CN105555962A - 利用肌氨酸代谢产物中的甲醛或过氧化物的前列腺癌诊断试纸,其制造方法及利用其的前列腺癌诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用作为肌氨酸代谢产物的甲醛或过氧化物的前列腺癌诊断试纸、其制造方法及利用其的前列腺癌诊断方法,相比现有的利用分光光度计等的方法,能够更加简便迅速地进行前列腺癌诊断,在对小便中的肌氨酸进行定性、定量时,如现有的尿液检查试纸一样,将检查试纸与标本小便进行反应,从而能够通过肉眼对颜色变化进行确认,由此即使没有专门的人力及高价的装置也能进行前列腺癌诊断。
Description
技术领域
本发明涉及前列腺癌的诊断试纸(teststrip)及利用其的前列腺癌诊断方法,尤其,特征在于提供,利用甲醛(formaldehyde)或过氧化物而诊断前列腺癌的试纸及利用其的前列腺癌诊断方法,所述甲醛或过氧化物是由前列腺癌患者的小便中所包含的肌氨酸(sarcosine)氧化而生成的。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)统计,前列腺癌作为男性发病率较高的癌种,仅次于肺癌、胃癌、肝癌、大肠癌、食道癌排在第六位,在美国,每年约有18万6千人患病,其中约有2万9千名死亡的男性中前列腺癌是最普遍的癌症之一,但此疾病的进展追查较难。典型的诊断根据血液检查和随后的活检(biopsy),所述血液检查找出血液中的被称作前列腺特异抗体(PSA:ProstateSpecificAntigen)的特定蛋白质。
但是现有的前列腺特异抗体的数值在前列腺癌中常常升高,但是这并不能直接表示肿瘤的存在,抗体的数值高并不意味着其恶性程度高。此外,健康的男性血液中也存在微量的前列腺特异抗体,因此通过前列腺特异抗体检查来诊断前列腺癌的可信度降低。
最近美国密歇根大学医科大学的阿鲁尔〃奇纳伊安(ArulChinnaiyan)博士在自然(nature)中表示,根据由前列腺癌细胞所产生的代谢物质肌氨酸在小便中检测出的量,从而能够判断前列腺癌和其是否有向其他器官转移的倾向性。
研究员在尿液中确认了在早期、进行性、转移性前列腺癌患者的小便中探知前列腺癌并区分此疾病的阳性及侵害性形态时所使用的化合物。此外发表,氨基乙酸(aminoacidglycine)的甲基(methylation)化的形态的肌氨酸的浓度在前列腺癌患者的尿液中,尤其当癌细胞有向其他器官扩散的倾向更高时,肌氨酸的浓度表现更高,在现有前列腺癌诊断时,与用作现有诊断指标的前列腺特异抗体相比,肌氨酸的数值更为准确。
利用其来开发出检测小便内的肌氨酸的方法,从而用作前列腺癌的诊断指标的各种尝试正在进行。
现有的方法主要使用高效液相色谱法(HPLC,HighPerformanceLiquidChromatography)和对小便标本进行肌氨酸氧化酶处理后使用分光光度计(spectrophotometer)的方法。两种方法虽然都能够达到定量,但是具有专门技术的特别实验者需要使用高价的装置,并且需要经过将试料进行多个步骤处理的复杂的过程,因此问题在于,使用中带来制约。
现有的关于前列腺癌诊断工具及其方法的先行技术提出如下几种。
2010年6月2日柏林夏洛蒂医科大学(ChariteUniversitatsmedizinBerlin)在日本申请的日本公开专利(2012-529021)中所记载的发明是诊断前列腺癌或其因子的活体外(exvivo)的方法,并且所述方法包括如下步骤:测定疑似患有前列腺癌或疑似携带其因子(disposition)的被实验体的试验样品(sample)的至少一个代谢物质;以及将所述至少一个代谢物质通过其诊断前列腺癌或其因子。所述先行专利包括:代谢物质的收集、包括代谢物质特性值的数据收集、以及包括所述数据收集的贮存媒介。此外,所述先行专利也提供一种系统,所述系统与数据贮存媒介以能够运转的形态连接,并且对样品的代谢物质的特性值进行比较。此外,包括:包括至少一个代谢物质的诊断工具;以及用于制造诊断前列腺癌的诊断工具的代谢物质的使用。
所述先行发明涉及对前列腺癌相关的代谢物质进行分类的方法,并且为了诊断前列腺癌,记载有测定肌氨酸含量的观点。
所述先行发明为了测定小便的肌氨酸含量,而利用已经公知的方法,换句话说,为了测定小便的肌氨酸的直接含量,而利用液相色谱(LC,liquidchromatography)质量分析法及/或气相色谱(GC,gaschromatography)质量分析法。
与此相反,本发明的差别在于,提供利用作为肌氨酸代谢产物的甲醛的前列腺癌诊断试纸及利用其的前列腺癌诊断方法。
此外,1989年8月9日勃林格曼哈因盖尹贝合在韩国申请并登记的“通过酶促氧化(enzymaticoxidation)的标本的比色测定方法及试剂”(登记号:1992-0001449)的相关发明涉及通过标本的酶促氧化的标本的比色测定方法,所述测定方法是,作为在电子受体的存在下通过标本的酶促氧化的标本的比色测定及对标本的量的测定值,通过颜色形成而测定还原的电子受体的方法,其特征在于,在具有作为直接电子受体的+1和-1之间的氧化态的氮的化合物的群组中选择的物质的存在下,通过适当的氧化还原酶标本得到氧化。
所述先行发明因为利用葡萄糖氧化还原酶,所以不同于利用肌氨酸氧化酶的本发明,为了测定标本量,记载有比色测定方法,但是于本发明的根本区别在于,不使用肌氨酸代谢物质。
此外,2006年9月1日贝斯以色列戴克尼斯医疗中心在韩国申请的“子痫前症(pre-eclampsia)或子痫的诊断及治疗方法”(公开号2007-0001991)的相关发明,其涉及利用增加VEGF或PIGF浓度的化合物或减少sFlt-1浓度的化合物来治疗子痫前症或子痫的方法。此外,特征是通过检测sFlt-1、VEGF或PIGF浓度来监控子痫前症或子痫的治疗的方法,此外,特征是通过检测对象体的sFlt-1、VEGF或PIGF浓度来诊断子痫前症或子痫的方法。
所述先行发明记载有为了诊断子痫前症或子痫而检测试料中的VEGF或PIGF浓度的构成,相反地,本发明为了检测用于前列腺癌诊断的肌氨酸含量而利用肌氨酸氧化酶,从而在这一点上构成不同,并且为了疾病的诊断而利用比色试纸法的角度虽然有一部分相似,但不同点是,本发明利用对通过肌氨酸氧化而生成的甲醛进行检测的比色试纸法。
此外,2008年8月15日密他伯顿公司(Metaboton,Inc)申请的“前列腺癌的代谢性能分析(profiling)法”(日本公开专利2010-537170)的相关发明,涉及癌症指标(marker),尤其,提供异常存在于前列腺癌中的代谢产物,并且提供以对癌特异的代谢产物为标的的诊断、研究及治疗用途。
所述先行发明为了诊断前列腺癌而记载有测定肌氨酸含量这一点上虽部分类似,但是为了测定肌氨酸含量而利用肌氨酸氧化酶的内容并没有记载,此点与本发明不同,并且为了测定小便的肌氨酸含量而利用GC-MS(气相色谱/质量分析法,gaschromatography/MassSpectrometer)及UHPLC-MS(超高效液相色谱-质谱法),与此相反,本发明为了检测甲醛而使用比色试纸法,所述甲醛通过肌氨酸氧化而生成。
发明内容
由此,本发明为了解决如上所述的现有诸多问题而提出,本发明的目的在于提供一种试纸及其方法,就所述试纸而言,在对小便中的肌氨酸进行定性、定量时,如现有的尿液检查试纸一样,将检查试纸与标本小便进行反应,从而能够通过肉眼对颜色变化进行确认,由此即使没有专门的人力及高价的装置也能进行前列腺癌诊断。
为了达成所述目的,根据本发明的技术思想的利用作为肌氨酸代谢产物的甲醛的前列腺癌诊断试纸、其制造方法及利用其的前列腺癌诊断方法提供一种前列腺癌诊断试纸,其包括:生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase);以及与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应而执行色原体功能的4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑(AHMT:4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole)。
此外,提供一种前列腺癌诊断试纸,其包括:生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase);以及与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应而执行色原体功能的N-甲基苯并噻唑啉酮-2-腙(MBTH:N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone)。
此外,提供一种前列腺癌诊断试纸制造方法,就前列腺癌诊断试纸制造方法而言,生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶、保持强碱性的缓冲液、与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应从而执行色原体功能的AHMT溶解物中浸渍纤维素试纸后,进行干燥而制造。
此外,提供一种前列腺癌诊断试纸的制造方法,就前列腺癌诊断试纸的制造方法而言,生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶、保持强碱性的缓冲液、与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应从而执行色原体功能的MBTH溶解物中浸渍纤维素试纸后,进行干燥而制造。
此外,优选地,进一步包括使得添加试剂能够得到固定的水溶性聚合物固定体。
此外,优选地,为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合(chelate)化的乙二胺四乙酸(EDTA,Ethylenediaminetetraaceticacid)。
此外,优选地,所述肌氨酸氧化酶的浓度在200~500单位(unit)/dL范围内。
此外,所述缓冲液为1.0~2.0摩尔(mole)浓度,pH在9.0~12.5范围内。
此外,所述溶解物为了对色原体的显色进行突出,还包括酒石黄(Tartrazine)。
此外,提供利用如上所述的前列腺癌诊断试纸来诊断前列腺癌的方法。
此外,根据本发明的又另一个技术思想的利用作为肌氨酸代谢产物的过氧化物的前列腺癌诊断试纸、其制造方法及利用其的前列腺癌诊断方法提供一种前列腺癌诊断试纸,其包括:生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase);以及与所述肌氨酸代谢产物中的过氧化物反应而执行色原体功能的过氧化物色原体;以及执行催化剂功能的过氧化酶(Peroxidase)。
此外,优选地,所述过氧化物色原体为,在3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine);四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine);1,4-苯二胺(1,4-diaminobenzene);1,2-二羟基苯(1,2-dihydroxybenzene);4-氯萘酚(4-chloronapthol);3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole);2,7'-二氨基芴(2,7'-diaminofluorene);N,N'-二甲基乙二胺(N,N'-dimethylethylenediamine);N,N'-双-(4-氨基苯基)-1,3-苯二甲基二胺(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine)中任意一个以上。
此外,优选地,进一步包括使得添加试剂能够得到固定的水溶性聚合物固定体。
此外,优选地,为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合(chelate)化并去除的乙二胺四乙酸(EDTA,Ethylenediaminetetraaceticacid)。
此外,提供一种前列腺癌诊断试纸制造方法,就前列腺癌诊断试纸制造方法而言,将肌氨酸氧化酶及过氧化酶在保持pH7.5~10.0范围的缓冲液中进行溶解,浸渍纤维素试纸后进行干燥。
此外,更为优选地,所述肌氨酸氧化酶的浓度在200~500单位(unit)/dL的范围内。
此外,优选地,所述溶解物进一步包括对试剂进行固定的水溶性聚合物固定体。
此外,所述溶解物为了对色原体的显色进行突出,还包括染料。
此外,优选地,所述溶解物为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合(chelate)化并去除的乙二胺四乙酸。
此外,提供一种利用所述前列腺癌诊断试纸的对前列腺癌进行诊断的方法。
就利用通过本发明的作为肌氨酸代谢产物的甲醛的前列腺癌诊断试纸及利用其的前列腺癌诊断方法而言,在对小便中的肌氨酸进行定性、定量时,不像现有的HPLC方法、分光光度计法一样,具有专门技术的人员在实验室内进行将标本与试剂混合等化学反应后,利用HPLC或分光光度计对其进行分析,因此,具有如下效果:无需专门人力及高价装置,而能够简单地利用为前列腺癌的诊断指标。
附图说明
图1是表示根据本发明的实施例的试纸的外观的构成图。
图2是根据通过本发明第一实施例的PH的肌氨酸氧化酶的活性度变化图。
图3及图4是为了对用于实现本发明第一实施例的实验结果进行说明而用的照片及其图示化图。
图5是根据通过本发明的第二实施例的PH的肌氨酸氧化酶的活性度变化图。
图6及图7是为了对用于实现本发明第二实施例的实验结果进行说明而用的照片及其图示化图。
具体实施方式
参照附图,通过本发明的实施例对利用作为肌氨酸代谢产物的甲醛的前列腺癌诊断试纸及利用其的前列腺癌诊断方法进行详细说明。本发明可以施加各种变更,并且可以具有各种形态,将特定实施例示出于附图,并对本发明进行详细说明。但是这并非是使本发明受到特定提出形态的限定,应该理解为包括本发明的思想及技术范围所包含的全部变更、均等物乃至替代物。说明各个附图时,将类似的参照标号用于类似的构成要素。在附图中,构造物的大小为了本发明的明确性而以比实际放大地示出,或者为了理解概略性的构成而比实际缩小地示出。
此外,第一、第二等的术语在说明各种构成要素时能够使用,但是所述构成要素并非受所述术语限定。所述术语的使用目的只是为了将一个构成要素区别于另一个构成要素。例如,在不脱离本发明的权利范围的同时,可以将第一构成要素命名为第二构成要素,并且相类似地,第二构成要素也可以命名为第一构成要素。另外,只要没有进行另外的定义,包括技术上或科学的术语在内的在此所使用的全部术语与本发明所属技术领域内具有通常知识的人员一般所理解的意思相同。与通常所使用的字典中所定义的相同的术语应理解为具有与相关技术文脉上具有的意思一致的意思,并且只要本申请中没有明确定义,则不可理解为理想化或过度形式化的意义。
以下,针对本发明的第一及第二实施例,参照附图进行详细说明。
首先,本发明的第一实施例所述的利用作为肌氨酸代谢物的甲醛的前列腺癌诊断试纸及利用其的前列腺癌诊断方法,即使没有高价的装置及专门的人力,也能够简单地执行前列腺癌的诊断指标。
在前列腺癌(ProstateCancer)患者的小便中,肌氨酸(Sarcosine)的浓度特异增加的事实收录在2009年所发表的自然(Nature)杂志457号中。
肌氨酸通过肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase)代谢为甘氨酸(Glycine)、过氧化物(H2O2)及甲醛(formaldehyde),通过对生成为肌氨酸的代谢产物的过氧化物和甲醛进行定量检测,由此能够计算出肌氨酸的浓度,并且由此能够作为前列腺癌的诊断指标来使用。所述代谢过程表示为如下【化学式1】。
化学式1
肌氨酸+O2+H2O→甘氨酸+H2O2+甲醛
(通过肌氨酸氧化酶)
以下【化学式2】中表示的反应式利用4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑(4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole)[1750-12-5](以下,称作AHMT。),并且利用所述化学式可对甲醛进行定量。
化学式2
此外,以下【化学式3】中表示的反应式利用了N-甲基苯并噻唑啉酮-2-腙(N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone,以下称作MBTH),也是利用所述化学式可对甲醛进行定量。
化学式3
如所述【化学式1】所示,肌氨酸通过肌氨酸氧化酶,与肌氨酸的浓度成比例地生成过氧化物和甲醛。对此时的肌氨酸氧化酶的活性带来影响的因子有缓冲液(BufferSolution)的pH、浓度及反应温度等。
此时的反应温度是室温即足够,并且优选地,缓冲液的浓度大概为1~2摩尔(mole)浓度,pH为8~9.5。
此外,缓冲液可以使用三甲醇氨基甲烷(Tris)、磷酸盐(Phosphate)、柠檬酸盐(Citrate)、硼酸盐(Borate)等。
通过肌氨酸氧化酶所生成的甲醛,如所述【化学式2】所示,与4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑(4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole;以下称作AHMT),如所述【化学式3】所示,与N-甲基苯并噻唑啉酮-2-腙(N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone;以下称作MBTH)等的色原体通过化学反应来形成色络合物。所述色络合物能够通过肉眼轻易识别。由此,如果能够制造利用如上反应式的试纸,则能够轻易实现前列腺癌的诊断。
此时,当是类似于蓝色等不能被眼睛轻易识别的颜色时也可以使用额外的方法,即,利用黄色颜料等将底色制成黄色,由此以绿色、青绿色等进行显色,以便使得显色的倾向相比蓝色颜色更突出。由此为了能够通过肉眼轻易地识别,在进行颜色处理的物质中存在多种,酒石黄(Tartrazine)在本实施例中得到使用。
另外,如果制作为纤维素(cellulose)试纸,则可以添加表面活性剂及水溶性聚合物固定体,所述表面活性剂用于使得小便能够轻易被试纸吸收,所述水溶性聚合物固定体用于使得所添加的试剂能够固定于所述纤维素试纸。
所述AHMT或MBTH与甲醛的反应在强碱性(alkaline)环境下进行反应。
此时的反应依赖于pH,并且如【图2】所示,最小pH需要为9.0以上才能使得如【化学式2】所示的反应进行。或,使得如【化学式3】所示的反应得到进行,从而形成青色络合物,进而可通过试纸的颜色变化来通过肉眼进行确认。
比色试纸法的情况,也考虑到使得试纸浸入苛刻的pH条件的试料中,从而制造1.5摩尔浓度的硼酸盐-氢氧化钠pH9.5~12溶液,进而用作缓冲液。在本实施例中虽然使用了硼酸盐-氢氧化钠,但是如果保持充分的强碱性,则使用其他的缓冲溶液也无妨。如果,pH低于其时,不发生反应,并且高于其时,此后在浸渍纤维素试纸时,由于溶液的强碱性,试纸被破坏而无法浸渍。
考虑到对肌氨酸氧化酶试纸进行热干燥时的酶活性降低,从而需要向缓冲液添加肌氨酸氧化酶200~500单位(unit)/dL的过量的酶。如果此时肌氨酸氧化酶的量较少,则试纸的干燥过程中酶的活性降低,从而无法具备充分的反应性,并且如果添加量多,则不仅会造成费用的增加,而且会导致自然变色。
如以下【表1】所示,肌氨酸氧化酶通过金属离子而使得其活性受到较大影响,试料中必然存在金属离子,因此为了通过将其螯合(chelate)化来防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性降低,从而添加EDTA0.01~0.02g/dL。此时,EDTA的情况,添加量较少时,则无法充分地去除金属离子,相反地,量较多时,反而使得发色反应降低。本实施例中使用了EDTA4NA,也可以使用能够对金属离子进行螯合化的其他物质。此后,作为色原体溶解AHMT20~50mM。此时,试剂的添加量较少时中浓度、高浓度的标本上没有显色差异,并且相反地,添加量较多时,自然状态下发生变色,从而引发产品的变质或假阳性。
表1
浸渍纤维素试纸后,去除过量的试剂后,在70~80℃下进行干燥30分钟。
此后在试纸上粘贴两面胶(tape)并切断,固定于支撑体后进行成型,从而制造成类似于【图1】的形态,并且因为制造后对湿气敏感,从而与除湿剂共同保管于密封较好的盒子中,并在需要时进行使用。
【图3】是利用通过如上方法而制造的试纸,为了诊断前列腺癌而进行的实验结果,【图4】是将其进行图示化的图,以一个试纸条(strip)为基准,为白色、浅橙色、黄色或紫色时,最上方白色用于确认试料的底色,是不做任何处理的白色试纸,第二排浅橙色试纸是用于确认尿液的稀释程度的试纸。从左侧开始是利用负(Negative)、1000、2000、4000nM中的AHMT,从而利用甲醛的肌氨酸检测反应照片。(变化为黄色、紫色的试纸)
以下,对本发明的第二实施例进行详细说明。
根据本发明的第二实施例,利用作为肌氨酸代谢产物的过氧化物的前列腺癌诊断试纸及利用其的前列腺癌诊断方法,即使没有高价的装置及专门人力也能够简单地进行前列腺癌的诊断指标。
前列腺癌(ProstateCancer)患者的小便中肌氨酸(Sarcosine)的浓度特异地增加的事实收录在2009年所发表的自然(Nature)杂志457号中。
换句话说,肌氨酸通过肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase)代谢为甘氨酸(Glycine)、过氧化物(H2O2)及甲醛(formaldehyde),通过对生成为肌氨酸的代谢产物的过氧化物和甲醛进行定量检测,由此能够计算出肌氨酸的浓度,并且由此能够作为前列腺癌的诊断指标来使用。所述代谢过程表示为如下【化学式4】。
化学式4
另外,现有的对过氧化物进行定量的方法有如下【化学式5】所示的方法,且广为人知。
化学式5
如果构成为,利用以上【化学式4】和【化学式5】,从而在试纸上进行以下【化学式6】的反应式,则通过比色试纸反应能够对肌氨酸的浓度进行定量。利用所述方法是本发明的基本技术内容。
化学式6
如以上的【化学式4】所示,肌氨酸通过肌氨酸氧化酶而与肌氨酸的浓度成比例地生成过氧化物和甲醛。对此时的肌氨酸氧化酶的活性带来影响的因子有缓冲液(BufferSolution)的pH、浓度及反应温度等。
此时的反应温度是室温即足够,并且优选地,缓冲液的浓度为大概1~2摩尔(mole)浓度,pH为8~9.5。
此外,缓冲液可以使用三甲醇氨基甲烷(Tris)、磷酸盐(Phosphate)、柠檬酸盐(Citrate)、硼酸盐(Borate)等。
对通过肌氨酸氧化酶所生成的过氧化物脱氢化反应进行催化的过氧化酶(Peroxidase)在所述【化学式6】中具体表达其过程,并且添加肌氨酸氧化酶的50~80%左右的活性度程度的量即充分。接下来诸如3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine);四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine);1,4-苯二胺(1,4-diaminobenzene);1,2-二羟基苯(1,2-dihydroxybenzene);4-氯萘酚(4-chloronapthol);3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole);2,7'-二氨基芴(2,7'-diaminofluorene);N,N'-二甲基乙二胺(N,N'-dimethylethylenediamine);N,N'-双-(4-氨基苯基)-1,3-苯二甲基二胺(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine)等的过氧化物色原体被氧化,从而具有一定的颜色。
此时,当是类似于蓝色等不容易被眼睛识别的颜色时,也可以使用额外的方法,即,通过利用黄色染料等从而将底色制成黄色,从而显色的倾向不是蓝色,而是以绿色、青绿色等突出地进行显色。
此外,也可以还添加表面活性剂,以便使得小便能够轻易被试纸吸收,并且也可以添加固定体(一般利用水溶性聚合物),所述固定体用于使得所添加的试剂能够固定于纤维素试纸。
另外,肌氨酸氧化酶和过氧化酶两种酶同时使用时,由于各个酶的pH稳定性的差异,需将浸渍溶液分两次进行制造。
如【图5】所示,肌氨酸氧化酶的情况,在pH8.0时具有最大活性度,并且普通分光光度计法的情况,缓冲液的浓度为0.05~0.1摩尔浓度,pH7.5~8.5即充分。本发明为比色试纸法,因为将制造的试纸浸入试料并取出,所以苛刻地露出于试料的酸性pH等。为了克服此时的苛刻露出,就一次溶液的缓冲液而言,制造并使用1.0~2.0摩尔浓度的硼酸盐-氢氧化钠pH9.5~12溶液。
此后考虑到将试纸浸渍于配置的溶液后,将试纸进行热干燥时的酶活性度降低,从而需要添加肌氨酸氧化酶200~500单位(unit)/dL的过量酶。如果此时肌氨酸氧化酶的量较少,则试纸的干燥过程中酶的活性降低,从而无法具备充分的反应性,并且如果添加量多,则不仅造成费用的增加,而且会导致自然变色。
为了使得添加的试剂能够固定于纤维素试纸,而添加水溶性聚合物,聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrrolidine)1.0~2.0gdL,此时当添加量较少时,则试剂不能固定于试纸,从而将完成的试纸浸入试料时,试剂涌出而造成颜色污染,并且当量较多时,即便是水溶性聚合物也会影响试料的吸收。
将四甲基联苯胺用作色原体时,显色以青色系列呈现,当是浅青色时,通过肉眼无法轻易地确认其差异。因为所述理由,将黄色用作底色,从而进行青色系列的显色时,通过黄色底与青色的混色使得显色显示为绿色系列,由此易于肉眼确认,为此,使用酒石黄0.05~0.1g/dL。此时,酒石黄如果使用量较少,则被试料本来的颜色埋没,从而显示青色系列而不是绿色系列,并且如果使用量较多,则通过微量的肌氨酸的浅青色反应被浓的黄色埋没而显示出假阴性的结果。
如以下的【表2】所示,肌氨酸氧化酶通过金属离子其活性得到较大影响,当试料中金属离子过量存在时,对其进行螯合(chelate)化并去除,从而防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,为此,添加EDTA0.01~0.02g/dL。换句话说,EDTA起到金属吸附剂的作用,这是为了使得酶的活性化顺利实现。在本实施例中,使用了EDTA4NA,也可以使用能够对金属离子进行螯合化的其他物质。另外,EDTA的情况,添加量较少时,无法充分去除金属离子,并且相反地当量较多时,反而降低显色反应。
表2
如果试剂充分溶解,则浸渍纤维素试纸后,过量的试剂被去除后。在70~80℃下进行30分钟干燥。
二次溶液为了对过氧化酶进行稳定的固定,在0.5~1.0摩尔浓度的硼酸盐-盐酸pH6.0~7.0缓冲液的基础上溶解过氧化酶100~200单位(unit)/dL、四甲基联苯胺20毫摩尔(mM)浓度。此时,试剂的添加量较少时,在中浓度、高浓度的标本中不存在显色差异,并且相反地,添加量较多时,自然状态下变色,从而造成产品的变质或假阳性的结果。
试剂得到充分溶解时,将浸渍于前述的一次溶液后干燥的试纸再次浸渍于二次溶液,从而在70~80℃下进行30分钟干燥。
此后在试纸上粘贴两面胶并切断,从而固定于支撑体后进行成型,从而制造成类似于【图1】的形态,并且因为此结果物对湿气敏感,从而与除湿剂共同保管于密封较好的盒子中,并在需要时进行使用。
【图6】是利用通过如上方法制造的试纸,为了诊断前列腺癌而进行的实验结果,【图7】是将其进行明确图示化的图,从左侧开始是利用负(Negative)、1000、2000、4000nM中的四甲基联苯胺时,利用过氧化酶的肌氨酸检测反应照片。
以上对本发明的优选实施例进行了说明,但是本发明可以使用各种变化和变更及均等物。本发明明确的是,可以对所述实施例进行适当的变形而得到相同的使用。因此本发明的范围不受所述记载的内容的限定,而是通过以下权利要求范围的界限来决定。
Claims (22)
1.一种前列腺癌诊断试纸,其特征在于,包括:
生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase);以及
与肌氨酸氧化而生成的甲醛进行反应而执行色原体功能的4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑(AHMT)。
2.一种前列腺癌诊断试纸,其特征在于,包括:
生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase);以及
与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应而执行色原体功能的N-甲基苯并噻唑啉酮-2-腙(MBTH)。
3.根据权利要求1或2中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸,其特征在于,
进一步包括使得添加试剂能够得到固定的水溶性聚合物固定体。
4.根据权利要求1或2中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸,其特征在于,
为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合化而加以去除的乙二胺四乙酸(EDTA)。
5.一种前列腺癌诊断试纸的制造方法,其涉及前列腺癌诊断试纸的制造方法,在生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶、保持强碱性的缓冲液、与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应从而执行色原体功能的AHMT溶解物中浸渍纤维素试纸后,进行干燥而制造。
6.一种前列腺癌诊断试纸的制造方法,其涉及前列腺癌诊断试纸的制造方法,在生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶、保持强碱性的缓冲液、与肌氨酸被氧化而生成的甲醛进行反应从而执行色原体功能的MBTH溶解物中浸渍纤维素试纸后,进行干燥而制造。
7.根据权利要求5或6中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述肌氨酸氧化酶的浓度在200~500单位(unit)/dL范围内。
8.根据权利要求5或6中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述缓冲液为1.0~2.0摩尔浓度,pH在9.0~12.5范围内。
9.根据权利要求5或6中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述溶解物还包括对试剂进行固定的水溶性聚合物固定体。
10.根据权利要求5或6中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述溶解物为了使色原体的显色突出,进一步包括酒石黄。
11.根据权利要求5或6中任意一项所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述溶解物为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合化的乙二胺四乙酸(EDTA)。
12.一种诊断前列腺癌的方法,其利用权利要求1至6中任意一项的前列腺癌诊断试纸。
13.一种前列腺癌诊断试纸,其特征在于,包括:
生成肌氨酸代谢产物的肌氨酸氧化酶(SarcosineOxidase);
与所述肌氨酸代谢产物中的过氧化物反应而执行色原体功能的过氧化物色原体;以及
执行催化剂功能的过氧化酶(Peroxidase)。
14.根据权利要求13所述的前列腺癌诊断试纸,其特征在于,
所述过氧化物色原体为,在3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine);四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine);1,4-苯二胺(1,4-diaminobenzene);1,2-二羟基苯(1,2-dihydroxybenzene);4-氯萘酚(4-chloronapthol);3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole);2,7'-二氨基芴(2,7'-diaminofluorene);N,N'-二甲基乙二胺(N,N'-dimethylethylenediamine);N,N'-双-(4-氨基苯基)-1,3-苯二甲基二胺(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine)中的任意一个以上。
15.根据权利要求13所述的前列腺癌诊断试纸,其特征在于,
进一步包括使得添加试剂能够得到固定的水溶性聚合物固定体。
16.根据权利要求13所述的前列腺癌诊断试纸,其特征在于,
为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合化而去除的乙二胺四乙酸(EDTA)。
17.一种前列腺癌诊断试纸的制造方法,其涉及前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
将肌氨酸氧化酶及过氧化酶在保持pH7.5~10.0范围的缓冲液中进行溶解,并浸渍纤维素试纸后进行干燥。
18.根据权利要求17所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述肌氨酸氧化酶的浓度在200~500单位(unit)/dL的范围内。
19.根据权利要求17所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述溶解物进一步包括对试剂进行固定的水溶性聚合物固定体。
20.根据权利要求17所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述溶解物为了对色原体的显色进行突出,还包括染料。
21.根据权利要求17所述的前列腺癌诊断试纸的制造方法,其特征在于,
所述溶解物为了防止金属离子导致的肌氨酸氧化酶的活性度降低,进一步包括对所述金属离子进行螯合化的乙二胺四乙酸(EDTA)。
22.一种诊断前列腺癌的方法,其利用权利要求13至16中任意一项的前列腺癌诊断试纸。
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