KR101955430B1 - 사르코신 대사산물 중 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents
사르코신 대사산물 중 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법에 관한 것으로, 기존의 분광광도계 등을 이용하는 방법보다 더 간편하고 신속하게 전립선암을 진단할 수 있는 것이다.
이러한 본 발명은, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 상기 사르코신 대사산물 중 과산화물과 반응하여 색원체로 기능하는 과산화물 색원체; 및 촉매제의 기능을 하는 과산화효소(Peroxidase); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지를 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한, 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서, 사르코신 산화효소 및 과산화효소를 pH 7.5 ~ 10.0 범위를 유지하는 완충액에 용해하여 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법이 제공된다.
이러한 본 발명은, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 상기 사르코신 대사산물 중 과산화물과 반응하여 색원체로 기능하는 과산화물 색원체; 및 촉매제의 기능을 하는 과산화효소(Peroxidase); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지를 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한, 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서, 사르코신 산화효소 및 과산화효소를 pH 7.5 ~ 10.0 범위를 유지하는 완충액에 용해하여 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법에 관한 것으로, 특히, 전립선암 환자의 소변에 포함되어 있는 사르코신이 산화되어 생성되는 과산화물(Peroxide)을 이용하여 전립선암을 진단하는 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
세계보건기구(WHO)에 따르면 전립선암은 남성의 경우 페암, 위암, 간암, 대장암, 식도암 다음 6번째로 발생 빈도가 높은 암으로 미국에서는 매년 약 18만6천명의 환자가 발생해 이중 약 2만9천명이 사망하는 남성들 중에 가장 일반적으로 진단되는 암 중의 하나이나, 그 질환의 발달을 추적하기가 어렵다. 전형적인 진단은 혈액중의 전립선 특이항체 (PSA : Prostate Specific Antigen)라 불리우는 특정한 단백질을 찾는 혈액 검사와 이후에 뒤따르는 생검에 의존한다.
그러나 기존의 전립선 특이 항체의 수치는 전립선암에서 종종 높아지지만 이것이 직접적인 종양의 존재를 보여주는 것은 아니며, 항체의 수치가 높다고 하여 그 악성도를 의미하는 것은 아니다. 또한 건강한 남성의 혈액속에도 미량의 전립선 특이항체가 존재하는 것도 전립선 특이항체 검사를 통한 전립선암 진단의 신뢰도를 낮추는 이유가 되어왔다.
최근 미국 미시간대학 의과대학의 아룰 치나이얀 박사는 네이쳐에서 전립선암세포에서 만들어지는 대사물질 사르코신이 소변에서 얼마나 검출되느냐에 따라 전립선암과 그 다른 기관들로 퍼지려는 경향성 여부를 판단할 수 있다고 밝혔다.
연구자들은 초기단계, 진행성, 전이성 전립선암 환자들의 소변에서 전립선암을 탐지하고, 그 질병의 양성 및 침해성 형태를 구분하는데 사용될 수 있는 화합물을 뇨에서 확인하였다. 또한, 아미노산 글리신의 메틸화된 형태인 사르코신의 농도는 전립선암 환자들의 뇨에서 특히 암세포들이 다른 기관들로 퍼지는 경향이 더 클 때 사르코신의 농도가 더 높게 나타난다는 사실을 발표하였고, 기존의 전립선암의 진단시 현재 진단지표로 사용되고 있는 전립선 특이항체보다 사르코신의 수치가 더 정확하다는 사실을 발표하였다.
이를 이용해 소변내의 사르코신을 검출하는 방법을 개발하여 전립선암의 진단지표로 사용하고자 하는 다양한 시도가 이루어지고 있다.
기존의 방법은 HPLC법과 소변 검체에 사르코신 산화효소를 처리 후 분광광도계를 사용하는 방법이 주로 사용된다. 두 방법 모두 정량까지 가능하나, 전문적인 기술을 가진 특별한 시험자가 고가의 장비를 이용해야 하며 시료를 여러 단계에 걸쳐 처리해야 하는 복잡한 과정을 거쳐야 하므로 사용에 제약이 따르는 문제점이 있다.
기존의 전립선암 진단 수단 및 그 방법에 관한 선행기술들을 몇가지 제시하면 다음과 같다.
2010년 6월 2일 Charite Universitatsmedizin Berlin이 일본국에 출원한 일본공개특허(2012-529021)에 기재된 발명은 전립선암 또는 그 소인을 진단하는 ex vivo의 방법이며, 전립선암을 앓든가 또는 그 소인을 가진다고 의심되는 피험체의 시험 샘플만의 적어도 1개의 대사 물질을 측정하는 스텝 및 상기 적어도 1개의 대사 물질을 그것에 의해 전립선암 또는 그 소인을 진단하는 스텝을 포함하는 것이다. 상기 선행특허는 대사물질의 수집, 대사물질의 특성값을 포함한 데이터 수집, 및 상기 데이터 수집을 포함한 기억 매체를 포함한다. 또한, 상기 선행특허는 데이터 기억 매체와 작동할 수 있는 형태로 연결된, 샘플의 대사물질의 특성값을 비교하는 시스템도 제공하고 있다. 또한, 적어도 1개의 대사물질을 포함한 진단수단, 및 전립선암을 진단하는 진단수단을 제조하기 위한 1개의 대사물질의 사용을 포함하고 있다.
이러한 상기 선행발명은 전립선암에 관계하는 대사 물질을 분류하는 방법에 관한 것이며, 전립선암을 진단하기 위하여 사르코신 함량을 측정하는 점이 기재되어 있다.
상기 선행발명은 소변의 사르코신 함량을 측정하기 위하여 이미 공지된 방법, 즉, 소변의 사르코신의 직접적인 함량을 측정하기 위하여 액체 크로마토그래피(LC) 질량 분석 및/또는 가스크로마토그래피(GC) 질량 분석을 이용하고 있다.
이에 반하여 본원 발명은 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법을 제공한다는 점에서 차이가 있다.
또한, 1989년 8월 9일 뵈링거 만하임 게엠베하가 한국에서 출원하여 등록된 "효소적 산화에 의한 검체의 비색적 측정방법 및 시약"(등록번호 1992-0001449)에 관한 발명은, 전자수용체의 존재 하에 검체의 효소적 산화에 의한 검체의 비색적 측정 및 검체의 양에 대한 측정치로서 색 형성에 의하여 환원된 전자수용체의 측정방법에 있어서, 직접 전자수용체로서 +1과 -1 사이의 산화단계에 있는 질소를 갖는 화합물들의 그룹에서 선택된 물질의 존재 하에서 적절한 산화 환원 효소에 의해 검체가 산화되는 것을 특징으로 하는, 검체의 효소적 산화에 의한 검체의 비색적 측정방법에 관한 것이다.
상기 선행발명은 포도당 산화환원 효소를 이용하기 때문에 사르코신 산화효소를 이용하는 본원발명과는 다르고, 검체양을 측정하기 위하여 비색적 측정방법이 기재되어 있기는 하지만, 근본적으로 사르코신 대사물질을 사용하지 않는다는 점에서 본원발명과는 차이점이 있다.
또한, 2006년 9월 1일 베스 이스라엘 데코니스 메디칼센터가 한국에서 출원한 "자간전증 또는 자간의 진단 및 치료 방법"(공개번호 2007-0001991)에 관한 발명은, VEGF 또는 PlGF 농도를 증가시키는 화합물 또는 sF1t-1 농도를 감소시키는 화합물을 이용하여 자간전증 또는 자간을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 sF1t-1, VEGF, 또는 PlGF 농도를 검출함으로써 자간전증 또는 자간의 치료를 모니터하는 방법을 특징으로 한다. 또한 대상체의 sF1t-1, VEGF, 또는 PlGF 농도를 검출함으로써 자간전증 또는 자간을 진단하는 방법을 특징으로 한다.
상기 선행발명은 자간전증 또는 자간을 진단하기 위하여 요 시료 속의 VEGF, 또는 PlGF 농도를 검출하는 구성이 기재된 반면, 본원발명은 전립선암 진단을 위해 사르코신 함량을 검출하기 위해 사르코신 산화효소를 이용하는 점에서 구성이 상이하며, 질병의 진단을 위해 비색시험지법을 이용하는 점은 일부 유사하나, 본원발명은 사르코신 산화에 의해 생성되는 과산화물을 검출하는 비색 시험지법을 이용한다는 점에서 상이하다.
또한, 2008년 8월 15일 Metaboton, Inc.가 출원한 "전립선암의 대사 프로파일링법"(일본공개특허 2010-537170)에 관한 발명은, 암 시험지에 관한 것으로 특히, 전립선암 중에 이상적으로 존재하는 대사 산물을 제공하며, 암에 특이적인 대사 산물을 표적으로 하는 진단, 연구, 및 치료 용도를 제공하고 있다.
상기 선행발명은 전립선암을 진단하기 위해 사르코신 함량을 측정하는 점이 기재된 점에서 일부 유사하나, 사르코신 함량을 측정하기 위해 사르코신 산화효소를 이용하는 점이 기재되지 않은 점에서 본원 발명과 상이하며, 소변의 사르코신 함량을 측정하기 위해 GC-MS(가스크로트그라피/질량분석법) 및 UHPLC-MS(초고성능 액체 크로트그라피 질량 분석)을 이용하는 반면, 본원발명은 사르코신 산화에 의해 생성되는 과산화물을 검출하기 위해 비색 시험지법을 이용한다는 점에서 상이하다.
이에 본 발명은 상기와 같은 종래의 제반 문제점을 해소하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 소변 중의 사르코신을 정성, 정량함에 있어서 기존의 요검사 시험지와 같이 검사 시험지를 검체 소변에 반응시켜서 색변화를 육안으로 확인할 수 있도록 함으로써, 전문인력 및 고가의 장비없이도 전립선암의 진단방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 기술적 사상에 의한 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 상기 사르코신 대사산물 중 과산화물과 반응하여 색원체로 기능하는 과산화물 색원체; 및 촉매제의 기능을 하는 과산화효소(Peroxidase); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지를 제공한다.
또한, 상기 과산화물 색원체는, 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine); 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-다이아미노벤젠 (1,4-diaminobenzene); 1,2-다이하이드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene); 4-클로로나프톨(4-chloronapthol); 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole); 2,7'-다이아미노플로렌(2,7'-diaminofluorene); 엔,엔'-다이메칠에틸렌다이아민(N,N'-dimethylethylenediamine); 엔,엔'-비스-(4-아미노페닐)-1,3-자이렌다이아민(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine); 중 어느 하나 이상인 것이 더 양호하다.
또한, 첨가 시약들이 고정될 수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체; 를 더 포함하는 것이 양호하다.
또한, 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시켜 제거하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid); 를 더 포함하는 것이 양호하다.
또한, 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서, 사르코신 산화효소 및 과산화효소를 pH 7.5 ~ 10.0 범위를 유지하는 완충액에 용해하여 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법이 제공된다.
또한, 상기 사르코신 산화효소의 농도는 200 ~ 500 unit/dL의 범위인 것이 더 양호하다.
또한, 상기 용해물은 시약들을 고정시키는 수용성 고분자 고정체가 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 상기 용해물은 색원체의 발색을 도드라지게 하기 위하여 염료가 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 상기 용해물은 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시키는 EDTA가 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 상기 전립선암 진단 시험지로 전립선암을 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의한 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 소변 중의 사르코신을 정성, 정량함에 있어서 기존의 HPLC 방법, 분광광도계 방법과 같이 전문적인 기술을 가진 자가 실험실에서 검체와 시약을 혼합하는 등의 화학반응 이후에 이를 HPCL 또는 분광광도계를 이용하여 분석하는 것처럼 전문인력 및 고가의 장비를 필요로 하지 않고 간단하게 전립선암의 진단 지표로 이용할 수 있도록 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 pH에 따른 사르코신 산화효소의 활성도 변화도.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 시험지의 외관을 보여주는 구성도.
도 3은 본 발명의 실시예의 구현을 위한 실험결과를 설명하기 위한 사진.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 시험지의 외관을 보여주는 구성도.
도 3은 본 발명의 실시예의 구현을 위한 실험결과를 설명하기 위한 사진.
첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 의한 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하거나, 개략적인 구성을 이해하기 위하여 실제보다 축소하여 도시한 것이다.
또한, 제1 및 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 한편, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 실시예에 의한 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 전립선암의 진단 지표를 고가의 장비 및 전문인력 없이도 간단하게 수행할 수 있게 한다.
전립선암(Prostate Cancer) 환자의 소변에서 사르코신(Sarcosine)의 농도가 특이하게 증가한다는 사실은 2009년에 발표된 네이쳐(Nature)지 457호에 수록되어 있는 사실이다.
즉, 사르코신은 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase)에 의하여 글리신(Glycine), 과산화물(H2O2) 및 포름알데히드(Formaldehyde)로 대사되는 바, 사르코신의 대사산물로 생성된 과산화물과 포름알데히드를 정량적으로 검출함으로써 사르코신의 농도를 산출 할 수 있으며, 이를 통하여 전립선암의 진단지표로 활용하는 것이 가능하다. 이러한 대사과정을 나타낸 것이 아래의 [화학식 1]이다.
한편, 기존의 과산화물을 정량하는 방법은 아래의 [화학식 2]와 같은 방법이 널리 알려져 있다.
위의 [화학식 1]과 [화학식 2]를 이용하여 아래 [화학식 3]의 반응식을 시험지 위에서 반응할 수 있도록 구성하면 사르코신의 농도를 비색 시험지 반응을 통하여 정량할 수 있게 된다. 이러한 방법을 이용하는 것이 본 발명의 기본적 기술내용이 된다.
사르코신은 위의 [화학식 1]과 같이 사르코신 산화효소에 의하여 과산화물과 포름알데히드를 사르코신의 농도에 비례적으로 생성하게 된다. 이때의 사르코신 산화효소의 활성에 영향을 주는 인자로는 완충액(Buffer Solution)의 pH 및 농도, 반응온도 등이 있다.
이때의 반응온도는 실온이면 족하고, 완충액의 농도는 대략 1~2 몰농도, pH는 8 ~ 9.5가 바람직하다.
또한, 완충액으로는 트리스(Tris), 포스페이트(Phosphate), 시트레이트(Citrate), 보레이트(Borate) 등이 사용 가능하다.
사르코신 산화효소에 의하여 생성된 과산화물 탈수소화 반응을 촉매하는 과산화효소(Peroxidase)는 상기 [화학식 2]에 그 과정이 구체적으로 표현되어 있으며, 사르코신 산화효소의 50 ~ 80% 정도의 활성도 정도의 양을 첨가하면 충분하다. 이어서 3,3'-다이아미노벤지딘 (3,3'-diaminobenzidine); 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-다이아미노벤젠 (1,4-diaminobenzene); 1,2-다이하이드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene); 4-클로로나프톨 (4-chloronapthol); 3-아미노-9-에틸카바졸 (3-amino-9-ethylcarbazole); 2,7'-다이아미노플로렌 (2,7'-diaminofluorene); 엔, 엔'-다이메칠에틸렌다이아민 (N,N'-dimethylethylenediamine); 엔,엔'-비스-(4-아미노페닐)-1,3-자이렌다이아민 N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine 등과 같은 과산화물 색원체가 산화되어, 일정한 색깔을 띠게 된다.
이때 파란색 등과 같이 쉽게 눈에 인식되지 아니하는 색일 경우에는 노란색 염료 등을 이용하여 바탕색을 노랗게 만듦으로써, 발색의 경향이 파란색이 아닌 녹색, 청록색 등으로 도드라지게 하는 추가적인 방법도 이용할 수 있다.
또한, 소변이 시험지에 쉽게 흡수될 수 있도록 하는 계면활성제가 추가될 수도 있고, 첨가 시약들이 셀룰로오즈 시험지에 고정될 수 있도록 하는 고정체(보통 수용성 폴리머 이용)도 첨가될 수 있다.
한편, 사르코신 산화 효소와 과산화효소의 2종류의 효소를 동시에 사용함에 있어서 각 효소의 pH 안정성의 차이로 인해 침지 용액을 두 차례에 나누어 제조해야 한다.
사르코신 산화효소의 경우 [도 1]과 같이 pH 8.0에서 최대 활성도를 갖게 되며, 일반적인 분광광도계법의 경우 완충액의 농도는 0.05~0.1 몰농도, pH 7.5~8.5 면 충분하다. 본 발명은 비색 시험지법으로 조제된 시험지를 시료에 담궜다 꺼냄으로서, 시료의 산성 pH 등에 가혹하게 노출된다. 이때의 가혹한 노출을 극복하기 위해 1차 용액의 완충액은 1.0 ~ 2.0 몰농도의 보레이트-수산화나트륨 pH 8.0~9.5, 용액을 제조하여 이용한다.
이후에 조제 용액에 시험지를 침지 후 시험지를 열 건조할 때의 효소 활성도가 떨어지는 것을 고려하여 사르코신 산화 효소 200 ~ 500 unit/dL 의 과량의 효소가 첨가되어야 한다. 만약 이때 사르코신 산화효소의 양이 적으면 시험지의 건조 과정에서 효소의 활성이 떨어져 충분한 반응성을 갖지 못하게 되며, 첨가량이 많으면 비용의 증가뿐만 아니라 자연변색을 초래할 수도 있다.
첨가하는 시약들이 셀룰로오즈 시험지에 고정될 수 있도록 수용성 폴리머, 폴리비닐피로리딘 1.0~2.0 g/dL을 첨가하는데, 이때 첨가량이 작으면 시약이 시험지에 고정되지 않아 완성된 시험지를 시료에 담궜을 때 시약이 용출되어 색 오염이 일어나며, 양이 많으면 수용성 폴리머라 할지라도 시료의 흡수를 방해하게 된다.
3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘을 색원체로 사용할 경우 발색이 청색계열로 일어나는데 옅은 청색의 경우 육안으로 그 차이를 확인하기가 용이하지 않다. 이러한 이유 때문에 노란색을 바탕색으로 해서 청색 계열의 발색이 진행될 경우 노란색 바탕과 청색의 혼색으로 녹색계열로 발색이 보이게 함으로써, 육안 확인이 쉽도록 하기 위해 타트라진을 0.05~0.1 g/dL를 사용한다. 이때 타르라진의 사용량이 적으면 시료 본연의 색에 묻혀 녹색이 아니 청색 계열로 발색하게 되며, 사용량이 많으면 미량의 사르코신에 의한 옅은 청색 반응이 짙은 노란색에 묻혀 위음성의 결과를 보이게 된다.
아래의 [표 1]과 같이 사르코신 산화효소는 금속이온에 의해 그 활성도가 크게 영향을 받게 되는데 시료에 금속 이온이 과량 존재할 경우 이를 킬레이트화 시켜 제거하여 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저하를 막기 위해서, EDTA 0.01 ~0.02 g/dL 를 첨가한다. 즉, EDTA는 금속 흡착제 역할을 하는 것이며, 이는 효소들의 활성화가 잘 이루어지게 하기 위함이다. 본 실시예에서는 EDTA4NA를 사용하였는데, 금속이온을 킬레이트화시킬 수 있는 다른 물질을 사용해도 무방하다. 한편, EDTA의 경우 첨가량이 적으면 충분이 금속이온을 제거하지 못하고, 반대로 양이 많을 경우 오히려 발색 반응을 저하시키게 된다.
시약이 충분히 용해되면 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후, 과량의 시약은 제거 후 70~80℃에서 30분간 건조시킨다.
2차 용액은 과산화효소를 안전하게 고정화시킬수 있도록 0.5~1.0 몰농도의 보레이트-염산 pH 6.0~7.0 완충액을 바탕으로 과산화효소 100~200 unit/dL, 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘 20 밀리몰(mM)농도를 용해시킨다. 이때 시약의 첨가량이 작으면 중농도, 고농도의 검체에서 발색차이가 없게 되며, 반대로 첨가량이 많으면 자연상태에서 변색되어 제품의 변질이나 위양성의 결과를 초래한다.
시약이 충분히 용해되면 앞서 1차 용액을 침지후 건조시킨 시험지를 2차 용액에 다시 침지시켜 70~80℃에서 30분간 건조시킨다.
이후에 시험지에 양면테이프를 붙히고 절단하여 지지체에 고정시킨 후 성형하여 [도 2]와 같은 형태로 제조하게 되며, 이 결과물은 습기에 민감하므로 제습제와 함께 밀페도가 높은 통에 보관하여 필요시 사용한다.
[도 3]은 위와 같은 방법에 의하여 제조된 시험지를 이용하여 전립선암을 진단하기 위한 실험 결과물로서, 좌측부터 Negative, 1000, 2000, 4000 nM 에서의 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘을 이용했을 때 과산화효소를 이용한 사르코신 검출반응 사진이다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
Claims (10)
- 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase);
상기 사르코신 대사산물 중 과산화물과 반응하여 색원체로 기능하는 과산화물 색원체; 및
촉매제의 기능을 하는 과산화효소(Peroxidase); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
- 제 1항에 있어서,
상기 과산화물 색원체는,
3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine); 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-다이아미노벤젠 (1,4-diaminobenzene); 1,2-다이하이드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene); 4-클로로나프톨(4-chloronapthol); 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole); 2,7'-다이아미노플로렌(2,7'-diaminofluorene); 엔,엔'-다이메칠에틸렌다이아민(N,N'-dimethylethylenediamine); 엔,엔'-비스-(4-아미노페닐)-1,3-자이렌다이아민(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine); 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지
- 제 1 항에 있어서,
첨가 시약들이 고정될 수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
- 제 1 항에 있어서,
금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시켜 제거하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
- 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서,
i) 사르코신 산화효소를 pH 8.0 ~9.5 범위를 유지하는 완충액에 용해한 1차 용액에 셀룰로오즈 시험지를 침지하고 건조하는 단계; 및
ii) 과산화효소 및 과산화물 색원체를 pH 6.0 ~ 7.0 범위를 유지하는 완충액에 용해한 2차 용액에 상기 i)단계에서 제조된 시험지를 침지하고 건조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 사르코신 산화효소의 농도는 200 ~ 500 unit/dL의 범위인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 1차 용액 또는 2차 용액은 시약들을 고정시키는 수용성 고분자 고정체가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 1차 용액 또는 2차 용액은 색원체의 발색을 도드라지게 하기 위하여 염료가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 1차 용액 또는 2차 용액은 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시키는 EDTA가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의한 전립선암 진단 시험지로 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020130121327A KR101955430B1 (ko) | 2013-10-11 | 2013-10-11 | 사르코신 대사산물 중 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 |
| CN201480051799.5A CN105555962A (zh) | 2013-10-04 | 2014-09-30 | 利用肌氨酸代谢产物中的甲醛或过氧化物的前列腺癌诊断试纸，其制造方法及利用其的前列腺癌诊断方法 |
| PCT/KR2014/009215 WO2015050366A1 (ko) | 2013-10-04 | 2014-09-30 | 사르코신 대사산물 중 포름알데히드 또는 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법 |
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| Title |
|---|
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| Cancer Biology & Therapy, 2010, Vol. 9, pp. 341-342. |
| Chemical Reviews, 2010, Vol.110, pp. 2536-2572. |
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