JP3516002B2 - クレアチニン測定用試験片 - Google Patents
クレアチニン測定用試験片Info
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Description
ニン測定用試験片及び測定法に関し、詳しくは、尿のよ
うな緩衝作用の強い体液中のクレアチニンであっても高
精度で測定することが可能な安定性の高い試験片を提供
するものである。
代謝物であり、クレアチンが脱水、環化した構造を有す
る。体内においては、大半はクレアチン又はクレアチン
リン酸として筋肉中に存在する。クレアチンは、ATP
から高エネルギーリン酸を受けてクレアチンリン酸とな
り、エネルギー貯蔵物質として機能し、筋収縮などのエ
ネルギー消費時にはADPに高エネルギーリン酸を転移
してクレアチンに戻るか、非酵素的反応によってクレア
チニンとなる。その後、生成したクレアチニンは、腎臓
を介して尿中へ排泄される。
ち尿中濃度は、筋肉疾患や腎機能障害の指標に用いられ
ている。また、腎機能障害がある場合等、血中のクレア
チニン濃度が疾患の指標となり得る。
知の「ヤッフェ(Jaffe) 反応」は、強アルカリ性条件下
におけるクレアチニンとピクリン酸との縮合物による呈
色反応を利用したものであり、簡便かつ経済的な検出方
法として広く一般的に使用されている。またヤッフェ反
応は、ピクリン酸の代わりに3,5−ジニトロ安息香酸
を使用する、ベネディクト−ベーレ(Benedict-Bhere)の
方法が応用化されている。
使われているが、その一方でこの反応を簡便な乾式の試
験片へ応用した技術が開示されている(特開平1−12
9164号、特開平1−129165号、特開平5−2
81235号各公報)。しかしながら、尿を対象とした
場合、これらに記載の方法はいずれもある程度のクレア
チニンを測定できるものの、精度のよい方法とは言いが
たいものであった。
緩衝作用が非常に強いため、強アルカリ性下が必須条件
であるヤッフェ反応あるいはベネディクト−ベーレの方
法において、アルカリ性物質を加えても尿の緩衝作用に
よって反応pHの低下が引き起こされ、結果的にクレア
チニンの検出・測定に大きな誤差を与えてしまうからで
ある。
ニンの測定において誤差を少なくするためには、強力な
アルカリ性物質(例えば水酸化ナトリウムや水酸化リチ
ウム等の水酸化物)を、尿の緩衝能を上回る程度に多量
に添加する必要がある。本発明者らの実験によれば、尿
の緩衝能を上回って強アルカリ性を確保・維持するに
は、尿以外の検体を用いる場合の約5倍量以上のアルカ
リ性物質を添加しなけらばならないことが判明してい
る。
定に使用されるピクリン酸や3,5−ジニトロ安息香
酸、特にこれらの反応生成物は、尿の緩衝作用を上回る
程の量のアルカリ性物質を添加すると極めて不安定であ
り、生成物の呈色にも大きな影響を与える。
前に大量のアルカリ性物質を添加することによって、ピ
クリン酸や3,5−ジニトロ安息香酸の安定性を保つこ
とはできるが、使用する全ての試薬類をあらかじめ仕込
んである乾式の試験片では、これらの安定性を保つこと
はできない。したがって、希釈されていない尿を対象と
して、クレアチニンを精度よく測定する試験片を作製す
ることは、非常に困難であった。
らなされたものであり、非希釈尿のような緩衝作用の強
い体液であっても、クレアチニンを精度よく測定できる
安定な試験片を提供することを課題とする。
に鋭意研究した結果、3,4−ジニトロ安息香酸が、尿
の緩衝作用を上回る程に増量したアルカリ性物質の存在
下でも安定して、クレアチニンとの縮合反応により呈色
することを見出し、本発明を完成させた。
の全部又は少なくとも一部に接する3,4−ジニトロ安
息香酸及び強アルカリ性物質とを含む、体液中のクレア
チニン測定用試験片である。
として、展開層を支持するための支持体をさらに有し、
この支持体上に3,4−ジニトロ安息香酸を含む試薬層
が設けられ、この試薬層上に強アルカリ性物質を含む展
開層が設けられた試験片を提供する。
濃度を測定する方法であって、試料液中に、試料液のp
Hが12〜13となる量の強アルカリ性物質と、3,4
−ジニトロ安息香酸とを溶解させ、試料中に含まれるク
レアチニンと3,4−ジニトロ安息香酸との縮合反応に
よる呈色を測定することを特徴とするクレアチニンの測
定法を提供する。
得るが、特に非希釈尿が好適に適用される。その際、前
記強アルカリ性物質は、試験片に非希釈尿を吸収させた
ときに反応pHを12〜13に維持することができるこ
とが好ましい。この強アルカリ性物質として、具体的に
は水酸化リチウムが挙げられる。
試験片は、展開層と、この展開層の全部又は少なくとも
一部に接する3,4−ジニトロ安息香酸及び強アルカリ
性物質とを有し、好ましくは支持体をさらに備える。
相の反応系を作るためのものであり、素材としては濾
紙、織布、不織布、ガラス繊維、ニトロセルロース、親
水性高分子等、多孔性の素材が挙げられる。また、形状
としては、ストリップ(細片)状、棒状等が挙げられ
る。これらの内では、濾紙などのようなセルロース等の
天然由来の繊維素材は、強アルカリ条件下では加水分解
や劣化することがあるため、化学合成繊維生地等が好ま
しい。
発明の試験片は、展開層を支持するための支持体を有し
ていてもよい。支持体は、展開層と一体となり得る形状
であってもよいし、展開層の一部のみを支持するもので
あってもよい。支持体の素材としては、乾式試験片を作
製する際に通常用いられるプラスチック樹脂、例えばポ
リエチレンテレフタレート(以下、「PET」と省略す
る)等が挙げられる。支持体に光透過性の素材を用いる
と、試験片を使用する際に、呈色を支持体側から観察、
測定することが可能となる。
性物質は、上記のような展開層の全部又は少なくとも一
部に接する。ここで「接する」とは、3,4−ジニトロ
安息香酸及び強アルカリ性物質が展開層の表面上に接し
ていることのみを意味するものではなく、展開層の内部
で展開層を構成する素材に接していることも含む。ま
た、上記の物質は間接的に展開層に接していてもよく、
例えばマイクロカプセルに封入された状態で接していて
もよい。さらには、展開層上に3,4−ジニトロ安息香
酸及び強アルカリ性物質の一方の物質が層状に設けら
れ、他方の物質がその上に接するように担持されていて
もよい。
3,4−ジニトロ安息香酸を含む層が表面上に形成され
た支持体と、強アルカリ性物質を含む層が表面上に形成
された展開層とが、3,4−ジニトロ安息香酸層と強ア
ルカリ性物質層が接するようにして圧着等の手法により
積層化させた試験片(図1参照)が挙げられる。このよ
うに多層化することで、3,4−ジニトロ安息香酸の安
定性を一層高めることができる。その際、支持体として
プラスチック素材等の非多孔性素材を用いるときは、
3,4−ジニトロ安息香酸を支持体上に固定するため
に、バインダーを用いて試薬層として支持体上に担持さ
せてもよい。また、強アルカリ性物質は、展開層中に含
浸させてもよい。尚、3,4−ジニトロ安息香酸と強ア
ルカリ性物質の試験片中の存在部位は、上記と逆であっ
てもよいが、反応環境を強アルカリにすることが必要で
あるので、展開層及び支持層のうち、先に検体試料が触
れる展開層側に水酸化物を含ませることが好ましい。ま
た、強アルカリ性物質は、強アルカリ性条件を強化する
ために、試薬層及び展開層の両方に含有させてもよい。
せたときに強アルカリ性の環境を誘導することができる
ものであればよく、特に、試験片に非希釈尿を吸収させ
たときに、試験片での反応pHを12〜13に維持する
ことができることが好ましい。具体的には、水酸化アル
カリ金属であれば、大抵の物質が使用できる。試験片の
作製・保存中に、水酸化アルカリ金属の二酸化炭素を吸
着する性質により炭酸が生じるため、試験片のpHが低
下することが知られている。この観点から、使用する水
酸化アルカリ金属としては、炭酸を生じにくい水酸化リ
チウムが望ましい。水酸化リチウムを用いる場合には、
例えば展開層が厚さ150μm、面積が100cm2 の
場合、19〜31g含有されていることが好ましい。
反応により呈色する物質として3,4−ジニトロ安息香
酸を用いる以外は、従来の試験片と同様にして製造する
ことができる。例えば、バインダーと3,4−ジニトロ
安息香酸とを溶媒中に溶解又は分散させることによって
粘性の高い塗工液を調製し、この塗工液を支持体表面に
一定の厚さに塗工した後乾燥させて、試薬層を形成させ
る。バインダーとしては、メチルセルロース等の非活性
かつ親水性のポリマーが挙げられる。上記のようにして
得られる支持体と、強アルカリ性物質溶液を含浸、乾燥
させた展開層とを、試薬層と展開層が接するようにして
圧着することによって、全体を積層化する。これらの操
作は、最終製品と同じ大きさの素材を用いて行ってもよ
いが、大きい素材を用いて積層化したものを適宜裁断し
てもよい。
体とを積層化したものを、そのまま試験片として用いて
もよいが、これを細片化したものをPET等からなる把
持部の先端に固定して用いてもよい。
の上へ試料(非希釈尿等)を滴下して、試薬層の色変化
を、目視あるいは分光色差計、反射率測定装置(例えば
スポットケムSP−4410((株)京都第一科学の商
標)等の装置を用いて読み取る。装置を用いて定量分析
する場合には、試料液を試験片の展開層へ滴下した後、
クレアチニンと3,4−ジニトロ安息香酸の縮合物の吸
収波長(550nm)における反射率の変化速度を測定
し、あらかじめ既知濃度系列のクレアチニン溶液を滴下
して測定しておいた結果から作成した検量線を用いて、
前記変化速度から濃度を算出する。支持体に光透過性の
素材を用いたときは、呈色を支持体側から測定してもよ
い。
しているので、試験片に試料液を吸収させたときに、試
料液中のpHを高く維持することができ、試料中に含ま
れるクレアチニンと3,4−ジニトロ安息香酸との縮合
反応による呈色を安定化させることができる。その結
果、高い測定精度を有し、簡便にクレアチニンを定量す
ることができる。
説明する。下記の塗工液成分を混合した後、支持体(1
25μmのPET製白色フィルム)上に、濡れ厚さ15
0μmの厚さで塗工し、40℃で10分間乾燥させる。
溶解させた後、化学合成繊維生地(ポリエステル編み物
「ザヴィーナ・ミニマックス」(株)鐘紡の商標)へ1
30ml/m2吸収、含浸させた後、40℃で15分間乾
燥させる。
蒸留水で湿らせた展開層を、試薬層の上にのせて圧着さ
せることによりラミネートした後、この積層物を裁断機
で5mm×7mmになるように裁断する。裁断して得られた
パッドを、面積が5mm×70mm,厚さが0.25mmのス
ティック状の白色PET片の先端部分に貼り付け、最終
的な試験片を得る。
図1に示す。
に説明する。
した。得られた試験片を用いて、尿中のクレアチニンを
測定した。ヒトプール尿へクレアチニンを100〜50
0mg/dlとなるように添加したものを試料とし、ヤ
ッフェ反応を用いた市販の溶液系自動分析装置用試薬
(「クリニメイト」(株)第一化学の商標)と、本発明
による試験片の各々を用いて、クレアチニン定量値の相
関をとった。
lとし、37℃の環境下で、スポットケムSP−441
0((株)京都第一科学製)を使用して、クレアチニン
と3,4−ジニトロ安息香酸の縮合物の吸収波長(55
0nm)における反射率を展開層側から測定した。得ら
れた反射率は、化1式に示すクベルカ−ムンク(Kubelka
-Munk)の式に従ってK/S値に換算し、その20〜30
秒間の増加量(ΔK/S)から1分間あたりの増加量を
求めた。
測定された各クレアチニン濃度と1分間あたりのΔK/
Sとの関係を図2に示す。これを検量線とした。検量線
は、上記測定範囲で良好な直線性を示した。
用いて測定された結果と、本発明による試験片を用いて
測定された結果との相関を、化2式に示す。
(濃度)は、個人差があるものの、一般的に300mg
/dlまでの範囲であり、本発明によって得られる検量
線は500mg/dlまでの直線性を示しており、尿中
クレアチニンの定量に十分な測定範囲を有している。
溶液系自動分析装置用試薬と、本発明による試験片を用
い、クレアチニンを定量した。これらの値の相関を化3
式に示す。このように、両者は、実尿に対しても良好な
相関関係を示した。
る試験片)
酸の代わりに3,5−ジニトロ安息香酸を用い、3,5
−ジニトロ安息香酸の安定性を鑑みてアルカリ性物質量
が実施例1の試験片の1/5量である試験片を作製し、
実尿を試料として実施例2と同様に測定した。本発明の
試験片を用いた結果との相関を化4式に示す。
る試験片)
は低かった。これは、反応時のpH(アルカリ性)が維
持されないような強い緩衝能を、尿が持つことが多いた
めに、比較例の試験片では正確な測定ができなかったた
めであると考えられる。
のクレアチニン濃度を精度よく測定できる安定な乾式の
試験片を提供することができる。
チニン測定用の検量線である。縦軸は1分間あたりのΔ
K/S値を、横軸はクレアチニン濃度(mg/dl)を
示す。
生地) 2.3,4−ジニトロ安息香酸を含む試薬層 3.支持層(白色PETフィルム)
Claims (4)
- 【請求項1】 展開層を支持するための支持体を有し、
この支持体上に3,4−ジニトロ安息香酸を含む試薬層
が設けられ、この試薬層上に強アルカリ性物質を含む展
開層が設けられた体液中のクレアチニン測定用試験片。 - 【請求項2】 前記体液が非希釈尿である請求項1記載
の試験片。 - 【請求項3】 前記強アルカリ性物質が、試験片に非希
釈尿を染み込ませたときに反応pHを12〜13に維持
することができる請求項1又は2に記載の試験片。 - 【請求項4】 前記強アルカリ性物質が水酸化リチウム
である請求項1〜3のいずれか一項に記載の試験片。
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