KR20160122188A - 3기능성 t 세포-항원 커플러 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

3기능성 t 세포-항원 커플러 및 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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KR20160122188A
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갈리나 데니소바
라자니쉬 기리
케네스 앤소니 엠와와시
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Abstract

표적-특이적 리간드, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드 및 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 포함하는 3 기능성 분자가 제공된다. 이러한 신규한 수용체로 조작하는 것은 사이토카인 생성, 탈과립화 및 세포용해를 포함한 수많은 T 세포 기능들의 항원 특이적 활성화를 생성하게 한다.

Description

3기능성 T 세포-항원 커플러 및 이의 제조 방법 및 용도 {TRIFUNCTIONAL T CELL-ANTIGEN COUPLER AND METHODS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2014년 2월 7일 출원된 미국 가특허 출원 제 61/936,906호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
기술분야
본 출원은 특이적 표적 세포들에 대해 높은 세포독성 및 감소된 오프-타겟(off-target) 독성을 가지도록 T-세포들을 조작함에 의한 암 치료방법에 관계된다. 특히, 본 출원은 천연 T-세포 활성화 과정을 모사하는 신규한 생물학적 제제들을 발현시키도록 T-세포들을 조작하는 것에 관계된다.
배경기술
암은 캐나다에서 2013년에만 암으로 진단된 사례가 150,000이 넘을 것으로 예상되었던 주요 건강 문제이다. 초기 단계 질환의 환자들은 종래의 치료법들 (외과적 수술, 방사선치료, 화학치료)에 의해 효과적으로 치료될 수 있으나, 진행된 질환의 환자들에게는 선택권이 거의 없으며 가능한 선택권들도 본질적으로는 질병을 완화시키기 위함이 통상적이었다. 능동적 면역치료는 종양 침착물을 제거하기 위해 환자의 면역체계를 이용하고자 하며 종래의 치료법들로 실패했던 환자들에게 흥미로운 선택권을 제공한다 (Humphries, 2013). 사실, 몇가지 임상 연구들은 T 세포를 이용한 면역치료가 흑색종이 진행된 환자들에 있어서 치유력이 있을 수 있음을 입증하였으며, 이는 본 접근법의 유용성을 확인시켜 주는 것이다 (Humphries, 2013). 추가적으로, 만성 림프구 백혈병 (CLL) 및 급성 림프모구 백혈병 (ALL)을 앓고 있는 환자들 또한 T 세포 면역치료를 이용하여 효과적으로 치료되고 치유되었다 (Fry and Mackall, 2013)(Kochenderfer and Rosenberg, 2013). 몇 가지 면역치료 접근법들이 있으나, 키메라 수용체를 이용한 T-세포들의 조작은 임의의 환자의 면역 세포들로 하여금 주조직 적합 복합체 (MHC) 독립 방식으로 임의의 의도한 표적에 대해 표적화 하는 것을 가능하게 한다. 지금까지, T 세포들을 조작함에 사용된 키메라 수용체들은 표적 도메인, 통상적으로 단쇄 가변 분절 (scFv); 막통과 도메인; 및 T 세포 수용체로부터의 신호 요소들 및 관련 단백질들을 함유하는 시토졸 도메인으로 구성된다 (Dotti et al., 2009). 이러한 키메라 수용체는 "T-바디", "키메라 항원 수용체" (CAR) 또는 "키메라 면역 수용체" (CIR) 로도 언급되어 왔는데- 현재, 대부분의 연구자들은 "CAR" 용어를 사용한다 (Dotti et al., 2009). 이들 CAR은 모듈식 용어로 고려되며, 과학자들은 상이한 세포질 신호전달 도메인의 CAR 기능에 대한 영향을 조사하는 것에 상당한 시간을 보냈다. 1세대 CAR은 CD3ζ 또는 FcεRIγ로부터 단일 신호전달 도메인을 사용하였다. 2세대 CAR은 CD3ζ의 신호전달 도메인을 CD28 또는 TNFR 군의 수용체들로부터의 공동자극 수용체들의 세포질 도메인과 조합하였다 (Dotti et al., 2009). 3세대 CAR은 다수의 공동자극 도메인들을 조합하였으나, 3세대 CAR은 항원-특이성을 잃을 수도 있는 염려가 있다 (Han et al., 2013). 임상에서 시험되는 대부분의 CAR-조작 T 세포들은 CD3ζ이 CD28 또는 CD137의 세포질 도메인에 결합된 2세대 CAR을 사용한다 (Han et al., 2013)(Finney et al., 2004)(Milone et al., 2009).
CAR-조작된 T 세포들은 임상 응용에 있어 상당한 가능성을 보여주었으나, 이들은 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 제공되는 활성화 신호를 대체하는 합성법에 의존한다. 이러한 합성 수용체는 TCR과 관계된 신호전달 성분들(예컨대, CD3엡실론, Lck) 모두를 전달하는 것은 아니기 때문에, T 세포들이 CAR에 의해 최적으로 활성화되는지 여부 또는 CAR 활성화가 T 세포 분화 (예컨대, 기억으로의 진행)에 어떻게 영향을 미치는지는 여전히 불명확하다. 더욱이, CAR 신호전달 도메인들은 CAR 구조의 성질에 의해 이들 신호전달 도메인들의 천연 조절 파트너들에서 분리되어 있기 때문에, CAR이 지속적으로 낮은 수준의 활성화를 가져와서 오프-타겟 독성을 초래할 수 있는 내재적 위험 또한 존재한다.
이러한 한계들을 고려하면, T 세포들을 이들의 천연 TCR을 통해 종양을 공격하도록 재유도하는 것이 바람직하다. 이를 위하여, 용어 "이중특이성 T-세포 연관체(engager)" (BiTE)의 한 종류의 재조합 단백질을 제조한 바 있다 (Chames and Baty, 2009)(Portell et al., 2013). 이러한 단백질들은 T-세포 TCR 수용체들을 표적 항원들과 가교결합시키기 위해 이중특이성 항체 분절들을 사용한다. 이는 효율적인 T-세포 활성화를 가져오며, 세포독성을 유발한다. 유사하게, 이러한 목적을 구현하는 이중특이성 항체들이 생성되었는데, 일부 과학자들은 화학 결합을 이용하여 항-CD3 항체들을 종양-특이적 항체들에 간단히 결합시켰다 (Chames and Baty, 2009). 이들 이중특이성 단백질들이 시험관내에서 일부 활성을 보였으나, GMP 생성, 짧은 생물학적 반감기 및 생체이용률은 암 치료에 있어 이들 분자들을 성공적으로 이용하기 위한 중요한 과제를 제시한다. 추가적으로, 이러한 분자들은 또한 천연 TCR 신호전달을 적절히 개괄하지 못했는데, 이들 분자들이 TCR 공동-수용체들 (CD8 및 CD4)을 관여시키지 않기 때문이다.
따라서 종래의 CAR에 비해 개선된 활성 및 안전성을 보유한 T 세포-항원 커플러에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
요약
본 발명의 발명자들은 T 세포 수용체 (TCR)를 통한 자연 신호전달을 보다 잘 모사하면서도, 비제한 표적의 주조직 적합 복합체를 보유하는 3기능성 T 세포-항원 커플러가 종래의 키메라 항원 수용체들에 비해 개선된 활성 및 안전성을 가짐을 입증하였다.
따라서 본 발명의 한 양태는 다음을 포함하는 핵산을 제공한다 :
a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
b. TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 또다른 양태는 상기 기재된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 또다른 양태는 상기 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명의 또다른 양태는 상기 기재된 핵산을 발현시키는 T-세포를 제공한다. 본 발명의 또다른 양태는 T 세포 및 담체를 포함하는 제약상 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암치료를 필요로하는 개체에서 암을 치료하기 위한 T 세포의 용도를 제공하는데, 여기서 T 세포는 다음을 포함하는 핵산을 발현시킨다:
a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
b. TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
한 구체예에서, 표적-특이적 리간드는 암세포 상의 항원을 결합시킨다.
또다른 구체예에서, 표적-특이적 리간드는 설계된 안키린 반복 (DARPin) 폴리펩티드 또는 scFv이다.
또다른 구체예에서, TCR 복합체와 관련된 단백질은 CD3이다.
또다른 구체예에서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 단일사슬 항체이다.
또다른 구체예에서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 UCHT1, 또는 이의 변이체이다.
또다른 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 시토졸 도메인 및 막통과 도메인을 포함한다.
또다른 구체예에서, 시토졸 도메인은 CD4 시토졸 도메인이고 막통과 도메인은 CD4 막통과 도메인이다.
또다른 구체예에서 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합된다.
또다른 구체예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드에 융합된다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 벡터 구조체를 제공한다:
a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
b. TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드, 및
d. 포유동물 세포에서 기능성인 프로모터.
한 구체예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합되어 T 세포 항원 커플러 융합물을 제공하며 T 세포 항원 커플러 융합물의 코딩 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다.
또 다른 구체예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드에 융합되어 T 세포 항원 커플러 융합물을 제공하며 T 세포 항원 커플러 융합물의 코딩 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 발명은 또한 벡터 구조체로 형질감염된 분리된 T 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 하기 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나 본 발명의 사상 및 범위에 속하는 다양한 변화 및 변형들은 이러한 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명할 것이므로, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구체예들을 나타내는 구체예들은 단지 설명으로서 제공됨을 이해하여야 한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 종래의 2세대 CAR과 비교한 3기능성 T 세포-항원 커플러 (트리-TAC)의 도표 요약이다. 본 작업에서 사용된 구조체들의 개요가 포함되어 있다.
도 2는 트리-TAC 변이체들 및 전형적인 CAR의 표면 발현 분석을 보여준다.
도 3은 상이한 표지자들 IFN-γ, TNF-α 및 CD107a에서 보이는 세포 활성화 분석을 보여준다.
도 4는 전형적인 CAR 및 트리-TAC의 분자 표적을 발현시키거나 (D2F2E2) 또는 발현시키지 않는 (D2F2) 두 가지 상이한 세포주들의 사멸을 분석한다.
도 5는 천연 T-세포 초기 (A), 현재 사용되고 있는 두 가지 인공적 T-세포 활성화 방법(B 및 C), 및 TAC 활성화 기술 (D)을 도시한다.
도 6은 (A) TAC 분자의 구조 1 및 (B) TAC 분자의 구조 2를 도시한다.
도 7은 scFv CD4 TAC의 기능성을 보여준다. (A)는 scFv CD4 TAC 수용체의 표면 발현을 공 벡터와 비교하여 보여주는 히스토그램이고, (B)는 scFv CD4 TAC (상단) 또는 scFV CAR (하단)을 발현시키는 T-세포들의 항원 특이적 활성화를 보여주며 (C)는 scFv CD4 TAC 및 scFv CAR 모두에 의한 MCF-7 인간 종양 세포주 (Her2 양성)의 비슷한 사멸을 보여준다.
도 8은 CD4-TAC 구조 2를 특성화한다. (A)는 DARPin CD4 TAC 수용체의 표면 발현을 공 벡터와 비교하여 보여주는 히스토그램이고, (B)는 Her2 항원에 노출된 DARPin TAC 구조 2를 이용하여 조작된 T 세포의 사이토카인 생성 및 탈과립화를 보여주며 (C)는 CD4 TAC 구조 2의 성장을 공 벡터 대조군에 비교하여 보여준다.
도 9는 DARPin CD4 TAC 구조 1의 기능성을 보여준다. (A)는 DARPin CD4 YAC의 표면 발현을 DARPin CAR 및 NGFR 단독 대조군에 비교하여 보여주며, (B)는 CD4 TAC 구조 1의 성장을 보여주고 (C) 및 (D)는 다양한 활성화 및 분해 표지자에 대해 양성인 세포들의 백분율을 보여준다.
도 10은 TAC 및 CAR의 세포독성 및 전반적인 활성을 보여준다. TAC, CAR 또는 공 벡터 대조군을 이용하여 조작된 세포들을 다양한 인간 종양 세포주들에서 배양시켰다.
도 11은 다양한 TAC 대조군들의 수용체 표면 발현 및 활성화를 보여준다. (A)는 세포 표면 발현 (좌), 탈과립화 (중앙) 및 사이토카인 생성 (우)을 보여주며 (B)는 오직 전장 CD4-TAC만이 세포독성 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
도 12는 다양한 막통과 TAC 변이체들의 성질들을 보여준다. (A)는 다양한 막통과 도메인 구조들에 대한 개요이며, (B)는 CD8 정제된 T 세포에서 조작된 다양한 구조들의 발현 표면을 보여주고 (C)는 다양한 변이체들의 탈과립화 및 사이토카인 생성에 대한 시험을 보여준다.
도 13은 TAC 변이체들과의 Lck 상호작용을 보여준다. (A)는 Lck를 풀다운(pull down)시키는 전장 TAC 및 시토졸 결손 능력을 보여주며 (B)는 (A)의 펠릿들에서 검출된 Lck의 밀도측정 분석이다.
도 14는 CD4 TAC 표면 발현 및 활성을 BiTE 유사 변이체에 비교하여 보여준다. (A)는 NGFR 단독 대조군, CD4 TAC 및 BiTE 유사 변이체의 표면 발현을 도시하며 (B)는 다양한 세포주들에서의 세포독성을 비교한다.
도 15는 UCHT1의 무작위 돌연변이원 라이브러리에 비교한 야생형 CD4 TAC를 보여준다. (A)는 돌연변이의 도식적 설명을 보여주며, (B)는 라이브러리의 표면 발현을 보여주는 히스토그램이고 (C)는 T 세포들을 활성화시키고 사이토카인을 생성하는 라이브러리의 능력을 보여준다.
도 16은 A85V, T161P 돌연변이체의 개선된 표면 발현을 보여준다. (A)는 CD4 TAC 및 A85V, T161P 돌연변이체 간의 최종 CD/CD8 개체군들을 비교하며, (B)는 A85V, T161P 돌연변이체의 개선된 표면 발현을 보여주고 (C)는 A85V, T161 돌연변이체에서 사이토카인 생성이 감소됨을 보여준다.
도 17은 A85V, T161P 돌연변이체 세포독성 및 성장을 보여준다. (A)는 다양한 세포주들에서 A85V, T161P 돌연변이체의 세포독성을 보여주며 (B)는 2주에 걸친 배양에서의 세포 성장을 보여준다.
상세한 설명
(i) 정의
본 출원에서 사용되는 용어 "세포"는 하나의 세포 뿐만 아니라 복수의 세포들을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "T 세포"는 세포-매개 면역에서 중추적 역할을 하는 림프구의 한 형태를 의미한다. T 림프구로도 언급되는 T 세포는 세포 표면 상에 T-세포 수용체 (TCR)의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살해 세포와 같은 다른 림프구와 구별될 수 있다. 구별되는 기능들을 보유한 T 세포들의 몇가지 부분집합들이 존재하는데, 이에는 T 보조 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포 및 자연 살해 T 세포가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 용어 "T 세포 항원 커플러"는, T 세포 상에서 발현될 경우 특정 항원에 T 세포를 표적시키는 조작된 핵산 구조체 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및/또는 "핵산 서열" 및/또는 "핵산"은 염기, 당 및 당간 (골격) 결합들로 이루어진 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단량체의 서열을 의미한다. 이 용어는 또한 비-자연적으로 발생하는 단량체 또는 이의 일부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 서열들을 포함한다. 본 출원의 핵산 서열들은 데옥시리보핵산 서열 (DNA) 또는 리보핵산 서열 (RNA)일 수 있으며 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함한 자연적으로 발생하는 염기들을 포함할 수 있다. 이 서열들은 또한 변형된 염기들을 함유할 수도 있다. 이러한 변형된 염기들의 예에는 아자 및 데아자 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실; 및 잔틴 및 하이포잔틴이 포함된다. 본 출원의 핵산들은 생물학적 유기체로부터 분리되거나, 실험실의 유전자 재조합법에 의해 형성되거나 핵산을 생성하는 화학적 합성법 또는 그 외 다른 공지된 프로토콜에 의해 수득될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "분리된 핵산 서열"은 재조합 DNA 기술로 제조될 경우 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없는, 또는 화학적으로 합성될 경우 화학적 전구물질 또는 그 외 다른 화학물질이 실질적으로 없는 핵산을 의미한다. 분리된 핵산은 또한 그로부터 핵산이 유도되는, 자연적으로 핵산 측면에 위치하는 서열들(즉, 핵산의 5′ 및 3′ 말단에 위치하는 서열들)이 실질적으로 없다. 용어 "핵산"은 DNA 및 RNA를 포함하고자 하며 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다. 또한, 용어 "핵산"은 상보적 핵산 서열들을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "재조합 핵산" 또는 "조작된 핵산"은 생물학적 유기체에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 재조합 핵산들은 달리 자연에서 발견되지 않을 서열들을 제조하기 위하여 실험실의 유전자 재조합법 (가령, 분자 클로닝)에 의해 형성될 수 있다. 재조합 핵산들은 또한 핵산들을 생성하기 위한 화학적 합성법 또는 그 외 다른 공지의 프로토콜에 의해 생성될 수도 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 핵산에 의해 인코딩되는 것들에 상응하는 아미노산들의 사슬을 기술한다. 본 출원의 폴리펩티드 또는 단백질은 펩티드일 수 있으며, 이는 보통 2 내지 약 30개의 아미노산들의 아미노산 사슬을 기술한다. 본 출원에서 사용되는 용어 단백질은 또한 30개 초과의 아미노산들을 보유하는 아미노산 사슬을 기술하며 단백질 또는 전장 단백질의 분절 또는 도메인일 수 있다. 더욱이, 본 출원에서 사용되는 용어 단백질은 아미노산들의 직쇄를 의미할 수 있거나 기능적 단백질로 이미 가공되어 폴딩된 아미노산들의 사슬을 의미할 수 있다. 그러나 30은 펩티드와 단백질을 구별하는 것에 관한 임의의 수이며, 이 용어들은 아미노산들의 사슬에 대하여 호환적으로 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 출원의 단백질들은 이들이 자연적으로 생성되는 세포로부터 단백질들을 분리 및 정제하여, 효소적 (예컨대, 단백질분해적) 절단에 의해, 및/또는 본 출원의 단백질들 또는 분절들을 인코딩하는 핵산을 발현시켜 재조합적으로 얻을 수 있다. 본 출원의 단백질 및/또는 분절들은 또한 단백질 및 분절들을 제조하기 위한 화학적 합성법 또는 그 외 다른 공지의 프로토콜에 의해 얻을 수도 있다.
용어 "분리된 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술들에 의해 제조될 경우 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없는, 또는 화학적으로 합성될 경우 화학적 전구물질들 또는 그 외 다른 화학물질들이 실질적으로 없는 폴리펩티드를 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항체"는 단일클론 항체들, 다클론 항체들, 단일사슬 항체들, 키메라 항체들 및 항체 융합물들을 포함하고자 한다. 항체는 재조합 공급원으로부터 얻거나 및/또는 유전자삽입 동물들에서 제조될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "항체 분절"은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디(minibodies), 디아바디(diabodies), 및 이의 다량체, 다중특이적 항체 분절들 및 도메인 항체들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 용어 "벡터"는 세포 내부에 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 구체예에서, 벡터는 세포내에서 발현될 핵산에 작동적으로 연결되는 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터)을 포함하는 발현 벡터이다. 해당 기술 분야에 공지된 벡터들에는, 플라스미드, 파지, 코스미드 및 바이러스가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
(ii) 조성물
본 발명의 발명자들은 T-세포 수용체 (TCR)를 통한 자연 신호전달을 보다 잘 모사하면서도, 비제한 표적의 MHC를 보유하는 3기능성 T 세포-항원 커플러 (트리-TAC)를 개발하였다. 구체적으로는, 본 발명의 발명자들은, CD4 보조-수용체의 막통과 구역들 및 세포내 구역들이, 단일 사슬 항체로 융합되어 있는 분자를 생성하였는데, 이러한 분자에서 CD4 보조-수용체의 막통과 구역들 및 세포내 구역들은 각각 지질 래프트(lipid raft)에 위치시키고(localize) Lck를 결합시키며, 단일 사슬 항체는 CD3를 결합시킨다. 이 구조는 자연적인 MHC 결합과 유사하게 CD3 분자 및 TCR을 지질 래프트 구역 내부로 끌어당겨 TCR 부근으로 Lck를 가져오도록 설계된다. 키메라 수용체를 표적화하기 위하여, 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin)을 CD4-UCHT1 키메라에 결합시켜, 3-기능성 T 세포-항원 커플러 (트리-TAC)를 생성하였다.
실험적으로, 인간 T 세포들은 동일한 DARPin을 사용하여 프로토타입 트리-TAC 또는 종래의 CAR을 발현시키도록 조작되었다. 모든 양태들에서, 트리-TAC를 이용하여 조작된 T 세포들은 종래의 CAR에 상당하는 기능성을 보여주었음이 결정되었다. 두 개의 변수들 (TNF-α 생성 및 CD107a 유동)에 관하여, 트리-TAC는 종래의 CAR보다 더 활성을 띠었음이 관찰되었다. 더욱이, 데이터는 각 분자에 기반하여 트리-TAC가 상당히 개선된 활성을 보여줌을 나타낸다. 추가적으로 트리-TAC는 전형적인 CAR에 비해 개선된 안전성을 제공하는데, 이는 어떠한 활성화 도메인도 상기 단백질의 일부가 아니기 때문이다.
따라서, 본 출원은 다음을 포함하는 핵산에 관계된다:
표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
TCR 복합체를 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
한 구체예에서, 핵산은 재조합체, 또는 조작된 핵산이다. 또다른 구체예에서, 제 1, 제 2 및/또는 제 3 폴리뉴클레오티드는 재조합, 또는 조작된 폴리뉴클레오티드이다.
본 출원은 또한 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 및 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
각각 제 1, 제 2 및 제 3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 및 이러한 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 3기능성 T 세포-항원 커플러 또는 트리-TAC로도 본 출원에서 언급된다.
표적-특이적 리간드
표적-특이적 리간드는 T 세포-항원 커플러를 표적 세포로 유도(direct)한다. 따라서, 표적-특이적 리간드는 표적 세포에 직접 또는 간접으로 결합하는 임의의 물질을 의미한다. 표적 세포는 암을 포함한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 질병 상태와 관계된 임의의 세포일 수 있다. 한 구체예에서, 표적 특이적 리간드는 표적 세포 상의 항원 (면역 반응을 유도할 수 있는 세포에 의해 생성된 단백질)에 결합한다. 표적-특이적 리간드는 또한 항원 결합 도메인으로 언급될 수 있다.
한 구체예에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 여기서, 표적-특이적 리간드는 종양 세포 상의 종양 항원 또는 종양 관련 항원에 결합할 수 있다. 종양 항원은 해당 기술 분야에 널리 공지이다. 본 출원에서 사용되는 용어 "종양 항원" 또는 "종양 관련 항원"은 숙주에서 면역 반응을 유발하는 (예컨대, MHC 복합체들에 의해 제공될 수 있는) 종양 세포들에서 생성되는 임의의 항원 물질을 의미한다. 단백질성인 경우 종양 항원은 예를 들어 8 또는 그 이상의 아미노산 내지 전장 단백질의 서열 및 MHC 복합체에서 제시될 수 있는 전장 단백질 중 최소한 하나의 항원 분절을 포함하는 8 내지 전장 단백질 중 임의의 수의 아미노산 서열일 수 있다. 종양 항원들의 예에는 HER2 (erbB-2), B-세포 성숙 항원 (BCMA), 알파페토단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), CA-125, MUC-1, 상피성 종양 항원 (ETA), 티로시나제, 흑색종-관련 항원 (MAGE), 전립선-특이적 항원 (PSA), 신경아교종-관련 항원, β-인간 융모성 생식선 자극호르몬, 갑상샘글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 창자 카르복실에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, 서비빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), ELF2M, 호중구 엘라스타제, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
표적-특이적 리간드의 예들에는 표적 세포 및/또는 항원에 결합하는 항체들 및 이의 분절들, 예를 들어, 단일사슬 항체들, 가령, scFVs, 또는 소형 단백질들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
표적-특이적 리간드의 한 예는 특이적 세포 및/또는 항원에 표적되는 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin)이다. 한 구체예에서, 표적-특이적 리간드는 HER2 (erbB-2)에 표적화되는 DARPin이다. HER2 (erb-2)에 표적화된 DARPin의 한 예는 본 출원에서 서열 번호: 7 및 8로 제시된다.
표적-특이적 리간드의 또다른 예는 특이적 세포 및/또는 항원에 표적되는 scFV이다. 한 구체예에서, 표적-특이적 리간드는 HER2 (erb-2)를 결합시키는 scFv이다. HER2 (erb-2)를 결합시키는 scFv의 한 예는 본 출원에서 서열번호: 22 및 23로 제공된다.
TCR 복합체를 결합시키는 리간드
T 세포-항원 커플러는 보조-수용체 자극과 함께 T-세포 수용체 (TCR)를 모집하도록 설계된다. 따라서, T 세포 항원 커플러는 T-세포 수용체 복합체와 관계된 단백질을 결합시키는 리간드를 포함한다.
TCR (T-세포 수용체)은 항원의 결합에 대한 반응에서 T 세포들의 활성화에 참여하는 내재성 막 단백질들의 복합체이다. TCR은 불변성 CD3 (분화 클러스터 3) 사슬 분자들을 보유하는 복합체의 일부로서 발현되는 고도의 가변성 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬들로 통상적으로 이루어진 디설파이드-결합된 막-고정 헤테로다이머이다. 이 수용체를 발현시키는 T 세포들은 α:β (또는 αβ) T 세포로 언급되지만, T 세포들 중 소수는 가변성 감마 (γ) 및 델타 (δ) 사슬들로 형성된, γδ T 세포로 언급되는 교대 수용체를 발현시킨다. CD3는 4개의 별개의 사슬들로 이루어진 단백질 복합체이다. 포유동물에서, 이 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 및 두 개의 CD3ε 사슬들을 함유한다.
본 출원에서 사용되는 용어 T-세포 수용체 복합체와 관계된 단백질을 결합시키는 리간드"는 TCR 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하는 임의의 물질을 포함한다. TCR과 관계된 단백질들에는 TCR 알파 (α) 사슬, TCR 베타 (β) 사슬, TCR 감마 (γ) 사슬, TCR 델타 (δ) 사슬, CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 CD3ε 사슬들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, T-세포 수용체 복합체와 관계된 단백질을 결합시키는 리간드는 TCR 알파 (α) 사슬, TCR 베타 (β) 사슬, TCR 감마 (γ) 사슬, TCR 델타 (δ) 사슬, CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및/또는 CD3ε 사슬에 대한 항체이다.
한 구체예에서, 이 리간드는 CD3를 결합시키는 항체 또는 이의 분절이다. CD3 항체들의 예들은 해당 분야에 공지이다 (무로모납, 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙). 한 구체예에서, CD3를 결합시키는 항체는 단일사슬 항체, 예를 들어, 단일-사슬 가변 분절 (scFv)이다.
CD3 항체의 또다른 예는 CD3ε를 표적하는 UCHT1이다. UCHT1에 관한 서열은 본 출원에서 서열번호: 13 및 14로 제시된다.
T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드
T 세포 항원 커플러는 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "T 세포 수용체 신호전달 도메인"은 (a) 지질 래프트에 국한하는 및/또는 (b) Lck를 결합시키는 폴리펩티드를 의미한다. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 세포질 도메인 및/또는 막통과 도메인을 포함한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 하나 이상의 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 본 출원에서 사용되는, "단백질 도메인"은 나머지 단백질 사슬과 독립적으로 기능하고 존재할 수 있는, 주어진 단백질 서열 구조 중 보존된 부분을 의미한다. 한 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 세포질 도메인을 포함한다. 또다른 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 막통과 도메인을 포함한다. 또다른 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 세포질 및 막통과 도메인 모두를 포함한다.
T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 TCR 보조-수용체들과 보조-자극제들 및 TCR 보조-수용체와 보조-자극제 단백질 도메인들을 포함한다.
"TCR 보조-수용체"는 항원-제시 세포와 소통함에 있어서 T 세포 수용체 (TCR)를 보조하는 분자를 의미한다. TCR 보조-수용체의 예에는 CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CDt 37 및 CD 154가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"TCR 보조-자극제"는 항원에 대한 T 세포의 반응에 필요한 분자를 의미한다. TCR 보조-자극제의 예에는 PD-1, ICOS, CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, 림프구 기능-연합 항원 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 특이적으로 CD83을 결합시키는 리간드가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 TCR 보조-수용체 또는 보조-자극제 단백질의 세포질 도메인 및 막통과 도메인 모두를 포함한다. 세포질 도메인 및 막통과 도메인은 동일한 보조-수용체 또는 보조-자극제로부터 또는 상이한 보조-수용체 또는 보조-자극제로부터 온 것일 수 있다. 세포질 도메인 및 막통과 도메인들은 링커(linker)에 의해 선택적으로 결합된다.
한 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 CD4 보조-수용체의 막통과 및 세포질 도메인들을 포함한다 (예를 들어 서열번호: 17 및 18을 참조하라).
또다른 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 CD8α 보조-수용체의 막통과 및 세포질 도메인들을 포함한다.
다른 구체예에서, T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드의 세포질 및/또는 막통과 도메인은 합성된 것이다. 예를 들어, 막통과 도메인은 선택적으로 매우 소수성인 합성 막 도메인이다.
또다른 예에서, 막통과 도메인은 글리코포린 막통과 도메인이다. 또한 또다른 예에서 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 GPI 앵커를 이용하여 막에 T-세포 항원 커플러를 부착시키기 위한 CD48 GPI 신호 서열을 포함한다.
본 출원에 기재된 T 세포 항원 커플러의 세 가지 성분들 (표적-특이적 리간드, TCR 복합체를 결합시키는 리간드 및 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드) 이외에도, 다른 폴리펩티드들 또한 포함될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, T 세포 항원 커플러는 T 세포를 표적화 또는 활성화하기 위해 직접 또는 간접적으로 작용하는 추가적인 폴리펩티드들을 선택적으로 포함한다.
링커
T 세포 항원 커플러의 다양한 성분들은 서로 직접적으로 융합될 수 있거나, 또는 최소한 하나의 링커, 선택적으로 펩티드 링커에 의해 결합될 수도 있다. 펩티드 링커는 개개의 결합된 성분들의 기능을 방해하지 않는 한 임의의 크기일 수 있다. 한 구체예에서, 펩티드 링커는 약 1 내지 약 15 아미노산 길이이고, 더욱 구체적으로는 약 1 내지 약 10 아미노산 길이, 그리고 가장 구체적으로는 약 1 내지 약 6 아미노산 길이이다.
T 세포 항원 커플러에 유용한 링커들의 예에는 G4S3 링커가 포함된다. 링커의 다른 예들에는 서열번호: 11, 12, 15, 16, 19, 20 및 21에 상응하는 펩티드들 그리고 이의 변이체들 및 분절들이다:
구조
T 세포-항원 커플러는 다양한 구조들로 존재할 수 있으며, 이는 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.
한 구체예에서, 표적 특이적 리간드 및 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 모두 TCR 복합체를 결합시키는 리간드에 융합된다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 N-DARPin TAC (구조 1로도 언급됨; 서열번호: 1 및 2)는 다음을 순차적으로 포함한다:
i) N-DARPin 트리 TAC 선도 서열 (분비 신호) (서열번호: 5 및 6)
ii) Her2 항원에 특이적인 DARPin (서열번호: 7 및 8)
iii) Myc 태그 (서열번호: 9 및 10)
iv) 링커 1 (서열번호: 11 및 12)
v) UCHT1 (서열번호: 13 및 14)
vi) 링커 2 (서열번호: 15 및 16)
vii) CD4 (서열번호: 17 및 18)
또다른 구체예에서, DARPin은 Her2 항원에 특이적인 scFV ScFv (서열번호: 22 및 23)로 치환된다.
또다른 구체예에서, TCR 복합체를 결합시키는 리간드 및 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드 모두 표적 특이적 리간드 (본 출원에 기재된 C-DARPin TAC (구조 1로도 언급됨; 서열번호: 3 및 4))에 융합된다. 대안적인 구조들은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
벡터 구조체
본 출원에 기재된 핵산들을 세포 내로 도입시키기 위하여 다양한 전달 벡터들 및 발현 비히클들이 이용될 수 있다. 따라서, 전술한 폴리뉴클레오티드들이 선택적으로 하나의 벡터 안에 포함되어, 하나의 벡터 구조체를 제공하며, 이는 본 출원에서 벡터로도 언급된다.
그러므로 본 출원은 또한 다음을 포함하는 벡터에 관한 것이다:
a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
b. CD3를 결합시키는 항체를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드,
및 선택적으로 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터.
특정 핵산 서열의 전사를 개시하는 DNA 영역인 프로모터들은 해당 기술 분야에 널리 공지이다. "포유동물 세포에서 기능하는 프로모터"는 포유동물 세포에서 연관 핵산 서열의 발현을 추진하는 프로모터를 의미한다. 핵산 서열의 발현을 추진하는 프로모터는 핵산 서열에 "작동적으로 연결되는" 것으로서 언급될 수 있다.
한 구체예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합되어 T 세포 항원 커플러 융합물을 제공하며 T 세포 항원 커플러 융합물의 코딩 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다.
또다른 구체예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드에 융합되어 T 세포 항원 커플러 융합물을 제공하며 T 세포 항원 커플러 융합물의 코딩 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다.
선택적으로, 벡터는 T 세포와 같은 포유동물 세포들에서의 발현을 위해 설계된다. 한 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 선택적으로 레트로바이러스 벡터이다.
유용한 벡터들은 렌티바이러스, 쥐과 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 폭스 바이러스, 온코레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스로부터 유래된 벡터들을 포함한다. 유용한 다른 전달 벡터들은 단순 헤르페스 바이러스, 트랜스포존, 백시니아 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, HTLV, 인간 포미 바이러스(human foamy virus) 및 이의 변이체들로부터 유래된 벡터들을 포함한다. 유용한 또다른 벡터들은 스푸마바이러스, 포유동물 B형 레트로바이러스, 포유동물 C형 레트로바이러스, 조류 C형 레트로바이러스, 포유동물 D형 레트로바이러스 및 HTLV/BLV형 레트로바이러스로부터 유래된 벡터들을 포함한다. 개시된 조성물들 및 방법들에서 유용한 렌티바이러스 벡터의 한 예는 pCCL 벡터이다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변이체들
본 출원에 개시된 폴리펩티드 서열들 및 벡터 서열들을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열들에 많은 변형들이 이루어질 수 있으며 이들은 당업자에게 자명할 것이다. 변형은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 또는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 상대적 배치 또는 순서 변경을 포함한다.
한 구체예에서, 본 출원에 설명된 폴리뉴클레오티드는 인코딩된 폴리펩티드의 기능 및/또는 T 세포 항원 커플러의 기능, 활성 및/또는 발현을 최적화하기 위해 변형 또는 변이될 수 있다.
본 출원에서 UCHT1 돌연변이체가 생성되어 TAC의 개선된 표면 발현을 가져올 수 있음을 보여준다 (도 15-17). 따라서 한 구체예에서, TAC는 TCR 복합체를 결합시키는 변형 또는 변이된 리간드를 포함하는데, 여기서 변형 또는 변이된 항체를 포함하는 TAC는 TCR 복합체를 결합시키는 야생형, 또는 비-변형 또는 변이된 리간드를 포함하는 TAC에 비하여 증가된 표면 발현 및/또는 활성을 가진다. CD3를 결합시키는 변이된 또는 변형된 항체의 한 예는 본 출원에 기재된 UCHT1 A85V, T161P 돌연변이체이다 (서열번호: 24 및 25).
서열 동일성
본 출원의 폴리뉴클레오티드들은 또한 본 출원의 핵산 분자에 대하여 최소한 대략 다음의 동일성을 보유하는 핵산 분자들 (또는 이의 분절)을 포함한다: 70% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 90% 동일성, 최소한 95% 동일성, 최소한 96% 동일성, 최소한 97% 동일성, 최소한 98% 동일성 또는, 최소한 99% 또는 99.5% 동일성. 본 출원의 폴리펩티드들은 또한 본 출원의 폴리펩티드에 대하여 최소한 대략 다음의 동일성을 보유하는 폴리펩티드들 (또는 이의 분절)을 포함한다: 70% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 90% 동일성, 최소한 95% 동일성, 최소한 96% 동일성, 최소한 97% 동일성, 최소한 98% 동일성 또는, 최소한 99% 또는 99.5% 동일성. 동일성은 최상위 정렬 매치가 얻어지도록 조정된 두 가지 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열들의 유사성을 의미한다. 동일성은 해당 기술 분야에 공지된 방법들에 따라 계산된다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오티드 서열 ("서열 A"로 명명)이 서열번호: 1의 일부에 대하여 90% 동일성을 가지는 경우, 이 때 서열 A는 서열번호: 1 중 참조된 부분의 100개 뉴클레오티드 당 최대 10개의 점 돌연변이 (가령 다른 뉴클레오티드로의 치환)를 포함할 수 있음을 제외하고, 서열 A는 서열번호: 1의 참조된 부분에 대하여 동일할 것이다.
서열 동일성은 바람직하게는 본 출원에 제공된 뉴클레오티드 서열들 및/또는 이의 상보적 서열에 대하여 최소한 대략 다음과 같이 설정된다: 70% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 90% 동일성, 최소한 95% 동일성, 최소한 96% 동일성, 최소한 97% 동일성, 최소한 98% 동일성 또는, 가장 바람직하게는, 최소한 99% 또는 99.5% 동일성. 서열 동일성은 또한 바람직하게는 본 출원에 제공된 폴리펩티드 서열들에 대하여 최소한 대략 다음과 같이 설정된다: 70% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 90% 동일성, 최소한 95% 동일성, 최소한 96% 동일성, 최소한 97% 동일성, 최소한 98% 동일성 또는, 가장 바람직하게는, 최소한 99% 또는 99.5% 동일성. 서열 동일성은 바람직하게는 Bioinformatics사 (위스콘신 대학)의 GCG 프로그램을 이용하여 계산될 것이다. 서열 동일성을 계산하기 위해 다른 프로그램들, 가령 Clustal W 프로그램 또한 이용가능하다 (바람직하게는 기본 매개변수들을 이용하는 프로그램; Thompson, J D et al., Nucleic Acid Res. 22:4673-4680).
혼성화
본 출원은, 엄격한 혼성화 조건들하에서 본 출원에 기재된 핵산 분자에 혼성화하기에 충분한 동일성을 보유하는 서열을 가지는 DNA를 포함한다 (혼성화 기술들은 해당 기술 분야에 널리 공지이다). 본 출원은 또한 본 출원에 기재된 서열들 및/또는 이의 상보적 서열 중 하나 이상에 혼성화하는 핵산 분자들을 포함한다. 이러한 핵산 분자들은 바람직하게는 매우 엄격한 조건들하에서 혼성화한다 (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Most Recent Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.를 참조하라). 매우 엄격한 세척은 바람직하게는 적은 양의 염 (바람직하게는 약 0.2% SSC) 및 약 50-65ㅀ C의 온도에서 이루어지며 선택적으로는 약 15분간 실시된다.
T 세포에서의 발현
T 세포 항원 커플러는 T 세포들에서의 발현을 위해 설계된다. 따라서 본 출원의 한 양태는 T 세포 항원 커플러를 발현시키는 T 세포를 제공한다. 본 출원의 또다른 양태는 T 세포 항원 커플러 또는 T 세포 항원 커플러를 포함하는 벡터로 형질도입되거나 형질감염된 T 세포에 관계된다. 선택적으로, T 세포는 분리된 T 세포이다.
T 세포는 혈액 (예를 들어, 말초혈액 단핵구), 골수, 흉선 조직, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 비장 조직, 및 종양을 포함한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 수많은 공급원들로부터 얻을 수 있다. 한 구체예에서, T 세포들은 자가 T 세포이다. 또다른 구체예에서, T 세포들은 하나의 세포주의 T 세포들로부터 얻는다. T 세포들을 시험관내 배양 및 유지시키는 방법들은 해당 기술 분야에 널리 공지이다.
일단 얻어지면, T 세포들은 선택적으로 시험관내 농축된다. 해당 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이, 세포들의 개체군은 양성 또는 음성 선택(positive or negative selection)에 의해 농축될 수 있다. 더욱이, T 세포들을 선택적으로 동결 또는 동결보존(cryopreserved) 시킨 후 나중에 해동시킬 수 있다.
T 세포 항원 커플러를 T 세포들에 도입시키기 전 또는 후에, T 세포들을 해당 분야에 널리 공지된 방법들을 이용하여 선택적으로 활성화 및/또는 팽창시킨다. 예를 들어, T 세포들은 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포들의 표면 상의 보조-자극제 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 팽창될 수 있다.
T 세포들을 핵산 서열들로 형질도입 또는 형질감염시키고 형질도입시킨 핵산들을 T 세포들에서 발현시키는 방법들은 해당 기술 분야에 널리 공지이다. 예를 들어, 핵산은 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단들에 의해 세포 내부로 도입될 수 있다. 물리적 수단들에는, 미세주입, 전기천공, 입자충격주입법 (particle bombardment), 리포펙션 및 인산칼슘 침전이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 생물학적 수단들에는 DNA 및 RNA 벡터들의 사용이 포함된다.
한 구체예에서, 레트로바이러스 벡터들을 포함한 바이러스 벡터들이, 핵산을 T 세포 내로 도입 및 발현시키기 위해 사용된다. 바이러스 벡터들에는 렌티바이러스, 쥐과 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 폭스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스로부터 유래된 벡터들이 포함된다. 이 벡터는 T 세포에 형질도입된 핵산 분자의 발현을 추진시키는 프로모터를 선택적으로 포함한다.
T 세포에서 형질도입된 핵산 서열 및/또는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 존재 및/또는 발현을 확인하기 위해 다양한 분석법들이 사용될 수 있다. 분석법들에는, 서던 및 노던 블롯팅( Southern and Northern blotting), RT-PCR 및 PCR, ELISA 및 웨스턴 블롯팅(Western blotting)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, T 세포 항원 커플러를 발현시키는 T 세포는 T 세포 항원 커플러를 발현시키지 않는 T 세포에 비해 및/또는 종래의 CAR을 발현시키는 T 세포에 비하여 항원의 존재하에서 T 세포 활성화를 증가시켰다. 증가된 T 세포 활성화는 활성화 표지자들, 가령, CD107α, IFNγ, IL2 또는 TNFα의 증가된 종양 세포주 사멸, 증가된 사이토카인 생성, 증가된 세포용해, 증가된 탈과립화 및/또는 증가된 발현을 포함한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 수많은 방법들에 의해 확인될 수 있다. 이러한 증가는 개개의 세포에서 또는 세포들의 개체군에서 측정될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "증가된" 또는 "증가하는"은 T 세포 항원 커플러를 발현시키지 않는 T 세포 또는 T 세포들의 개체군 및/또는 종래의 CAR을 발현시키는 T 세포 또는 T 세포들의 개체군에 비하여 T 세포 항원 커플러를 발현시키는 T 세포 또는 T 세포들의 개체군에서의 최소한 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100% 또는 200% 증가를 의미한다.
T 세포 항원 커플러를 발현시키는 T 세포들, 선택적으로 자가 T 세포들은 이를 필요로하는 개체에 투여될 수 있다. 따라서, T 세포 항원 커플러로 형질도입된 및/또는 T 세포 항원 커플러를 발현시키는 T 세포는 제약상 조성물로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 T 세포들은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
제약상 조성물은 그 자체로 공지된, 개체들에 투여될 수 있는 제약상 허용가능한 조성물들의 제조 방법들에 의해 제조될 수 있으며, 그리하여 유효량의 T 세포들은 제약상 허용가능한 담체와의 혼합물로 조합된다. 적합한 담체들은 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000)에 설명되어 있다. 이를 근거로, 상기 조성물들은 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 관련된 물질들의 용액, 및 적합한 pH를 가진 그리고 생리학적 유체들과 등-삼투성인 완충 용액에 함유된 물질들의 용액들이 포함되나 전적으로 다른 것을 배제하는 것은 아니다.
적합한 제약상 허용가능한 담체들에는 제약상 조성물의 생물학적 활성의 효율성을 해하지 않는 본질적으로 화학적 비활성 및 비독성 조성물들을 포함한다. 적합한 제약상 담체들의 예에는, 물, 식염수, 글리세롤 용액, 에탄올, N-(1(2,3-디올레일옥시)프로필)N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 디올레실포스포티딜-에탄올아민 (DOPE), 및 리포좀이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 조성물들은 환자에게 직접 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 적합한 양의 담체와 함께 치료적 유효량의 화합물을 함유하여야 한다.
제약상 조성물들에는 또한 동결건조 분말 또는 수성 또는 비-수성 멸균 주사 용액 또는 현탁액이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 조성물은 조성물을 의도한 수용자의 조직 또는 혈액과 실질적으로 적합성이게 하는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 그 외 다른 성분들에는 예를 들어, 물, 계면활성제 (가령, Tween), 알콜, 폴리올, 글리세린 및 베지터블 오일이 포함된다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 정제, 또는 농축 용액 또는 현탁액으로부터 제조될 수 있다.
(iii) 방법 및 용도
본 출원의 한 양태는 특정 항원으로 T 세포를 유도하기 위한 3기능성 T-세포 항원 커플러의 용도를 제공한다.
따라서, 본 출원은 또한 치료를 필요로하는 개체에서 암을 치료하기 위해 변형된 T 세포의 용도에 관한 것인데, 여기서 변형된 T 세포는 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, TCR 복합체를 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 발현시킨다. 이 출원은 또한 유효량의 변형된 T 세포들을 치료를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법들에 관한 것이다. 치료를 필요로하는 개체에서 암을 치료하기 위한 유효량의 변형된 T 세포들의 용도 또한 개시되어 있다. 또한 치료를 필요로하는 개체에서 암을 치료하는 약제의 제조에 있어서 변형된 T 세포의 용도가 개시되어 있다. 또한 치료를 필요로하는 개체에서 암을 치료함에 사용하기 위한 변형된 T 세포도 개시되어 있다. 한 구체예에서, 표적-특이적 리간드는 암 세포 상의 항원에 결합함으로써, 변형된 T 세포를 암 세포로 표적화한다.
치료될 수 있는 암들에는 임의의 형태의 신생물 질병이 포함된다. 치료될 수 있는 암들의 예에는 유방암, 폐암 및 백혈병, 예를 들어 혼합 직계성 백혈병 (MLL), 만성 림프구 백혈병 (CLL) 또는 급성 림프모구 백혈병 (ALL)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 암들에는 암종, 모세포종, 흑색종, 육종, 혈액암, 림프성 악성종양, 양성 및 악성종양(benign and malignant tumors), 악성종양(malignancies)이 포함된다. 암은 비-고형 종양 또는 고형 종양들을 포함할 수 있다. 치료될 수 있는 암들에는 혈관신생되지 않은, 또는 아직 실질적으로 혈관신생되지 않은 종양들, 뿐만 아니라 혈관신생된 종양들이 포함된다.
본 출원에 기재된 변형된 T 세포 및/또는 제약상 조성물들은 인간 및 동물들을 포함한 살아있는 유기체들에 투여되거나 사용될 수 있다. 본 출원에 사용되는 용어 "개체"는 임의의 동물계 구성원, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 의미한다.
T 세포들을 분리, 유전적 변형, 및 치료가 필요한 개체에게 투여하는 절차들은 해당 기술 분야에 공지이다. 특히, T 세포들은 포유동물 (바람직하게는 인간으로부터 분리되고), 선택적으로 본 출원에 설명된 바와 같이 팽창 및/또는 활성화되고 본 출원의 핵산 분자들로 형질 도입 또는 형질 감염된다. T 세포들은 개체에 대하여 자가성 일 수 있다. 또다른 구체예에서, 세포들은 개체에 관하여 동종이계, 동계(syngeneic) 또는 이종일 수 있다.
변형된 T 세포들은 단독으로, 또는 본 출원에 기재된 바와 같은 제약상 조성물로 투여될 수 있다. 본 출원의 조성물들은 바람직하게는 정맥내 투여를 위해 제형화된다.
변형된 T 세포 및/또는 제약상 조성물들의 "유효량"의 투여는 원하는 결과를 구현하는데 필요한 투여량의, 그리고 시기 동안의 유효량으로 정의된다. 예를 들어, 유효량의 물질은 인자들, 가령, 개개 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개개 개체에서 원하는 반응을 유도하는 재조합 단백질의 능력에 따라 달라질 수 있다. 용량 요법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러번의 분할된 용량이 매일 투여될 수 있거나 용량은 치료 상황의 긴급도에 의해 나타나는 바에 따라 비례하여 감소될 수 있다.
예를 들어, 본 출원에 기재된 변형된 T 세포 및/또는 제약상 조성물들은 체중 1 kg 당 104 내지 109 개의 세포들, 선택적으로 체중 1 kg 당 105 내지 108 개의 세포들 또는 체중 1 kg 당 106 내지 107 개의 세포들의 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 1회 또는 다회로 투여될 수 있다.
변형된 T 세포 및/또는 제약상 조성물들은 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 삽입 또는 이식을 포함한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 해당 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 변형된 T 세포 및/또는 제약상 조성물들은 개체에 피하, 피내(intradennally), 종양내, 절내(intranodally), 골수내( intrameduliary), 근육내, 혈관내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내 투여될 수 있다. 변형된 T 세포 및/또는 이의 제약상 조성물들은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
본 출원에서 사용되는, 그리고 해당 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, "치료하는 것" 또는 "치료"는 임상 결과들을 포함하여 유익한 또는 원하는 결과들을 얻기 위한 접근이다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과들에는 하나 이상의 증상들 또는 조건들의 완화 또는 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질병의 확산 저해, 질병 진행의 지연 또는 저하, 질병 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 또는 전체적이든), 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존에 비하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 한 구체예에서, "치료"는 질병 또는 병태를 예방하는 것을 포함한다.
표 1. 서열 표
서열번호 설명 뉴클레오티드/아미노산
서열번호: 1 N-DARPin 트리 TAC 뉴클레오티드
서열번호: 2 N-DARPin 트리 TAC 아미노산
서열번호: 3 C-DARPin 트리 TAC 뉴클레오티드
서열번호: 4 C-DARPin 트리 TAC 아미노산
서열번호: 5 N-DARPin 트리 TAC 선도 서열 (분비 신호) 뉴클레오티드
서열번호: 6 N-DARPin 트리 TAC 선도 서열 (분비 신호) 아미노산
서열번호: 7 Her2 항원 특이적 DARPin 뉴클레오티드
서열번호: 8 Her2 항원 특이적 DARPin 아미노산
서열번호: 9 Myc 태그 뉴클레오티드
서열번호:10 Myc 태그 아미노산
서열번호:11 링커 1 뉴클레오티드
서열번호:12 링커 1 아미노산
서열번호:13 UCHT11 뉴클레오티드
서열번호:14 UCHT12 아미노산
서열번호:15 링커 2 뉴클레오티드
서열번호:16 링커 2 아미노산
서열번호:17 CD4 도메인3 뉴클레오티드
서열번호:18 CD4 도메인4 아미노산
서열번호:19 유니버설 리지드 링커
(Universal rigid linker)		 아미노산
서열번호:20 CD28계 링커 아미노산
서열번호:21 CD4계 링커 아미노산
서열번호:22 Her2 항원 특이적 ScFv 뉴클레오티드
서열번호:23 Her2 항원 특이적 ScFv 아미노산
서열번호:24 UCHT1 (A85V, T161P) 뉴클레오티드
서열번호:25 UCHT1 (A85V, T161P) 아미노산
1 경쇄, 뉴클레오티드 1-324; 링커, 뉴클레오티드 325-387; 중쇄, 뉴클레오티드 388-750
2 경쇄, 아미노산 1-108; 링커, 아미노산들 109-128; 중쇄, 아미노산 129-250
3 세포외 링커, 뉴클레오티드 1-66; 막통과 도메인, 뉴클레오티드 67-132; 시토졸 도메인, 뉴클레오티드 133-254
4 세포외 링커, 아미노산 1-22; 막통과 도메인, 아미노산 23-44; 시토졸 도메인, 아미노산 45-84
상기 내용은 일반적으로 본 출원을 설명한다. 하기 구체적인 실시예들을 참고하여 본 출원을 보다 완전히 이해할 수 있을 것이다. 이들 실시예들은 오직 설명을 위하여 기재된 것이며 본 출원의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 형태의 변화 및 등가물의 치환은 편의상 또는 상황에 따라 고려된다. 특정 용어들이 본 출원에서 사용되었더라도, 이러한 용어들은 설명적 의미이며 제한을 목적으로 하고자 함이 아니다.
하기 비-제한적 실시예들은 본 출원을 설명한다.
실시예
실시예 1.
배경 및 요약
3 기능성 T 세포-항원 커플러 (트리-TAC)는 MHC 비제한 표적화(MHC unrestricted targeting)를 유지하면서도 TCR을 통한 자연 신호전달을 보다 잘 개괄하기 위하여 개발되었다. T-세포 활성화는 TCR에 의한 MHC의 결합 후 발생하며 T 세포들 상의 보조-수용체 (CD4 또는 CD8)는 동시에 MHC 분자 내부의 보존 부위에 결합한다 (Yin et al., 2012)(Kuhns and Davis, 2012). 보조-수용체들은 TCR 신호 복합체 형성에 특히 중요한 막 마이크로 도메인인 (He and Marguet, 2008), "지질 래프트" 내부에 특이적으로 위치되어 있다 (Fragoso et al., 2003)(Arcaro et al., 2000). TCR 활성화 복합체의 정확한 마이크로도메인 위치결정을 확보하는 것 이외에도, 이들 보조-수용체는 또한 T-세포 활성화에 결정적인 단백질 키나아제인 (Methi et al., 2005)(Acuto and Cantrell, 2000) Lck에 직접 결합한다(Kim et al., 2003). 전술한 바와 같이, 존재하는 키메라 수용체 또는 이중-기능성 단백질들 중 어느 것도 보조-수용체 분자 또는 Lck를 관여시키지 않는다. 각각 지질 래프트에 국한시키고 Lck를 결합시키는, CD4 보조-수용체의 막통과 구역들 및 세포내 구역들이 CD3를 결합시키는 단일 사슬 항체로 융합되어 있는 곳에서 분자가 생성되었다 (UCHT1; 서열번호: 13 및 14; 서열은 또한 공통의 도메인에 존재한다). 이 구조는 자연적인 MHC 결합과 유사하게 CD3 분자 및 TCR을 지질 래프트 구역 내부로 끌어당겨 TCR 부근 내부로 Lck를 가져오도록 설계된다. 키메라 수용체를 표적화하기 위하여, 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)을 CD4-UCHT1 키메라에 결합시켜, 3-기능성 T 세포-항원 커플러 (트리-TAC)를 생성하였다. 이러한 특이한 경우, DARPin은 원암 유전자, erbB-2에 특이적이었다.
인간 T 세포들은 동일한 DARPin을 사용하여 프로토타입 트리-TAC 또는 종래의 CAR을 발현시키도록 조작되었다. 모든 양태들에서, 트리-TAC를 이용하여 조작된 T 세포들은 종래의 CAR에 상당하는 기능성을 보여주었음이 결정되었다. 흥미롭게도, 두 개의 변수들 (TNF-α 생성 및 CD107a 유동)에 관하여, 트리-TAC는 종래의 CAR보다 더 활성을 띠었음이 관찰되었다. 더욱이, 데이터는 각 분자에 기반하여 트리-TAC가 상당히 개선된 활성을 보여줌을 나타낸다. 추가적으로 트리-TAC는 전형적인 CAR에 비해 개선된 안전성을 제공하는데, 이는 어떠한 활성화 도메인도 상기 단백질의 일부가 아니기 때문이다.
종래의 CAR은 몇가지 신호전달 도메인들을 조합함으로써 T-세포들을 자극함에 효과적이다 (도 1C). 그에 비해, 트리-TAC (도 1 A/B)는 그 자신의 임의의 신호전달 도메인들을 함유하지 않는다. 이것은 순전히 항원 의존 방식에서 다른 주요 플레이어들 (회색으로 도시됨) 간에 제시된 상호작용을 용이하게 하는 것에 의존한다. 이러한 설계 가설을 시험하기 위하여, 전장 N-DARPin 트리-TAC의 몇가지 변이체들을 생성하였다 (도 1D).
전술한 작업은 CAR 분자들의 세포 표면을 일관되고 상당하게 발현시켰다. DARPin CAR은 양호한 표면 발현을 보여줌을 발견하였다 (도 2). 대조적으로, 트리-TAC는 훨씬 저급한 표면 발현을 보였다. 이는 UCHT1 도메인을 보유한 모든 변이체들에 대해서 관찰되었다. 그러나 UCHT1 도메인이 없는 트리-TAC 변이체는 DARPin CAR와 유사한 표면 발현을 보였다.
트리-TAC, 트리-TAC 변이체들 또는 DARPin CAR을 발현시키도록 조작된 T 세포들을 플레이트-결합 항원으로 자극하였다. 트리-TAC 및 DARPin CAR을 발현하도록 조작된 T 세포들은 측정된 기능들 모두를 (TNF-α 생성, IFN-γ 생성 및 CD107a 유동) 정교하게 생성할 수 있었다 (도 3A 및 3B). CD3 및 표적 항원 모두에 대한 트리-TAC의 결합은 T 세포들이 이들의 기능들을 정교하게 생성하는데 중요한 것으로 밝혀졌다. 도 3에서, UCHT1의 제거는 CD3에 대한 결합을 없애어 트리-TAC의 기능을 제거하는 것으로 증명된다. 다른 데이터에서, 트리-TAC로부터 DARPin의 제거 또한 기능을 제거하는 것으로 결정되었다.
예상했던 바와 같이, 이들 T-세포들을 세포독성에 대해 시험했을 때, 트리-TAC-UCHT1-DARPin은 항원 발현 세포들을 사멸시키는 능력이 전혀 없음을 보여주었다 (도 4). N-DARPin 트리-TAC는 전형적인 DARPin-CAR과 매우 유사한 높은 수준의 선택적 세포독성을 보였다. 흥미롭게도, DARPin-CAR을 발현시키는 T 세포들은 높은 T-세포: 표적 세포 비율에서 오프-타겟 사멸을 보여주는 반면 (도 4에서 D2F2에 대한 사멸을 보라), 트리-TAC를 발현시키는 T 세포들은 이러한 효과들을 보이지 않았음이 나타나있다.
실험
도 1은 도식적 개괄이다. (A)는 N-DARPin 트리-TAC를 도시한다. Her2에 대하여 표적화된 안키린 반복 도메인은 (G4S)3 링커를 사용하여 단일 사슬 가변 분절 (scFv) UCHT1로 융합된다. 이 때 scFv는 CD4 분자에 연결된다. CD4는 링커 구역 및 막통과 구역 뿐만 아니라 세포질 고정 구역을 내포한다. 잠재적 상호작용들이 희미한 회색으로 도시되어 있다. (B)는 C-DARPin 트리-TAC를 도시한다. 이러한 구조에서, scFv UCHT1은 DARPin 도메인을 이용하여 전환된다. 잠재적 상호작용들이 다시 희미한 회색으로 도시되어 있다. (C)는 전형적인 2세대 CAR 모델이다. DARPin 표적 도메인은 CD8α 링커를 통해 CD28 막통과 도메인에 연결된다. 3개의 ITAM 활성화 모티브를 보유한 CD3 제타 도메인은 그 후 CD28의 시토졸 부분에 연결된다. (D)는 DARPin 표적 도메인, CD3 결합 scFv 모이어티, 또는 CD4 도메인의 시토졸 부분 중 하나가 부재하는 다양한 트리-TAC 제어의 개괄이다.
도 2는 각각의 트리-TAC 변이체들의 히스토그램과 함께 형질도입된 T-세포들의 표현형 표면 발현 분석을 보여준다. T-세포들은 Her2Fc과 함께 배양되었으며, Her2Fc는 차후에 유세포 측정법을 통해 검출되었다. 제공된 데이터들을 CD8+ 림프구에 대해 게이트(gate)시켰다. 도시된 게이트는 형질도입되지 않은 대조군에 기초하여 선택되었다.
도 3은 조작된 T-세포들의 기능적 분석이다. (A)에서, 세포들을 GolgiPlugTM을 함유하는 매질에서 플레이트 결합된 Her2Fc를 이용하여 4시간 동안 자극하였다. 세포들을 먼저 CD8+에 대해 염색한 다음, 투과시키고 TNF-α 및 IFN-γ 생성에 관해 분석하였다. 초기 게이트들을 단일항(singlet) CD8+ 림프구에 대해 설정하였다. 도시된 게이트들은 형질도입되지 않은 대조군에 기초하여 설정되었다. B)에서, 이전과 같이, 세포들을 플레이트 결합된 Her2Fc로 자극하였다. 매질은 GolgiPlugTM 뿐만 아니라 항-CD107a 항체를 포함하였다. 능동적으로 탈과립화하는 세포들은 보다 높은 CD107a 재생율을 가지는 것으로 기대되었으며, 차후에 항-CD107a에 대하여 보다 높은 신호를 보여준다.
도 4는 조작된 T-세포 세포독성을 보여준다. 두 가지 상이한 부착성(adherent) 마우스 종양 세포주들을 T-세포 부착 24시간 전에 도말하였다. D2F2/E2를 인간 Her2를 발현시키도록 조작하였으며, D2F2는 조작하지 않는다. 지시된 비율의 T-세포들을 종양 함유 웰에 첨가하였다. 종양 세포들을 T-세포들과 함께 6시간 동안 배양시켰다. T-세포들을 후속적으로 세척하여 제거하였다. 10% Alamar 블루 함유 매질을 3시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 세포 생존의 지시자로서 대사 활성은 종말점 분석을 통해 결정되었다. T-세포들이 없는 웰들을 최대 생존능/ 대사 활성으로 정의하고 100%로 설정하는 반면, 세포들 없이 배양된 매질은 0% 대사 활성으로 설정되었다. 제공된 데이터는 3회 반복의 평균이다.
논의
MHC-독립 방식으로 특정 표적들을 향해 T-세포들을 재유도하기(redirect) 위해 키메라 수용체를 사용하는 것은 암을 치료하는 흥미로운 방법이며, 병원체로부터의 항원들이 형질막에서 발견되는 감염성 질병들에 적용가능하다. 키메라 수용체는 다음과 같은 결과를 가져올 것이다: (1) 표적 세포들에 대한 특이적 세포독성 및 (2) 최소 오프 타겟 독성. 종래의 CAR들은 이러한 점에서 제한되는데, 이들은 신호전달 도메인들이 적절한 규제를 받지 않을 수 있는 비정상적 위치들에 배치되어 있는 합성 구조에 의존하고, 그리하여 특이적 활성의 세포상 제어가 감소되기 때문이다.
트리-TAC는 신호전달 도메인들의 이소성 위치결정 (ectopic localization)을 이용하지 않고 자연 TCR의 신호전달 성분들을 재유도(re-direct)하도록 설계되었다. 트리-TAC는 다음의 원리들에 따라 설계되었다: (1) 키메라 수용체는 상호작용하여 주요 활성화 단백질 복합체들의 필요에 따른(ordered) 조합을 용이하게 하여야 하며, (2) 키메라 수용체는 기존의 세포 적응(cellular adaptation), 가령, 마이크로-도메인 환경들을 이용하여야 하며 (3) 키메라 수용체는 임의의 활성화 도메인들을 보유하지 않아야 한다. 트리-TAC는, 데이터가 증명하는 바와 같이 2세대 CAR의 활성화율보다 우수하지는 않을 지라도 이와 동등한 활성화율로 이를 효과적으로 구현할 수 있다.
그러므로 이러한 트리-TAC는 설계된 부가적 보조-수용체들과의 추후 통합에 이상적으로 적당하여, T-세포 활성화를 보다 미세하게 조정한다. 궁극적으로, 이는 표적화된 세포독성을 손상시키지 않고 훨씬 감소된 오프 타겟 효과를 일으켜야 한다. 트리-TAC는 현존하는 CAR보다 낮은 독성을 보여주는 것으로 나타난다. DARPin CAR은 높은 세포 대 표적 비율에서 온화한(mild) 오프 타겟 사멸을 보여주며, 이는 치료에서 사용될 때 문제를 일으킬 수 있다. 그러나 종래의 CAR만큼 기능성인 트리-TAC는 오프-타겟 효과를 나타내지 않았다. 왜냐하면 DARPins이 높은 친화도로 표적에 결합하기 때문에, 오프 타겟 효과는 DARPin을 이용하는 키메라 수용체를 높은 수준으로 발현시키는 세포들에 대하여 보다 공통적일 수 있다. 그러므로 임의의 이론에 제한됨 없이, 트리-TAC의 낮은 표면 발현은 이러한 오프-타겟 효과들이 일어날 가능성을 감소시키기 때문에 유리할 수 있다.
궁극적으로, 트리-TAC 기술의 모듈식 특성은 T-세포 활성화 과정을 훨씬 더 정교하고 미세하게 조정할 수 있게 한다. 예를 들어, TCR 복합체의 소집(recruitment)은 보다 낮은 CD3 친화도를 가진 트리-TAC 분자들을 조작함으로써 조절될 수 있었다. 이는 암 표적들을 검출할 수 있도록 높은 친화도의 표적 도메인을 보유하면서도 자연적인 낮은 TCR 친화도를 모사하는데 사용될 수 있었다 (Chervin et al., 2009). 전형적인 CAR과 달리, 트리-TAC 기술은 이를 보다 근접하게 모사하게 위해 조작될 수 있다.
결론적으로, 제시된 트리-TAC 기술은 T-세포 활성화 및 세포독성을 효과적으로 촉발시킬 수 있고, (2) 자연 T-세포 활성화를 모사함으로써 이를 수행할 수 있으며 (3) 그 자체의 활성화 도메인들을 필요로하지 않는 매우 효과적인 분자 툴이다.
실시예 2. 트리-TAC 기술의 특성화
트리-TAC 기술의 개요가 도 5에 도시되어 있다.
도 5A는 상이한 수용체들 및 이들의 관련 단백질 파트너들의 공동-조합에 기초한 CD8 T-세포 활성화의 한 예를 보여준다. 초기에, 주조직 적합 복합체 I이 항원 (나선)에 제공된다. 이는 항원에 결합할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR) 복합체에 의해 인식된다. TCR 복합체는 여러 개의 개별적인 아단위체를 함유한다. 이 α/β 도메인들은 MHC-I 상에 제공된 항원과 직접 상호작용할 수 있다. 이후 이 α/β 도메인들은 여러 개의 다른 도메인들 (ε, γ, δ 및 ζ)과 상호작용하며, 이들 모두는 다양한 세포내 활성화 도메인들을 통하여 T-세포 활성화에 참여한다. TCR 복합체는 CD8 보조-수용체와 동시에 MHC-I과 상호작용한다. CD8 보조-수용체는 항원 독립 방식으로 MHC-I에 결합한다. CD8은 TCR 수용체 복합체를 활성화함에 중요한 단백질 키나아제인 Lck와 직접 상호작용한다. CD8 및 Lck 상호작용은 또한 지질 래프트 (막 부위) 마이크로도메인들과의 연합을 확보하게 하는데, 이들 도메인들은 다른 관련 신호전달 모이어티들 (어두운 구형)을 조직하여 캡슐화한다는 가설에 기초한다. 그후 추후 활성화 단계들은 CD28 소집을 가져온다. 이러한 상호작용 연쇄반응이 동시에 여러번 발생한다면, T-세포들은 활성화되어 그 세포독성 효과를 발휘할 수 있다.
도 5B는 키메라 항원 수용체 (CAR)들의 개요를 제공한다. CAR들은 합성적으로 조작된 단일 분자 내의 몇 가지 주요 활성화 도메인들, 가령, ζ 및 CD28을 조합함으로써 T-세포 활성화의 복합 기전을 재생하려고 한다. 그후 CAR은 특이적 결합 도메인들을 이용하여 선택 항원과 직접 상호작용한다. 여기에 도시된 것은 안키린 반복 단백질 (DARPin)이다. 동시에 발생하는 이러한 여러 상호작용들이 T-세포 활성화를 일으키는 것으로 생각된다.
도 5C는 선택 항원에 TCR 복합체를 직접적으로 가교결합시킴으로써 T-세포들을 관여시키는 이중특이성 T-세포 연관체 (BiTE) 유사 분자들을 도시한다. 여기에 도시된 BiTE 유사 분자는 2개의 결합 도메인들을 내포한다. DARPin 모이어티는 표적 항원과 상호작용한다. 단일 사슬 가변 분절 도메인 (scFv)은 그의 엡실론 도메인을 통해 TCR 복합체를 결합시킨다. 이러한 가교결합이 여러번 동시에 발생하면 T-세포 활성화가 일어난다.
도 5D는 자연 활성화 과정을 모사하는 TAC 기술의 개요이다. T-세포 항원 커플러 (TAC)는 DARPin 결합 도메인을 통해 항원에 결합할 수 있다. DARPin은 그후 TCR 복합체의 엡실론 도메인에 결합할 수 있는 scFv에 연결된다. 그후 TAC는 CD4 막통과 및 시토졸 도메인과 연관된다. CD8과 유사하게 CD4는 Lck와 상호작용하고 지질 래프트 내에 위치된다. 그러므로 TAC는 보조-수용체 자극과 TCR 소집을 결합시킨다. 이론에 제한됨 없이, 동시에 발생하는 이러한 여러번의 상호작용은 T-세포 활성화를 일으키는 것으로 생각된다.
TAC 분자의 상이한 구조들이 존재할 수 있다. 도 6A는 구조 1의 TAC 분자 모델을 보여준다. CD4-꼬리, 막통과, 및 링커 도메인들은 TCR-엡실론 특이적 scFv (UCHT1)와 조합된다. scFv는 그후 항원 결합 도메인에 연결된다. 이 도메인은 교환가능하다. 이러한 제시에서, 사용되는 항원 결합 도메인들은 Her2 항원에 특이적인 DARPin 도메인 또는 scFv이다. 도 6B는 구조 2의 TAC 분자를 보여준다. 여기서, CD4 도메인들은 먼저 항원 결합 도메인과 상호작용한다. 이 도메인은 그후 TCR 소집 scFv (UCHT1) 도메인에 연결된다.
도 7은 scFv CD4 TAC의 기능을 보여준다. 도 7A는 scFv CD4 TAC 수용체의 표면 발현을 공 벡터에 비교하여 보여주는 히스토그램이다. 세포들은 FcHer2 항원을 이용하여 염색되었으며, 이 항원은 결국 형광 표지된 항체들을 이용하여 검출되었다. 도 7B는 scFv CD4 TAC (상단) 또는 scFV CAR (하단)을 발현시키는 T-세포들의 항원 특이적 활성화를 보여준다. scFv CD4 TAC (상단) 또는 scFv CAR (하단)을 발현시키는 T-세포들을 플레이트 결합 Her2 항원과 함께 배양시켰다. 변형된 세포들 모두가 항원 특이적 활성화를 보여주었다. DMSO 음성 대조군은 활성을 전혀 보이지 않았다 (데이터 도시되지 않음). 도 7C는 scFv CD4 TAC 및 scFv CAR 모두에 의한 MCF-7 인간 종양 세포주 (Her2 양성)의 비슷한 사멸을 보여준다. scFv CD4 TAC 및 scFv CAR 모두를 MCF-7 인간 종양 세포주 (Her2 양성)와 함께 배양하고 공 벡터 대조군과 비교하였다.
도 8은 구조 2의 CD4-TAC의 특성이다. 도 8A는 구조 2의 DARPin CD4-TAC를 벡터 대조군과 비교한 히스토그램이다. 표면 발현은 FcHer2 변형된 항원을 이용하여 탐침되었다. 구조 2의 CD4-TAC를 발현시키는 세포들은 FcHer2 결합에 있어 뚜렷한 증가를 보이는데, 이는 수용체의 높은 표면 발현을 입증한다. 명확하게 하기 위해 구조 2의 CD4 TAC 모델이 도시되어 있다. 도 8B는 플레이트 결합 Her2 항원에 노출시킨 DARPin TAC 구조 2로 조작된 T-세포들을 보여준다. 사이토카인 생성 및 탈과립화가 측정되었다. 데이터는 DARPin TAC 구조 2가 기능성 수용체임을 보여준다. 항원 없이 처리한 것은 T-세포 활성화를 전혀 보이지 않았다 (데이터 도시되지 않음). 도 8C는 CD4 TAC 구조 2의 성장을 공 벡터 대조군과 비교하여 보여준다. 세포들은 100u/ml IL2 10ng/ml IL7에서 성장하였다. 100,000개 세포들로 시작하여, 예정된 간격으로 배양 샘플들을 계수함으로써 성장을 모니터하였다. 구조 2는 대조군에 비해 현저히 감소된 성장율을 보유한다.
도 9는 DARPin CD4 TAC 구조 1의 기능성을 보여준다. 도 9A는 DARPin CAR (녹색), 및 NGFR 단독 대조군 (청색)과 비교한 DARPin CD4 TAC (적색)의 표면 발현을 보여준다. 세포들은 수용체 특이적 항원 FcHer2로 탐침되었다. 히스토그램은 DARPin CD4 TAC가 표면 상에서 잘 발현됨을 보여준다. 그러나 이의 최대 표면 발현은 CAR 구조에 비해 더 낮다. 도 9B는 CD4 TAC 구조 1의 성장을 보여준다. 2주간 세포들을 샘플링하고 손으로 계수하여 배양 성장을 모니터하였다. 공 벡터(empty vector)는 DARPin CAR과 유사한 성장을 보여준다. 그러나 TAC는 그에 비해 감소된 성장을 보유한다. 도 9C 및 9D는 다양한 활성화 및 분해(degradation) 표지자들에 대해 양성인 세포들의 백분율을 보여준다. 공 벡터, DARPin CD4 및 DARPin CAR은 플레이트 결합 항원 Her2 또는 DMSO 대조군과 함께 배양되었다. 통계 분석 소프트웨어 SPICE를 이용하여 세 가지 별도의 실험 결과들을 요약한다. 분산 그래프는 한 세트의 활성화 표지자들에 대해 양성인 세포들의 백분율을 보여준다. CD4-TAC는 탈과립화 표지자들에 대해 양성인 세포들의 보다 높은 백분율을 보여준다. DARPin CAR 세포들은 다양한 활성화 표지자들에 대하여 양성이며 현저히 농축된 탈과립화 표지자들의 개체군이 없다. 파이 차트는 동일한 데이터를 나타낸다. CD4-TAC는 탈과립화에 중점을 두었을 때 보다 눈에 띄게 높은 세포들의 개체군을 가짐이 입증된다. CD4-TAC는 다양한 수준의 사이토카인 생성과 함께 탈과립화하는 다수의 활성화 세포들을 가진다. 그러나 CAR은 총 개체군의 50% 미만을 구성하는 탈과립화와 함께 보다 무작위적으로 분포된 패턴의 활성화를 보인다. 이 패턴은 CAR에 의해 덜 제어되는 T-세포 활성화를 나타낼 수 있다.
도 10은 TAC 및 CAR의 세포독성 및 전체 활성을 보여준다. TAC, CAR 또는 공 벡터 대조군으로 조작된 세포들을 다양한 인간 종양 세포주들과 함께 배양하였다. MDA MB 231, SK OV 3 및 A549 모두는 Her2 항원을 발현시킨다. LOXIMVI는 Her2 음성이다. 모든 경우에서, TAC는 개선된 세포독성을 보여줌이 관찰되었다. 항원 음성 세포주 LOCIMVI는 표적화되지 않는데, 이는 세포독성이 항원 특이적임을 뒷받침한다.
도 11은 다양한 TAC 대조군들의 수용체 표면 발현 및 활성화를 보여준다. 세포 표면 발현 (좌측), 탈과립화 (중앙) 및 사이토카인 생성 (우측)이 도 11A에 도시되어 있다. 이들 도메인들의 중요성을 결정하기 위해 특정 도메인들이 없는 구조들이 제조되었다. 상부로부터 하부방향으로 DARPin 항원 결합 도메인 및 UCHT1 TCR 결합 도메인이 제거되었으며, 전장 TAC는 하부에 존재한다. UCHT1 도메인이 없는 TAC의 표면 발현은 전장 CD4 TAC에 비해 개선된 표면 발현을 가져왔다. DARPin 음성 돌연변이체는 FcHer2 항원을 이용하여 검출되지 못했다. 탈과립화 (중앙)는 오직 전장 TAC에서만 관찰되었다. UCHT1 및 DARPin 모두의 결실은 탈과립화를 전혀 일으키지 않았다. 유사하게, 사이토카인 생성은 오직 전장 TAC에서만 관찰되었다. 도 11B는 마우스 세포주 D2F2가 인간 Her2 항원 (D2F2/E2)를 발현시키도록 조작되었음을 보여준다. 두가지 세포주들 모두는 전장 CD4-TAC 또는 이의 결실 변이체들로 조작된 T-세포들과 배양되었다. 데이터는 4:1 종말점의 작동체(Effector) 대 표적(Target) 비율을 보여준다. 오직 전장 CD4-TAC만이 세포독성 반응을 유도할 수 있었다. 이는 DARPin 및 UCHT1 도메인들이 수용체 기능에 관여함을 증명한다.
도 12는 다양한 막통과 TAC 변이체들의 성질들을 보여준다. 도 12A는 다양한 막통과 구조들에 대한 개요이다. 제 1 세트의 변이체들은 시토졸 도메인이 없다. CD4 TAC -시토졸은 전체 시토졸 도메인이 제거되어 있다. 합성 구조는 설계된, 매우 소수성인 막 도메인으로 대체된 CD4 TM을 가진다. 글리코포린 변이체는 CD4 막통과 도메인을 글리코포린 막통과 도메인으로 대체한다. GPI 고정 변이체는 GPI 앵커(anchor)를 사용하여 막에 TAC를 부착시키기 위해 서열화된 CD48 GPI 신호를 사용한다. CD8A TAC 변이체는 막통과 및 시토졸 CD4 도메인을 CD8α 대응물로 대체하였다. 도 12B는 CD8 정제 T-세포들이 다양한 구조들로 조작되었음을 보여준다. 전장 TAC와 비교한 다양한 수용체들의 표면 발현이 도시된다. 모든 데이터들은 대조군의 형광 강도 중간값에 상대적이다. 모든 변이체들은 전장 CD4-TAC와 비교하여 현저히 낮은 수용체 표면 발현을 가진다. GPI 앵커 TAC 변이체는 바탕 이상으로 검출되지 않는다. 도 12C는 탈과립화 및 사이토카인 생성에 대한 다양한 변이체들의 시험을 도시한다. 세포들을 플레이트 결합 Her2 항원과 함께 배양하였다. 활성은 탈과립화 표지자 CD107a (좌측 막대 그래프)에 양성인 세포들의 백분율 또는 함께 선택된 모든 사이토카인 생성 세포들의 백분율 (TNFa, IFNg 및 TNFa/IFNg, 우측 막대 그래프)로서 제공된다. GPI 고정 또는 CD8a 변이체들은 바탕 수준의 탈과립화 및 사이토카인 생성을 보여준다. 글리코포린, 합성 및 -시토졸 TAC 변이체들은 보통 수준의 탈과립화 및 낮은 수준의 사이토카인 생성을 보인다. 모든 경우에서 활성은 전장 CD4-TAC 보다 훨씬 이하이다. 이를 종합하면 시토졸 도메인 없이 TAC를 고정하는 것은 감소된 활성을 가진 기능적 수용체들을 생성함을 보여준다.
도 13은 TAC 변이체들과의 Lck 상호작용을 보여준다. 도 13A에서, Her2 항원은 자석 비드에 공유적으로 부착되었다. 293TM 세포들은 TAC 및 TAC 시토졸 결실 변이체 모두 뿐만 아니라 Lck를 발현시키도록 조작되었다. 비드들을 세포 용해물과 함께 하룻밤동안 배양하고 후속적으로 세척하여 웨스턴 블롯하였다. Lck는 Lck 항체를 이용하여 검출되었고, TAC는 Myc 항체를 통해 검출되었다. B-액틴을 대조군으로 사용하였다. b-액틴은 풀다운되지 않았으며 오직 상청액 (S)에서만 검출되었다. 그러나 전장 TAC 및 시토졸 결실 모두는 효과적으로 풀다운 되었으며 펠릿 분획 (B)에서 검출되었다. 벡터 대조군 및 시토졸 도메인 없는 TAC는 비슷한 수준의 바탕 Lck 신호를 보여준다. 그러나 전장 CD4 TAC는 총량에 비해 상당한 수준의 Lck를 보여준다. 도 13B는 펠릿에서 검출된 Lck의 밀도측정 분석을 보여준다. 신호는 음성 대조군에 대하여 보정되었다. 이 데이터는 Lck가 전장 CD4-TAC와 상호작용할 수 있음을 뒷받침한다.
도 14에서, CD4 TAC 표면 발현 및 활성을 BiTE 유사 변이체와 비교한다. 도 14A는 NGFR만의 대조군 (좌측), CD4 TAC (중앙) 및 BiTE 유사 변이체 (우측)를 보여준다. 형질도입 표지자 NGFR 및 Her2 항원을 이용하여 표면 발현을 시험하였다. TAC는 BiTE에 비해 훨씬 낮은 표면 발현을 보여준다. 가장 특히, BiTE가 형질도입 음성 세포들 (NGFR-)이 강한 수용체 발현을 보일 수 있게 하기에 충분한 커플링 항체를 분비하는 것으로 보인다. 사이토카인 생성 및 탈과립화 모두 TAC 조작 세포들에 비해 BiTE 유사 세포들에서 더 높다. 도 14B는 다양한 Her2 양성 세포주들 (MDA MB 231, SK OV 3, A549)에서의 세포독성을 비교한다. 사이토카인 생성과 대조적으로, TAC 조작 세포들은 현저히 개선된 세포독성 활성을 보여준다.
도 15는 UCHT1의 무작위 돌연변이원 라이브러리에 대한 CD4 TAC WT의 비교를 보여준다. TAC 성질을 변화시키는 능력을 시험하기 위하여, UCHT1 및 TCR 엡실론의 결합 표면 상에서 발견된 24개의 아미노산들을 개별적으로 변이시켰다. 이는 480개라는 이론적 숫자의 특이적 클론(unique clones)을 생성하며, 이들 모두는 이러한 무작위 라이브러리에서 제시되어야 한다. 도 15A는 돌연변이체의 도식적 표현을 보여준다. 음영은 변이들을 나타내는데 이러한 변이들은 모두 scFv-엡실론 표면에 존재한다. 도 F5B는 표면 발현에 관한 히스토그램이다. 조작된 세포들은 표면 발현된 수용체를 검출하기 위하여 FcHer2 항원으로 탐침되었다. 라이브러리는 훨씬 개선된 수용체의 표면 발현을 보여준다. 도 15C는 WT 및 라이브러리 CD4 TAC 세포들이 플레이트 결합 항원과 함께 배양되었음을 보여준다. 사이토카인을 활성화하고 생성하는 이들의 능력이 제시된다. 라이브러리는 WT와 비교하여 유사한 활성을 가진다. 이론에 제한됨없이, 이는 scFv 도메인을 변화시킴으로써 본래의 기능적 프로파일을 보유하면서 TAC의 발현 성질을 개선시킬 수 있다는 생각을 뒷받침한다.
도 16은 A85V, T161P 돌연변이체의 개선된 표면 발현을 보여준다. 이 라이브러리는 WT 이상의 성장 이점을 가진 돌연변이체들을 선택할 수 있도록 연장된 시기동안 전파(propagate)되었다. 선택된 돌연변이체를 분석하였다 (A85V, T161P; 번호는 UCHT1 도메인 분절에 기초하여 부여된다). 도 16A는 말초혈액 단핵구 (PBMC)가 WT CD4-TAC 또는 A85V, T161P 돌연변이체로 조작되었음을 보여준다. CD4 TAC (좌) 및 A85V, T161P 돌연변이체 (우) 간의 최종 CD4/CD8 개체군들을 비교한다. 특히, WT CD4-TAC는 CD4 양성 세포들의 개체군을 감소시킨다. 이러한 효과는 돌연변이체 세포들에서 관찰되지 않는다. 도 16B는 NGFR 형질도입 표지자 및 FcHer2 양성에 의해 결정되는 표면 발현을 보여주며, A85V, T161P 돌연변이체의 개선된 표면 발현을 나타낸다. 도 16C는 A85V, T161P 돌연변이체 사이토카인 생성이 감소됨을 보여준다 (DMSO 대조군들은 활성 없음을 보여주었다, 데이터 도시되지 않음). WT TAC 및 A85V, T161P 돌연변이체간의 탈과립화는 비슷하다.
도 17은 A85V, T161P 돌연변이체 세포독성 및 성장을 보여준다. 도 17A에서, WT CD4 TAC 및 A85V, T161P 돌연변이체로 조작된 T-세포들은 Her2 항원 양성 세포주들 SK OV 3, MDA MB 231 및 A549와 함께 배양되었다. 모든 경우에서, 돌연변이체는 감소된 수준의 세포독성을 나타내었으며; A549의 경우, 세포독성이 전혀 검출되지 않았다. 도 17B에서, 100 000개 세포들로 시작하여 배지에서의 세포 성장을 2주간에 걸쳐 모니터하였다. 주기적으로 샘플들을 채취하고 세포들을 손으로 계수하였다. A85V, T161P 돌연변이체는 WT 변이체에 비하여 눈에 띄게 개선된 성장을 보여준다. 종합하면, 이는 이 라이브러리가 여러가지 TAC 기능들을 변형 및 최적화시킬 수 있는 다양한 돌연변이체들을 함유할 가능성이 있음을 입증한다. 그러므로 UCHT1은 기능적 조절인자로서 사용될 수 있다.
본 출원은 현재 바람직한 실시예들로 고려되는 예들을 참고하여 설명되었으나, 본 출원은 개시된 실시예들에 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 이와 반대로, 본 출원은 첨부된 청구범위의 사상 및 범위에 포함되는 다양한 변형 및 균등한 배열들을 포함하고자 한다.
모든 공개문헌, 특허, 특허 출원들은, 각각 개개의 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 온전히 참고문헌이 되는 것으로 나타내어진 것과 동일한 정도로 온전히 참고문헌으로 포함된다.
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 450 455 460 Glu Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr 465 470 475 480 Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val 485 490 495 Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg 500 505 510 Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg 515 520 525 Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys 530 535 540 Thr Cys Ser Pro Ile 545 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 atggatttcc aggtccagat tttctccttc ctgctgattt ccgcaagcgt catt 54 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile <210> 7 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 atgtcacggg gctccgacct gggcaaaaag ctgctggagg ccgctagggc cgggcaggac 60 gatgaagtga gaatcctgat ggccaacggg gctgacgtga atgctaagga 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120 125 Asn <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 gaacagaaac tgattagcga agaagacctg 30 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 aaccccgggg gaggaggagg gagcggggga ggaggcagcg gcgggggagg ctctggagga 60 ggagggagcg gatcc 75 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Asn Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser 20 25 <210> 13 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 atggacatcc agatgactca gaccacaagc tccctgtctg caagtctggg cgaccgggtg 60 acaatctcct gcagagcctc tcaggatatt aggaactacc tgaattggta tcagcagaaa 120 cctgatggca cagtcaagct gctgatctac tataccagcc ggctgcactc aggcgtgcca 180 agcaaattct caggaagcgg ctccgggact gactactccc tgaccatctc taacctggag 240 caggaagata ttgctaccta tttctgccag cagggcaata cactgccctg gacttttgcc 300 ggaggcacca aactggagat caagggggga ggcgggagtg gaggcggggg atcaggagga 360 ggaggcagcg gaggaggagg gtccgaggtc cagctgcagc agagcggacc agaactggtg 420 aagcccggag caagtatgaa aatctcctgt aaggcctcag gatacagctt caccggctat 480 acaatgaact gggtgaaaca gtcccatggc aagaacctgg aatggatggg gctgattaat 540 ccttacaaag gcgtcagcac ctataatcag aagtttaaag acaaggccac actgactgtg 600 gataagtcta gttcaaccgc ttacatggag ctgctgtccc tgacatctga agacagtgcc 660 gtgtactatt gtgctcggtc tggctactat ggggacagtg attggtactt cgatgtctgg 720 ggacagggca ctaccctgac cgtgttttct 750 <210> 14 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 145 150 155 160 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser 245 250 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 actagtggcg gaggaggatc actcgag 27 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu 1 5 <210> 17 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 agcggacagg tgctgctgga atccaatatc aaagtcctgc ccacttggtc tacccccgtg 60 cagcctatgg ctctgattgt gctgggagga gtcgcaggac tgctgctgtt tatcgggctg 120 ggaattttct tttgcgtgcg ctgccggcac cggagaaggc aggccgagcg catgagccag 180 atcaagcgac tgctgagcga gaagaaaacc tgtcagtgtc cccatagatt ccagaagacc 240 tgttcaccca tt 252 <210> 18 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp 1 5 10 15 Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala 20 25 30 Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys 35 40 45 Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg Leu 50 55 60 Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr 65 70 75 80 Cys Ser Pro Ile <210> 19 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 35 40 45 Ala Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 <210> 20 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Leu Ser Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly 1 5 10 15 Pro Ala Ala Pro Ala Ala Leu Ala Pro Ala Pro Leu Ala Pro Gly Pro 20 25 30 Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Leu Ala Pro Gly Pro Ser 35 40 45 Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 <210> 21 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Ser Gly Ala Val Leu Leu Ala Ser Ala Val Ala Val Leu Pro Ser Ala 1 5 10 15 Ser Ser Pro Val Ala Pro Ser Gly Ala Val Leu Leu Ala Ser Ala Val 20 25 30 Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ser Pro Val Ala Pro Ser Gly Ala Val 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Ala Val Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ser Pro Val 50 55 60 Ala Pro 65 <210> 22 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 atgtctagac aggtacaact gcagcagtca ggacctgaac tgaagaagcc tggagagaca 60 gtcaagatct cctgcaaggc ctctgggtat cctttcacaa actatggaat gaactgggtg 120 aagcaggctc caggacaggg tttaaagtgg atgggctgga ttaacacctc cactggagag 180 tcaacatttg ctgatgactt caagggacgg tttgacttct ctttggaaac ctctgccaac 240 actgcctatt tgcagatcaa caacctcaaa agtgaagaca tggctacata tttctgtgca 300 agatgggagg tttaccacgg ctacgttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtt 360 tcctctggcg gtggcggttc tggtggcggt ggctccggcg gtggcggttc tgacatccag 420 ctgacccagt ctcacaaatt cctgtccact tcagtaggag acagggtcag catcacctgc 480 aaggccagtc aggatgtgta taatgctgtt gcctggtatc aacagaaacc aggacaatct 540 cctaaacttc tgatttactc ggcatcctcc cggtacactg gagtcccttc tcgcttcact 600 ggcagtggct ctgggccgga tttcactttc accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg 660 gcagtttatt tctgtcagca acattttcgt actccattca cgttcggctc ggggacaaaa 720 ttggagatc 729 <210> 23 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 Met Ser Arg Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 1 5 10 15 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe 20 25 30 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Glu Ser Thr Phe Ala 50 55 60 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Asp Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn 65 70 75 80 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr 85 90 95 Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Glu Val Tyr His Gly Tyr Val Pro Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 130 135 140 His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys 145 150 155 160 Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Asn Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr 180 185 190 Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe 195 200 205 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Gln His Phe Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile <210> 24 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 atggacatcc agatgactca gaccacaagc tccctgtctg caagtctggg cgaccgggtg 60 acaatctcct gcagagcctc tcaggatatt aggaactacc tgaattggta tcagcagaaa 120 cctgatggca cagtcaagct gctgatctac tataccagcc ggctgcactc aggcgtgcca 180 agcaaattct caggaagcgg ctccgggact gactactccc tgaccatctc taacctggag 240 caggaagata ttgttaccta tttctgccag cagggcaata cactgccctg gacttttgcc 300 ggaggcacca aactggagat caagggggga ggcgggagtg gaggcggggg atcaggagga 360 ggaggcagcg gaggaggagg gtccgaggtc cagctgcagc agagcggacc agaactggtg 420 aagcccggag caagtatgaa aatctcctgt aaggcctcag gatacagctt caccggctat 480 ccgatgaact gggtgaaaca gtcccatggc aagaacctgg aatggatggg gctgattaat 540 ccttacaaag gcgtcagcac ctataatcag aagtttaaag acaaggccac actgactgtg 600 gataagtcta gttcaaccgc ttacatggag ctgctgtccc tgacatctga agacagtgcc 660 gtgtactatt gtgctcggtc tggctactat ggggacagtg attggtactt cgatgtctgg 720 ggacagggca ctaccctgac cgtgttttct 750 <210> 25 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Gln Glu Asp Ile Val Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser 245 250

Claims (36)

  1. 다음을 포함하는 핵산:
    a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
    b. TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
    c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적-특이적 리간드는 종양 항원에 결합함을 특징으로 하는 핵산.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 표적-특이적 리간드는 설계된 안키린 반복 (DARPin) 폴리펩티드 또는 scFv임을 특징으로 하는 핵산.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질은 CD3임을 특징으로 하는 핵산.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 핵산.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 UCHT1, 또는 이의 변이체임을 특징으로 하는 핵산.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 시토졸 도메인(cytosolic domain) 및 막통과 도메인(transmembrane domain)을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 시토졸 도메인은 CD4 시토졸 도메인이고 막통과 도메인은 CD4 막통과 도메인임을 특징으로 하는 핵산.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합됨을 특징으로 하는 핵산.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드에 융합됨을 특징으로 하는 핵산.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드.
  12. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  13. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 핵산을 발현시키는 T-세포.
  14. 다음을 포함하는 벡터 구조체:
    a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
    b. TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
    c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드, 및
    d. 포유동물 세포에서 기능적인 프로모터.
  15. 청구항 14에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합되어, T 세포 항원 커플러 융합물(fusion)을 제공하며 T 세포 항원 커플러 융합물의 코딩 서열은 프로모터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  16. 청구항 14에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드에 융합되어, T 세포 항원 커플러 융합물을 제공하며 T 세포 항원 커플러 융합물의 코딩 서열은 프로모터에 작동적으로 연결됨을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  17. 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적-특이적 리간드는 종양 항원에 결합함을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  18. 청구항 14 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적-특이적 리간드는 설계된 안키린 반복 (DARPin) 폴리펩티드 또는 scFv임을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  19. 청구항 14 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질은 CD3임을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  20. 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  21. 청구항 14 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 UCHT1, 또는 이의 변이체임을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  22. 청구항 13 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 시토졸 도메인 및 막통과 도메인을 포함함을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 시토졸 도메인은 CD4 시토졸 도메인이고 막통과 도메인은 CD4 막통과 도메인임을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  24. 청구항 14 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합됨을 특징으로 하는 벡터 구조체.
  25. 청구항 14 내지 24 중 어느 한 항의 벡터 구조체로 형질감염된 분리된 T 세포.
  26. 청구항 13 또는 청구항 25의 T 세포 및 담체를 포함하는 제약상 조성물.
  27. T 세포가 다음을 포함하는 핵산을 발현시키는, 치료를 필요로하는 개체에서 암을 치료하기 위한 T세포의 용도:
    a. 표적-특이적 리간드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드;
    b. TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드; 및
    c. T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 표적-특이적 리간드는 암 세포 상의 항원에 결합함을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  29. 청구항 27 또는 청구항 28에 있어서, 상기 표적-특이적 리간드는 설계된 안키린 반복 (DARPin) 폴리펩티드 또는 scFv임을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  30. 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질은 CD3임을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  31. 청구항 27 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  32. 청구항 27 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, TCR 복합체와 관련된 단백질을 결합시키는 리간드는 UCHT1, 또는 이의 변이체임을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  33. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 수용체 신호전달 도메인 폴리펩티드는 시토졸 도메인 및 막통과 도메인을 포함함을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 시토졸 도메인은 CD4 시토졸 도메인이고 막통과 도메인은 CD4 막통과 도메인임을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  35. 청구항 27 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리뉴클레오티드에 융합됨을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
  36. 청구항 27 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드는 제 1 폴리뉴클레오티드에 융합됨을 특징으로 하는 T 세포의 용도.
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