ES2312177T3 - Fragmentos de union a antigenos que detectan especificamente celulas cancerosas, nucleotidos que codifican los fragmentos y el uso de los mismos para la profilaxis y deteccion de canceres. - Google Patents

Fragmentos de union a antigenos que detectan especificamente celulas cancerosas, nucleotidos que codifican los fragmentos y el uso de los mismos para la profilaxis y deteccion de canceres. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL ANTICUERPO MONOCLONAL H11 Y A FRAGMENTOS DE UNION DEL ANTIGENO QUE UNEN ESPECIFICAMENTE EL ANTIGENO RECONOCIDO POR EL H11, EL ANTIGENO C. EL ANTIGENO C SE ENCUENTRA ESPECIFICAMENTE EN CELULAS NEOPLASICAS Y NO EN CELULAS NORMALES. TAMBIEN SE PRESENTAN DERIVADOS DE POLINUCLEOTIDOS Y DE POLIPEPTIDOS BASADOS EN EL H11, INCLUIDAS LAS MOLECULAS DE LA REGION V DE CADENA SENCILLA Y PROTEINAS DE FUSION Y VARIAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS. CUANDO SE ADMINISTRAN A UN INDIVIDUO, EL ANTICUERPO H11 ES EFECTIVO EN EL DIAGNOSTICO, LOCALIZACION Y/O TRATAMIENTO DE NEOPLASIAS. EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD NEOPLASICA, EN PARTICULAR DEL MELANOMA, NEUROBLASTOMA, GLIOMA, SARCOMA DEL TEJIDO BLANDO Y CARCINOMA PULMONAR DE CELULAS PEQUEÑAS. A LOS PACIENTES EN REMISION COMO RESULTADO DE MODOS TRADICIONALES DE TRATAMIENTO CONTRA EL CANCER SE LES PUEDE TRATAR CON UNA COMPOSICION DE ESTA INVENCION CON LA ESPERANZA DE REDUCIR EL RIESGO DE RECURRENCIA. A LOS PACIENTES TAMBIEN SE LES PUEDE TRATAR AL MISMO TIEMPO CON ANTICUERPOS Y CON LOS AGENTES ANTINEOPLASICOS TRADICIONALES.

Description

Fragmentos de unión a antígenos que detectan específicamente células cancerosas, nucleótidos que codifican los fragmentos y uso de los mismos para la profilaxis y detección de cánceres.
Campo técnico
Esta invención se refiere a anticuerpos específicos para un antígeno detectado en células neoplásicas pero no en células normales. Este antígeno se denomina en la presente memoria "antígeno C". El antígeno C se reconoce por el anticuerpo monoclonal humano (Mab) denominado "H11". La invención incluye una amplia diversidad de anticuerpos, y derivados funcionales de los mismos que conservan la especificidad inmunológica de H11 y se denominan en la presente memoria "\alphaC". El anticuerpo ilustrativo, H11, composiciones que comprenden el H11, e hibridomas que producen H11 están incluidos en la presente memoria. La región V de H11 de polinucleótidos y polipéptidos codificados de este modo y moléculas recombinantes que contienen estos polinucleótidos también están incluidos en la invención. También se describen en la presente memoria métodos para el uso, incluyendo el uso terapéutico y de diagnóstico de los anticuerpos \alphaC.
Técnica antecedente
A pesar de numerosos avances en la investigación médica, el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. En naciones industrializadas, aproximadamente una de cinco personas morirá de cáncer. Los modos tradicionales de cuidados médicos, tales como resección quirúrgica, radioterapia y quimioterapia, tienen una tasa de fallo significativa, especialmente para tumores sólidos. Los fallos suceden debido a que el tumor inicial no responde, o debido a la recurrencia debido al nuevo crecimiento en el sitio original y/o metástasis. Incluso en cánceres tales como el cáncer de mama en el que la tasa de mortalidad ha disminuido, la intervención exitosa se basa en la detección temprana de las células cancerosas. La etiología, el diagnóstico y la ablación del cáncer siguen siendo un enfoque central de la investigación y desarrollo médicos.
La neoplasia que da como resultado tumores sólidos se puede curar habitualmente completamente retirando quirúrgicamente la masa. Si un tumor se convierte en maligno, como se manifiesta por la invasión del tejido circundante, es mucho más difícil de erradicar. Una vez que un tumor maligno metastatiza es mucho menos probable que se
erradique.
Los tres cánceres principales en términos de morbilidad y mortalidad, son los de colon, mama, y pulmón. Los nuevos procedimientos quirúrgicos ofrecen una tasa de supervivencia aumentada para el cáncer de colon. Los métodos de exploración mejorados aumentan la detección de cáncer de mama, permitiendo una terapia más temprana y menos agresiva. Numerosos estudios han mostrado que la detección temprana aumenta la supervivencia y las opciones de tratamiento. El cáncer de pulmón continúa en gran medida siendo resistente a tratamiento.
Excluyendo el carcinoma de células basales, hay más de un millón de nuevos casos de cáncer por año solamente en los Estados Unidos y el cáncer representa más de medio millón de muertes por año en este país. En el mundo como conjunto, los cinco cánceres más comunes son los de pulmón, estómago, mama, colon/recto, y cuello de útero y el número total de casos nuevos por año es de más de 6 millones. Solamente aproximadamente la mitad del número de personas que desarrollan cáncer mueren por el mismo.
El melanoma es una de las enfermedades humanas para las que hay una necesidad aguda de nuevas modalidades terapéuticas. Es una forma particularmente agresiva de cáncer cutáneo y se produce con una mayor frecuencia en individuos con exposición al sol sin protección regular. En las fases tempranas de la enfermedad, el melanoma se caracteriza por proliferación en la unión dermis-epidermis, que invade pronto el tejido adyacente y metastatiza ampliamente. Una vez que ha metastatizado, a menudo es imposible la extirpación, y como consecuencia, es fatal. A nivel mundial se diagnostica melanoma en 70.000 pacientes y es responsable de 25.000 muertes informadas cada año. La Sociedad Americana contra el Cáncer prevé esto en el año 2000. Uno de cada 75 americanos será diagnosticado de melanoma.
El neuroblastoma es un tumor altamente maligno que se produce durante la infancia y en las primeras partes de la niñez. Excepto por el tumor de Wilm, es el tumor retroperitoneal más común en niños. Este tumor metastatiza tempranamente, con implicación amplia de nódulos linfáticos, hígado, hueso, pulmón y médula ósea. Aunque el tumor primario se puede resolver por resección, la tasa de recurrencia es elevada.
En 1997 se diagnosticarán aproximadamente 178.100 nuevos casos de cáncer de pulmón, representando el 13% de los diagnósticos de cáncer. Un número estimado de 160.400 muertes debido a cáncer pulmonar se producirán en 1997 representando el 29% de todas las muertes por cáncer. La tasa de supervivencia de un año para el cáncer del pulmón ha aumentado del 32% en 1973 al 41% en 1993, en gran medida debido a mejoras en las técnicas quirúrgicas. La tasa de supervivencia de 5 años para todos los estadios combinados es solamente del 14%. La tasa de supervivencia es del 48% para los casos detectados cuando la enfermedad todavía está localizada, pero solamente el 15% de los cánceres de pulmón se descubren tan tempranamente.
\newpage
El cáncer pulmonar microcítico es la forma más maligna y de crecimiento más rápido de cáncer pulmonar y representa el 20-25% de los nuevos casos de cáncer de pulmón. Se diagnosticarán 60.000 casos en los Estados Unidos en 1996. El tumor primario generalmente responde a quimioterapia, pero es seguido de metástasis ampliamente distribuidas. El tiempo de supervivencia medio desde el diagnóstico es de aproximadamente 1 año, con una tasa de supervivencia de 5 años del 5-10%.
El cáncer de mama es uno de los cánceres más comunes y es la tercera causa principal de muerte por cánceres en los Estados Unidos con una incidencia anual de aproximadamente 180.200 nuevos casos entre mujeres en los Estados Unidos durante 1997. Aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama se diagnosticarán en hombres en 1997. En naciones industriales, aproximadamente una de cada ocho mujeres puede esperar desarrollar cáncer de mama. La tasa de mortalidad global de cáncer de mama ha permanecido sin cambios desde 1930. Ha aumentado un promedio del 0,2% por año, pero ha descendido en mujeres por debajo de 65 años de edad en un promedio de 0,3% por año. Los datos preliminares sugieren que la mortalidad por cáncer de mama puede estar comenzando a disminuir, probablemente, como un resultado de un aumento en los diagnósticos de cáncer localizado y carcinoma in situ. Véase por ejemplo, Marchant (1994) Contemporary Management of Breast Disease II: Breast Cancer, in: Obstetrics and Gynecology Clinics of North America 21:555-560; and Colditz (1993) Cancer Suppl. 71:1480-1489. Un número estimado de 44.190 muertes (43.900 mujeres, 290 hombres) se producirán en 1997 debido a cáncer de mama. En mujeres, es la segunda causa principal de muerte por cáncer después del cáncer de pulmón. La tasa de supervivencia de cinco años para el cáncer de mama localizado ha aumentado del 72% en 1940 al 97% actual. Si el cáncer se ha dispersado regionalmente, sin embargo, la tasa es del 76%, y para mujeres con metástasis distantes la tasa es del 20%. La supervivencia después de un diagnóstico de cáncer de mama continúa disminuyendo una vez transcurridos cinco años. El sesenta y cinco por ciento de las mujeres que tienen diagnosticado un cáncer de mama sobrevive 10 años y el 56% sobrevive 15 años.
Los linfomas de células de no-Hodgkin son cánceres del sistema inmune que se espera que afecten aproximadamente a 225.000 pacientes en los Estados Unidos en 1996. Estos cánceres son diversos con respecto al pronóstico y al tratamiento y se clasifican generalmente en uno de tres grados. La supervivencia media del grado menor es de 6,6 años y en los cánceres de grado superior se tiene una esperanza de vida mucho menor. Prácticamente todos los linfomas de células B no-Hodgkin son incurables. Los nuevos diagnósticos de linfomas no-Hodgkin han aumentado aproximadamente el 7% anualmente a lo largo de la última década, estimándose 52.700 nuevos diagnósticos para 1996. El aumento se debe en parte a la prevalencia creciente de linfomas en la población de pacientes con SIDA.
El cáncer de colon y rectal representará un número estimado de 131.200 casos en 1997, incluyendo 94.100 de cáncer de colón y 37.100 de cáncer rectal. Los cánceres colo-rectales representan aproximadamente el 9% de nuevos diagnósticos de cáncer. En 1997 se producirá un número estimado de 54.900 muertes debido a cáncer colo-rectal, representado aproximadamente el 10% de las muertes por cáncer. Las tasas de mortalidad para cáncer colo-rectal han caído al 32% para mujeres y el 14% para hombres durante los últimos 20 años, reflejando tasas de incidencia decrecientes y tasas de supervivencia crecientes. Sin embargo, la tasa de mortalidad en hombres afroamericanos continúa aumentando. Las tasas de supervivencia relativas de 1 a 5 años para pacientes con cáncer de colon y rectal son del 82% y del 61%, respectivamente. Cuando se detectan cánceres colo-rectales en un estadio temprano, localizado, la tasa de supervivencia de 5 años es del 91%. Sin embargo, solamente el 37% de los cánceres colo-rectales se descubren en este estadio. Después de que se haya dispersado el cáncer regionalmente para implicar órganos adyacentes o nódulos linfáticos, la tasa cae al 63%. Las tasas de supervivencia para personas con metástasis distantes es del 7%. La supervivencia continúa disminuyendo una vez transcurridos 5 años, y el 50% sobrevive 10 años.
A pesar de las dificultades se han investigado curas eficaces usando fármacos anti cancerosos (solos o en combinación con otros tratamientos) para algunos cánceres anteriormente altamente letales. Los más notables entre los mismos son el linfoma de Hodgkin, el cáncer testicular, el coriocarcinoma y algunas leucemias y otros cánceres de la infancia. Para varios de los cánceres más comunes, el diagnóstico temprano, la cirugía apropiada y la radioterapia local permiten la recuperación a una gran proporción de pacientes.
Los métodos actuales de tratamiento de cáncer son relativamente no selectivos. La cirugía retira el tejido enfermo, la radioterapia encoge los tumores sólidos y la quimioterapia inactiva las células que se dividen rápidamente. La quimioterapia en particular, produce numerosos efectos secundarios, en algunos casos tan graves que impiden el uso de fármacos potencialmente eficaces. Además, los cánceres desarrollan a menudo resistencia a fármacos quimioterapéuticos.
Se han realizado numerosos esfuerzos para mejorar la especificidad de la terapia del cáncer. Para una revisión, véase Kohn y Liotta (1995) Cancer Res. 55:1856-1862. En particular, la identificación de antígenos de superficie celular expresados exclusivamente de forma preferente en determinados tumores permite la formulación de estrategias de tratamiento más selectivas. Se han usado anticuerpos dirigidos contra estos antígenos en inmunoterapia de varios tipos de cánceres.
La unidad estructural de inmunoglobulina (Ig) básica en sistemas vertebrados está compuesta por dos cadenas polipeptídicas ligeras ("L") idénticas (aproximadamente 23 kDa), y dos cadenas pesadas ("H") idénticas (aproximadamente de 53 a 70 kDa). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y". En la base de la Y, las dos cadenas H están unidas por enlaces disulfuro covalentes.
La Figura 1 muestra un esquema de una estructura de anticuerpo. Las cadenas L y H están compuestas cada una de una región variable (V) en el extremo N, y una región constante (C) en el extremo C. En la cadena L, la región V (denominada "V_{L}J_{L}") está compuesta por una región V (V_{L}) conectada por la unión de la región (J_{L}) a la región C (C_{L}). En la cadena H, la región V (V_{H}D_{H}J_{H}) está compuesta por una región variable (V_{H}) unida por una combinación de la región de diversidad (D_{H}) y la región de unión (J_{H}) a la región C (C_{H}). Las regiones V_{L}J_{L} y las regiones V_{H}D_{H}J_{H} de las cadenas L y H, respectivamente, se asocian en las puntas de la Y para formar la parte de unión a antígeno y determinar la especificidad de unión a antígeno.
La región (C_{H}) define el isotipo, es decir, la clase o subclase del anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes isotipos difieren significativamente en sus funciones efectoras, tales como la capacidad de activar complemento, unirse a receptores específicos (por ejemplo, receptores Fc) presentes en una amplia diversidad de tipos celulares, cruzar barreras de mucosa y placentarias y formar polímeros de la molécula IgG básica de cuatro cadenas.
Los anticuerpos se clasifican en "clases" de acuerdo con el tipo C_{H} utilizado en la molécula de inmunoglobulina (IgM, IgG, IgD, IgE, o IgA). Hay al menos cinco tipos de genes de C_{H} (C\mu, C\gamma, C\delta, C\varepsilon, y C\alpha), y algunas especies tienen múltiples subtipos C_{H} (por ejemplo, C\gamma_{1}, C\gamma_{2}, C\gamma_{3}, y C\gamma_{4}, en seres humanos). Hay un total de nueve genes C_{H} en el genoma haploide de seres humanos, ocho en ratón y rata y varios menos en muchas otras especies. Por el contrario, normalmente hay solamente dos tipos de regiones C de cadena L (C_{L}), kappa (\kappa) y lambda (\lambda), y solamente una de estas regiones C está presente en una proteína de cadena L única (es decir, solamente hay una región C de cadena L posible para cada V_{L}J_{L} producida). Cada clase de cadena H se puede asociar con las clases de cadena L (por ejemplo, una región C_{H}\gamma puede estar presente en el mismo anticuerpo como una cadena L \kappa o \lambda), aunque las dos regiones C de las cadenas H y L dentro de una clase particular no variarán con la especificidad del antígeno (por ejemplo, un anticuerpo IgG tiene siempre una región C de cadena H C\gamma independientemente de la especificidad del antígeno).
Cada una de las regiones V, D, J y C de las cadenas H y L están codificadas por diferentes secuencias genómicas. Se genera la diversidad de anticuerpos por recombinación entre los diferentes segmentos génicos V_{H}, D_{H}. y J_{H} en la cadena H y segmentos génicos V_{L} y J_{L} en la cadena L. La recombinación de los diferentes genes V_{H}, D_{H}. y J_{H}, se consigue por recombinación de ADN durante la diferenciación de células B. En resumen, la secuencia de cadena H se recombina en primer lugar para generar un complejo de D_{H}, J_{H} y después un segundo suceso de recombinación produce un complejo V_{H}D_{H}J_{H}. Se produce una cadena H funcional después de la transcripción seguido por corte y empalme del transcrito de ARN. La producción de una cadena H funcional desencadena la recombinación de las secuencias de cadena L para producir una región V_{L}J_{L} redispuesta, que a su vez, forma una región V_{L}J_{L}C_{L} funcional, es decir, la cadena funcional L_{.}
El valor y el potencial de anticuerpos como reactivos de diagnóstico y terapéuticos se han reconocido durante largo tiempo en la técnica. Desafortunadamente, el campo se ha ralentizado por los lentos procesos tediosos requeridos para producir grandes cantidades de un anticuerpo de una especificidad deseada. Las técnicas de fusión celular clásicas permitidas para la producción eficaz de Mab fusionando la célula que produce el anticuerpo con una línea celular inmortalizada. La línea celular resultante es una línea celular de hibridoma.
Los anticuerpos y los derivados funcionales de los mismos se han usado en una diversidad de escenarios clínicos. Por ejemplo, se usaron fragmentos de anticuerpo Mab específicos para digoxina para tratar intoxicación por digitales con riesgo para la vida. Los anticuerpos cada vez son más útiles de forma rutinaria en técnicas de diagnóstico tales como radio inmuno diagnóstico de cánceres de colon. Koda et al. (1995) Am. J. Gastroenterol. 90:1644. Varios usos de Mab, que anteriormente se pensaban que no se podían usar, se han puesto en práctica recientemente. Por ejemplo, véase Hall (1995) Science 279: 915-916.
Se encuentran varios autoanticuerpos (anticuerpos que reconocen y se unen a auto antígenos) en seres humanos. Muchos de los mismos se asocian a enfermedades particulares tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, cirrosis biliar primaria, polimiositis, vasculitis sistémica, glomérulo nefritis necrotizante idiopática y esclerosis lateral amiotrófica. Para una revisión, véase Shattner (1986/1987) Immunol. Lett. 14:143-153. Otros autoanticuerpos son de origen natural. Lutz y Wipp (1982) J. Immunol. 128:1965; y Guilbert et al. (1982) J. Immunol. 128:2889-2787. Recientemente se han detectado autoanticuerpos humanos para antígenos de cáncer específicos, y en algunos casos, se han producido por la tecnología de hibridoma. Estos anticuerpos también se han producido por inmunización activa. Patente de Estados Unidos Nº 5.474.755. De forma original, las células B humanas se inmortalizaron usando Virus de Epstein-Barr o mielomas de ratón. Para una revisión, véase Buck et. al. (1984) "Monoclonal Antibodies" NY, Plenum Press. Técnicas más recientes han permitido la inmortalización sin el uso de este virus potencialmente dañino. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.618.477; y Glassy (1987) Cancer Res. 47:5181-5188. En la mayoría de los casos, los anticuerpos son específicos para uno, o en algunos casos, unos pocos tipos de cáncer. Por ejemplo, se ha descrito un Mab que reconoce específicamente células de glioma pero no otras células tumorales o normales. Estos anticuerpos se usaron para formar las imágenes del glioma en el cerebro del paciente. Fischer et al. (1991) Immunobiol. Prot. Pep. VI (M. Atassi, ed.) Plenum Press, NY págs. 263-270. No se ha descrito ningún anticuerpo que sea capaz de reconocer una amplia diversidad de tumores al mismo tiempo que no reconoce, o reconoce de forma deficiente, células normales no cancerosas.
Las técnicas genéticas recombinantes han permitido la clonación y expresión de anticuerpos, fragmentos funcionales de los mismos y los antígenos reconocidos. Estos anticuerpos modificados por ingeniería genética proporcionan métodos de producción y modalidades de tratamiento novedosos. Por ejemplo, se han expresado fragmentos de inmunoglobulina funcionales en bacterias y semillas y plantas transgénicas de tabaco. Skerra (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:256-262; Fiedler and Conrad (1995) Bio/Technology 13: 1090-1093; Zhang et al. (1993) Cancer Res. 55:3384-3591; Ma et al. (1995) Science 268:916; y, para un revisión de los anticuerpos sintéticos, véase Barbas (1995) Nature Med 1:836-839.
Se han producido y caracterizado varios Mab humanos contra antígenos asociados a tumores. Los antígenos asociados a tumores reconocidos por Mab humanos incluyen antígenos de superficie celular, citoplásmicos y nucleares. Yoshikawa et al. (1989) Jpn. J. Cancer Res. (Gann) 80:546-553; Yamaguchi et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2416-2420; Haspel et al. (1985) Cancer Res. 45:3951-3961; Cote et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2959-2963; Glassy (1987) Cancer Res. 47:5181-5188; Borup-Christensen et al. (1987) Cancer Detect. Prevent. Suppl. 1:207-215; Haspel et al. (1985) Cancer Res. 45:3951-3961; Kan-Mitchell et al. (1989) Cancer Res. 49:4536-4541; Yoshikawa et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:1122-1133; and McKnight et al. (1990) Human Antibod. Hybridomas 1:125-129.
Se han usado Mab humanos e información de imágenes, diagnóstico y terapia de cáncer. Olsson (1985) J. Nat. Cancer Inst. 75:397-404; Larrick and Bourla (1986) J Biol. Resp. Mod. 5:379-393; McCabe et al. (1988) Cancer Res. 48:4348-4353; Research News (1993) Science 262:841; Ditzel et al. (1994) Cancer 73 :858-863; and Alonso (1991) Am. J. Clin. Oncol. 4:463-471. Se ha informado de un anticuerpo bioespecífico de cadena única recombinante que tiene una alta toxicidad para celulares tumorales. Esta molécula reconoce tanto el antígeno CD3 de las células T humanas como EpCAM, que se asocia a células tumorales diseminadas en pacientes con cáncer colo-rectal residual mínimo. Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025.
Se informaron varios anticuerpos anti-GD2 monoclonales murinos que suprimían el crecimiento de tumores de origen neuroectodérmico en ratones atímicos (nu/nu) o que provocaban remisión en pacientes con melanoma metastático. Un anticuerpo anti-GD2 quimérico anti-ratón provocó remisión en pacientes con neuroblastoma metastático. El mecanismo de acción de los anticuerpos se considera que implica la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad mediada por complemento (CMC). Se han obtenido respuestas clínicas tratando melanoma con Mab contra GM2, GD2 y GD3. Cheresh et al. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:5155-5159. La inmunización activa con una vacuna de gangliósido que comprende GM2 produjo anticuerpos anti-GM2 en 50/58 pacientes, que sobrevivieron más tiempo que la media de los pacientes sin anticuerpo anti-GM2 detectable.
También se ha observado que los Mab de GD2 reaccionan específicamente con carcinoma pulmonar microcítico. Cheresh et al. (1986) Cancer Res. 46:5112-5118. También se han producido Mab humanos específicos para otros cánceres incluyendo de pulmón, melanoma, estómago, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cuello de útero y carcinoma mamario. Murakami (1985) in Vitro Cell. Dev Biol. 21:593; Schadendorf (1989) J. Immunol. 142:1621-1625; Yoshikawa et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:1122-1133; Pickering and Misra (1984) Clin. Immunol. Immunopathol. 32:253-260; Hagiwara and Sato (1983) Mol. Biol Med 1:245-252; and Schlom et al. (1980) Proc. Natl. Acad Sci. USA 77:6841-6845. También se han sugerido Mab anti-cáncer humanos y los antígenos que reconocen para el uso en vacunas. Véase, por ejemplo, Finn et al. (1995) Immunol. Rev. 145:61-89. Se usó un Mab humano para tumores cerebrales malignos en un ensayo clínico de fase I sin efectos secundarios adversos. Matsumoto et al. (1994) The Clinical Report 28:118-126. También se han informado resultados de ensayo de Fase II de tratamiento combinado con Mab murino y factor estimulante de colonias en cáncer gastrointestinal metastático. Saleh et al. (1995) Cancer Res. 55:4339-4346. También se ha observado que una inmuno toxina de cadena única cura meningitis carcinomatosa en un modelo de rata. Pastan et al. (1995) Proc. Nail. Acad Sci. USA 92:2765-2769. Se ha demostrado que Mab humanos que reconocen específicamente células de cáncer ovárico forman de forma eficaz las imágenes de este cáncer. Chaudhuri et al. (1994) Cancer 73: 1098-1104.
Si hubiera una estrategia simple y fiable para proporcionar reactividad inmune contra un antígeno común para estos cánceres en vez de una inmunidad específica de cáncer, las previsiones clínicas de cánceres mejorarían en general.
Descripción de la invención
Esta invención incluye composiciones que contienen fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo, donde el anticuerpo reconoce específicamente el antígeno reconocido por un anticuerpo que comprende una región V de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, y una región V de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 5. Los fragmentos de unión a antígeno comprenden al menos siete restos de aminoácidos consecutivos de la región CDR3 de la cadena pesada de la SEC ID Nº 2. Preferiblemente, el anticuerpo es H11. La invención incluye adicionalmente anticuerpos que comprenden las regiones V de la cadenas H y L de la cadena H11 (SEC ID Nº 2 y 5, respectivamente). El H11 reconoce específicamente células cancerosas de una amplia diversidad de cánceres pero no reconoce células normales no cancerosas. Por "no reconoce" se quiere decir que las células no cancerosas no se unen específicamente a H11 o se reconocen sólo de forma deficiente por el anticuerpo. Los anticuerpos se denominan \alphaC e incluyen H11 y cualquier anticuerpo con la "especificidad inmunológica" de H11, es decir, que reconocen el antígeno reconocido por H11, y que es específico para al menos un tipo de célula cancerosa pero que no reconoce células normales. Estos fragmentos de unión al antígeno incluyen, pero sin limitación, anticuerpos nativos completos, ilustrados por H11; anticuerpos biespecíficos; anticuerpos quiméricos; Fab, Fab', fragmentos de región V de cadena única (scFv) y polipéptidos de fusión.
La invención incluye adicionalmente moléculas de fusión de anticuerpo H11 que comprenden una región de polipéptidos con una molécula antigénica, terapéutica, tóxica o de marcado unida a la región C de la cadena H, una región V_{H}-V_{L} o V_{L}-V_{H} V de cadena única y polinucleótidos que codifican tales polipéptidos.
También se describen en la presente memoria polipéptidos que tienen la especificidad inmunológica de H11, donde el polipéptido comprende al menos 5 aminoácidos consecutivos de una región V de un anticuerpo \alphaC. La región V puede ser de una cadena L o una cadena H. Los 5 aminoácidos consecutivos juegan preferiblemente un papel en la especificidad inmunológica, y pueden ser de una CDR (Región Determinante de Complementariedad de un anticuerpo). Se incluyen H11 intacto, fragmentos funcionalmente activos de H11, proteínas de fusión, anticuerpos quiméricos, proteínas antigénicas múltiples, y otros derivados de polipéptidos de anticuerpos \alphaC. Son de especial interés las regiones V de cadena única y las proteínas de fusión.
Los compuestos y las composiciones de esta invención se pueden usar, entre otras cosas, para detectar o tratar un cáncer; incluyendo la terapia de dicho cáncer, y cuidados profilácticos, particularmente para disminuir el riesgo de recurrencia.
La invención incorpora adicionalmente células y líneas celulares que producen los fragmentos de unión al antígeno \alphaC.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con la especificidad inmunológica de H11, donde el polipéptido codificado comprende al menos 5 aminoácidos consecutivos de una región V de H11. La región V puede ser de la cadena L o la cadena H de H11. Los 5 aminoácidos consecutivos juegan preferiblemente un papel en la reactividad inmunológica de H11 y pueden ser de una CDR. La región V de H11 se ha observado que tiene una región pequeña de homología con un anticuerpo denominado A6. Los péptidos comprendidos solamente en esta región de homología y que carecen de otros restos de aminoácidos específicos para H11 están específicamente excluidos de la invención reivindicada. Se describe A6 en el documento WO953574.
En la presente memoria se describen polinucleótidos aislados de al menos 20 nucleótidos consecutivos capaces de formar un dúplex estable con las secuencias codificadas desde cadena L o H de H11, pero no con secuencias de otras moléculas de inmunoglobulina que se han descrito previamente. Cualquiera de estos polinucleótidos puede estar en la forma de vectores de clonación, vectores de expresión, o se puede transfectar en células hospedadoras.
Una realización adicional de esta invención se refiere al tratamiento profiláctico de un paciente con cáncer con al menos un fragmento de unión al antígeno \alphaC. En particular, la invención proporciona el uso de un fragmento de unión a un antígeno de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar neoplasia. Preferiblemente, se fusiona \alphaC a una molécula terapéutica para realizar el suministro de la molécula terapéutica a la célula cancerosa. El individuo puede tener un tumor clínicamente detectable, o el tumor puede haberse tratado previamente y haberse convertido en indetectable. El uso puede ser para paliar la enfermedad, o para disminuir el riesgo de recurrencia.
También se describe en la presente memoria un kit para la detección o cuantificación del antígeno reconocido por \alphaC (en lo sucesivo en la presente memoria, el "antígeno C") en una muestra, que comprende H11 o un polipéptido de esta invención en un envase adecuado. También se realizan en la invención métodos para detectar el antígeno C o células que expresan el antígeno C empleando un reactivo o un kit realizado en esta invención.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra un esquema de la estructura general de anticuerpo.
La Figura 2 ilustra análisis citrométricos de flujo de células reconocidas por H11.
La Figura 3 ilustra análisis citrométricos de flujo de células reconocidas por H11.
La Figura 4 ilustra análisis citrométricos de flujo de células reconocidas por H11. A es A-375 (melanoma), B es SKMG-1 (glioma), C es SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama), D es HT-29 (adenocarcinoma de colon), E es MB-468 (carcinoma de mama) y F es T47D (carcinoma de mama).
La Figura 5 ilustra la unión de H11 a extractos de células tumorales. Las barras claras representan H11 y las barras oscuras representan el anticuerpo de control.
La Figura 6 ilustra la unión de H11 a extractos de células tumorales.
La Figura 7 ilustra la unión de H11 a líneas de células tumorales humanas por ELISA de célula fijada. Las barras claras son IgM H11 y las barras oscuras son IgM de control.
La Figura 8 ilustra un esquema del vector de expresión pSJF1.
La Figura 9 ilustra la determinación de las similitudes antihigiénicas entre el Mab H11 y H11-scFv por ELISA fijado por células. Se determinó la reactividad por anticuerpos de conejo para H11 scFv.
La figura 10 ilustra la intensidad de fluorescencia relativa de H11-scFv biotinilado (línea gruesa) y BGA scFv (línea delgada) de células de linfoma.
La figura 11 ilustra la titulación de la reactividad de H11-scFv biotinilado para la unión a células de linfoma, RAMOS, Daudi, CA-46 y células CCRF-CM como se determinan por ELISA de células fijadas. Las concentraciones de anticuerpos disminuyen de unos 10 \mug/ml iniciales (barra abierta) a 5 \mug/ml, después 2,5 \mug/ml y finalmente 1,25 \mug/ml (línea sombreada con dobles cruces).
La Figura 12 ilustra la intensidad de fluorescencia relativa de H11-scFv y scFv de control que se une a líneas de células tumorales. A es A-375 (melanoma) B es SK-BR-3 (adenocarcinoma de mama), C es HT-29 (adenocarcinoma de colon), D es CA-46 (linfoma de Burkitt), E es RAMOS (linfoma de Burkin), F es H9 (linfoma de células T) y G es CCRF-CEM (linfoma linfoblastoide agudo).
La Figura 13 ilustra la unión de ^{125}I-H11-scFv a células LS174T.
La Figura 14 ilustra la unión de ^{111}I-H11-scFv a A375.
La Figura 15 ilustra el vector de expresión de mamífero pNB2 usado para transfectar y expresar H11-IgG recombinante.
La Figura 16 ilustra el vector de expresión de mamífero pNB3 usado para transfectar y expresar H11-IgG recombinante.
La Figura 17 ilustra la purificación de ^{125}I-H11-scFv en una mini columna de P-2 (A) y análisis de ^{125}I-H11-scFv por cromatografía de papel en metanol al 85% (B).
La Figura 18 ilustra la purificación ^{125}I-H11 IgM en una mini columna de Sephadex G-25 (A) y análisis de ^{125}I-H11 IgM por cromatografía de papel en metanol al 85% (B).
La figura 19 ilustra la purificación de ^{111}In-DTPA-H11-scFv en una mini columna Sephadex G-50 (A) y análisis de ^{111}In-DTPA-H11-scFv por ITLC-SG/citrato 0,1 M (B).
La figura 20 ilustra la unión in vivo de ^{111}In-H11-scFv a tumores de xenoinjerto de A375 en ratones desnudos.
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Mejor modo de realizar la invención
Esta invención incluye fragmentos de unión a antígeno ilustrados por Mab humano identificado recientemente que reconoce específicamente células cancerosas. Esta especificidad se extiende solamente a células cancerosas, y el anticuerpo no reconoce células no cancerosas. El anticuerpo ejemplar se denomina H11 y las regiones variables se codifican por la SEC ID Nº 1 y 4 (siendo las SEC ID Nº 3 y 6 las cadenas complementarias de 1 y 4 respectivamente.) y reconoce el antígeno denominado "antígeno C". La especificidad de H11 incluye, pero sin limitación, glioblastoma, neuroblastoma, melanoma maligno, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de próstata.
Como se muestra en los ejemplos de la presente memoria, H11 y H11-scFv no reconocen células no cancerosas de todos los tejidos normales ensayados. H11 y los fragmentos de unión al antígeno \alphaC, por lo tanto, son útiles para paliar las afecciones clínicas relacionadas con una amplia diversidad de cánceres. La invención comprende elementos de unión al antígeno que reconoce el antígeno H11 para el que es específico (denominado antígeno C). La invención comprende adicionalmente derivados polipeptídicos de H11. Estas composiciones se pueden usar en el diagnóstico, el tratamiento, y la fabricación de reactivos novedosos. La invención incluye adicionalmente polinucleótidos que codifican \alphaC H11 y derivados de los mismos. También se describen en la presente memoria métodos para el uso de los mismos.
La invención incluye adicionalmente derivados de \alphaC con especificidad inmunológica para el antígeno C. Estos derivados comprenden regiones de una secuencia polipeptídica que comprende parte de la unión VDJ de H11. También se incluyen regiones que abarcan al menos una, preferiblemente 2, y más preferiblemente 3 o más de las secuencias de aminoácidos de CDR H11.
Las secuencias completas de las regiones C de cadena L y H de H11 todavía no se han determinado, pero se espera que sean idénticas o prácticamente idénticas a las de otras moléculas de inmunoglobulinas humanas. Además, el conocimiento de las secuencias de aminoácidos de la región V permite la subclonación con cualquier región C. Tales técnicas de subclonación se conocen bien en la técnica. Las moléculas quiméricas producidas por estas técnicas de clonación también están incluidas en la invención.
La exploración de una biblioteca de fagos de heptapéptidos disponible en el mercado con H11 IgM y clones de anticuerpos scFv han mostrado una secuencia consenso muy fuerte en el extremo N que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Phe-His-Arg-Tyr-Ser/Thr. Los resultados se muestran en la Tabla 1
TABLA 1
1
Las secuencias de ADN usan múltiples codones, indicando origines de fagos muy diferentes. Por ejemplo, la Arg está codificada por las familias de tripletes CGx y AGx. Además, la comparación del pentapéptido de H11 consenso con bases de datos de secuencias mostró homología con la familia S100 de proteínas de unión a Ca^{2+}. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
2
Determinados compuestos, composiciones y métodos que se describen en esta solicitud se refieren generalmente a \alphaC y derivados que se generan de forma rutinaria mediante técnicas clásicas de inmunoquímica. Esto incluye \alphaC que se ha acoplado a otro compuesto por conjugación química, o por mezcla con un excipiente o un adyuvante. La expresión de fragmentos de unión al antígeno incluye cualquier péptido que se une al antígeno C de un modo específico para célula cancerosa. Típicamente, esos derivados incluyen fragmentos de inmunoglobulinas tales como Fab (Fab')_{2}, Fab', scFv (tanto formas monoméricas como poliméricas) y cadenas H y L aisladas. Un fragmento de unión antígeno conserva la especificidad de H11, aunque la avidez y/o la afinidad pueden estar alteradas. Se prefiere especialmente el H11-scFv que se describe en la presente memoria.
Los fragmentos de unión a antígeno (también denominados "derivados") en la presente memoria) se generan típicamente por ingeniería genética, aunque se pueden obtener alternativamente mediante otros métodos y combinaciones de métodos. Esta clasificación incluye, pero sin limitación, fragmentos de péptidos modificados genéticamente y péptidos de fusión. Los compuestos preferidos incluyen fragmentos polipeptídicos de las CDR de H11, proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden componentes efectores de citocinas, proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden adyuvantes o fármacos, y proteínas de región V de cadena única.
La invención comprende adicionalmente polinucleótidos que codifican las regiones V del anticuerpo H11 y derivados del mismo. Los mismos incluyen fragmentos de polinucleótidos aislados, polinucleótidos recombinantes, y plásmidos y vectores terapéuticos, tales como vectores vaccinia, que comprenden los polinucleótidos. Estos polinucleótidos se ilustran por las SEC ID Nº 1, 3, 4, 6, 13, 15, 16 y 18.
Las composiciones farmacéuticas y las modalidades de tratamiento de esta invención son adecuadas para suscitar una respuesta inmune contra neoplasia. Los pacientes humanos con cáncer, incluyendo, pero sin limitación, glioblastoma, melanoma, neuroblastoma, adenocarcinoma, glioma, sarcoma de tejidos blandos, y diversos carcinomas (incluyendo el cáncer microcítico de pulmón) son sujetos especialmente apropiados.
Ya que H11 se ha demostrado que reconoce específicamente una diversidad de carcinomas, es particularmente útil en el diagnóstico, la formación de imágenes y el tratamiento de carcinomas. Los carcinomas adecuados, incluyen cualquiera conocido en el campo de la oncología, incluyendo, pero sin limitación, astrocitoma, oligodendroglioma, ependimoma, meduloblastoma, tumor ectodérmico neural primitivo (PNET), adenocarcinoma ductal pancreático, adenocarcinomas pulmonares microcíticos y no microcíticos, carcinoma de células escamosas, carcinoma bronqueo alveolar, adenocarcinoma epitelial, y metástasis hepáticas de los mismos, hepatoma, colangiocarcinoma, tumores de mama tales como adenocarcinoma ductal y lobular, carcinomas escamosos y adenocarcinomas del cuello del útero, carcinomas epiteliales uterinos y ováricos, adenocarcinomas prostáticos, carcinoma de células escamosas transicionales de la vejiga, linfomas de células B y T (nodular y difuso) plasmocitoma, leucemias aguas y crónicas, melanoma maligno, sarcomas de tejidos blandos y leiomiosarcomas.
Los sujetos pueden tener una forma avanzada de la enfermedad, en cuyo caso el objetivo del tratamiento puede incluir mitigación o inversión de la progresión de la enfermedad, y mitigación de los efectos secundarios. Los sujetos pueden tener un historial de la afección para la que ya se han tratado, en cuyo caso el objetivo incluirá típicamente una disminución o demora del riesgo de recurrencia.
Adicionalmente, los fragmentos de unión al antígeno de esta invención se pueden usar como reactivos de diagnóstico y de formación de imágenes. Estas aplicaciones se describen con más detalle en las siguientes secciones.
"H11" es un anticuerpo obtenido por la fusión de linfocitos de sangre periférica de un hombre de 64 años de edad con un glioma de grado bajo y fusionada a una línea celular de mieloma humana para producir un hibridoma denominado NBGM1/H11. La generación y caracterización de H11 se describe en el Ejemplo 1. "\alphaC" representa cualquier anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, monoclonal, policlonal o derivado del mismo que reconoce específicamente el antígeno C y distingue entre células cancerosas y no cancerosas. \alphaC incluye H11.
"Actividad inmunológica" de \alphaC se refiere a la capacidad de unirse específicamente al anfígeno C. Tal unión puede suscitar o no una respuesta inmune. Una respuesta inmune específica puede comprender anticuerpos, células B, células T y cualquier combinación de las mismas y las funciones efectoras que se producen a partir de los mismos. Se incluyen las funciones medidas por anticuerpos DAC y citolisis mediada por complemento (CDC). La respuesta de células T incluye la función de célula T auxiliar, la función de células T citotóxicas, la función de células T de inflamación/inducción, y la supresión mediada por células T. Un compuesto capaz de suscitar una respuesta inmune especifica de acuerdo con cualquiera de estos criterios se denomina "inmunogénica".
La "actividad" o "función" de \alphaC se refiere a cualquiera de las actividades inmunológicas de \alphaC o a cualquier otra actividad biológica adscrita a H11 en esta descripción, incluyendo el papel de H11 en la detección, mitigación o paliación de cáncer.
La "región V" de H11 se refiere a la región V de la cadena H de H11 o la región V de la cadena L de H11, sola o en combinación. Estas regiones V se ilustran en las SEC ID Nº 2 y 5; el ADN que codifica estas regiones se ilustra en las SEC ID Nº 1 y 4 respectivamente.
GM-CSF, IL-2, y otras moléculas biológicamente activas a las que se hace referencia en la presente memoria quieren decir que incluyen fragmentos y derivados basados en la respectiva molécula parental que tiene la misma función biológica o fisiológica.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a polímeros de restos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos y puede estar interrumpido por restos químicos diferentes de aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácido que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente bien de marcado o bioactivo. A menos que se indique o esté implicado de otro modo, el término \alphaC o H11 incluye cualquier monómero o polímero polipeptídico con especificidad inmunológica de H11, incluyendo el anticuerpo \alphaC intacto, y polipéptidos funcionalmente equivalentes más pequeños y más grandes.
Un "polipéptido de fusión" es un polipéptido que comprende regiones en una posición diferente en la secuencia de lo que sucede en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en proteínas separadas y se juntan en el polipéptido de fusión; pueden existir normalmente en la misma proteína pero se ponen en una nueva posición en el polipéptido de fusión; o se pueden disponer sintéticamente. Por ejemplo, como se describe a continuación, la invención incluye proteínas recombinantes (y los polinucleótidos que codifican las proteínas) que comprenden una parte funcional de \alphaC y una toxina. Los métodos para hacer estas proteínas de fusión se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO93/07286.
Un "fragmento funcionalmente equivalente" de un polipéptido \alphaC varía de la secuencia nativa por cualquier combinación de adiciones, deleciones, o sustituciones mientras que se conserva al menos una propiedad funcional del fragmento para el contexto en el que usa. Un fragmento funcionalmente equivalente de un polinucleótido \alphaC codifica un polipéptido que es funcionalmente equivalente a H11 cuando se produce por un sistema de expresión, o tiene una especificidad de hibridación similar que un polinucleótido H11 cuando se usa en un ensayo de hibridación. Un fragmento funcionalmente equivalente de un polipéptido \alphaC tiene típicamente una o más de las siguientes propiedades: capacidad de unirse al antígeno C; capacidad de unirse al menos a un tipo de célula cancerosa de un modo específico; y una capacidad de suscitar una respuesta inmune con una especificidad de antígeno similar a la suscitada por H11.
Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier análogo de combinación. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye moléculas de doble cadena, monocatenarias y de triple hélice. A menos que se especifique o requiera de otro modo, cualquier realización de la invención descrita en la presente memoria que sea un polinucleótido incluye tanto la forma bicatenaria y cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o predichas que establecen la forma bicatenaria del ADN, RNH o moléculas híbridas.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribocimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, muestras de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos enlazadores tales como fluororibosa y tioato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede estar modificado adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente de marcado. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son capuchones, sustitución de uno más de los nucleótidos de origen natural con un análogo e introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, a iones metálicos, componentes de marcado, otros polinucleótidos, o un soporte sólido.
El término polinucleótido "recombinante" se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc, de origen semisintético, o sintético que no sucede en la naturaleza o está unido a otro polinucleótido en una disposición no natural.
Un "vector" se refiere a un plásmido o virus de ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que se tiene que suministrar a una célula diana, in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para propósitos de terapia, y puede estar opcionalmente en la forma de un casete de expresión. Como se usa en la presente memoria, un vector no necesita ser capaz de replicación en la célula o sujeto diana final. El término incluye detectores de clonación para la replicación de un polinucleótido, y vectores de expresión para la traducción de una secuencia que codifica un polinucleótido. También están incluidos vectores virales, que comprenden un polinucleótido encapsidado o envuelto en una partícula viral.
Una "línea celular" o un "cultivo celular" se refieren a células bacterianas, vegetales, de insecto o de eucariotas superiores que crecen o se mantienen in vitro. Los descendientes de una célula pueden no ser completamente idénticos (morfológicamente, genotípicamente, o fenotípicamente) a la célula parental. Se puede producir un Mab por un hibridoma u otra célula. Los métodos para hacer hibridomas, tanto murinos como humanos, se conocen en la técnica. Se describen métodos particulares para producir hibridomas humanos y se hace referencia a los mismos a lo largo de la memoria descriptiva.
Una "célula hospedadora" indica una célula procariota o eucariota que se ha alterado genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente por administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente alteradas, el término se refiere tanto a la célula alterada originalmente como a la progeniedad de la misma.
"Heterólogo" significa obtenido de una entidad genotípicamente diferente del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, un polinucleótido se puede poner por técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector obtenido de una fuente diferente, y ser un polinucleótido heterólogo. Un promotor retirado de esta secuencia codificante relativa y unido de forma funcional a una secuencia codificante diferente de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.
Un "péptido señal" o " secuencia líder" es una secuencia de aminoácidos corta que se dirige a una proteína sintetizada recientemente a través de una membrana celular, habitualmente el retículo endoplásmico en células eucariotas, y la membrana interna, tanto las membranas internas como externas de bacterias. Los péptidos señal están típicamente en la parte N-terminal de un polipéptido y se retiran típicamente enzimáticamente entre la biosíntesis y la secreción del polipéptido de la célula. El péptido señal no está presente en la proteína secretada, solamente durante la producción de proteínas.
Un polinucleótido o polipéptido "aislado" es uno que está sustancialmente libre de los materiales con los que se asocia en su entorno nativo. Por sustancialmente libre se quiere decir al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80% e incluso más preferiblemente al menos el 90% libre de estos materiales.
Un "dúplex estable" de polinucleótidos, o un "complejo estable" formado entre cualquiera de dos o más componentes en una reacción bioquímica, se refiere a un dúplex o un complejo que tiene una durabilidad suficiente para persistir entre la formación del dúplex o complejo y la detección posterior, incluyendo cualquier etapa de lavado opcional u otra manipulación que pueda producirse entre medias.
Una "muestra biológica" incluye una diversidad de tipos de muestras, incluyendo muestras sanguíneas y de otros líquidos de origen biológico, muestras de tejidos sólidos tales como muestras de biopsia o de cultivos tisulares o células obtenidas de los mismos y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que se han manipulado de cualquier modo después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización, o acumulación de determinados componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. El término incluye diversos tipos de muestras clínicas obtenidas de cualquier especie, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, y lisados celulares. Particularmente, para los propósitos descritos en la presente memoria, las muestras biológicas comprenden tejido tumoral o tejido que se piensa que es tumoral y que se obtienen, por ejemplo, por resección quirúrgica, biopsia, aspiración o cualquier método conocido en la técnica.
Un "inmunógeno" se refiere a una composición para uso humano o animal, que se administra con la intención de conferir al receptor un grado de reactividad inmunológica específica contra un antígeno particular. La reactividad inmunológica se puede realizar por anticuerpos o células (particularmente células B, células plasmáticas, células auxiliares T y linfocitos T citotóxicos, y sus precursores) que son inmunológicamente reactivos contra la diana, o cualquier combinación de los mismos. Para los propósitos de esta invención, la diana es principalmente antígeno C asociado al tumor o una parte específica del tumor del mismo. La reactividad inmunológica se puede desear para propósitos experimentales, para el tratamiento de una afección particular, para la eliminación de una sustancia particular, o para la profilaxis. Un inmunógeno activo tiene por objeto suscitar una respuesta inmune que persista en la ausencia de los componentes de la vacuna.
"Adyuvante" como se usa en la presente memoria tiene varios significados, que dependerán todos claramente del contexto en el que se usa el término. En el contexto de una preparación farmacéutica, un adyuvante es un agente químico o biológico dado en combinación con o fusionado recombinantemente con un antígeno para mejorar la inmunogenecidad del antígeno. En el contexto de diagnóstico o el tratamiento de cáncer, adyuvante se refiere a una clase de pacientes con cáncer sin masa tumoral clínicamente detectable, pero de los que se sospecha que están en riesgo de recurrencia.
Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer que se manifiesta normalmente como un tumor sólido, un tumor "clínicamente detectable" es uno que es detectable en la base de la masa tumoral; es decir, por procedimientos tales como exploración TAC, rayos X o palpación. Los hallazgos bioquímicos, histológicos o inmunológicos solos pueden ser insuficientes para cumplir esta definición.
Como se usa en la presente memoria, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o la célula que se está tratando, y se puede realizar para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen evitar el inicio o recurrencia de la enfermedad, la mitigación de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica, directa o indirecta de la enfermedad, la evitación de la metástasis, la disminución de la velocidad de la progresión de la enfermedad, la mitigación o paliación de la patología, y la remisión o pronóstico mejorado.
La "patología" asociada con una patología es cualquier afección que comprometa el bienestar, la fisiología normal, o la calidad de vida del individuo afectado. Esto puede implicar, pero sin limitación, invasión destructiva de los tejidos afectados en áreas previamente no afectadas, crecimiento a costa de la función tisular normal, actividad biológica irregular o suprimida, agravamiento o supresión de una respuesta inflamatoria o inmunológica, susceptibilidad aumentada a otros organismos o agentes patógenos, síntomas clínicos indeseables tales como dolor, fiebre, náuseas, fatiga, alteraciones del ánimo, y otras características tales como se pueden determinar por un médico a cargo del
caso.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para realizar un resultado clínico beneficioso o deseado. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más dosis. En términos de tratamiento, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para paliar, mitigar, estabilizar, invertir o ralentizar la progresión de la enfermedad, o disminuir de otro modo las consecuencias patológicas de la enfermedad. En términos de un adyuvante, una cantidad eficaz es una suficiente para mejorar la respuesta inmune al inmunógeno. La cantidad eficaz se determina generalmente por el médico en una base de caso por caso y está dentro del conocimiento de la técnica. Cuando se determina una dosificación apropiada, típicamente se tienen en cuenta varios factores. Estos factores incluyen edad, sexo y peso del paciente, la afección que se está tratando, la gravedad de la afección y la forma del anticuerpo que se están administrando. Por ejemplo, la concentración de scFv no necesita ser tan alta como la de anticuerpos nativos para ser terapéuticamente eficaz.
Un "individuo", "paciente" o "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, animales de granja, animales deportivos, y mascotas.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la especialidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Wei&C.C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., eds., 1991). Estas técnicas se pueden aplicar a los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, como tales, se pueden considerar para realizar y practicar la invención. Se discutirán técnicas particularmente útiles para realizaciones particulares en las siguientes secciones.
La invención también incluye \alphaC conjugado con un resto químicamente funcional. Típicamente, el resto es un marcador capaz de producir una señal detectable. Estos \alphaC conjugados son útiles, por ejemplo, en sistemas de detección, tales como cuantificación de carga tumoral, y formación de imágenes de focos metastáticos y formación de imágenes de tumor. Tales marcadores se conocen la técnica e incluyen pero sin limitación, radioisótopos, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, con factores de sustrato e inhibidores. Véase, para ejemplos de patentes que describen el uso de tales marcadores, las Patentes de Estados Unidos Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Los restos se pueden unir covalentemente a \alphaC, unir recombinantemente o conjugar al \alphaC por un reactivo secundario, tal como un anticuerpo secundario, proteína A o un complejo de biotina-avidina.
Otros restos funcionales incluyen péptidos señal, agentes que mejoran la reactividad inmunológica, agentes que facilitan el acoplamiento a un soporte sólido, soporte de vacunas, modificadores de respuesta biológica, marcadores y fármacos paramagnéticos. Los péptidos señal se han descrito anteriormente e incluyen formas procariotas y eucariotas. Los agentes que mejoran la reactividad inmunológica incluyen, pero sin limitación, superantígenos bacterianos. Los agentes que facilitan el acoplamiento a un soporte sólido incluyen, pero sin limitación, biotina o avidina. Los soportes inmunogénicos incluyen, pero sin limitación, cualquier tampón fisiológicamente aceptable. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen citocinas, particularmente el factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina-2, interleucina-4, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos e interferones \gamma.
Los restos de fármacos adecuados incluyen agentes antineoplásicos. Los mismos incluyen pero sin limitación, radioisótopos, alcaloides de la vinca, tales como la vinablastina, vincristina y sulfatos de vindesina, adriamicina, sulfato de bleomicina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, decarbazina, dactinomicina, clorhidrato de duanorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, etopósido, fluorouracilo, lomustina, clorhidrato de meclororetamina, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, pentozapina, pipobromano, clorhidrato de procarbazo, estreptozotocina, taxol, tioguanina, y mostaza de uracilo.
Se pueden producir inmunotoxinas, incluyendo moléculas de cadena única, mediante medios recombinantes. La producción de diversas inmunotoxinas se conocen bien la técnica, y se puede encontrar métodos, por ejemplo, en "Monoclonal Antibody-toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe et al. (1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, págs. 168-190; Vitatta (1987) Science 238:1098-1104; y Winter y Milstein (1991) Nature 349:293-299. Las toxinas adecuadas incluyen, pero sin limitación, ricina, radionúclidos, proteína antiviral de fitolaca americana, exotoxina A de Pseudomonas, toxina diftérica, cadena A de ricina, toxinas fúngicas tales como restrictocina y enzimas fosfolipasa. Véase, de forma general, "Chimeric Toxins", Olsnes and Pihl, Pharmac. Ther. 15:355-381 (1981); y "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin and Byers, págs.. 159-179, 224-266, Academic Press (1985).
Los restos químicamente funcionales se pueden hacer recombinantemente, por ejemplo, creando un gen de fusión que codifique el fragmento de unión a antígeno y regiones funcionales de otros genes (por ejemplo, enzimas). En el caso de fusiones de genes, los dos componentes están presentes dentro del mismo gen de polipéptido. Alternativamente, los fragmentos de unión a antígeno \alphaC se pueden unir químicamente al resto mediante una diversidad de procedimientos químicos bien conocidos. Por ejemplo, cuando el resto es una proteína, la unión puede ser mediante agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales, por ejemplo, SPDP, glutaraldehído de carbodiimida o similares. Los restos pueden unirse covalentemente o conjugarse, por un reactivo secundario, tal como un anticuerpo secundario, proteína A o un complejo de biotina-avidina. Los restos paramagnéticos y la conjugación de los mismos con anticuerpos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Miltenyi et al. (1990) Cytometry 11:231-238.
El anticuerpo \alphaC de esta invención se puede preparar de varias maneras. Se obtiene de la forma más práctica a partir de células modificadas genéticamente para expresar un fragmento de unión a antígeno que contiene la SEC ID Nº 5 y otros polinucleótidos que codifican fragmentos de unión a \alphaC. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en un medio adecuado, y se puede usar el medio consumido como una fuente de anticuerpos. Opcionalmente se pueden incluir canales o perlas recubiertas con matriz y co-cultivos celulares para mejorar el crecimiento de células productoras de anticuerpos. Para la producción de grandes cantidades de anticuerpos, generalmente es más práctico obtener un fluido de ascitis. El método para generar ascitis comprende generalmente inyectar células de hibridoma en un mamífero histocompatible o inmunotolerante inmunológicamente virgen, especialmente un ratón. El mamífero se puede sensibilizar para la producción de ascitis mediante administración previa de una composición adecuada; por ejemplo, Pristano.
Alternativamente, \alphaC se puede sintetizar químicamente usando datos de secuencia y otra información proporcionada en esta descripción, junto con métodos convencionales de síntesis de proteínas. Un método adecuado es la técnica de Merrifield de fase sólida. Los sintetizadores de péptidos automatizados están disponibles en el mercado tales como los fabricados por Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA).
\alphaC También se puede obtener empleando métodos recombinantes rutinarios tales como los que se describen en Sambrook et al. (1989). Por ejemplo, usando las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos (SEC ID Nº 1-6, y 13-18) y la información proporcionada en la presente memoria, se puede clonar un polinucleótido que codifica la cadena H o L de \alphaC en un vector de expresión adecuada (que contiene secuencias de control para la transcripción, tales como un promotor). El vector de expresión se introduce a su vez en una célula hospedadora. La célula hospedadora se hace crecer en condiciones adecuadas de tal forma que el polinucleótido se transcribe y se traduce en una proteína. Se pueden producir las cadenas H y L de \alphaC de forma separada y después combinar por redisposición de enlaces disulfuro. Alternativamente se pueden transfectar vectores con polinucleótidos separados que codifiquen cada cadena \alphaC o de un vector con un único polinucleótido que codifica ambas cadenas como transcritos separados, en una única célula hospedadora que después puede producir y ensamblar la molécula entera. Preferiblemente, la célula hospedadora se obtiene de un eucariota superior que puede producir el complemento de carbohidrato normal de la molécula. El \alphaC producido de este modo se puede modificar usando técnicas convencionales en la técnica. Los polinucleótidos que codifican \alphaC para usar en la producción de \alphaC se pueden obtener, a su vez, por un hibridoma que produzca un anticuerpo \alphaC o se pueden producir sintéticamente o recombinantemente a partir de las secuencias de ADN proporcionadas en la presente memoria.
Otro método para obtener \alphaC es inmunizar animales hospedadores adecuados con antígeno C y seguir procedimientos convencionales para la producción policlonal o de Mab. Los Mab producidos desde este modo se pueden "humanizar" mediante métodos conocidos en la técnica. Se proporcionan ejemplos de anticuerpos humanizados, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.530.101 y 5.585.089.
Los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos en los que al menos parte de las secuencias se ha alterado a partir de su forma inicial para convertirla en más similar a inmunoglobulinas humanas. En una versión, las regiones C de cadena H y cadena L se sustituyen por la secuencia humana. Esto es un polipéptido de fusión que comprende una región V de H11 y una región C de inmunoglobulina heteróloga. En otra versión, las regiones de CDR comprenden secuencias de aminoácidos de H11 mientras que las regiones flanqueantes V también se han convertido en secuencias humanas. Véase, por ejemplo, el documento EP 0329400. En una tercera versión, las regiones V se humanizan diseñando secuencias consenso de regiones V humanas y de ratón, y convirtiendo los restos en el exterior de las CDR que son diferentes fuera de las secuencias consenso. La invención incluye Mab humanizados.
Al producir anticuerpos humanizados, la selección de los restos flanqueantes puede ser crítica para conservar la alta afinidad de unión. En principio, una secuencia flanqueante de cualquier HuAb puede servir como la plantilla para el injerto de CDR; sin embargo, se ha demostrado que la sustitución lineal de CDR en una secuencia flanqueante de este tipo puede conducir a una pérdida significativa de la afinidad de unión al antígeno. Glaser et al. (1992) J. Immunol. 149:2606; Tempest et al. (1992) Biotechnology 9:266; and Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med 17:217. Cuanto más homólogo sea un HuAb al muAb original, con menor probabilidad introducirán las secuencias flanqueantes humanas distorsiones en las CDR murinas que podrían disminuir la afinidad. Basándose en una búsqueda de homología de secuencia frente a una base de datos de secuencia de anticuerpos, el HuAb IC4 proporciona una buena homología de secuencia flanqueante con muM4TS.22, aunque también serían adecuados otros HuAb altamente homólogos, especialmente en las cadenas L kappa del subgrupo humano I o cadenas H del subgrupo humano III. Kabat et al., (1987). Están disponibles diversos programas informáticos tales como ENCAD (Levitt et al. (1983) J. Mol. Biol. 168:595) para predecir la secuencia ideal para la región V. La invención, por tanto, incluye HuAb con diferentes regiones V. Está dentro del conocimiento del especialista de la técnica determinar secuencias de región V adecuadas y optimizar estas secuencias. Los métodos para obtener anticuerpos con inmunogenicidad disminuida también se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.270.202 y EP 699.755.
Los métodos para la producción y el aislamiento de anticuerpos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. El anticuerpo H11 es una inmunoglobulina humana de la subclase IgM y se puede aislar mediante cualquier técnica adecuada para inmunoglobulinas de este isotipo. Los métodos de purificación pueden incluir precipitación con sales (por ejemplo, con sulfato de amonio), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, en una columna de intercambio catiónica o aniónica) procesada a pH neutro y eluida con gradientes graduables con fuerza iónica creciente, cromatografía de filtración en gel (incluyendo filtración en gel de PLC), y cromatografía sobre resinas de afinidad tales como proteína A, proteína G, hidroxiapatita, y anti-inmunoglobulina. H11 también se puede purificar en columnas de afinidad que comprenden el antígeno C; por ejemplo, en la forma de un AbI o Ab3 purificado. Preferiblemente, H11 se purifica usando cromatografía Proteína A-CL-Sepharose^{TM} 4B seguido sobre cromatografía sobre una columna de intercambio iónico DEAE- Sepharose^{TM} 4B.
La invención también incluye anticuerpos híbridos, en los que un par de cadenas H y L se obtiene a partir de un anticuerpo, mientras que otro par de cadenas H y L se obtiene de un segundo anticuerpo diferente. Para los propósitos de este invención, un par de cadenas L y H es de \alphaC. En un ejemplo, cada par de cadena L-H se une a diferentes epítopos sobre el antígeno C. Tales híbridos también se pueden formar usando cadenas H o L humanizadas.
Otro \alphaC considerado por esta invención es un anticuerpo en donde la cadena H o L se ha modificado para proporcionar propiedades adicionales. Por ejemplo, un cambio en la secuencia de aminoácidos puede dar como resultado una inmunogenicidad disminuida del polipéptido resultante. Los cambios varían del cambio de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región tal como un dominio de región C. Los cambios típicos incluyen, pero sin limitación, los relacionados con la fijación de complemento, interacción con receptores de membrana, y otras funciones efectoras. Un anticuerpo recombinante también se puede diseñar para ayudar al suministro específico de una sustancia (tal como una citocina) a una célula tumoral. También se incluyen en la invención péptidos en los que diversos dominios de inmunoglobulinas se han puesto en un orden diferente del que sucede en la naturaleza.
Si se tiene que administrar \alphaC a un individuo, tiene preferiblemente al menos un 80% de pureza, más preferiblemente tiene al menos un 90% de pureza, aún más preferiblemente tiene al menos un 95% de pureza y está libre de pirógenos y otros contaminantes. En este contexto, el porcentaje de pureza se calcula como un porcentaje en peso del contenido total de proteína para la preparación, y no incluye constituyentes que se añaden de forma deliberada a la composición después de que se haya purificado el \alphaC.
Los anticuerpos \alphaC se pueden usar para varios propósitos. Los mismos incluyen suscitar una respuesta de anticuerpos para producir \alpha\alphaC que se puede usar para suscitar una respuesta de células T para \alphaC o el antígeno C y tratar diversos tipos de cáncer. Los usos se elaboran más concretamente en una sesión posterior.
La invención incluye fragmentos de polipéptidos de \alphaC que contienen al menos una parte de una región V de \alphaC. Los fragmentos preferidos son los que tienen la actividad inmunológica de H11. También se prefieren fragmentos que comprenden secuencias de aminoácidos sustancialmente diferentes de otras inmunoglobulinas, y fragmentos que comprenden una CDR. En una realización, la invención incluye un fragmento polipeptídico de la región V de la cadena H de \alphaC, que comprende al menos 25 aminoácidos consecutivos, más preferiblemente 30 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 2, ó 5 aminoácidos consecutivos de la CDR1 de la misma, o al menos 7 aminoácidos consecutivos, preferiblemente al menos 9 aminoácidos consecutivos de la CDR2 o CDR3 de la misma. La invención también incluye un fragmento de polipéptido de la región V de la cadena L de \alphaC, que comprende al menos 25 aminoácidos consecutivos, más preferiblemente 30 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 5 ó 7 aminoácidos consecutivos de la CDR2 de la misma, o al menos 8 aminoácidos consecutivos, preferiblemente 10 aminoácidos consecutivos de la CDR1 o CDR3 de la misma.
El tamaño de los polipéptidos de \alphaC puede ser solamente el tamaño mínimo requerido para proporcionar una función deseada. Los polipéptidos pueden comprender opcionalmente una secuencia adicional, virgen para \alphaC o de una fuente heteróloga si se desea. Los péptidos de \alphaC pueden contener solamente 5 aminoácidos consecutivos de una secuencia de región V de H11 que no sea igual que la región homóloga de A6. También están incluidos los polipéptidos que comprenden 7 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 10 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 15 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 25 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 50 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 75 aminoácidos de la región V de la cadena L o H de \alphaC. Incluso más preferible son polipéptidos que comprenden toda la región V de la cadena L o H de \alphaC. Preferiblemente, los polipéptidos se obtienen de H11. Preferiblemente, los polipéptidos son los scFv ilustrados en las SEC ID Nº 14 y 17.
La invención incluye polipéptidos \alphaC modificados que son funcionalmente equivalentes a H11, o tiene actividad inmunológica de H11 alterada pero medible. Se prefieren polipéptidos modificados con actividad inmunológica de H11 mejorada. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen los que tienen sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, y una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran de forma significativamente perjudicial la actividad inmunológica.
Un ejemplo de esto son los polipéptidos de H11 que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de H11 prototipo. La sustituciones pueden variar de cambiar o modificar uno o más restos de aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como la región V. Las sustituciones de aminoácidos, si están presentes, son preferiblemente sustituciones conservativas que no afectan de forma perjudicial a las propiedades de plegado o funcionales del péptido. Los grupos de aminoácidos funcionalmente relacionados dentro de los que se pueden realizar sustituciones conservativas son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano. Los polipéptidos de esta invención pueden estar en forma glicosilada o no glicosilada, se pueden modificar pos-transduccionalmente (por ejemplo, acetilación y fosforilación) o se pueden modificar sintéticamente (por ejemplo, la unión de un grupo de marcado).
Los derivados de polipéptidos H11 que comprenden tanto una cadena L de H11 como una cadena H de H11 se pueden formar como cadenas L y H separadas y después se pueden ensamblar o se pueden ensamblar in situ con un sistema de expresión para ambas cadenas. Tales sistemas de expresión se pueden crear transfectando una célula adecuada con un plásmido que comprende regiones que se pueden transcribir separadas para la cadena L y H, o co-transfectando la misma célula con plásmidos para cada cadena. En un tercer método, un plásmido adecuado con una región que codifica una cadena H se transfecta en un mutante que ha perdido la cadena H.
Los mutantes que han perdido la cadena H se pueden obtener tratando aproximadamente 2x10^{7} células productoras de H11 con IgG de conejo anti-ratón marcada con fluoresceína (específica para cadena H, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las poblaciones celulares teñidas y no teñidas se analizan en un clasificador de células activado por fluorescencia. Las células no teñidas se recogen en un tubo esterilizado y se ponen en placas de 96 pocillos con una célula/pocillo por dilución limitante. Después, los sobrenadantes de cultivo se ensayan por ELISA usando IgG de cabra anti-ratón (específica para cadena H) y kappa de cabra anti-ratón. Los clones con genotipo positivo para kappa y negativo para IgG se subclonan al menos 3 veces para obtener mutantes H11^{(-H)} estables. Se puede aislar el ARNm de clones H11^{(-H)} mutantes con pérdida de cadena H supuestos y se puede determinar la secuencia del ADNc de la región V de la cadena L. Se realiza una PCR inversa del ARNm para la V_{H} de H11 con 2 conjuntos de cebadores 3' y 5', usados para la clonación de ADNc de H11^{(-H)} (Ejemplo 7). Un mutante con pérdida de cadena H no produce ninguna banda de ADN detectable. La transfección de las células se produce con un plásmido de cadena H adecuado.
Otro derivado de \alphaC incluido en esta invención es un anticuerpo en el que la cadena H o L de \alphaC se ha modificado para proporcionar propiedades adicionales. Por ejemplo, un cambio en la secuencia de aminoácidos puede dar como resultado una mayor inmunogenicidad del polipéptido resultante. Los cambios varían de cambiar uno o más aminoácidos hasta el completo rediseño de una región tal como un dominio de la región C. Los cambios contemplados afectan a la fijación de complementos, interacción con receptores de membrana y otras funciones efectoras. Un anticuerpo H11 recombinante también se puede diseñar para ayudar al suministro específico de una sustancia (tal como una linfocina) a una célula efectora. También se incluyen en la invención proteínas en las que se han puesto diversos dominios de inmunoglobulina en un orden diferente al que se produce en la naturaleza.
La invención también incluye fragmentos de región V de cadena única ("scFv") de H11. Los fragmentos de región V de cadena única se producen uniendo regiones de cadena L y/o H usando un péptido enlazador corto. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Se puede usar cualquier péptido que tenga una flexibilidad y longitud suficientes como un enlazador en un scFv. Habitualmente, el enlazador se selecciona para que tenga de poca a ninguna inmunogenicidad. Un ejemplo de un péptido enlazador es (GGGGS)_{3}, que abarca aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi de una región V y el extremo amino de otra región V. También se pueden usar otras secuencias enlazadoras y pueden proporcionar funciones adicionales, tales como un medio para unirse a un fármaco o un soporte sólido.
Se puede usar toda o cualquier parte de la cadena H o L en cualquier combinación. Típicamente, las regiones V completas están incluidas en las scFv. Por ejemplo, la región V de cadena L se puede unir a la región V de cadena H. Alternativamente, una parte de la región V de cadena L se puede unir a la región V de cadena H o una parte de la misma. También se contemplan scFv en los que la región V de cadena H es de H11, y la región V de la cadena L es de otra inmunoglobulina. También es posible construir un scFv bifásico, en el que un componente sea un polipéptido H11 y otro componente sea un polipéptido diferente, tal como un epítopo de célula T.
Los scFv se pueden ensamblar en cualquier orden, por ejemplo, V_{H}-(enlazador)-V_{L} o V_{L}-(enlazador)-V_{H}. Por ejemplo, las SEC ID Nº 13 y 16 muestran construcciones de H11-scFv2 que tienen la forma V_{L}-(enlazador)-V_{H}. Sin embargo, la construcción mostrada en la SEC ID Nº 13 forma monómeros, mientras que la construcción mostrada de la SEC ID Nº 16 forma dímeros. Puede haber una diferencia en el nivel de expresión de estas dos configuraciones en sistemas de expresión particulares, en cuyo caso puede preferirse una de estas formas. También se pueden realizar scFv en tándem, tal como (X)-enlazador)-(X)-enlazador, en los que X son polipéptidos \alphaC, o combinaciones de polipéptidos \alphaC con otros polipéptidos. En otra realización, los polipéptidos de anticuerpos de cadena única no tienen polipéptido enlazador, o solamente un enlazador corto e inflexible. Las configuraciones ilustrativas incluyen V_{L}-V_{H} y V_{H}-V_{L}. La unión es demasiado corta para permitir la interacción entre V_{L} y V_{H} dentro de la cadena, y las cadenas forman homodímeros con un sitio de unión a antígeno V_{L}/N_{H} en cada extremo. Tales moléculas se denominan en la técnica "diacuerpos".
Se pueden producir scFv recombinantemente o sintéticamente. Para la producción sintética de scFv se puede usar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv se puede introducir un plásmido adecuado que contenga un polinucleótido que codifique el scFv en una célula hospedadora adecuada, eucariota, tales como células de levadura, vegetales, de insecto o de mamífero, o procariota, tal como Escherichia coli, y la proteína expresada por el polinucleótido se puede aislar usando técnicas de purificación de proteínas convencionales.
Un sistema particularmente útil para la producción de scFv es el plásmido pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI) en E. coli. El pET-22b(+) contiene un dominio de unión a ión níquel que consiste en 6 restos de histidina secuenciales, que permite que la proteína expresada se purifique sobre una resina de afinidad adecuada. Otro ejemplo de un vector adecuado es pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) que se ha descrito anteriormente.
Las condiciones de expresión deben garantizar que el scFv asuma la estructura terciaria funcional, y, preferiblemente, óptima. Dependiendo del plásmido usado (especialmente la actividad del promotor) y la célula hospedadora, puede ser necesario modular la velocidad de producción. Por ejemplo, usando un promotor más débil, o expresión a temperaturas menores, puede ser necesario optimizar la producción de scFv plegados de forma apropiada en sistemas procariotas; o, puede ser preferible expresar scFv en células eucariotas.
Los scFv preferidos comprenden al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 2, y al menos 10 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 5, especialmente donde los aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y los aminoácidos de la SEC ID Nº 5 están unidos por un polipéptido enlazador de 5 a 20 aminoácidos, o que comprenden la región V de cadena L y la región V de cadena H de H11.
La invención también incluye formas poliméricas de los polipéptidos \alphaC, que contienen una pluralidad de polipéptidos \alphaC. Una realización es un polímero lineal de polipéptidos \alphaC, conjugados opcionalmente a un soporte. Estos polímeros lineales pueden comprender múltiples copias de un único polipéptido uC o combinaciones de diferentes polipéptidos \alphaC, y pueden tener polipéptidos \alphaC en tándem o polipéptidos \alphaC separados por otras secuencias de aminoácidos. Otra realización son péptidos de antígenos múltiples \alphaC (MAP). Los MAP tienen un núcleo inmunológicamente inerte pequeño que tiene dendritas de lisina que se ramifican radialmente, sobre las que se unen varios polipéptidos \alphaC covalentemente. Véase, por ejemplo, Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 1719-1725; y Tarn (1989) Meth. Enz. 168:7-15. El resultado es una gran macromolécula que tiene una alta proporción molar de polipéptidos \alphaC a núcleo. Los MAP son inmunogenes eficaces y antígenos útiles para inmunoensayo. El núcleo para crear un MAP de \alphaC se puede obtener mediante técnicas de síntesis de péptidos convencionales, o se puede obtener en el mercado, por ejemplo, de Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA. Se produce una matriz de núcleo típica de tres niveles de lisina y ocho aminoácidos.
Cuando se usan polipéptidos \alphaC como inmunógenos, los polipéptidos se suministran preferiblemente junto con un soporte. Se puede usar cualquier soporte que no sea dañino para el hospedador. Los soportes adecuados son típicamente grandes, macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas; polisacáridos (tales come Sepharose funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, perlas de celulosa y similares); aminoácidos poliméricos (tales como ácido poliglutámico, polilisina y similares); copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos o bacterias atenuadas, tales como Salmonella. Son proteínas de soporte especialmente útiles las albúmina séricas, la hemacianina de lapa californiana (KLH), determinadas moléculas de Ig, tiroglobulina, olvalbúmina, y toxoide tetánico. Se prefiere especialmente KLH.
Los polipéptidos \alphaC de la invención se pueden identificar de varios modos. Por ejemplo, las regiones V de las cadenas L y H se pueden identificar preparando una serie de polipéptidos cortos que abarcan conjuntamente toda la secuencia de aminoácidos de la región V. Usando una serie de polipéptidos de 20 ó 50 aminoácidos de longitud, cada región V de \alphaC se puede supervisar para propiedades funcionales útiles. También es posible realizar un análisis de ordenador de una secuencia de proteínas para identificar polipéptidos potencialmente interesantes, tales como unos que lleva la forma de D2 o los implicados en contacto idiotipo-anti-idiotipo.
La invención incluye adicionalmente diversas adaptaciones de \alphaC descritas en esta sección combinadas de diversas maneras para proporcionar otros polipéptidos \alphaC con propiedades deseables. Por ejemplo, los polipéptidos \alphaC con restos de aminoácidos modificados pueden estar comprendidos en un MAP. En otro ejemplo, un scFv de \alphaC se fusiona con una citocina tal como IL-2. Todas estas combinaciones están contempladas en esta invención.
Los polipéptidos de esta invención se pueden obtener mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo proteolisis del anticuerpo \alphaC, mediante métodos recombinantes o mediante síntesis química. Los métodos se conocen en la técnica y no necesitan ser descritos con detalle en la presente memoria. Los ejemplos de enzimas proteolíticas incluyen, pero sin limitación, tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, proteasa V8, subtilisina, plasmina, y trombina. Se puede incubar \alphaC intacto con una o más proteinasas de forma simultánea o de forma secuencial. Alternativamente, o adicionalmente, se puede tratar el anticuerpo intacto con agentes reductores de disulfuro. Después, los péptidos se puede separar entre sí mediante técnicas conocidas en la técnica incluyendo, pero sin limitación, cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel, y HPLC de fase inversa.
Los polipéptidos \alphaC también se pueden producir mediante expresión a partir de un polinucleótido que codifica el péptido de acuerdo con la información proporcionada a lo largo de esta solicitud, en un sistema de expresión adecuado. Típicamente, los polinucleótidos que codifican un polipéptido \alphaC se ligan en un vector de expresión bajo el control de un promotor adecuado y se usan para alterar genéticamente la célula hospedadora pretendida. Se pueden usar sistemas de hospedador tanto eucariotas como procariotas. Después, el polipéptido se aísla de células lisadas o del medio de cultivo y se purifica hasta el nivel necesitado para su uso pretendido. Los ejemplos de células hospedadoras procariotas apropiadas para el uso con esta invención incluyen E. coli. Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas incluyen células aviares, de insecto, vegetales y de animales incluyendo, pero sin limitación, células COS7, HeLa y
CHO.
En determinadas aplicaciones, tal como cuando se expresa un polipéptido H11 en un medio de almacenamiento adecuado tal como una semilla de planta, el polipéptido H11 se puede usar sin purificación. Fiedler et al. (1995) Biotechnology 13:1090-1093. Para la mayoría de las aplicaciones, generalmente se prefiere que el polipéptido se purifique al menos parcialmente a partir de otros constituyentes celulares. Preferiblemente, el polipéptido tiene al menos aproximadamente el 50% de pureza como porcentaje en peso de proteína total. Más preferiblemente, la proteína tiene al menos aproximadamente un 50-75% de pureza. Para uso clínico, el polipéptido tiene preferiblemente al menos aproximadamente un 80% de pureza.
La invención también incluye métodos para detectar antígeno C en una muestra biológica. Los métodos incluyen obtener una muestra biológica, poner en contacto la muestra con \alphaC en condiciones que permitan la unión del anticuerpo al antígeno y detectar la unión, si la hay, del anticuerpo al antígeno.
Se pueden usar métodos para detectar anti-H11 o anti-\alphaC en una muestra biológica. Se puede detectar anti-\alphaC si tiene reactividad cruzada con H11. Anti-\alphaC con esta actividad puede surgir de forma espontánea durante el desarrollo de una enfermedad asociada a tumor. Anti-\alphaC con esta actividad es especialmente probable en individuos que han recibido una terapia con \alphaC. Estos métodos se pueden aplicar en un entorno clínico, por ejemplo, para controlar niveles de anticuerpos en un individuo, así como en un entorno industrial, como en la producción comercial de anti-H11 o anti-\alphaC.
Los métodos de ensayo incluyen poner en contacto cualquier anticuerpo diana de anti-H11 o anti-\alphaC en la muestra con un anticuerpo o polipéptido H11 en condiciones adecuadas para permitir la formación de un complejo estable entre la diana y H11, y detectar cualquier complejo estable formado. La muestra se prepara de forma adecuada antes de realizar el ensayo, opcionalmente enriqueciendo la concentración de anticuerpos. Cuando se usa \alphaC murino intacto, generalmente es preferible agotar la muestra de cualquier actividad de inmunoglobulina anti-ratón que pueda estar presente. Se puede retirar el anticuerpo inmunoglobulina anti-ratón de una muestra, por ejemplo, por precipitación con una IgG de ratón normal o adsorción con un adsorbente de Ig de ratón. La unión del anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón, particularmente el específico para la región Fc, se puede minimizar por la selección razonable de los reactivos del ensayo. Son apropiados fragmentos F(ab')_{2} o Fab de \alphaC murino y otros reactivos tales como \alphaC o H11 humanizados con menos determinantes de ratón.
Después de que se haya preparado la muestra de forma adecuada, se mezcla con un exceso de \alphaC en condiciones que permitan la formación de un complejo entre \alphaC y cualquier anticuerpo diana que pueda estar presente. La cantidad de complejo después se determina, y se compara con los complejos formados con muestras convencionales que contienen cantidades conocidas de anticuerpo diana en el intervalo esperado. Se puede observar la formación de complejo mediante cualquier método conocido en la técnica tal como inmunoprecipitación o nefelometría, pero generalmente es más sensible emplear un reactivo marcado con marcadores tales como radioisótopos tales como ^{125}I, enzimas tales como peroxidasa y \beta-galactosidasa, o fluorocromos tales como fluoresceína.
La invención proporciona diversos polinucleótidos que codifican el anticuerpo H11 o fragmentos de H11, basándose en las secuencias de polinucleótidos proporcionados en la presente memoria (SEC ID Nº 1 y 4). Se describen diversas realizaciones en esta sección, que comprenden varias combinaciones diferentes de las secuencias de región V de cadena H o L de H11. En general, un polinucleótido H11 de esta invención codifica al menos una característica que sea única para la molécula de H11 (en comparación con otras inmunoglobulinas y, en particular, el anticuerpo A6). Preferiblemente, esta característica está relacionada de algún modo con una reactividad inmunológica de H11.
La invención incluye polinucleótidos que codifican una parte de la región V de cadena L de H11 que comprende al menos aproximadamente 70 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 80 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 150 nucleótidos de la SEC ID Nº 4. La invención también incluye un polinucleótido que decodifica una parte de la región V de la cadena L de H11 que comprende al menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 30 nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos de la secuencia que codifica CDR1 de la misma. La invención también incluye un polinucleótido que codifica una parte de la región V de la cadena L de H11 que comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos de la secuencia que codifica CDR2 o CDR3 del mismo.
La invención también incluye polinucleótidos que codifican una parte de la región V de la cadena H de H11, que comprende al menos aproximadamente 70 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 80 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 150 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº 1. La invención también incluye un polinucleótido que codifica una parte de la región V de la cadena L de H11 que comprende 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia codificante de CDR1 del mismo. La invención también incluye un polinucleótido que codifica una parte de la región V de la cadena L de H11, que comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos de la secuencia codificante de CDR2 o CDR3 de la misma.
La invención incluye polinucleótidos H11 aislados que codifican un polipéptido que tiene actividad inmunológica de H11, donde el polipéptido codifica al menos 5 aminoácidos de una cadena V L de H11 como se ilustra en la SEC ID Nº 5. La invención también incluye polinucleótidos H11 aislados que codifican un polipéptido que tiene actividad inmunológica de H11, donde el polipéptido codifica al menos 5 aminoácidos de una cadena V H de H11 como se ilustra en la SEC ID Nº 2. La secuencia de polinucleótidos puede ser similar a la ilustrada en la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 4 con cambios diseñados para optimizar el uso de codón, estabilidad, facilitar la clonación, o cualquier otro propósito. Está dentro del conocimiento de la técnica, dada la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 5, diseñar tales polinucleótidos. Los polinucleótidos preferidos codifican al menos cinco aminoácidos de una CDR de H11.
La invención también incluye polinucleótidos que codifican variantes funcionalmente equivalentes y derivados de H11 y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden mejorar, disminuir o no afectar de forma significativa a las propiedades de los polipéptidos codificados de este modo. Estas variantes, derivados y fragmentos funcionalmente equivalentes muestran la capacidad de reconocer específicamente el antígeno C. Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada, así como los que dan como resultado sustituciones conservativas de restos aminoacídicos, una o unas pocas deleciones o adiciones de aminoácidos, y sustitución de restos de aminoácidos por análogos de aminoácidos son los que no afectarán de forma significativa a las propiedades del polipéptido codificado. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano.
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transición, elementos de control tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, y sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o uno diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión y transformación de una célula hospedadora, y cualquiera de tales construcciones como puede ser deseable para proporcionar la realización de esta invención.
La invención incluye un polinucleótido de al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 200 nucleótidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 300 nucleótidos que forman un híbrido estable con un polinucleótido que codifica la región V de cadena L o cadena H de H11, pero sin otras regiones codificantes de inmunoglobulinas conocidas en el momento de presentar esta solicitud. Se puede usar cualquier conjunto de condiciones para este ensayo, siempre que exista al menos un conjunto de condiciones en el que el polinucleótido de ensayo demuestre la especificidad requerida. Preferiblemente, las secuencias que codifican H11 a las que se une el polinucleótido de ensayo son las mostradas en la SEC ID Nº 4. Ya que las secuencias de inmunoglobulina conocidas entran dentro de una jerarquía de similitud con H11, el ensayo se puede realizar comparando la hibridación del polinucleótido de ensayo con la secuencia de H11 con la hibridación con las secuencias más claramente relacionadas. Se prefiere un panel de aproximadamente 10 de las secuencias más claramente relacionadas con las SEC ID Nº: 1, 3, ó 5.
Se pueden realizar reacciones de hibridación en condiciones de "rigurosidad" diferente. Se conocen bien condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación. Véase, por ejemplo, Sambrook y Maniatis. Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (donde SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y su equivalente usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida del 0%, del 25%, del 50% y del 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempo de incubación de lavado de 1, 2 ó 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SCC o agua
desionizada.
Se pueden identificar polinucleótidos H11 útiles que codifican fragmentos de H11 generando fragmentos de polinucleótidos de H11 (basándose en la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 4; por ejemplo) y ensayando los polipéptidos codificados de este modo para una función de interés. Alternativamente, el fragmento polipeptídico codificado por un polinucleótido particular se puede preparar y ensayar para una función de interés. Alternativamente, dado un polipéptido \alphaC con propiedades deseables, se pueden diseñar polinucleótidos que codifiquen el polipéptido.
Incluidos en todas estas realizaciones están polinucleótidos con regiones codificantes para polímeros H11, proteínas de fusión, inmunoglobulinas humanizadas, regiones V de cadena única, y otros polipéptidos particulares de interés. Estos polipéptidos se han descrito anteriormente.
La invención también proporciona polinucleótidos unidos covalentemtente a un marcador detectable. Tales polinucleótidos son útiles, por ejemplo, como sondas para la detección de secuencias de nucleótidos relacionadas.
Los polinucleótidos de esta invención se pueden obtener usando síntesis química, métodos de clonación recombinante, PCR, o cualquier combinación de los mismos. Los métodos de síntesis de polinucleótidos química se conocen en la técnica y no se necesitan describir con detalle la presente memoria. Un especialista en la técnica puede usar los datos de secuencia proporcionados en la presente memoria para obtener un polinucleótido deseado empleando un sintetizador de ADN o haciendo un pedido de un servicio disponible en el mercado.
Alternativamente se pueden obtener secuencias de polinucleótidos \alphaC a partir de una línea celular productora de anticuerpo \alphaC, vector de clonación de \alphaC, o vector de expresión de \alphaC. Se pueden aislar, amplificar, y procesar ARN o ADN que codifiquen la secuencia deseada mediante técnicas recombinantes convencionales. Tales técnicas incluyen digestión con nucleasas de restricción, y amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) o una combinación adecuada de las mismas. La tecnología de PCR se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202, así como en PCR: The Polymerase Chain Reaction. Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).
Se pueden insertar polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada en un vector adecuado y el vector, a su vez, se puede introducir en una célula hospedadora adecuada para la replicación y amplificación. Se pueden introducir polinucleótidos en células hospedadoras mediante cualquier medio conocido en la técnica. Se transforman las células introduciendo un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento f o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno se puede mantener dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula hospedadora. Se puede aislar ADN amplificado de la célula hospedadora mediante métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989). También se puede obtener ARN de la célula hospedadora transformada, o se puede obtener directamente del ADN usando una polimerasa de ARN dependiente de ADN.
La presente invención incluye adicionalmente una diversidad de vectores que comprenden un polinucleótido H11. Estos vectores se pueden usar para expresión de polipéptidos recombinantes, también son una fuente de polinucleótidos H11. Se pueden usar vectores de clonación para obtener copias por duplicado de los polinucleótidos H11 que contienen, o como un medio para almacenar los polinucleótidos en un depósito para la recuperación futura. Se pueden usar vectores de expresión (y células hospedadoras que contienen estos vectores de expresión) para obtener polipéptidos producidos a partir de los polinucleótidos que contienen. También se pueden usar cuando sea deseable expresar H11 en un individuo, y por tanto, tenga células intactas capaces de sintetizar el polipéptido, tal como en terapia génica. Los vectores de clonación y expresión adecuados incluyen cualquiera conocido en la técnica, por ejemplo, aquellos para el uso de sistemas de expresión bacterianos, de mamífero, de levadura y de insecto. Se conocen vectores específicos y células hospedadoras adecuadas en la técnica y no se describen con detalle en la presente memoria. Véase, por ejemplo, Gacesa y Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994).
Los vectores de clonación y expresión contienen típicamente un marcador de selección (por ejemplo, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector), aunque un gen marcador de este tipo se puede llevar sobre otra secuencia polionucleotídica co-introducida en la célula hospedadora. Solamente estas células hospedadoras en las que se ha introducido un gen de selección crecerán en condiciones de selección. Los genes de selección típicos: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato; (b) complementan las deficiencias autotróficas; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo. La selección del gen marcador apropiado dependerá de la célula hospedadora, y se conocen genes apropiados para diferentes hospedadores en la técnica. Los vectores también contienen típicamente un sistema de replicación reconocido por el hospedador.
Se pueden construir vectores de clonación adecuados de acuerdo con técnicas convencionales, o se pueden seleccionar de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Mientras que el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula hospedadora cuyo uso se pretende, los vectores de clonación tendrán generalmente la capacidad de autoreplicación, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, o pueden llevar genes marcadores. Los ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, AND de fagos, y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28. Estos y otros vectores de clonación están disponibles de distribuidores comerciales tales como BioRsd, Stratagene, e Invitrogen.
Los vectores de expresión generalmente son construcciones polinucleotídicas de réplica que contienen un polinucleótido que codifica un polipéptido \alphaC de interés. El polinucleótido que codifica el polipéptido \alphaC está unido de forma funcional a elementos controladores de la transcripción adecuados, tales como promotores, potenciadores y terminadores. Para la expresión (es decir, traducción), también se requieren habitualmente uno o más elementos de control de la traducción, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de inicio de la traducción, y codones de terminación. Estos elementos de control (transcripcionales y transducionales) se pueden obtener del gen H11 o ser heterólogos (es decir, obtenerse de otros genes u otros organismos). Una secuencia polionucleotídica que codifica un péptido señal también se puede incluir para permitir que un polipéptido \alphaC atraviese o se aloje en membranas celulares o se secrete de la célula. En la técnica se conocen varios vectores de expresión adecuados para la expresión en células eucariotas incluyendo células de levadura, aviares, y de mamífero. Un ejemplo del vector de expresión es pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), en el que la transcripción se dirige por el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus (CMV). Este vector también contiene sitios de reconocimiento para múltiples enzimas de restricción para la inserción de un polinucleótido \alphaC de interés. Otro ejemplo de un vector de expresión (sistema) es el sistema de baculovirus/insecto.
También se incluyen en la invención sistemas de expresión adecuados para usar en la terapia génica dirigida a anticuerpos que comprenden un polinucleótido \alphaC. Se describen sistemas adecuados, por ejemplo, por Brown et al. Virol. 198:477-48 8; y Miyamura et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:8507-8511.
Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés se pueden introducir en la célula hospedadora mediante cualquiera de varios medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro cálcico, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (donde el vector es un agente infeccioso, tal como virus vaccinia, que se describe a continuación). La selección de introducir vectores o polinucleótidos \alphaC dependerá a menudo de las características de la célula hospedadora.
Una vez introducida en una célula hospedadora adecuada, la expresión de un polipéptido \alphaC se puede determinar usando cualquier ensayo conocido en la técnica. Por ejemplo, la presencia del polipéptido \alphaC se puede detectar por RIA o ELISA del sobrenadante de cultivo (si se secreta el polipéptido H11) o lisados celulares.
Un vector de expresión particularmente útil para los polinucleótidos H11 es un virus vaccinia que comprende una secuencia polionucleotídica de H11, que también se puede usar en preparaciones de vacunas. Moss (1991) Science 252:1662-1667. Para introducir secuencias polionucleotídicas que codifican en el polipéptido H11, incluyendo los fragmentos de polipéptido H11, en vacunas, la secuencia polionucleotídica de interés se inserta en primer lugar en un plásmido que contiene un promotor del virus vaccinia con secuencias flanqueantes homólogas al ADN vaccinia no requerido para la aplicación. Después, las células que contienen plásmido se infectan con vaccinia, que conduce a un bajo nivel de recombinación homóloga entre los plásmidos y el virus, con transferencia resultante del promotor de vaccinia y la secuencia polionucleotídica que codifica el polipéptido H11 en el genoma del virus vaccinia. Típicamente, el polionucleótido H11 se inserta en el gen TK (timidina kinasa) viral. La inserción en el sitio TK atenúa el virus en más de 10.000 veces en comparación con el tipo silvestre. Flexner et al. (1980) Vaccine 88 (Cold Spring Harbor Laboratory), págs. 179-184. Se identifica el virus recombinante por el fenotipo TK. Preferiblemente, la expresión del polinucleótido H11 está bajo control del promotor temprano/tardío de vaccinia (7,5 K), por lo que los polipéptidos H11 resultantes se pueden expresar en células infectadas a lo largo del ciclo de vida del virus. Sin embargo, se pueden usar otros promotores conocidos en la técnica, tales como pH6, o promotores sintéticos. La expresión del polipéptido H11 se produce en células infectadas con el virus vaccinia recombinante o individuos inmunizados con el virus vaccinia recombinante vivo. Se pueden usar una cualquiera de varias cepas de vaccinia, incluyendo, pero sin limitación, WR, ALVAC, y NYVAC.
Un vector de esta invención puede contener uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido \alphaC. También puede contener secuencias polionucleotídicas que codifican otros polipéptidos que mejoran, facilitan, o modulan el resultado deseado, tales como linfocinas, incluyendo, pero sin limitación IL-2, IL-4, GM-CSF, TNF-\alpha, e IFN-\gamma. Una linfocina preferida es GM-CSF. Las construcciones GM-CSF preferidas son las que se han delecionado para los elementos ricos en AU de las regiones no traducidas 3' y las secuencias en la región no traducida 5' que son capaces de formar un bucle. También se realizan en esta invención vectores vaccinia que codifican para variantes \alphaC recombinantes, tales como scFv, quimeras y polímeros.
Otras realizaciones de esta invención son células hospedadoras transformadas con polinucleótidos \alphaC y vectores que comprenden secuencias polionucleotídicas de \alphaC como se han descrito anteriormente. Se pueden usar tanto células hospedadoras procariotas como eucariotas. Los hospedadores procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo, E. coli y Mycobacteria. Entre los hospedadores eucariotas están las células de levadura, de insecto, aviares, vegetales y de mamífero. Los sistemas hospedadotes se conocen en la técnica y no necesitan ser descritos con detalle en la presente memoria. Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero incluyen CHO y NSO, que se pueden obtener de la Colección Europea de Cultivos Celulares (Inglaterra). La transfección de células NSO con un plásmido, por ejemplo, que se dirige por un promotor de CMV seguido por amplificación desde el plásmido usando glutaminas sintetasa proporciona un sistema útil para la producción de proteínas. Cockett et al. (1990) Bio/Technology 8:662-667.
Las células hospedadoras de esta invención se pueden usar, entre otras cosas, como depósitos de polinucleótidos \alphaC o como vehículos para la producción de polinucleótidos y polipéptidos \alphaC. También se pueden usar como vehículos para la expresión in vivo de polipéptidos \alphaC. Los polinucleótidos H11 de esta invención se pueden usar en sistemas de expresión para producir polipéptidos H11, H11 intacto o formas recombinantes de H11, tal como se describe a continuación.
Los polinucléotidos de esta invención tienen varios usos. Son útiles, por ejemplo, en sistemas de expresión para la producción de \alphaC. También son útiles en sondas de hibridación para ensayar para la presencia de polinucleótidos \alphaC o secuencias relacionadas en una muestra usando métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Además, los polinucleótidos también son útiles como cebadores para realizar la amplificación de polinucleótidos deseados. Los polinucleótidos de esta invención también son útiles en composiciones farmacéuticas incluyendo vacunas y para la terapia génica.
Los polinucleótidos también se pueden usar como sondas de hibridación para la detección de secuencias que codifican \alphaC. Las muestras adecuadas incluyen células transformadas ex vivo para el uso en terapia génica. En una ilustración, se extrae ADN o ARN de una muestra, y se procesa opcionalmente sobre un gel y/o se digiere con endonucleasas de restricción. El polinucleótido de muestra procesado se transfiere típicamente a un medio adecuado para lavado. El polinucleótido de muestra se pone después en contacto con la sonda de polinucleótido H11 en condiciones que permiten que se forme un dúplex estable si la muestra contiene una secuencia \alphaC coincidente. Se detecta cualquier dúplex que está deformado mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la sonda de polinucleótido \alphaC se puede suministrar de forma marcada, y el marcador remanente con la muestra después de lavado reflejará directamente la cantidad de dúplex estable formado. En una segunda ilustración, la hibridación se realiza in situ. A una muestra tisular preparada de forma adecuada se superpone una zona marcada para indicar la localización de secuencias que codifican \alphaC.
También se puede usar un polinucleótido \alphaC corto como un cebador para una reacción de PCR, particularmente para amplificar una secuencia más larga que comprende una región que hibrida con el cebador. Esto se puede realizar de forma preparativa, para producir polinucleótidos para la manipulación genética adicional. También se puede realizar de forma analítica, para determinar si está presente un polinucleótido que codifica \alphaC, por ejemplo, en una muestra de interés diagnóstico.
Otro uso de los polinucleótidos es en vacunas y en terapia génica. El principio general es administrar el polinucleótido de tal forma que promueva o atenúe la expresión del polipéptido codificado en el mismo. Por tanto, la presente invención incluye métodos para inducir una respuesta inmune y métodos para el tratamiento que comprende la administración de una cantidad eficaz de polinucleótidos \alphaC a un individuo. En estos métodos, un polinucleótido \alphaC que codifica un polipéptido \alphaC se administra a un individuo directamente o por células transfectadas con el polinucleótido \alphaC. Preferiblemente, el polinucleótido \alphaC está en la forma de un plásmido circular, preferiblemente en una configuración súper enrollada. Preferiblemente, el polinucleótido \alphaC se replica en el interior de una célula. Por tanto, el polinucleótido \alphaC está unido de forma funcional a un promotor adecuado, tal como un promotor heterólogo que es intrínsecamente activo en células del tipo tisular diana. Preferiblemente, una vez que están en los núcleos de las células, los plásmidos persisten como moléculas episódicas circulares sin replicación. Se puede realizar la mutación in vitro con construcciones de plásmido para codificar, por ejemplo, moléculas con mayor afinidad y/o avidez.
Para determinar si los plásmidos que contienen polinucleótidos \alphaC son capaces de la expresión \alphaC en células eucariotas, las células, tales como COS-7, CHO, o HeLa se pueden transfectar con los plásmidos. Después se determina la expresión \alphaC por inmunoensayo; por ejemplo, por transferencia de Western. Se pueden detectar polipéptidos \alphaC más pequeños, por ejemplo, construyendo el plásmido de tal forma que el polipéptido \alphaC resultante se fusione con un marcado, tal como un epítopo diana o un marcador enzimático. Se puede conseguir la caracterización adicional del polipéptido \alphaC expresado purificando el péptido y realizando después uno de los ensayos funcionales que se describen en la presente memoria.
En un modo de terapia génica, los polinucleótidos de esta invención se usan para alterar genéticamente células ex vivo. En esta estrategia, las células retiradas de un donante u obtenidas de una línea celular se transfectan o transducen con vectores que codifican un polipéptido \alphaC y después se administran a un receptor. Las células adecuadas para la transfección incluyen células mononucleares de sangre periférica.
En otro modo de terapia génica, los polinucleótidos de esta invención se usan para alterar genéticamente células in vivo. El propósito incluye pero sin limitación, tratar diversos tipos de cáncer.
Los polipéptidos \alphaC se pueden caracterizar de varios modos. Por ejemplo, un polipéptido \alphaC se puede ensayar para su capacidad de unirse específicamente a células cancerosas y para su capacidad de inhibir específicamente la unión entre células cancerosas y H11 intacto. Un polipéptido \alphaC también puede reaccionar con polipéptidos anti-CDR3. Los polipéptidos \alphaC también se pueden ensayar para su capacidad de paliar o mitigar enfermedades neoplásicas, tales como carcinomas. Se entiende que solamente necesita estar presente una de estas propiedades para que un polipéptido entre dentro del alcance de esta invención, aunque preferiblemente están presentes más de una de estas propiedades.
La capacidad de un polipéptido \alphaC para unirse a células cancerosas o fracciones antigénicas de las mismas se puede ensayar mediante inmunoensayo. Es adecuada cualquier forma de ensayo de unión directa. En uno de tales ensayos, la célula cancerosa o el supuesto polipéptido \alphaC se marca. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{125}I, enzimas tales como peroxidasa, marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y marcadores quimioluminiscentes. Típicamente, el otro compañero de unión se insolubiliza (por ejemplo, por recubrimiento sobre una placa de microtitulación) para facilitar el lavado. Después de combinar el componente marcado con el componente insolubilizado, la fase sólida se lava y se determina la cantidad del marcador unido. Otro de tales ensayos es un ensayo de tipo sándwich, en el que se captura el supuesto polipéptido \alphaC por una primera anti-inmunoglobulina sobre una fase sólida y se desarrolla con un anticuerpo \alphaC. En cada uno de sus ejemplos, el alcance de la unión de \alphaC está directamente relacionado con la cantidad de marcador unido a la fase sólida.
Para realizar los ensayos de inhibición, el supuesto polipéptido \alphaC se titula para su capacidad de disminuir la unión de H11 a células cancerosas. Cada una de las parejas de unión en la reacción que se tiene que inhibir está marcada, mientras que la otra se insolubiliza típicamente para facilitar el lavado. El supuesto polipéptido \alphaC se mezcla típicamente con el componente marcado y después se combina la mezcla con la fase sólida. Los polipéptidos con las características de H11 disminuirán de forma proporcional la cantidad de marcador unido a la fase sólida, en comparación con los polipéptidos de control. Este ensayo puede ser más sensible que la medición de la unión directa, ya que la menor interacción de afinidad entre \alphaC y antígeno C puede ser demasiado débil para formar un enlace estable, pero adecua-
da para interferir con la unión del otro par de ligando-receptor cuando está presente en una concentración suficiente.
La presente invención incluye composiciones farmacéuticas y composiciones inmunogénicas que contienen \alphaC solo o en combinación. Tales composiciones farmacéuticas y vacunas son útiles para suscitar una respuesta inmune y tratar enfermedades neoplásicas, solas o junto con otras formas de terapia, tales como quimioterapia o radioterapia.
La preparación de composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpo \alphaC, o un polinucleótido o un polipéptido obtenido del mismo como un ingrediente activo se realiza de acuerdo con procedimientos generalmente aceptados para la preparación de preparaciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª Edición (1990), E.W. Martin ed., Mack Publishing Co., PA. Dependiendo del uso pretendido y del modo de administración, puede ser deseable procesar el ingrediente activo de forma adicional en la preparación de composiciones farmacéuticas. El procesamiento adecuado puede incluir esterilización, mezclado con componentes apropiados no tóxicos y que no interfieren, división en dosis unitarias, e inclusión en un dispositivo de suministro.
Las composiciones líquidas farmacéuticamente aceptables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo y dispersando un polipéptido realizado en la presente memoria en un excipiente líquido, tal como agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol o etanol. La composición también puede contener otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, adyuvantes, soportes, y sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, y agentes de tamponamiento del pH.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se suministran por un modo apropiado para la forma de la composición. Las vías típicas incluyen la subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, oral, intranasal e intrapulmorar (es decir, por aerosol). Las composiciones farmacéuticas de esta invención para uso humano se administran típicamente por una vía parenteral, más típicamente intracutánea, subcutánea e intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral, o administración tópica se pueden suministrar en forma sólida, semi sólida o líquida, incluyendo comprimidos, cápsulas, polvos, líquidos y suspensiones. Las composiciones para inyección se pueden suministrar como soluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones o como formas sólidas adecuadas para la disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. Para la administración por el tracto respiratorio, una composición preferida es una que proporcione un aerosol sólido, en polvo o líquido, cuando se usa en un dispositivo de aerosol apropiado. Aunque no se requiere, las composiciones farmacéuticas se suministran preferiblemente en una forma de dosificación unitaria adecuada para la administración de una cantidad precisa. Esta invención también contempla formas de liberación lenta o de liberación sostenida, por las que se proporciona un nivel relativamente uniforme del compuesto activo a lo largo de un periodo prolongado.
Las composiciones realizadas en esta invención se pueden evaluar para su capacidad de reconocer específicamente una neoplasia. En consecuencia, se preparan compuestos de ensayo como una composición farmacéutica adecuada y se administran a sujetos de ensayo. Se realizan estudios iniciales preferiblemente en animales pequeños tales como ratones o conejos, opcionalmente en siguiente lugar en primates no humanos y finalmente en seres humanos. La inmunogenecidad se ensaya preferiblemente en individuos sin una respuesta de anticuerpos previa. Se administra una composición de ensayo en una dosis apropiada en un protocolo de tratamiento apropiado. Puede ser apropiado comparar diferentes dosis y protocolos dentro del intervalo predicho. Tal ensayo está dentro del conocimiento de la técnica.
Las composiciones de esta invención son particularmente adecuadas para la administración a seres humanos con una enfermedad neoplásica. Son especialmente relevantes melanoma, neuroblastoma, glioma, sarcoma, linfoma y cáncer pulmonar microcítico.
También se incluyen en esta invención métodos para tratar el cáncer. Los métodos comprenden administrar una cantidad de una composición farmacéutica que contiene \alphaC para conseguir el efecto deseado, para la paliación de una masa tumoral existente o para prevenir la recurrencia. Para el tratamiento del cáncer, la cantidad de una composición farmacéutica administrada es una cantidad eficaz para producir el efecto deseado. Se puede proporcionar una cantidad eficaz en una o en una serie de administraciones.
La cantidad eficaz de fragmentos de unión a antígeno de \alphaC que se tiene que administrar dependerá de varios factores, tales como la vía de administración, el estado del individuo y el objetivo deseado. La expresión "terapéuticamente eficaz" quiere decir que la cantidad de fragmento de unión a antígenos usada, es una cantidad suficiente para mitigar el cáncer. "Mitigar" indica una disminución del efecto perjudicial del cáncer sobre el individuo. Típicamente si se administra directamente, la cantidad por administración es de aproximadamente 10 \mug a 20 mg, preferiblemente de 250 \mug a 10 mg, más preferiblemente de 300 \mug a 5 mg, aún más preferiblemente de 500 \mug a 2,5 mg. Las administraciones se realizan típicamente en una base semanal o bisemanal hasta que se detecte un parámetro deseado medible, tal como disminución de los síntomas de la enfermedad. Entonces se puede continuar la administración en una base de menor frecuencia, tal como quincenalmente o mensualmente, si es apropiado.
Las diversas composiciones de esta invención se pueden usar solas o junto con otros agentes activos que promuevan el objetivo deseado o proporcionen una terapia de adyuvante. Los agentes activos deseados incluyen los fármacos anti-neoplásicos y modificadores de respuesta biológica que se han descrito anteriormente y células efectoras como las descritas por Douillar et al. (1986) Hybridomas (Supp. 1:5139).
Cuando se usa para la inmunoterapia, \alphaC puede estar no marcado o marcado con un agente terapéutico como se ha descrito anteriormente. Esos agentes se pueden acoplar directa o indirectamente a los polipéptidos de la invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto es por el uso de un resto espaciador. Estos restos espaciadores, a su vez, pueden ser insolubles o solubles (Diener et al. (1986) Science 231:148) y se pueden seleccionar para permitir la liberación del fármaco de \alphaC al sitio diana. Alternativamente, se pueden traducir, sintetizar, ligar o producir de otro modo un \alphaC y un agente terapéutico como una molécula única que tenga funciones tanto de \alphaC como de agente terapéutico. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden acoplar a \alphaC para la inmunoterapia, incluyen pero sin limitación, modificadores de la respuesta biológica, fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen linfocinas que incluyen, pero sin limitación, factor de necrosis tumoral, interleucinas 1, 2, y 3, linfotoxina, factor de activación de macrófagos, factor de inhibición de migración y factor de estimulación de colonias e interferón. Los interferones con los que se pueden marcar \alphaC incluyen interferón \alpha, interferón \beta e interferón \gamma (IFN-\gamma) y sus subtipos.
Al usar \alphaC conjugado de forma radioisotópica para la inmunoterapia, determinados isotipos pueden ser más preferibles que otros dependiendo de factores tales como la distribución de leucocitos así como la estabilidad y emisión de isotipos. Si se desea, se puede evaluar la distribución de células malignas por las técnicas de diagnóstico in vivo que se describen a continuación. Dependiendo de la malignidad, algunos emisores pueden ser preferibles con respecto a otros. En general, se prefieren radioisótopos emisores de partículas alfa y beta en inmunoterapia. Por ejemplo, si un animal tiene focos de tumor salida, como en un carcinoma, puede ser preferible un emisor beta de alta energía capaz de penetrar varios milímetros en el tejido, tal como ^{90} Y. Por otro lado, si la malignidad consiste en células diana simples, como el caso de la leucemia, puede ser preferible un emisor alfa de alta energía de intervalo corto, tal como ^{212}Bi. Los radioisótopos que se pueden unir a los fragmentos de unión a antígeno de la invención para propósitos terapéuticos, incluyen pero sin limitación, ^{125}I, ^{131}I, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{212}Bi, ^{211}At, ^{212} Pb, ^{47}Sc, ^{109}Pd, y ^{188}Re.
Las lectinas son proteínas, aisladas habitualmente de material vegetal, que se unen a restos de azúcares específicos. Muchas lectinas también son capaces de aglutinar células y estimular linfocitos. Sin embargo, la ricina es una lectina tóxica que se ha usado inmunoterapéuticamente. Esto se consigue preferiblemente uniendo la cadena de péptido alfa de la ricina, que es responsable de la toxicidad, a la molécula de anticuerpo para permitir el suministro específico de sitio del efecto tóxico.
Las toxinas son sustancias venenosas producidas por plantas, animales, o microorganismos que, en una dosis suficiente a menudo son letales. La toxina diftérica es una sustancia producida por Corynebacterium diphtheria que se puede usar terapéuticamente. Esta toxina consiste en una subunidad alfa y beta que se pueden separar en condiciones apropiadas. El componente de cadena A tóxico se puede unir a un anticuerpo y se puede usar para el suministro específico de sitio a una célula neoplásica.
Por tanto, por ejemplo, se puede usar \alphaC en combinación con interferón-alfa. Esta modalidad de tratamiento mejora la dirección de Mab de melanomas aumentando la expresión de antígeno reactivo a Mab por la célula de melanoma. Greiner et al. (1987) Science 235:895. Alternativamente, se podría usar \alphaC, por ejemplo, en combinación con IFN-\alpha para activar e incrementar de este modo la expresión de receptores Fc por células efectoras, que a su vez, da como resultado una unión mejorada de los fragmentos de unión a antígeno a la célula efectora y la inactivación de células malignas diana. Los especialistas en la técnica serán capaces de seleccionar los diversos modificadores de la respuesta biológica para crear una función efectora deseada que mejore la eficacia de \alphaC.
Cuando se usa \alphaC con diversos agentes terapéuticos, tales como los que se describen en la presente memoria, la administración de ambos se produce habitualmente de forma sustancialmente simultánea. La expresión "de forma sustancialmente simultánea" quiere decir que se administran razonablemente juntos entre sí con respecto al tiempo. Habitualmente se prefiere administrar el agente terapéutico antes que \alphaC. Por ejemplo, el agente terapéutico se puede administrar 1 a 6 días antes del \alphaC. La administración del agente terapéutico puede ser diaria, o en cualquier otro intervalo adecuado, dependiendo de factores tales como, por ejemplo, la naturaleza de la neoplasia, el estado del paciente y la vida media del agente.
Al usar \alphaC es posible diseñar terapias de combinación. Puede ser deseable administrar un agente terapéutico o agentes antes de la administración de \alphaC en combinación con células efectoras y los mismos agentes terapéuticos o diferentes. Por ejemplo, se pueden tratar pacientes administrando en primer lugar IFN-\alpha e interleucina-2 (IL-2) diariamente durante 3 a 5 días, y administrar \alphaC el día 5 en combinación con células efectoras, IFN-\alpha e IL-2.
La presente invención también incluye el uso de liposomas con \alphaC unido a membrana para suministrar específicamente el liposoma al área de las células tumorales o neoplásicas que expresan el antígeno \alphaC. Estos liposomas se pueden producir de tal forma que contengan, además de \alphaC agentes inmuno terapéuticos tales como los que se han descrito anteriormente que, después se liberarían en el sitio de la de neoplasia. Wolff et al. (1984) Biochem. Biophys. Acta 802:259. Otro de tales sistemas de suministro de este tipo descrito por Brown et al. (1994) Virology 198:477-488; y Miyamura et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 8507-8511 utiliza cápsidas de parvovirus de B19 quiméricas para la presentación de los fragmentos de unión a antígeno. Tales sistemas quiméricos están incluidos para el uso en los métodos reivindicados.
Los intervalos de dosificación para la administración de \alphaC son los que son suficientemente grandes para producir el efecto deseado para que se mitiguen los síntomas de la enfermedad neoplásica sin provocar efectos secundarios innecesarios tales como reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, el estado, el sexo del paciente y el alcance de la enfermedad y se puede determinar por el especialista en la técnica. La dosificación se puede ajustar por el médico individual en el caso de cualquier complicación. La dosificación puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2.000 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días. Generalmente, cuando se administra \alphaC conjugado con agentes terapéuticos, se pueden usar dosificaciones menores, en comparación con las usadas para la formación de imágenes de inmunodiagnóstico in vivo.
Las composiciones terapéuticas de \alphaC se pueden administrar por inyección o por perfusión gradual. Los fragmentos de unión a antígeno de \alphaC se pueden administrar por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intracavitaria, por vía intratecal o por vía transdérmica solos o en combinación con células efectoras.
Otro método de administración es por vía intralesional, por ejemplo por inyección directa directamente en el tumor. La administración intralesional de diversas formas de inmunoterapia con pacientes con cáncer no provoca la toxicidad observada con la administración sistémica de agentes inmunológicos. Fletcher et al. (1987) Lymphokine Res. 6:45; Rabinowich et al. (1987) Cancer Res. 47:173; Rosenberg et al. (1989) Science 233:1318; y Pizz et al. (1984) Int. J. Cancer 34:359.
\alphaC es particularmente adecuado para el uso para el tratamiento y la formación de imágenes de cáncer cerebral. Cuando el sitio de suministro está en el cerebro, el agente terapéutico tiene que ser capaz de ser suministrado al cerebro. La barrera hematoencefálica limita la captación de muchos agentes terapéuticos al cerebro y la médula espinal desde la circulación general. Las moléculas que cruzan la barrera hematoencefálica usan dos mecanismos principales: difusión libre; y transporte facilitado. Debido a la presencia de la barrera hematoencefálica, la consecución de concentraciones beneficiosas de un agente terapéutico dado en el SNC puede requerir el uso de estrategias de suministro de fármaco específicas. El suministro de agentes terapéuticos al SNC se puede conseguir mediante varios métodos.
Un método se basa en técnicas neuroquirúrgicas. En el caso de pacientes gravemente enfermos, la intervención quirúrgica está garantizada a pesar de sus riesgos anexos. Por ejemplo, se pueden suministrar agentes terapéuticos por introducción física directa en el SNC, tal como por inyección intraventricular, intralesional, o intratecal. La inyección intraventricular se puede facilitar por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. También se proporcionan métodos de introducción por dispositivos recargables o biodegradables. Otra estrategia es la interrupción de la barrera hematoencefálica por sustancias que aumentan la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Los ejemplos incluyen infusión intra-arterial de agentes que difunden mal, tales como manitol, agentes farmacéuticos que aumentan la permeabilidad cerebrovascular tales como etopósido, o agentes vasoactivos tales como leucotrienos. Neuwelt and Rappoport (1984) Fed. Proc. 43:214-219; Baba et al. (1991) J. Cereb. Blood Flow Metab. 11:638-643; y Gennuso et al. (1993) Cancer Invest. 11:638-643.
Además, puede ser deseable administrar las composiciones localmente al área que necesita tratamiento: esto se puede conseguir, por ejemplo, por infusión local durante la cirugía, por inyección, mediante un catéter, o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas silásticas o fibras. Una membrana de ese tipo adecuada es Gliadel® proporcionada por Guilford Pharmaceuticals Inc.
Otro método implica técnicas farmacológicas tales como modificación o selección del \alphaC para proporcionar un análogo que cruzará la barrera hematoencefálica. Los ejemplos incluyen aumentar la hidrofobia de la molécula, disminuir la carga neta o el peso molecular de la molécula, o modificar la molécula, tal como para que se parezca a una transportada de forma normal a través de la barrera hematoencefálica. Levin (1980) J. Med Chem. 23:682-684; Pardridge (1991) in: Peptide Drug Delivery to the Brain; and Kostis et al. (1994) J. Clin. Pharmacol. 34:989-996.
La encapsulación de \alphaC en un entorno hidrófobo tal como liposomas también es eficaz para suministrar fármacos al SNC. Por ejemplo, el documento WO 91/04014 describe un sistema de suministro liposomal en el que se encapsula el fármaco dentro de liposomas a los que se han añadido moléculas que se transportan normalmente a través de la barrera hematoencefálica.
Otro método para formular \alphaC para que pase a través de la barrera hematoencefálica es encapsulación en ciclodextina. Se puede emplear cualquier ciclodextrina adecuada que pase a través de la barrera hematoencefálica, incluyendo, pero sin limitación, \beta-ciclodextrina, \gamma-ciclodextrina y derivados de las mismas. Véase, de forma general, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.017.566, 5.002.935 y 4.983.586. Tales composiciones también pueden incluir un derivado de glicerol como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.153.179.
Otro método más usa la ventaja de técnicas fisiológicas tales como conjugación de \alphaC con un agente transportable para producir un \alphaC transportable quimérico nuevo. Por ejemplo el análogo de tejido intestinal vasoactivo (VIPa) ejerce sus efectos vasoactivos solamente después de la conjugación con un Mab con el receptor de transferrina de molécula de soporte específica, que facilita la captación del conjugado VIPa-Mab a través de la barrera hematoencefálica. Pardridge (1991); and Bickel et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2618-2622. Se han identificado varios sistemas de transporte específicos adicionales, los mismos incluyen, pero sin limitación, aquellos para transferir insulina, o factores de crecimiento similares a insulina I y II. Otros soportes adecuados no específicos incluyen, pero sin limitación, piridinio, ácidos grasos, inositol, colesterol, y derivados de glucosa. Se han descrito determinados profármacos por los que, después de entrar en el sistema nervioso central, se escinde el fármaco del soporte para liberar el fármaco activo. Patente de Estados Unidos Nº 5.017.566.
Los sujetos adecuados incluyen aquellos de los que se sospecha que están en riesgo de un efecto patológico de cualquier neoplasia, particularmente carcinoma, y son adecuados para el tratamiento con las composiciones farmacéuticas de esta invención. Aquellos con un historial de cáncer son especialmente adecuados. Los sujetos humanos adecuados para la terapia comprenden dos grupos, que se pueden diferenciar por criterios clínicos. Los pacientes con "enfermedad avanzada" o "alta carga de tumor" son los que llevan un tumor clínicamente medible. Un tumor clínicamente medible es uno que se puede detectar en base a la masa tumoral (por ejemplo, por palpación, exploración TAC o Rayos X; marcadores positivos bioquímicos o histopatológicos que por sí mismo pueden ser insuficientes para identificar esta población). Una composición farmacéutica realizada en esta invención se administra a estos pacientes para suscitar una respuesta anti-tumor con el objetivo de paliar su afección. De forma ideal, la disminución de la masa tumoral se produce como un resultado, pero una mejora clínica constituye un beneficio. La mejora clínica incluye un riesgo o tasa de progresión disminuido o disminución de consecuencias patológicas del tumor.
Un segundo grupo de sujetos adecuados se conoce en la técnica como el "grupo adyuvante". Los mismos son individuos que han tenido una historia de cáncer, pero que han respondido a otro modo de terapia. La terapia anterior puede haber incluido, pero sin restricción, resección quirúrgica, radioterapia, y quimioterapia tradicional. Como un resultado, estos individuos no tienen tumor clínicamente medible. Sin embargo, se sospecha que están en riesgo de progresión de la enfermedad, cerca del sitio original del tumor o por metástasis.
Este grupo se puede subdividir adicionalmente en individuos de alto riesgo y bajo riesgo. La subdivisión se realiza en la base de características observadas antes o después del tratamiento inicial. Estas características se conocen en las especialidades clínicas, y se definen de forma adecuada para cada cáncer diferente. Las características típicas de subgrupos de alto riesgo son aquéllas en las que el tumor ha invadido tejidos vecinos y muestra implicación de nódulos linfáticos.
Otro grupo adecuado de sujetos es el que tiene una predisposición genética a cáncer pero todavía no tiene signos clínicos evidentes de cáncer. Por ejemplo, las mujeres que dan positivo para una mutación genética asociada a cáncer de mama, pero todavía están en edad reproductiva, pueden desear recibir de forma profiláctica un tratamiento de \alphaC para evitar la aparición de cáncer hasta que sea adecuado realizar cirugía preventiva.
Una composición farmacéutica realizada en esta invención se administra a pacientes en el grupo adyuvante, como en cada grupo de estos subgrupos para suscitar una respuesta anti-cáncer. De forma ideal, la composición retrasa la recurrencia del cáncer, o incluso mejor, disminuye el riesgo de recurrencia (es decir, mejora la tasa de curación). Tales parámetros se pueden determinar en comparación con otras poblaciones de pacientes y otros modos de terapia.
Por supuesto, pueden suceder entrecruzamientos entre estos dos grupos de pacientes, y las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar en cualquier momento que sea apropiado. Por ejemplo, se puede realizar terapia con \alphaC antes o durante la terapia tradicional de un paciente con una alta carga de tumor, y se puede continuar después de que el tumor se haya convertido en clínicamente indetectable. La terapia con \alphaC se puede continuar con un paciente que ha entrado inicialmente en el grupo adyuvante, pero que muestra signos de recurrencia. El médico a cargo del caso tiene la decisión de terminar cómo o cuándo se tienen que usar las composiciones de esta invención.
Diversos compuestos y composiciones de esta invención tienen otras indicaciones clínicas, de las cuales la siguiente sección proporciona solamente una visión de conjunto.
Una indicación es el tratamiento de células ex vivo. Esto puede ser deseable para propósitos experimentales, o para el tratamiento de un individuo con una enfermedad neoplásica. En un ejemplo se administra \alphaC a un cultivo de células, tales como células de sangre periférica obtenidas de un donante, o una línea celular adecuada. Aproximadamente de 0,5 a 2 g/ml de H11 es una dosis eficaz para este propósito. En un segundo ejemplo, se alteran genéticamente células de donante con un vector de expresión de esta invención para proporcionar la secreción continúa de \alphaC después de la administración de las células al receptor.
Se pueden usar métodos para la detección in vivo de células cancerosas. Se administra una cantidad diagnósticamente eficaz de \alphaC marcado de forma detectable al sujeto que necesita la formación de imágenes tumorales. La expresión "diagnósticamente eficaz" quiere decir que la cantidad de \alphaC marcado de forma detectable se administra de forma suficiente para permitir la detección de la neoplasia.
La concentración de \alphaC marcado de forma detectable que se administra debe ser suficiente de tal forma que la unión a las células que tienen antígeno \alphaC sea detectable comparado con el fondo. Además, es deseable que el \alphaC marcado de forma detectable se elimine de forma rápida del sistema circulatorio para proporcionar la mejor proporción de señal de diana con respecto al fondo.
Como norma, la dosificación de \alphaC marcado de forma detectable para el diagnóstico in vivo es ligeramente específico para cada paciente y depende de factores tales como la edad, el sexo, y el alcance de la enfermedad. La dosificación de \alphaC puede variar de aproximadamente 0,01 mg/m^{2} a aproximadamente 500 mg/m^{2}, preferiblemente de 0,01 mg/m^{2} a aproximadamente 200 mg/m^{2}, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/m^{2} a aproximadamente 10 mg/m^{2}. Tales dosificaciones pueden variar, por ejemplo, dependiendo del número de inyecciones dadas, la carga de tumor, y otros factores conocidos por los especialistas de la técnica. Por ejemplo, se han marcado tumores in vivo usando Mab conjugados con cianina. Ballou et al. (1995) Cancer Immunol. Immunother. 41:257-263.
Para la formación de imágenes de diagnóstico in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor principal en la selección de un radioisótopo dado. El radioisótopo seleccionado tiene que tener un tipo de desintegración que sea detectable para un tipo dado de instrumento. Otro factor importante más para seleccionar un radioisótopo para el diagnóstico in vivo es que la vida media del radioisótopo tiene que ser lo suficientemente larga de tal forma que todavía sea detectable en el momento de la máxima captación por la diana, pero lo suficientemente corta de tal forma que se minimice la radiación perjudicial con respecto al individuo. De forma ideal, un radioisótopo usado para la formación de imágenes in vivo carece de emisión de partículas, pero produce un gran número de fotones en el intervalo de 140-250 keV, para ser rápidamente detectado por cámaras gamma convencionales. Para la formación de imágenes, el intervalo de dosis de ^{111}ln-H11-scFv (por ejemplo, 2 mg de scFv marcado con 5 mCi de ^{111}Indio) administrado es de aproximadamente 0,01 mg a 20 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1-10 mg y aún más preferiblemente de aproximadamente 1-5 mg por paciente.
Para el diagnóstico in vivo, se pueden unir radioisótopos a \alphaC directamente o indirectamente usando un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios que se usan a menudo para unirse a radioisótopos de iones metálicos a inmonuglobulinas son agentes quelantes bifuncionales tales como el ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) y el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) y moléculas similares. Los ejemplos típicos de iones metálicos que se pueden unir a \alphaC son ^{111}ln, ^{97}Ru, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr, ^{90}Y, y ^{201}TI.
\alphaC también se puede marcar con un isótopo paramagnético para propósitos de diagnóstico in vivo, como en formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o resonancia de spin de electrones (ESR). En general, se puede utilizar cualquier método convencional para visualizar la formación de imágenes de diagnóstico. Habitualmente, se usan radioisótopos emisores de gamma y positrones para la formación imágenes en cámara e isótopos paramagnéticos para MRI. Los elementos que son particularmente útiles en tales técnicas incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}DY, ^{52}Cr, y ^{56}Fe. \alphaC también se puede marcar con un colorante fluorescente para los propósitos del diagnóstico in vivo.
\alphaC también se puede usar para detectar neoplasias usando ensayos in vitro. Se toman muestras del paciente y se someten a cualquier inmunoensayo adecuado con \alphaC para detectar la presencia del antígeno \alphaC. Esto es particularmente útil para detectar linfomas y leucemias donde las células tumorales que llevan antígeno \alphaC circulan en la corriente sanguínea del paciente.
\alphaC también se puede usar para controlar el curso de la mitigación de la neoplasia en un individuo. Por tanto, midiendo el aumento o la disminución del número de células que expresan el antígeno \alphaC o cambios en la concentración del antígeno \alphaC presente en diversos fluidos corporales, es posible determinar si un protocolo terapéutico particular que pretende mitigar la neoplasia es eficaz.
En la presente memoria se describen kits que contienen \alphaC. se pueden realizar procedimientos diagnósticos usando \alphaC por laboratorios de diagnóstico, laboratorios experimentales, facultativos o individuos privados. La muestra clínica se pre-trata opcionalmente para el enriquecimiento de la diana a ensayar. Después, el usuario aplica un reactivo contenido en el kit para detectar el nivel cambiado o la alteración en el componente de diagnóstico.
Cada kit comprende \alphaC usado para detectar el antígeno C en la muestra. Opcionalmente, el reactivo se puede conjugar con un marcador para permitir la detección de cualquier complejo formado con la diana en la muestra. En otra opción, se proporciona un segundo reactivo que es capaz de combinarse con el primer reactivo después de que haya encontrado su diana y suministra de este modo el marcador detectable. Por ejemplo, se puede proporcionar IgG anti-ratón marcada como un reactivo secundario para el uso con \alphaC intacto. Se puede proporcionar avidina marcada como un reactivo secundario cuando el reactivo primario se ha conjugado con biotina.
Los kits se pueden emplear para ensayar una diversidad de muestras biológicas, incluyendo tanto muestras líquidas, suspensiones celulares o muestras tisulares. Los ensayos adecuados que usan \alphaC que se pueden suministrar en forma de kit incluyen los que se describen en la presente memoria. Cada reactivo se suministra en una forma sólida o disuelto/suspendido en un tampón líquido adecuado para el almacenamiento del contenido y, posteriormente para el intercambio o adición al medio de relación en el que se realiza el ensayo. Se proporciona un envase adecuado. El kit puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son útiles en el procedimiento. Estos componentes adicionales incluyen, pero sin limitación, tampones, reactivos de captura, reactivos de desarrollo, marcadores, superficies de reacción, medios para la detección, muestras de control, instrucciones, e información de interpretación.
La anterior descripción proporciona, entre otras cosas, métodos detallados para preparar H11, en conjunto con polinucleótidos que codifican H11, fragmentos de polipéptidos H11 y otros derivados. Un especialista en la técnica puede practicar realizaciones de esta invención refiriéndose a los datos de secuencia para H11, que se proporciona en la presente memoria. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no para limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 1 Método para obtener Mab H11
El Mab NBGM1/H11 ("H11") es un anticuerpo IgM monoclonal humano que reacciona contra los siguientes tejidos tumorales humanos y correspondientes líneas de células tumorales: glioma, melanoma maligno, adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de mama. La caracterización in vitro del Mab NBGM1/H11 se muestra en el Ejemplo 2.
La fusión de H11 se consiguió fusionando 8 x 10^{6} linfocitos de sangre periférica obtenidos de un hombre de 64 años de edad con un glioma de bajo grado con la línea celular de mieloma humana TM-H2-SP2. La línea celular TM-H2-SP2 es la sublínea no secretora de inmunoglobulina de la línea celular parental de IgG(\kappa) TM-H2, un derivado deficiente en hipoxantina guanina fosforribositransferasa (EC 2.4.2.8) de una línea similar a mieloma humano desconocida seleccionada en metilcelulosa al 0,8% por su resistencia a 6-tioguanina (6 \mug/ml) y que no crece en medio de hipo xantina-aminopterina-timidina. El cariotipo de TM-H2-SP2 es 46\pm2, XX.
Las células viables de hibridoma resultantes se distribuyeron entre 40 micropocillos con una densidad de 2 x 10^{5} células/ml y 0,2 ml/pocillo. La frecuencia de crecimiento del H11 de fusión fue de 12 de 40 (30%) de pocillos que contenían potencialmente hibridoma. La extensión resultante por el crecimiento sostenido se define como el crecimiento prolongado con la expansión del cultivo durante periodos más largos de 3 meses; no se observaron casos de fallo de crecimiento de hibridoma que sucedían más tarde de 3 meses después de la fusión.
Se realizó la identificación de clones de hibridoma por ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas de captura de antígenos (ELISA) en placas de microtitulación usando anticuerpo policlonal IgM o IgG anti-humano como antígeno de recubrimiento. Un sobrenadante de cultivo de hibridoma era positivo si el valor de densidad óptica medida (D.O.) superaba el nivel de fondo medio de un sobrenadante de cultivo de control en más de dos desviaciones típicas.
La selección del clon de hibridoma NBGM1/H11 se realizó por ELISA de células fijas. Los sobrenadantes de cultivo de 6 pocillos de microtitulación, que dieron un valor alto en el ensayo de secreción de IgM o IgG, se identificaron frente a líneas de células tumorales humanas unidas y fijadas previamente: Glioblastoma (SKMG-1 y D-54MG); melanoma (A-375); y adenocarcinoma de colon (SK-CO-1). Se consideró que un sobrenadante de hibridoma era positivo si el valor de D.O. medido superaba el nivel de fondo medio de los sobrenadantes de cultivo de control en más de dos desviaciones típicas. El Mab producido por el hibridoma NBGM1/H11 continúa siendo reactivo contra estas líneas de células tumorales. Los anticuerpos "H11" son IgM_{(K)}.
La caracterización del banco de siembra de hibridoma NBGM1/H11 se realizó por Microbiological Associates (Rockville, MD). Las células fueron negativas para (1) contaminación bacteriana y fúngica, (2) contaminación por micoplasmas, (3) antígenos de HIV-1 y HIV-2 y (4) antígenos de HTLV-1 y HTLV-2.
Los métodos usados para la caracterización de Mab NBGM1/H11 incluyen: ELISA de captura de antígenos, ELISA de antígenos, ELISA de células fijas, citometría de flujo, tinción de inmunoperoxidasa de líneas de células tumorales humanas e inmunohistoquímica para tejidos tumorales y normales humanos (véanse los siguientes ejemplos).
Las características de unión de este Mab humano a líneas de células tumorales humanas como se determinó por citometría de flujo, tinción con inmunoperoxidasa, ELISA de células fijas, y ELISA de antígenos (es decir, extractos de células tumorales congelados-descongelados) se presentan a continuación.
Ejemplo 2 Unión de Mab H11 a Líneas Celulares Humanas de Gliobastoma (SKGM-1) y Melanoma (A375) por Análisis Citométrico de Flujo
Para determinar la unión de Mab H11 a células tumorales, se desprendieron células tumorales que crecían en matraces en T por incubación con PBS-EDTA. Las células se recogieron por centrifugación a baja velocidad, se lavaron con PBS/FBS al 1% frío, se centrifugaron y se aspiró el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en medio de cultivo con adiciones de uno de los siguientes: una IgM de melanoma humano de control; sobrenadante de cultivo de hibridoma NBGM1/H11; o PBS que contenía Mab H11 purificado; y se incubó sobre hielo durante 30 min. Después de la incubación, se recogieron las células por centrifugación, se lavaron por resuspensión en PBS-FBS y se centrifugaron. El sedimento celular después se incubó durante 30 min con IgM de cabra anti-ser humano conjugada con FITC. Después de la incubación, se lavaron las células con PBS-FBS. Finalmente, se resuspendieron las células en PBS-FBS, se añadió yoduro de propidio (PI) y se lavaron las células. Se analizaron las células positivas para PI y positivas para FITC por citometría de flujo.
Los resultados de los análisis citométrico de flujo se muestran en las Figuras 2, 3 y 4. Estos resultados indican que las formas sin procesar y purificadas de Mab H11 se unen a un antígeno o antígenos asociados a la superficie celular expresados sobre líneas de células tumorales humanas vivas incluyendo glioblastoma, melanoma, adenocarcinoma de mama y adenocarcinoma de colon.
Ejemplo 3 Unión de Mab H11 a Extractos Congelados-Descongelados de Líneas de Células Tumorales Humanas por Análisis ELISA
Para determinar la capacidad de H11 de unirse específicamente a antígeno o antígenos tumorales humanos, se recubrieron placas ELISA con extractos de células tumorales humanas preparadas por congelación y descongelación repetida de células de glioblastoma (SKMG-1), adenocarcinoma de mama (BT-20, MB-468 y MB-453) y adenocarcinoma de colon (SK-CO-1 y HT-29).
Las placas de ELISA recubiertas se incubaron durante 16-18 horas a 2-8ºC. Las placas se bloquearon con PBS-BSA al 3% durante 1 h a temperatura ambiente. Después se incubaron las placas con Mab H11 en PBS o IgM de control en PBS o medio de cultivo durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron e incubaron con IgM anti-ser humano biotinilada, seguido de incubación con IgM anti-ser humano biotinilada y seguido de incubación con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina durante 1 h. Después del lavado se añadió sustrato de fosfato de p-nitrofenilo a cada placa y, después de la incubación, se leyeron las placas a 405 nm en un lector de placas ELISA.
La unión del Mab H11 a los extractos de células tumorales se muestra en las Figuras 5 y 6. Estos resultados indican que el Mab H11 se une a extractos de células tumorales preparados a partir de células de glioblastoma, adenocarcinoma de mama y adenocarcinoma de colon de un modo dependiente de dosis.
Ejemplo 4 Unión de Mab H11 a Células Tumorales Humanas Determinada por Tinción con Inmunoperoxidasa
Para determinar la inmunorreactividad de H11, se realizó el siguiente experimento. Se dejaron crecer células tumorales en placas de 24 pocillos con cubreobjetos durante 48-96 h. Las células se lavaron con PBS, se fijaron con formaldehído y se incubaron con suero normal de cabra al 5% en PBS durante 30 min. Después del lavado, se incubaron las células durante 2 h con sobrenadantes de cultivo de hibridoma NBGM1/H11 o Mab H11 purificado (10 \mug/ml) en PBS o medio de cultivo con adiciones de IgM de mieloma humano de control (10 \mug/ml) durante 2 h. Después se lavaron las células y se incubaron con IgM anti-ser humano conjugada con HRP. Finalmente, se lavaron las células, se incubaron con sustrato de DAB para visualizar la unión de Mab H11, se realizó una tinción de contraste con hematoxilina y se montaron en GVA.
Los resultados de la inmunorreactividad del Mab H11 se muestran en la Tabla 3 donde la reactividad se indica como negativa (--), débilmente positiva (+), positiva (++) y fuertemente positiva (+++). Estos resultados indican que, como se determina por la tinción con inmunoperoxidasa, el epítopo reconocido por el Mab H11 se expresa por varios tipos diferentes de células tumorales y líneas celulares humanas.
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TABLA 3
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Ejemplo 5 Unión de Mab H11 a Líneas de Células Tumorales Humanas Determinada por ELISA de Células Fijas
La unión de H11 a líneas celulares y células tumorales humanas también se determinó por ELISA de células fijas. Las células tumorales en crecimiento se desprendieron de la superficie del matraz en T por incubación con EDTA-PBS. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS, se resuspendieron en medio de cultivo, se contaron y se pusieron 50 \mul de suspensión celular que contenía 5.000-10.000 células en cada pocillo de placas ELISA de 96 pocillos. Después de dejar que las células se unieran a las placas, se retiraron los sobrenadantes de cultivo y se bloquearon las placas con PBS-BSA. Después se incubaron las células con diferentes concentraciones (1-20 \mug/ml) de Mab H11 o de IgM de mieloma humano de control durante 2 h. Después de la incubación, se lavaron las placas, se incubaron con IgM anti-ser humano de cabra conjugada con biotina, se volvieron a lavar y se incubaron con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. Finalmente, las placas se lavaron, se incubaron con sustrato de p-nitrofenil fosfato y se leyeron a 405 nm en un lector de placas ELISA.
Los resultados de la reactividad del Mab H11 con líneas de células tumorales humanas por ELISA de células fijas se muestran en la Tabla 4 y en la Figura 7. En la Tabla 4, se usaron la IgM de control a 10 \mug/ml y H11 a 10 \mug/ml para ensayar la reactividad, y los valores se dan como absorbancia a 405 nm \pm desviación típica. Estos resultados indican que: 1) Mab H11 relaciona fuertemente con células de glioblastoma (SKMG-1), incluso a una concentración baja de 1 \mug/ml, mientras que la IgM de control a 20 \mug/ml no reacciona con células SKMG-1; y 2) Mab H11 reconoce el o los antígenos de tumor presentes en numerosas líneas de células tumorales (adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de colon, melanoma maligno, neuroblastoma, glioblastoma, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar microcítico y adenocarcinoma de próstata). El grado de reactividad de Mab varía tanto con el tipo de cáncer como con las líneas de células tumorales. La reactividad del Mab H11 para células cancerosas y tumorales era entre tres y diez veces superior que la de la IgM de control.
TABLA 4
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Ejemplo 6 Distribución Inmunoanatómica y Análisis Inmunopatológico de H11
Se usó inmunohistoquímica para determinar la especificidad de H11 para el detalle micro-anatómico y la heterogeneidad en tejidos y tumores. Las limitaciones de esta técnica incluyen posibles resultados falsos negativos debido a niveles bajos de expresión de la molécula en estudio, así como resultados de falsos positivos (reactividad cruzada) debido a la unión del anticuerpo a epítopos similares o epítopos compartidos por otros antígenos. Para abordar estas limitaciones, este estudio se realizó a la mayor concentración de anticuerpo que no mostraba unión no específica. Esto permitió una detección de todos los niveles de reactividad cruzada en diferentes tejidos. Además, los análisis de fijación establecieron la mejor combinación de intensidad de tinción antigénica y conservación morfológica. El presente ejemplo presenta resultados obtenidos a partir de IMPATH Inc., Nueva York, retenidos para estudiar la especificidad celular y expresión de antígeno de H11 en un panel seleccionado de secciones congeladas cortadas por criostato de tejidos normales y tumorales. El estudio usó una técnica de inmunoperoxidasa indirecta.
Se obtuvieron tejidos humanos histológicamente normales a partir de muestras quirúrgicas y de autopsia. Estos tejidos frescos se incluyeron en OCT (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) en criomoldes, se congelaron inmediatamente en isopentano y se enfriaron con nitrógeno líquido. Los tejidos del banco tisular congelado de IMPATH se cortaron con 5 micrómetros, se pusieron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se secaron al aire y se almacenaron a -70ºC.
H11, recibido sobre hielo seco y almacenado a 2-8ºC, se suministró no biotinilado a una concentración de 200 \mug/ml, con un volumen total de 3,0 ml. Una IgM de mieloma humana (Pierce, Nº Cat 311476) también suministrada por Novopharm, se usó como control negativo. Ambos anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato hasta las mismas concentraciones de trabajo dictadas por el análisis de titulación del anticuerpo H11. El anticuerpo secundario marcado con peroxidasa era una IgM anti-ser humano de cabra (American Qualex, San Clemente, CA, nº lote A112PN) diluida en PBS 1:500.
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Técnicas con inmunoperoxidasa: se realizaron estudios inmunohistoquímicos usando método de inmunoperoxidasa indirecto. Las secciones cortadas con criostato se retiraron del congelador a -70ºC, se secaron al aire y se fijaron de acuerdo con el protocolo de fijación (detalles de fijación, proporcionados a continuación). Las secciones tisulares se bloquearon durante 10 minutos con suero de cabra normal al 5% diluido en PBS, y después se incubaron con el anticuerpo primario durante una noche a 4ºC. Los portaobjetos se lavaron en PBS, seguido de un lavado con solución de Tween al 0,5%/PBS, y después de nuevo con PBS. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó con una incubación durante 30 minutos de peróxido de hidrógeno al 3%/metanol, seguido de 3 lavados de PBS. Después, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario de cabra IgM anti-humana (marcado con peroxidasa), durante 15 minutos a temperatura ambiente y se lavaron en PBS como se ha descrito anterior-
mente.
La reacción de peroxidasa se visualizó incubando secciones tisulares durante 2-5 minutos con tetraclorhidrato de 3,3-diaminobencidina (DAB) (Sigma Chemical Co., St. Louis. MO). Las secciones tisulares se lavaron de forma concienzuda, se realizó la tinción de contraste con una hematoxilina de Harris modificada (Fischer Scientific, Fairlawn, NJ) deshidratada por alcoholes graduados, se aclararon en xileno y se cubrieron con el cubreobjetos. Los tejidos que mostraban niveles elevados de tinción del fondo con el anticuerpo de control negativo se repitieron con un lavado más amplio. El carcinoma de mama humano (F95-036), suministrado por IMPATH, fue el control positivo para H11. Los controles negativos sustituyeron el anticuerpo de ensayo primario con IgM de mieloma humano
purificada.
El propósito del análisis de fijación fue establecer las condiciones que proporcionan la combinación óptima de intensidad de tinción antigénica y conservación morfológica. El tejido de control positivo se ensayó con cinco protocolos de fijación, incluyendo sin fijación. Los protocolos de fijación ensayados eran formalina tamponada neutra al 10% (23-25ºC), acetona (2-8ºC), metilo/acetona (1:1 V/V, 2-8ºC) y etanol al 95% (23-25ºC). Para este estudio, la formalina tamponada neutra al 10% (NBF) proporciona resultados óptimos para H11.
Usando NBF al 10% como agente de fijación, se ensayaron diluciones de anticuerpo seriadas (de 20,0 \mug/ml a 0,1 \mug/ml) en el control positivo, carcinoma de mama humano. Una concentración de 10,0 \mug/ml de anticuerpo H11 proporcionó resultados óptimos-máxima intensidad de tinción sin tinción de fondo significativa del control
negativo.
Los resultados obtenidos se representan en las Tablas 5 y 6. La Tabla 5 ilustra la reactividad de H11 en tejidos normales y la Tabla 6 ilustra la reactividad de H11 en tumores humanos.
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TABLA 5
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TABLA 6
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Los resultados obtenidos indican que se observó reactividad débil (1+) a fuerte (3+) en más del 70% de la muestra de control positivo. El antígeno reconocido por H11 tiene un patrón restringido de distribución. H11 era principalmente no reactivo con tejidos humanos normales ensayados en el sistema IMPATH. Se observó que todas las células epiteliales simples, así como los epitelios estratificados y los epitelios escamosos de diferentes órganos eran no reactivos. Tampoco se observó reactividad en células neuroectodérmicas, incluyendo las del cerebro, médula espinal y nervios periféricos. Los elementos mesenquimales tales como células esqueléticas y de músculo liso, fibroblastos y células endoteliales fueron negativos. Los tejidos de origen linfoide, incluyendo médula ósea, ganglio linfático, bazo y timo eran en gran medida no reactivos con el anticuerpo H11. Se observó reactividad débil (1+) en células esporádicas en una muestra de médula ósea y en los centros germinales de una de tres muestras de amígdala
ensayada.
Se observó inmunorreactividad positiva en casi todas las muestras de tumor ensayadas incluyendo mama, colon, glioma, gástrico, pulmonar (adeno, escamoso y microcítico), linfoma, melanoma, ovárico y próstata. Se observó reactividad en el 10% a más del 95% de las células tumorales presentes en estas muestras; la intensidad de tinción varió de débil (1+) a fuerte (3+). Sin embargo, el anticuerpo H11 no era reactivo con las tres muestras de sarcoma ensayadas. Algunos pero no todos los homólogos de las células tumorales, cuando estaban presentes en las muestras, eran reactivos con H11. Unas pocas células normales presentes en carcinoma de mama, gástrico y de próstata eran reactivas con el anticuerpo H11. Se cree que las células granulares grandes que eran reactivas con el anticuerpo H11 son células inflamatorias del linaje de eosinófilos-mastocitos.
En resumen, el anticuerpo H11 es en gran medida no reactivo con tejidos normales humanos con la excepción de algunos tejidos normales presentes en tumores. El anticuerpo H11 detecta un antígeno que se expresa en la mayoría de los tumores ensayados.
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Ejemplo 7 Clonación, Expresión y Reactividad Inmunológica de H11
Para determinar la capacidad de fragmentos de anticuerpos H11-scFv de unirse específicamente a células cancerosas, se realizaron los siguientes experimentos.
Las construcciones de anticuerpos de cadena única se realizaron mediante el siguiente procedimiento. Se sintetizaron cebadores específicos para los extremos 5' y 3' de las regiones V, kappa y mu de H11 en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems. Todos los cebadores contenían un sitio de endonucleasa de restricción para la clonación. Los cebadores 5 y 6 también contenían nucleótidos adicionales que codifican un enlazador (SGGGG)_{3}. Los cebadores usados se enumeran en la Tabla 7 donde el sitio de endonucleasa de restricción está subrayado.
TABLA 7
11
Se realizaron reacciones de PCR usando cebadores 1 y 2 para el dímero kappa, cebadores 3 y 4 para el dímero mu, cebadores 1 y 6 para el monómero kappa y cebadores 4 y 5 para el monómero mu. Los fragmentos de PCR después se purificaron y digirieron con sus respectivas endonucleasas de restricción. Los nucleótidos codificantes se ilustran en las SEC ID Nº: 13 y 16 y los nucleótidos complementarios se ilustran en las SEC ID Nº: 15 y 18 respectivamente.
El vector de expresión pSJF 1 que contiene un sitio de unión a ribosoma, la secuencia de péptido señal OmpA, el marcador de detección c-myc (9E10) y una cola de histidina (véase Figura 8) se preparó por corte con Bbs1 y BamH1. Las construcciones monoméricas y diméricas se ensamblaron ligando los respectivos fragmentos kappa y mu en pSFJ1 y utilizándolos para transformar células E. coli TG1 competentes. Las colonias resultantes se exploraron mediante PCR de colonia y digestiones con endonucleasas de restricción para confirmar que los insertos tenían el tamaño correcto y las secuencias se verificaron por secuenciación fluorescente con didesoxi.
Las TG1 transformadas que contenían el plásmido de expresión monomérico o dimérico de H11 se agitaron a 26ºC durante 24 h seguido por la adición de IPTG a una concentración final de 0,1 \muM. Las células se incubaron durante 16 horas adicionales y después se recogieron por centrifugación. Las proteínas periplasmáticas que contenían el anticuerpo H11 se liberaron por tratamiento con tampón de sacarosa (sacarosa al 25%, EDTA 1 mM, Tris 10 mM, pH 8,0) seguido por tampón de choque con hielo (Tris 8,0 10 mM, MgCl_{2} 0,5 mM). La expresión se verificó por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia de Western. El anticuerpo se purificó usando una columna cargada con níquel (columna quelante HiTrap de Pharmacia) y el anticuerpo unido se eluyó con un gradiente creciente de imidazol. El anticuerpo purificado se dializó frente a PBS/azida sódica al 0,02% y se concentró hasta 0,5 mg/ml.
Las similitudes antigénicas entre Mab H11 y H11-scFv también se determinaron por ELISA de células fijas. Las placas ELISA cubiertas con células A375 se incubaron con Mab H11, IgM de control, H11-scFv o BGA-scFv de control seguido por incubación con anticuerpo IgM de conejo anti-humano o anticuerpo de conejo anti-scFv de la manera apropiada. La detección fue por IgG-peroxidasa de rábano rusticano de cabra anti-conejo, seguido por sustrato. Los resultados, mostrados en la Figura 9, demuestran una alta afinidad tanto de H11 IgM como de H11-scFv y una baja afinidad tanto de la IgM de control como de BGA-SL-6.
Para determinar la especificidad de H11-scFv biotinilado con respecto a scFv de control biotinilado, se realizó el siguiente experimento. Se fijaron células tumorales humanas a placas ELISA y se incubaron con H11-scFV biotinilado o BGTA-scFV biotinilado (control) como se ha descrito anteriormente.
H11-scFV biotinilado también demostró una afinidad mucho mayor (entre 8 y 50 veces) para líneas celulares tumorales que el control en ELISA de células fijas. Los datos correspondientes a una concentración de 2,5 \mug/ml de H11scFV o BGA scFV se muestran en la Tabla 8 y en la Figura 10.
La Figura 11 ilustra la parte de la Tabla 8 relacionada con la titulación de reactividad de H11-scFv biotinilado para la unión a células de linfoma Daudi, Ramos, CA-46 y células CCRF-CEM. A cada concentración ensayada (1,25 a 10 \mug/ml) H11-scFv demostró una alta afinidad por células de linfoma, pero BGA scFv no.
TABLA 8
12
13 
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Para verificar la especificidad de H11-scFv biotinilado para células cancerosas, se realizó el siguiente experimento. Se prepararon muestras tisulares malignas y normales y se incubaron con H11-scFv biotinilado como se ha descrito anteriormente.
El H11-scFv se usó para teñir secciones de tejidos tumorales y normales. Los resultados se ilustran en la Tabla 8 para tejidos normales y en la Tabla 9 para tejidos tumorales.
La Figura 12 ilustra la intensidad de fluorescencia relativa de H11-scFv y scFv de control para líneas celulares tumorales.
Los datos en la Tabla 9 demuestran que H11-scFv biotinilado generalmente no reacciona con tejidos normales. Casi todos los tejidos normales ensayados no demostraron reactividad medible, generándose solamente una señal débilmente positiva por páncreas normal y tejidos de nervios periféricos. En la Tabla 9, -ve indica que no hay ninguna actividad medible y +/ indica actividad débilmente positiva.
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TABLA 9
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TABLA 10
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Los resultados presentados en la Tabla 10 indican que se observó tinción positiva en la mayoría de las muestras de carcinoma de mama (27/31) y colon (23/26) y próstata (17/20) ensayadas. Se observó tinción positiva a una concentración de 25 \mug/ml de H11-scFv. Aunque la tinción se detectó de forma predominante en celulares tumorales también se observaron diversos grados de reactividad en estroma y tejidos adyacentes. El H11-scFv también se ensayó para su especificidad para tejido normal. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 11 que resume la tinción inmunohistoquímica de H11-scFv con secciones de tejido humano normal.
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TABLA 11
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Ejemplo 8 Reactividad de H11-scFv con Células Tumorales Vivas Determinada por Citrometría de Flujo
Para ensayar la reactividad de H11-scFv para células tumorales vivas, se prepararon células de líneas tumorales para citometría de flujo como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Se incubaron células tumorales con H11-scFv biotinilado o scFv biotinilado de control como se ha descrito anteriormente a una concentración de proteína de 100 \mug/ml ó 200 \mug/ml. La reactividad se determinó como la fluorescencia media y el % de células positivas. Se preparó un H11-scFv biotinilado como se ha descrito anteriormente y con una concentración de proteínas de 100 \mug/ml ó 200 \mug/ml. La fluorescencia media y el % de células positivas se muestran en la Tabla 12 donde # es 3B1 biotinilado como scFv de control; * BGA SL-6 biotinilado como scFv de control; ** es PBS al 5% FCS como control; y *** es Biotina-5B1 como scFV de control.
TABLA 12
18
H11-scFv marcado con ^{125}I demostró una afinidad de unión (ka) de 3 x 10^{8} l/mol para células LS174T (unión específica mostrada en la Figura 13). ^{111}In-H11-scFv demostró una afinidad de unión (Ka) de 3,6 x 10^{8} l/mol para células A-375 y 1,4 x 10^{9} l/mol para células SKMG1. Los resultados se ilustran en la Figura 14. Había aproximadamente 24.000 sitios de unión/célula para células A-375 y aproximadamente 5000 sitios de unión/célula para SKMG1.
Estos resultados indican que las formas purificadas de Mab H11 se unen a un antígeno o antígenos asociados a la superficie celular expresados sobre líneas celulares de adenocarcinoma de mama (SK-BR-3), glioblastoma (SKMG-1) y melanoma (A-375) de linfoma.
Para ensayar adicionalmente la reactividad de H11-scFv biotinilado para células de linfoma vivas, se prepararon líneas de células tumorales y se incubaron con H11-scFv biotinilado a una concentración de proteína de 100 \mug/ml ó 200 \mug/ml, y se analizaron por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. La fluorescencia media y el % de células positivas se midieron por citometría de flujo. El control para la unión de scFv fue de BGA-scFv biotinilado. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
TABLA 13
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9 Unión de H11-scFv Biotiniliado a Células Tumorales Humanas Determinada por Tinción con Inmunoperoxidasa
Para determinar la inmunorreactividad de H11-scFv se realizó el siguiente experimento. Se dejaron crecer células tumorales en matraces en T y se prepararon citocentrifugaciones y se incubaron con H11-scFv biotinilado o PBS para determinar la unión.
Los resultados de la inmunorreactividad de H11-scFv se muestran en la Tabla 14 donde la reactividad se indica como negativa (- -), débilmente positiva (\pm) o positiva (+ o ++). Estos resultados indican que, como se determina por la tinción con inmunoperoxidasa, el epítopo reconocido por Mab H11 se expresa por varios tipos diferentes de células tumorales y líneas celulares humanas.
TABLA 14
21 
\newpage
Ejemplo 10 Reactividad de H11 IgG1 Producida de Forma Recombinante
Se produjo H11 IgG1 en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) del siguiente modo. Se prepararon varios vectores que contenían ADNc que codificaban secuencias de cadena ligera y pesada de H11. La orientación, los insertos de ADN y los criterios de selección para antibióticos de estas construcciones se muestran en la Tabla 15 donde CMV es citomegalovirus; DHFR es dihidrofolato reductasa; HC es cadena pesada y LC es cadena ligera.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 15
23 
\vskip1.000000\baselineskip
Estos vectores de expresión tienen sitios de inserción separados para las secuencias que codifican las cadenas de anticuerpo ligera y pesada. Un nivel elevado de expresión constitutiva tanto de las cadenas pesadas como ligeras se dirige por el potenciador/promotor inmediato-temprano del citomegalovirus (CMV). Un intrón quimérico que comprende el sitio de donación 5' del primer intrón de la \beta-globina humana y el sitio aceptor 3' del intrón de un gen de inmunoglobulina (región variable de cadena pesada) se localiza aguas abajo del promotor que frecuentemente ha demostrado mejorar los niveles de expresión génica. Se proporciona la poliadenilación de los ARNm por la señal de poliadenilación del virus de simio 40 (SV40).
Los plásmidos también contienen el gen que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR), y por lo tanto, se puede hacer crecer en células deficientes en DHFR de ovario de hámster chino (CHO). La amplificación usando metotrexato, un análogo de folato e inhibidor potente de DHFR, da como resultado la amplificación del gen de DHFR y sus secuencias flanqueantes (particularmente las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo en la construcción). Un aumento gradual en concentración de metotrexato (de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 800 nM) puede producir niveles muy elevados de proteína del gen o los genes diana. Las construcciones también contienen un gen que confiere resistencia a antibióticos que era un marcador de selección, se usa resistencia a neomicina o zeomicina. Los vectores se muestran en las Figuras 15 y 16.
Los resultados de los análisis de citometría de flujo de IgG1 de H11 producido de forma recombinante se muestran en la Tabla 16 e ilustran que H11 IgG1 que se une a un antígeno en células de carcinoma de mama SK-BR-3 se puede producir en células CHO.
TABLA 16
24 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Unión H11 a Líneas de Células Cancerosas
Se determinaron las afinidades de unión de H11 IgM y H11-scFv para diversas líneas de células cancerosas humanas marcando los anticuerpos H11 con yoduro radiactivo o indio radiactivo. ^{125}I-H11-scFv se preparó con actividades específicas de 7, 20 ó 150 \muCi/\mug y se obtuvo ^{125}I-H11 IgM 0,6 \muCi/\mug. Además, se preparó ^{111}In-H11-scFv que tenía una actividad específica de 13 y 38 \muCi/\mug como se describe en el Ejemplo 12. Como control para indicar la unión específica se usó scFv 3B 1 que no reconoce el antígeno C, y se marcó con 150 \muCi/\mug.
Se purificó ^{125}I-H11-scFv usando una minicolumna P-2 y se analizó por cromatografía en papel en metanol al 85% como se muestra en la Figura 17. Se purificó ^{125}I-H11 IgM usando una mini-columna de Sephadex G-50 (Pharmacia) y se analizó por cromatografía en papel en metanol al 85% como se muestra en la Figura 18. Se usó una columna de Sephadex G-50 para purificar ^{111}In-H111-scFv que después se analizó por ITLC-SG en Citrato 0,1 M como se muestra en la Figura 19.
Los resultados de la unión de H11 se muestran en las Figuras 3 y 14. La Figura 13 se muestra la unión específica de ^{125}I-H11-scFv a células de cáncer de colon humanas LS174T. La Figura 14 muestra la unión total de ^{111}In-H11-scFv a células A375.
Los resultados obtenidos indican que H11 se une específicamente tanto a células de melanoma humano como a LT174T. H11 también se une, pero con menor afinidad, a la línea de células cancerosas de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12 Formación de Imágenes de Tumor con ^{111}Indio-DTPA-H11-scFv
Se conjugó H11-scFv con el anhídrido bicíclico de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) con una proporción molar de 10:1 (DTPA:H11-scFv) dando como resultado un nivel de sustitución de 2 moles de DTPA por mol de H11-scFv. Se purificó DTPA-H11-scFv de DTPA en exceso en una mini-columna de Sephadex G-25 (Farmacia) y se reconcentró hasta 10 mg/ml usando un microconcentrador Centncon-30 (Amicon). El DTPA-H11-scFv se radiomarcó hasta una actividad específica de 25 mCi/mg con acetato de ^{111}Indio. Se retiró el ^{111}In no incorporado usando una minicolumna de Sephadex G-25. El acetato de ^{111}Indio se preparó a partir de cloruro de ^{111}Indio (Nordion) y tampón acetato 1 M a pH 6,0. La pureza radioquímica del ^{111}In-DTPA-H11-scFv fue mayor del 99% cuando se midió por cromatografía en gel de sílice de capa fina en citrato sódico 100 mM pH 5,0. La Figura 19 muestra la purificación y TLC.
A un ratón desnudo hembra con un xenoinjerto de melanoma A357 subcutáneo existente en el lado derecho y un xenoinjerto de cáncer de colon humano HT-29 subcutáneo en la región abdominal media se le inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola 100 \muCi de ^{111}In-DTPA-H11-scFv. El ratón se puso inmediatamente bajo la cámara gamma (Siemans ZL3700) conectada con un ordenador GE Star 4000i y se obtuvo una adquisición dinámica durante 120 minutos, durante un total de 480 marcos de 15 segundos cada uno. Los marcos se combinaron después en imágenes de 12 x 10 minutos. El tumor A375 fue visible en el lado derecho del ratón tan sólo a los 30 minutos después de la inyección.
El análisis de la región de interés de los dos tumores mostró que el tumor A375 acumuló radiactividad a lo largo del estudio de 120 minutos, mientras que el tumor HT-29 acumuló radiactividad durante la primera hora y después la concentración de radiactividad permaneció relativamente constante. La Figura 20 muestra 12 marcos y las dos flechas en el marco derecho inferior, tomado a los 120 minutos, muestra la acumulación de radiactividad en los dos tumores. La flecha estrecha se dirige hacia el tumor A375, y la flecha ancha se dirige hacia el tumor HT-29. Los tejidos normales visibles en las imágenes incluyen el corazón, el hígado, los riñones y la vejiga. El corazón es visible debido a las cantidades circulantes de radiactividad, y los riñones y la vejiga son visibles debido a la eliminación renal de ^{111}In-DTPA-H11-scFv. La pequeña cantidad de captación hepática puede deberse al flujo sanguíneo al hígado o a la unión parcial de ^{111}In-DTPA-H11-scFv al hígado.
Aunque la anterior descripción se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad y comprensión, será evidente para los especialistas en la técnica que se pueden poner en práctica determinados cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Dan, Michael D.
\hskip3.89cm
Maiti, Pradip K. 
\hskip3.89cm
Kaplan, Howard A. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FRAGMENTOS DE UNIÓN A ANTÍGENO H11 QUE DETECTAN ESPECÍFICAMENTE CÉLULAS CANCEROSAS, NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LOS FRAGMENTOS Y USO DE LOS MISMOS PARA LA PROFILAXIS Y DETECCIÓN DE CANCERES
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Morrison & Foerster
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 755 Page Mill Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
COUNTRY: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 94304-1018
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Lehnhardt, Susan K.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.943
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 31608-20001.20
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415) 813-5600
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (415) 494-0792
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 706141
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 543 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.543
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 179 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 543 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 450 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.450
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 450 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGAAGACA CCAGGCCGAT ATTGTGTTGA CGCA 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATCCGGATG CAGCCACAGT TCGTTT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATTCGGACA GGTGCAGCTG GTGGAG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGGATCCT GAGGAGACGG TGACCGT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCCG GAGGTGGTGG ATCAGGTGGA GGTGGCTCCC AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCTCCGGAA CCGCCACCGC CAGAGACAGA TGGTGCAGCC ACATTC 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: DCS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: unión(1..906, 913..918)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 304 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 867 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: unión(1.855, 862.867)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
42
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 287 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 867 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
45

Claims (30)

1. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, donde el anticuerpo reconoce específicamente el mismo antígeno reconocido específicamente por un anticuerpo que comprende una región V de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y una región V de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 y donde el fragmento de unión a antígeno comprende al menos siete restos de aminoácidos consecutivos de la región CDR3 de la cadena pesada de la SEC ID Nº: 2.
2. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, donde el anticuerpo reconoce específicamente el mismo antígeno reconocido específicamente por un fragmento de región V de cadena única (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14.
3. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo nativo completo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, Fab, F(ab')2, un fragmento de región V de cadena única (scFv) o un polipéptido de fusión, donde el polipéptido de fusión comprende el fragmento de unión a antígeno fusionado con un resto químicamente funcional.
4. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, donde el anticuerpo nativo completo comprende cadenas H que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y una cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5.
5. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, donde el scFv es igual que una cualquiera de las SEC ID Nº: 14 y 17.
6. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicho resto es un péptido señal, un agente que mejora la reactividad inmunológica, un agente que facilita el acoplamiento a un soporte sólido, un soporte de vacuna, un modificador de la respuesta biológica, una toxina, un marcador detectable, un marcador paramagnético o un fármaco.
7. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, donde el péptido señal es procariota o eucariota.
8. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho agente que mejora la reactividad inmunológica es un superantígeno bacteriano, dicho agente que facilita el acoplamiento a un soporte sólido es biotina o avidina, dicho soporte de inmunógeno es un tampón fisiológicamente aceptable y/o dicho modificador de la respuesta biológica es una citocina.
9. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 8, donde la citocina es el factor de necrosis tumoral, la interleucina-2, la interleucina-4, la interleucina-12, el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos o el interferón \gamma.
10. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, donde el fármaco es un agente antineoplásico que es un radioisótopo, alcaloide de la vinca, adriamicina, sulfato de bleomicina, Carboplatino, Cisplatino, ciclofosfamida, Citarabina, Decarbazina, Dactinomicina, Clorhidrato de Daunorubicina, Clorhidrato de Doxorubicina, Etopósido, fluorouracilo, lomustina, Clorhidrato de Meclororetamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, pentostatina, pipobromano, clorhidrato de procarbazol, estreptozotocina, taxol, tioguanina o mostaza de Uracilo y/o la toxina es ricina, un radionúclido, proteína antiviral de fitola americana, exotoxina A de Pseudomonas, toxina diftérica, cadena A de ricina, restrictocina o una enzima fosfolipasa.
11. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 10, donde el alcaloide de la vinca es sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina o sulfato de vindesina y/o el marcador detectable es un radioisótopo, compuesto fluorescente, metal coloide, compuesto quimioluminiscente, compuesto bioluminiscente, enzima, sustrato, cofactor o inhibidor.
12. Una composición que comprende un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, donde el excipiente es una preparación de liposomas.
14. Un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, donde el fragmento de unión a antígeno comprende adicionalmente una región C de inmunoglobulina heteróloga.
15. Un anticuerpo humanizado que comprende el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
16. Un péptido polimérico que comprende una pluralidad de los fragmentos de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
17. Una composición inmunogénica que comprende un fragmento de unión a antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad de adyuvante eficaz para mejorar la respuesta inmune.
18. Una secuencia polinucleotídica aislada que codifica un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la reivindicación 14.
19. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18, donde la secuencia codificante está dentro de las SEC ID Nº: 1 ó 4.
20. Un vector de clonación o expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19.
21. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 20 que es vaccinia.
22. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 o que se ha transformado o transfectado con un vector de acuerdo con la reivindicación 20.
23. Una composición farmacéutica o inmunogénica que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. El uso de un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la fabricación de un medicamento para tratar neoplasia.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el individuo que se tiene que tratar tiene un tumor clínicamente detectable y/o que implica paliar la neoplasia.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que un tumor que se había detectado previamente en el individuo se había tratado y es clínicamente indetectable en el momento de administrar el fragmento de unión a antígeno y/o donde el uso implica la disminución del riesgo de recurrencia de un tumor clínicamente detectable.
27. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 al 26 en el que el fragmento de unión a antígeno se puede administrar por vía parenteral por inyección subcutánea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intracavitaria, intratecal, transdérmica o intravenosa.
28. El uso acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que el fragmento de unión a antígeno se administra con una dosificación de 0,01 mg/kg/dosis a 2000 mg/kg/dosis y/o el fragmento de unión a antígeno se marca con un resto terapéutico.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el resto terapéutico es un radioisótopo, un agente antineoplásico, un inmunomodulador, un modificador de la respuesta biológica, una lectina o una toxina.
30. Un método para detectar un antígeno en una muestra, comprendiendo el método:
(a)
poner en contacto una muestra con un fragmento de unión a antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en condiciones que permiten la formación de un complejo estable anticuerpo-antígeno; y
(b)
detectar cualquier complejo estable formado en la etapa (a);
donde el antígeno se reconoce específicamente por un anticuerpo que comprende una cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y una región V de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5, o por un fragmento de región V de cadena única (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14.
ES97929703T 1996-05-22 1997-05-22 Fragmentos de union a antigenos que detectan especificamente celulas cancerosas, nucleotidos que codifican los fragmentos y el uso de los mismos para la profilaxis y deteccion de canceres. Expired - Lifetime ES2312177T3 (es)

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