflamatorias del
linaje de eosinófilos-mastocitos.
En resumen, el anticuerpo H11 es en gran medida
no reactivo con tejidos normales humanos con la excepción de
algunos tejidos normales presentes en tumores. El anticuerpo H11
detecta un antígeno que se expresa en la mayoría de los tumores
ensayados.
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Para determinar la capacidad de fragmentos de
anticuerpos H11-scFv de unirse específicamente a
células cancerosas, se realizaron los siguientes experimentos.
Las construcciones de anticuerpos de cadena
única se realizaron mediante el siguiente procedimiento. Se
sintetizaron cebadores específicos para los extremos 5' y 3' de las
regiones V, kappa y mu de H11 en un sintetizador de ADN de Applied
Biosystems. Todos los cebadores contenían un sitio de endonucleasa
de restricción para la clonación. Los cebadores 5 y 6 también
contenían nucleótidos adicionales que codifican un enlazador
(SGGGG)_{3}. Los cebadores usados se enumeran en la Tabla
7 donde el sitio de endonucleasa de restricción está subrayado.
Se realizaron reacciones de PCR usando cebadores
1 y 2 para el dímero kappa, cebadores 3 y 4 para el dímero mu,
cebadores 1 y 6 para el monómero kappa y cebadores 4 y 5 para el
monómero mu. Los fragmentos de PCR después se purificaron y
digirieron con sus respectivas endonucleasas de restricción. Los
nucleótidos codificantes se ilustran en las SEC ID Nº: 13 y 16 y
los nucleótidos complementarios se ilustran en las SEC ID Nº: 15 y
18 respectivamente.
El vector de expresión pSJF 1 que contiene un
sitio de unión a ribosoma, la secuencia de péptido señal OmpA, el
marcador de detección c-myc (9E10) y una cola de
histidina (véase Figura 8) se preparó por corte con Bbs1 y BamH1.
Las construcciones monoméricas y diméricas se ensamblaron ligando
los respectivos fragmentos kappa y mu en pSFJ1 y utilizándolos para
transformar células E. coli TG1 competentes. Las colonias
resultantes se exploraron mediante PCR de colonia y digestiones con
endonucleasas de restricción para confirmar que los insertos tenían
el tamaño correcto y las secuencias se verificaron por secuenciación
fluorescente con didesoxi.
Las TG1 transformadas que contenían el plásmido
de expresión monomérico o dimérico de H11 se agitaron a 26ºC
durante 24 h seguido por la adición de IPTG a una concentración
final de 0,1 \muM. Las células se incubaron durante 16 horas
adicionales y después se recogieron por centrifugación. Las
proteínas periplasmáticas que contenían el anticuerpo H11 se
liberaron por tratamiento con tampón de sacarosa (sacarosa al 25%,
EDTA 1 mM, Tris 10 mM, pH 8,0) seguido por tampón de choque con
hielo (Tris 8,0 10 mM, MgCl_{2} 0,5 mM). La expresión se verificó
por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia de
Western. El anticuerpo se purificó usando una columna cargada con
níquel (columna quelante HiTrap de Pharmacia) y el anticuerpo unido
se eluyó con un gradiente creciente de imidazol. El anticuerpo
purificado se dializó frente a PBS/azida sódica al 0,02% y se
concentró hasta 0,5 mg/ml.
Las similitudes antigénicas entre Mab H11 y
H11-scFv también se determinaron por ELISA de
células fijas. Las placas ELISA cubiertas con células A375 se
incubaron con Mab H11, IgM de control, H11-scFv o
BGA-scFv de control seguido por incubación con
anticuerpo IgM de conejo anti-humano o anticuerpo de
conejo anti-scFv de la manera apropiada. La
detección fue por IgG-peroxidasa de rábano rusticano
de cabra anti-conejo, seguido por sustrato. Los
resultados, mostrados en la Figura 9, demuestran una alta afinidad
tanto de H11 IgM como de H11-scFv y una baja
afinidad tanto de la IgM de control como de
BGA-SL-6.
Para determinar la especificidad de
H11-scFv biotinilado con respecto a scFv de control
biotinilado, se realizó el siguiente experimento. Se fijaron
células tumorales humanas a placas ELISA y se incubaron con
H11-scFV biotinilado o BGTA-scFV
biotinilado (control) como se ha descrito anteriormente.
H11-scFV biotinilado también
demostró una afinidad mucho mayor (entre 8 y 50 veces) para líneas
celulares tumorales que el control en ELISA de células fijas. Los
datos correspondientes a una concentración de 2,5 \mug/ml de
H11scFV o BGA scFV se muestran en la Tabla 8 y en la Figura 10.
La Figura 11 ilustra la parte de la Tabla 8
relacionada con la titulación de reactividad de
H11-scFv biotinilado para la unión a células de
linfoma Daudi, Ramos, CA-46 y células
CCRF-CEM. A cada concentración ensayada (1,25 a 10
\mug/ml) H11-scFv demostró una alta afinidad por
células de linfoma, pero BGA scFv no.
\newpage
Para verificar la especificidad de
H11-scFv biotinilado para células cancerosas, se
realizó el siguiente experimento. Se prepararon muestras tisulares
malignas y normales y se incubaron con H11-scFv
biotinilado como se ha descrito anteriormente.
El H11-scFv se usó para teñir
secciones de tejidos tumorales y normales. Los resultados se
ilustran en la Tabla 8 para tejidos normales y en la Tabla 9 para
tejidos tumorales.
La Figura 12 ilustra la intensidad de
fluorescencia relativa de H11-scFv y scFv de control
para líneas celulares tumorales.
Los datos en la Tabla 9 demuestran que
H11-scFv biotinilado generalmente no reacciona con
tejidos normales. Casi todos los tejidos normales ensayados no
demostraron reactividad medible, generándose solamente una señal
débilmente positiva por páncreas normal y tejidos de nervios
periféricos. En la Tabla 9, -ve indica que no hay ninguna actividad
medible y +/ indica actividad débilmente positiva.
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Los resultados presentados en la Tabla 10
indican que se observó tinción positiva en la mayoría de las
muestras de carcinoma de mama (27/31) y colon (23/26) y próstata
(17/20) ensayadas. Se observó tinción positiva a una concentración
de 25 \mug/ml de H11-scFv. Aunque la tinción se
detectó de forma predominante en celulares tumorales también se
observaron diversos grados de reactividad en estroma y tejidos
adyacentes. El H11-scFv también se ensayó para su
especificidad para tejido normal. Los resultados obtenidos se
presentan en la Tabla 11 que resume la tinción inmunohistoquímica
de H11-scFv con secciones de tejido humano
normal.
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Para ensayar la reactividad de
H11-scFv para células tumorales vivas, se prepararon
células de líneas tumorales para citometría de flujo como se ha
descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Se incubaron células
tumorales con H11-scFv biotinilado o scFv
biotinilado de control como se ha descrito anteriormente a una
concentración de proteína de 100 \mug/ml ó 200 \mug/ml. La
reactividad se determinó como la fluorescencia media y el % de
células positivas. Se preparó un H11-scFv
biotinilado como se ha descrito anteriormente y con una
concentración de proteínas de 100 \mug/ml ó 200 \mug/ml. La
fluorescencia media y el % de células positivas se muestran en la
Tabla 12 donde # es 3B1 biotinilado como scFv de control; * BGA
SL-6 biotinilado como scFv de control; ** es PBS al
5% FCS como control; y *** es Biotina-5B1 como scFV
de control.
H11-scFv marcado con ^{125}I
demostró una afinidad de unión (ka) de 3 x 10^{8} l/mol para
células LS174T (unión específica mostrada en la Figura 13).
^{111}In-H11-scFv demostró una
afinidad de unión (Ka) de 3,6 x 10^{8} l/mol para células
A-375 y 1,4 x 10^{9} l/mol para células SKMG1. Los
resultados se ilustran en la Figura 14. Había aproximadamente
24.000 sitios de unión/célula para células A-375 y
aproximadamente 5000 sitios de unión/célula para SKMG1.
Estos resultados indican que las formas
purificadas de Mab H11 se unen a un antígeno o antígenos asociados
a la superficie celular expresados sobre líneas celulares de
adenocarcinoma de mama (SK-BR-3),
glioblastoma (SKMG-1) y melanoma
(A-375) de linfoma.
Para ensayar adicionalmente la reactividad de
H11-scFv biotinilado para células de linfoma vivas,
se prepararon líneas de células tumorales y se incubaron con
H11-scFv biotinilado a una concentración de proteína
de 100 \mug/ml ó 200 \mug/ml, y se analizaron por citometría de
flujo como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. La
fluorescencia media y el % de células positivas se midieron por
citometría de flujo. El control para la unión de scFv fue de
BGA-scFv biotinilado. Los resultados se muestran en
la Tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la inmunorreactividad de
H11-scFv se realizó el siguiente experimento. Se
dejaron crecer células tumorales en matraces en T y se prepararon
citocentrifugaciones y se incubaron con H11-scFv
biotinilado o PBS para determinar la unión.
Los resultados de la inmunorreactividad de
H11-scFv se muestran en la Tabla 14 donde la
reactividad se indica como negativa (- -), débilmente
positiva (\pm) o positiva (+ o ++). Estos resultados indican que,
como se determina por la tinción con inmunoperoxidasa, el epítopo
reconocido por Mab H11 se expresa por varios tipos diferentes de
células tumorales y líneas celulares humanas.
\newpage
Se produjo H11 IgG1 en células de Ovario de
Hámster Chino (CHO) del siguiente modo. Se prepararon varios
vectores que contenían ADNc que codificaban secuencias de cadena
ligera y pesada de H11. La orientación, los insertos de ADN y los
criterios de selección para antibióticos de estas construcciones se
muestran en la Tabla 15 donde CMV es citomegalovirus; DHFR es
dihidrofolato reductasa; HC es cadena pesada y LC es cadena
ligera.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos vectores de expresión tienen sitios de
inserción separados para las secuencias que codifican las cadenas
de anticuerpo ligera y pesada. Un nivel elevado de expresión
constitutiva tanto de las cadenas pesadas como ligeras se dirige
por el potenciador/promotor inmediato-temprano del
citomegalovirus (CMV). Un intrón quimérico que comprende el sitio
de donación 5' del primer intrón de la
\beta-globina humana y el sitio aceptor 3' del
intrón de un gen de inmunoglobulina (región variable de cadena
pesada) se localiza aguas abajo del promotor que frecuentemente ha
demostrado mejorar los niveles de expresión génica. Se proporciona
la poliadenilación de los ARNm por la señal de poliadenilación del
virus de simio 40 (SV40).
Los plásmidos también contienen el gen que
codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR), y por lo tanto, se
puede hacer crecer en células deficientes en DHFR de ovario de
hámster chino (CHO). La amplificación usando metotrexato, un
análogo de folato e inhibidor potente de DHFR, da como resultado la
amplificación del gen de DHFR y sus secuencias flanqueantes
(particularmente las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo en la
construcción). Un aumento gradual en concentración de metotrexato
(de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 800 nM) puede
producir niveles muy elevados de proteína del gen o los genes diana.
Las construcciones también contienen un gen que confiere
resistencia a antibióticos que era un marcador de selección, se usa
resistencia a neomicina o zeomicina. Los vectores se muestran en
las Figuras 15 y 16.
Los resultados de los análisis de citometría de
flujo de IgG1 de H11 producido de forma recombinante se muestran en
la Tabla 16 e ilustran que H11 IgG1 que se une a un antígeno en
células de carcinoma de mama SK-BR-3
se puede producir en células CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las afinidades de unión de H11
IgM y H11-scFv para diversas líneas de células
cancerosas humanas marcando los anticuerpos H11 con yoduro
radiactivo o indio radiactivo.
^{125}I-H11-scFv se preparó con
actividades específicas de 7, 20 ó 150 \muCi/\mug y se obtuvo
^{125}I-H11 IgM 0,6 \muCi/\mug. Además, se
preparó ^{111}In-H11-scFv que
tenía una actividad específica de 13 y 38 \muCi/\mug como se
describe en el Ejemplo 12. Como control para indicar la unión
específica se usó scFv 3B 1 que no reconoce el antígeno C, y se
marcó con 150 \muCi/\mug.
Se purificó
^{125}I-H11-scFv usando una
minicolumna P-2 y se analizó por cromatografía en
papel en metanol al 85% como se muestra en la Figura 17. Se
purificó ^{125}I-H11 IgM usando una
mini-columna de Sephadex G-50
(Pharmacia) y se analizó por cromatografía en papel en metanol al
85% como se muestra en la Figura 18. Se usó una columna de Sephadex
G-50 para purificar
^{111}In-H111-scFv que después se
analizó por ITLC-SG en Citrato 0,1 M como se
muestra en la Figura 19.
Los resultados de la unión de H11 se muestran en
las Figuras 3 y 14. La Figura 13 se muestra la unión específica de
^{125}I-H11-scFv a células de
cáncer de colon humanas LS174T. La Figura 14 muestra la unión total
de ^{111}In-H11-scFv a células
A375.
Los resultados obtenidos indican que H11 se une
específicamente tanto a células de melanoma humano como a LT174T.
H11 también se une, pero con menor afinidad, a la línea de células
cancerosas de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Se conjugó H11-scFv con el
anhídrido bicíclico de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) con
una proporción molar de 10:1 (DTPA:H11-scFv) dando
como resultado un nivel de sustitución de 2 moles de DTPA por mol de
H11-scFv. Se purificó
DTPA-H11-scFv de DTPA en exceso en
una mini-columna de Sephadex G-25
(Farmacia) y se reconcentró hasta 10 mg/ml usando un
microconcentrador Centncon-30 (Amicon). El
DTPA-H11-scFv se radiomarcó hasta
una actividad específica de 25 mCi/mg con acetato de ^{111}Indio.
Se retiró el ^{111}In no incorporado usando una minicolumna de
Sephadex G-25. El acetato de ^{111}Indio se
preparó a partir de cloruro de ^{111}Indio (Nordion) y tampón
acetato 1 M a pH 6,0. La pureza radioquímica del
^{111}In-DTPA-H11-scFv
fue mayor del 99% cuando se midió por cromatografía en gel de
sílice de capa fina en citrato sódico 100 mM pH 5,0. La Figura 19
muestra la purificación y TLC.
A un ratón desnudo hembra con un xenoinjerto de
melanoma A357 subcutáneo existente en el lado derecho y un
xenoinjerto de cáncer de colon humano HT-29
subcutáneo en la región abdominal media se le inyectaron por vía
intravenosa en la vena de la cola 100 \muCi de
^{111}In-DTPA-H11-scFv.
El ratón se puso inmediatamente bajo la cámara gamma (Siemans
ZL3700) conectada con un ordenador GE Star 4000i y se obtuvo una
adquisición dinámica durante 120 minutos, durante un total de 480
marcos de 15 segundos cada uno. Los marcos se combinaron después en
imágenes de 12 x 10 minutos. El tumor A375 fue visible en el lado
derecho del ratón tan sólo a los 30 minutos después de la
inyección.
El análisis de la región de interés de los dos
tumores mostró que el tumor A375 acumuló radiactividad a lo largo
del estudio de 120 minutos, mientras que el tumor
HT-29 acumuló radiactividad durante la primera hora
y después la concentración de radiactividad permaneció relativamente
constante. La Figura 20 muestra 12 marcos y las dos flechas en el
marco derecho inferior, tomado a los 120 minutos, muestra la
acumulación de radiactividad en los dos tumores. La flecha estrecha
se dirige hacia el tumor A375, y la flecha ancha se dirige hacia el
tumor HT-29. Los tejidos normales visibles en las
imágenes incluyen el corazón, el hígado, los riñones y la vejiga.
El corazón es visible debido a las cantidades circulantes de
radiactividad, y los riñones y la vejiga son visibles debido a la
eliminación renal de
^{111}In-DTPA-H11-scFv.
La pequeña cantidad de captación hepática puede deberse al flujo
sanguíneo al hígado o a la unión parcial de
^{111}In-DTPA-H11-scFv
al hígado.
Aunque la anterior descripción se ha descrito
con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos
de claridad y comprensión, será evidente para los especialistas en
la técnica que se pueden poner en práctica determinados cambios y
modificaciones. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no se
deben considerar como limitantes del alcance de la invención, que
se define por las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Dan, Michael D.
\hskip3.89cmMaiti, Pradip K.
\hskip3.89cmKaplan, Howard A.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FRAGMENTOS DE UNIÓN A ANTÍGENO H11 QUE DETECTAN ESPECÍFICAMENTE CÉLULAS CANCEROSAS, NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LOS FRAGMENTOS Y USO DE LOS MISMOS PARA LA PROFILAXIS Y DETECCIÓN DE CANCERES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Morrison & Foerster
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 755 Page Mill Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- COUNTRY: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94304-1018
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Lehnhardt, Susan K.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.943
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 31608-20001.20
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 813-5600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (415) 494-0792
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 706141
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 543 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.543
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 179 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 543 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 450 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.450
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 450 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGAAGACA CCAGGCCGAT ATTGTGTTGA CGCA
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATCCGGATG CAGCCACAGT TCGTTT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTCGGACA GGTGCAGCTG GTGGAG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGGATCCT GAGGAGACGG TGACCGT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATATATCCG GAGGTGGTGG ATCAGGTGGA GGTGGCTCCC AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTCCGGAA CCGCCACCGC CAGAGACAGA TGGTGCAGCC ACATTC
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: DCS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión(1..906, 913..918)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 304 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 867 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión(1.855, 862.867)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 287 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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- (A)
- LONGITUD: 867 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
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- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
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Claims (30)
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1. Un fragmento de unión a antígeno de un
anticuerpo, donde el anticuerpo reconoce específicamente el mismo
antígeno reconocido específicamente por un anticuerpo que comprende
una región V de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID Nº: 2 y una región V de cadena L que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 y donde el fragmento de unión a
antígeno comprende al menos siete restos de aminoácidos
consecutivos de la región CDR3 de la cadena pesada de la SEC ID Nº:
2.
2. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 1, donde el anticuerpo reconoce
específicamente el mismo antígeno reconocido específicamente por un
fragmento de región V de cadena única (scFv) que tiene una
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14.
3. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo nativo completo,
un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, Fab,
F(ab')2, un fragmento de región V de cadena única (scFv) o
un polipéptido de fusión, donde el polipéptido de fusión comprende
el fragmento de unión a antígeno fusionado con un resto
químicamente funcional.
4. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 3, donde el anticuerpo nativo completo
comprende cadenas H que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 2 y una cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº: 5.
5. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 3, donde el scFv es igual que una cualquiera
de las SEC ID Nº: 14 y 17.
6. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 3, donde dicho resto es un péptido señal, un
agente que mejora la reactividad inmunológica, un agente que
facilita el acoplamiento a un soporte sólido, un soporte de vacuna,
un modificador de la respuesta biológica, una toxina, un marcador
detectable, un marcador paramagnético o un fármaco.
7. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 6, donde el péptido señal es procariota o
eucariota.
8. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 6, donde dicho agente que mejora la
reactividad inmunológica es un superantígeno bacteriano, dicho
agente que facilita el acoplamiento a un soporte sólido es biotina
o avidina, dicho soporte de inmunógeno es un tampón fisiológicamente
aceptable y/o dicho modificador de la respuesta biológica es una
citocina.
9. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 8, donde la citocina es el factor de necrosis
tumoral, la interleucina-2, la
interleucina-4, la interleucina-12,
el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos o el
interferón \gamma.
10. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 6, donde el fármaco es un agente
antineoplásico que es un radioisótopo, alcaloide de la vinca,
adriamicina, sulfato de bleomicina, Carboplatino, Cisplatino,
ciclofosfamida, Citarabina, Decarbazina, Dactinomicina, Clorhidrato
de Daunorubicina, Clorhidrato de Doxorubicina, Etopósido,
fluorouracilo, lomustina, Clorhidrato de Meclororetamina, melfalán,
mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, pentostatina,
pipobromano, clorhidrato de procarbazol, estreptozotocina, taxol,
tioguanina o mostaza de Uracilo y/o la toxina es ricina, un
radionúclido, proteína antiviral de fitola americana, exotoxina A
de Pseudomonas, toxina diftérica, cadena A de ricina, restrictocina
o una enzima fosfolipasa.
11. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 10, donde el alcaloide de la vinca es sulfato
de vinblastina, sulfato de vincristina o sulfato de vindesina y/o el
marcador detectable es un radioisótopo, compuesto fluorescente,
metal coloide, compuesto quimioluminiscente, compuesto
bioluminiscente, enzima, sustrato, cofactor o inhibidor.
12. Una composición que comprende un fragmento
de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
13. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 12, donde el excipiente es una preparación de
liposomas.
14. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo
con la reivindicación 1, donde el fragmento de unión a antígeno
comprende adicionalmente una región C de inmunoglobulina
heteróloga.
15. Un anticuerpo humanizado que comprende el
fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
16. Un péptido polimérico que comprende una
pluralidad de los fragmentos de unión a antígeno de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
17. Una composición inmunogénica que comprende
un fragmento de unión a antígeno como se define en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable y una cantidad de adyuvante eficaz para mejorar la
respuesta inmune.
18. Una secuencia polinucleotídica aislada que
codifica un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la
reivindicación 14.
19. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 18, donde la secuencia codificante está dentro de las
SEC ID Nº: 1 ó 4.
20. Un vector de clonación o expresión que
comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18 ó
19.
21. Un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 20 que es vaccinia.
22. Una célula hospedadora que comprende un
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 o que se ha
transformado o transfectado con un vector de acuerdo con la
reivindicación 20.
23. Una composición farmacéutica o inmunogénica
que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18
ó 19 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. El uso de un fragmento de unión a antígeno
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para
la fabricación de un medicamento para tratar neoplasia.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que el individuo que se tiene que tratar tiene un tumor
clínicamente detectable y/o que implica paliar la neoplasia.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que un tumor que se había detectado previamente en el
individuo se había tratado y es clínicamente indetectable en el
momento de administrar el fragmento de unión a antígeno y/o donde
el uso implica la disminución del riesgo de recurrencia de un tumor
clínicamente detectable.
27. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 24 al 26 en el que el fragmento de unión a antígeno
se puede administrar por vía parenteral por inyección subcutánea,
intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intracavitaria,
intratecal, transdérmica o intravenosa.
28. El uso acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, en el que el fragmento de unión a antígeno
se administra con una dosificación de 0,01 mg/kg/dosis a 2000
mg/kg/dosis y/o el fragmento de unión a antígeno se marca con un
resto terapéutico.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28,
en el que el resto terapéutico es un radioisótopo, un agente
antineoplásico, un inmunomodulador, un modificador de la respuesta
biológica, una lectina o una toxina.
30. Un método para detectar un antígeno en una
muestra, comprendiendo el método:
- (a)
- poner en contacto una muestra con un fragmento de unión a antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en condiciones que permiten la formación de un complejo estable anticuerpo-antígeno; y
- (b)
- detectar cualquier complejo estable formado en la etapa (a);
donde el antígeno se reconoce específicamente
por un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y una región V de cadena L que
tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5, o por un
fragmento de región V de cadena única (scFv) que tiene una secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14.