WO2015050366A1 - 사르코신 대사산물 중 포름알데히드 또는 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법 - Google Patents

사르코신 대사산물 중 포름알데히드 또는 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법 Download PDF

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    • G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • G01N2333/90672—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general
    • G01N2333/90677—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general with a definite EC number (1.5.3.-)
    • G01N2333/90683—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
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    • G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Definitions

  • the present invention relates to a prostate cancer diagnostic test paper and a method for diagnosing prostate cancer using the same, and in particular, a test paper for diagnosing prostate cancer using formaldehyde or peroxide, which is produced by oxidizing sarcosine contained in the urine of a prostate cancer patient, and using the same It is characterized by providing a method for diagnosing prostate cancer.
  • prostate cancer is the sixth most common cancer in men after lung cancer, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, and esophageal cancer. It is one of the most commonly diagnosed cancers among men dying 97,000, but it is difficult to track the development of the disease.
  • a typical diagnosis relies on a blood test to find a specific protein called Prostate Specific Antigen (PSA) in the blood followed by a biopsy.
  • PSA Prostate Specific Antigen
  • prostate-specific antibodies are often elevated in prostate cancer, this does not indicate the presence of a direct tumor, and the high levels of antibodies do not mean their malignancy.
  • the presence of trace amounts of prostate-specific antibodies in the blood of healthy men has been a reason to lower the reliability of prostate cancer diagnosis through prostate-specific antibody tests.
  • concentration of sarcosine a methylated form of the amino acid glycine
  • the existing prostate cancer diagnostic means and some prior arts related to the method are as follows.
  • the invention described in Japanese Laid-Open Patent Application (2012-529021), filed on June 2, 2010 by Charite Universitats Kunststoff Berlin, is an ex vivo method for diagnosing prostate cancer or its predisposition. Measuring at least one metabolite of only a test sample of a subject suspected of having it and diagnosing prostate cancer or its predisposition by the at least one metabolite.
  • the preceding patents include the collection of metabolites, data collection including characteristic values of metabolites, and storage media including the data collection.
  • the prior art also provides a system for comparing the characteristic values of the metabolite of the sample, which is connected in a form capable of operating with the data storage medium. It also includes the use of one metabolite to prepare a diagnostic means comprising at least one metabolite and a diagnostic means for diagnosing prostate cancer.
  • This prior art relates to a method of classifying metabolites related to prostate cancer, and it is described that the sarcosine content is measured to diagnose prostate cancer.
  • LC liquid chromatography
  • GC gas chromatography
  • the present invention is different in that it provides a prostate cancer diagnostic test paper using formaldehyde, a sarcosine metabolite, and a prostate cancer diagnostic method using the same.
  • the invention relating to "a colorimetric measurement method and reagent of a sample by enzymatic oxidation" (registered number 1992-0001449), filed and filed in South Korea on August 9, 1989, by Boehringer Mannheim GmbH.
  • the method for measuring the colorimetric measurement of a sample by enzymatic oxidation of the sample in the presence and the amount of the sample the method of measuring the electron acceptor reduced by color formation, the oxidation step between +1 and -1 as a direct electron acceptor
  • It relates to a colorimetric measurement method of a sample by enzymatic oxidation of the sample, characterized in that the sample is oxidized by an appropriate redox enzyme in the presence of a substance selected from the group of compounds having nitrogen.
  • the preceding invention is different from the present invention using sarcosine oxidase because it uses glucose oxidoreductase, and although a colorimetric measuring method is described for measuring the sample amount, it does not basically use a sarcosine metabolite. There is a difference from the present invention in that it does not.
  • the invention regarding a method for diagnosing and treating preeclampsia or eclampsia discloses a compound for increasing the concentration of VEGF or PlGF or
  • the present invention relates to a method for treating preeclampsia or eclampsia using a compound that reduces the sF1t-1 concentration. It also features a method of monitoring preeclampsia or preeclampsia by detecting sF1t-1, VEGF, or PlGF levels. Also characterized by a method of diagnosing preeclampsia or eclampsia by detecting sF1t-1, VEGF, or PlGF levels in a subject.
  • the present invention uses sarcosine oxidase to detect sarcosine content for prostate cancer diagnosis.
  • the configuration is different, the use of colorimetric assays for the diagnosis of disease is somewhat similar, but the present invention differs in that it uses colorimetric assays for detecting formaldehyde produced by sarcosine oxidation.
  • the invention relating to the metabolic profiling method of prostate cancer (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-537170), filed by Metaboton, Inc. on August 15, 2008, relates to a cancer marker, in particular, ideally present in prostate cancer. Metabolites are provided, and diagnostic, research, and therapeutic uses are targeted to cancer-specific metabolites.
  • the preceding invention is somewhat similar in that it is described in terms of measuring sarcosine content for diagnosing prostate cancer, but differs from the present invention in that it does not describe the use of sarcosine oxidase to measure sarcosine content, urine GC-MS (Gas Chromatography / Mass Spectrometry) and UHPLC-MS (Ultra High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry) are used to determine the sarcosine content of the present invention, whereas the present invention uses formaldehyde produced by sarcosine oxidation. It is different in that it uses a colorimetric test paper to detect.
  • the present invention has been proposed to solve the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to qualitatively and quantify sarcosine in urine. By visually confirming the visual acuity, it is to provide a test paper and a method for diagnosing prostate cancer without specialists and expensive equipment.
  • prostate cancer diagnostic test paper using formaldehyde which is a sarcosine metabolite according to the technical idea of the present invention, a manufacturing method thereof, and a prostate cancer diagnostic method using the same, sarcosine for generating a sarcosine metabolite Sarcosine Oxidase; And 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (AHMT: 4-Amino-3-hydrazino, which functions as a color source by reacting with formaldehyde produced by oxidation of sarcosine). -5-mercapto-1,2,4-triazole);
  • AHMT 4-amino-3-hydrazino, which functions as a color source by reacting with formaldehyde produced by oxidation of sarcosine.
  • a prostate cancer diagnostic test paper comprising a.
  • N-methylbenzothiazolion-2-hydrazone N-methylbenzothiszolinone-2-hydrazone
  • a prostate cancer diagnostic test paper comprising a.
  • sarcosine oxidase that produces sarcosine metabolites
  • buffers for maintaining strong alkalinity and AHMT lysate that functions as a color source by reacting with formaldehyde produced by oxidizing sarcosine
  • AHMT lysate that functions as a color source by reacting with formaldehyde produced by oxidizing sarcosine
  • sarcosine oxidase that produces sarcosine metabolites, buffers that maintain strong alkalinity, and sarcocin are oxidized to MBTH lysate that functions as a color source by reacting with formaldehyde produced by oxidation.
  • a method for preparing a prostate cancer diagnostic test paper prepared by dipping and drying a cellulose test paper.
  • a water-soluble polymer fixture to allow the addition reagents to be fixed; It is preferable to further include.
  • EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
  • the concentration of sarcosine oxidase is preferably in the range of 200 ⁇ 500 unit / dL.
  • the buffer is preferably 1.0 to 2.0 molarity, pH 9.0 to 12.5 range.
  • the lysate further contains tatrazine in order to increase the color development of the color source.
  • a prostate cancer diagnostic test paper using a peroxide, a sarcosine metabolite, a preparation method thereof, and a prostate cancer diagnostic method using the same are sarcosine oxidases that produce sarcosine metabolites. ; Peroxide colorants that function as colorants by reacting with peroxides in the sarcosine metabolite; And peroxidase, which functions as a catalyst; It provides a prostate cancer diagnostic test paper comprising a.
  • the peroxide color source 3,3'-diaminobenzidine (3,3'-diaminobenzidine); 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-diaminobenzene (1,4-diaminobenzene); 1,2-dihydroxybenzene; 4-chloronapthol; 3-amino-9-ethylcarbazole; 2,7'-diaminofluorene; N, N'-dimethylethylenediamine; N, N'-bis- (4-aminophenyl) -1,3-xylenediamine (N, N'-bis- (4-aminophenyl) -1,3-xylylenediamine); It is more preferable that it is at least one of them.
  • a water-soluble polymer fixture to allow the addition reagents to be fixed; It is preferable to further include.
  • EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
  • EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
  • the method for producing prostate cancer diagnostic test paper which is characterized by dissolving sarcosine oxidase and peroxidase in a buffer maintained at a pH of 7.5 to 10.0, immersing the cellulose test paper and then drying. Is provided.
  • the concentration of the sarcosine oxidase is more preferably in the range of 200 ⁇ 500 unit / dL.
  • the lysate preferably further comprises a water-soluble polymer fixture for fixing the reagents.
  • the lysate further contains a dye in order to increase the color development of the color source.
  • the lysate preferably further comprises EDTA for chelation of the metal ion in order to prevent the inhibition of the activity of sarcosine oxidase by the metal ion.
  • the prostate cancer diagnostic test paper using formaldehyde, a sarcosine metabolite according to the present invention, and the prostate cancer diagnostic method using the same have the same expertise as conventional HPLC method and spectrophotometer method in qualitative and quantifying sarcosine in urine. After chemical reactions such as mixing samples and reagents in an in-house laboratory, it is possible to use them as diagnostic indicators of prostate cancer simply without the need for specialized personnel and expensive equipment, such as analyzing them using HPCL or spectrophotometer. There is.
  • FIG. 1 is a block diagram showing the appearance of a test paper according to embodiments of the present invention
  • Figure 2 is a change in the activity of sarcosine oxidase according to the pH according to the first embodiment of the present invention.
  • 3 and 4 are photographs for explaining the experimental results for the implementation of the first embodiment of the present invention and a diagram illustrating them.
  • FIG. 6 Mi 7 is a photograph for explaining the experimental results for the implementation of the second embodiment of the present invention and a diagram illustrating the same.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • the first component may be referred to as the second component, and similarly, the second component may also be referred to as the first component.
  • all terms used herein, including technical or scientific terms have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Terms such as those defined in the commonly used dictionaries should be construed as having meanings consistent with the meanings in the context of the related art and shall not be construed in ideal or excessively formal meanings unless expressly defined in this application. Do not.
  • a prostate cancer diagnostic test paper using formaldehyde, a sarcosine metabolite according to the first embodiment of the present invention, and a prostate cancer diagnostic method using the same can easily perform diagnostic indicators of prostate cancer without expensive equipment and specialists. To be.
  • Sarcosine is metabolized to Glycine, Peroxide (H 2 O 2 ) and Formaldehyde by Sarcosine Oxidase. By doing so, it is possible to calculate the concentration of sarcosine, which can be used as a diagnostic indicator of prostate cancer.
  • This metabolic process is represented by the following [Formula 1].
  • Sarcosine generates peroxide and formaldehyde in proportion to the concentration of sarcosine by sarcosine oxidase as shown in [Formula 1].
  • Factors affecting the activity of sarcosine oxidase at this time include the pH and concentration of the buffer (Buffer Solution), the reaction temperature and the like.
  • the reaction temperature at this time is sufficient if it is room temperature, the concentration of the buffer is approximately 1 to 2 molar concentration, the pH is preferably 8 to 9.5.
  • Tris Tris, Phosphate, Citrate, Borate, and the like can be used as the buffer.
  • Formaldehyde produced by sarcosine oxidase is 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole as described in [Formula 2] (4-Amino-3-hydrazino- 5-mercapto-1,2,4-triazole; hereinafter referred to as AHMT) and N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone (hereinafter referred to as [Formula 3]) below MBTH
  • AHMT 4-Amino-3-hydrazino- 5-mercapto-1,2,4-triazole
  • [Formula 3] N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone
  • the yellow color may be used to make the background color yellow, and an additional method may be used in which the color tends to be colored green or cyan so that the color tends to be more dull than blue. have.
  • an additional method may be used in which the color tends to be colored green or cyan so that the color tends to be more dull than blue.
  • tatrazine was used in this embodiment.
  • a water-soluble polymer fixture may be added to allow the surfactant to be easily absorbed into the test paper and the reagents added to the cellulose test paper.
  • the reaction is dependent on the pH, as shown in [Fig. 2] should be at least pH 9.0 or more to the reaction as shown in [Formula 2] to form a purple complex.
  • the reaction as described in [Formula 3] proceeds to form a blue complex to be visually confirmed through the color change of the test paper.
  • a solution of 1.5 mol of borate-sodium hydroxide pH 9.5-12 is prepared and used as a buffer in consideration of the test paper being immersed in the sample under severe pH conditions.
  • borate-sodium hydroxide was used, but other buffer solutions may be used if strong alkalinity is sufficiently maintained. If the pH is lower than this, no reaction occurs. If the pH is higher than this, the test paper is destroyed due to the strong alkalinity of the solution when immersing the cellulose test paper.
  • the activity of sarcosine oxidase is greatly influenced by metal ions, and since metal ions are inevitably present in the sample, chelation of the sarcosine oxidase reduces the activity of sarcosine oxidase by metal ions.
  • add 0.01 to 0.02 g / dL of EDTA 0.01 to 0.02 g / dL of EDTA.
  • the addition amount is insufficient to remove the metal ions, on the contrary, when the amount is large, the color reaction is lowered.
  • EDTA4NA was used, but other materials that can chelate metal ions may be used.
  • FIG. 3 is an experimental result for diagnosing prostate cancer using test paper prepared by the above method
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the prostate cancer.
  • FIG. 4 shows white, pale orange, yellow or purple on the basis of one strip.
  • the top white is a white test paper that has not been treated to determine the background color of the sample; for the second pale orange test paper, the test paper is used to check the degree of dilution of the urine.
  • It is a photograph of sarcosine detection reaction using formaldehyde using AHMT at Negative, 1000, 2000, 4000 nM from the left. (Test paper changed to yellow and purple)
  • Prostate cancer diagnostic test paper using peroxide, a sarcosine metabolite according to a second embodiment of the present invention, and a prostate cancer diagnostic method using the same it is possible to easily perform the diagnostic indicators of prostate cancer without expensive equipment and professional personnel. .
  • sarcosine is metabolized by Glycine, Peroxide (H 2 O 2 ) and Formaldehyde by Sarcosine Oxidase.
  • Glycine Peroxide (H 2 O 2 )
  • Formaldehyde by Sarcosine Oxidase.
  • Sarcosine generates peroxide and formaldehyde in proportion to the concentration of sarcosine by sarcosine oxidase as shown in [Formula 4].
  • Factors affecting the activity of sarcosine oxidase at this time include the pH and concentration of the buffer (Buffer Solution), the reaction temperature and the like.
  • the reaction temperature at this time is sufficient if it is room temperature, the concentration of the buffer is approximately 1 to 2 molar concentration, the pH is preferably 8 to 9.5.
  • Tris Tris, Phosphate, Citrate, Borate, and the like can be used as the buffer.
  • Peroxidase catalyzing the peroxide dehydrogenation reaction generated by sarcosine oxidase is represented in the formula [6] specifically, the activity of about 50 to 80% of the sarcosine oxidase It is enough to add the amount.
  • the yellow color may be used to make the background color yellow, and an additional method may be used in which the color development tends to be green or cyan instead of blue.
  • a surfactant may be added to allow urine to be readily absorbed into the test paper, and a fixture (usually using a water soluble polymer) may be added to allow the addition reagents to be fixed to the cellulose test paper.
  • the dipping solution must be prepared in two separate portions.
  • the concentration of the buffer is 0.05 ⁇ 0.1 molar concentration, pH 7.5 ⁇ 8.5 is sufficient.
  • the test paper prepared by the colorimetric test paper method is immersed in the sample and exposed to the acidic pH of the sample.
  • the buffer of the primary solution is used to prepare a solution of borate-sodium hydroxide pH 8.0-9.5, 1.0 to 2.0 molarity.
  • an excess enzyme of 200-500 unit / dL of sarcosine oxidase should be added in consideration of the diminished enzyme activity when the test paper is immersed in the preparation solution and then thermally dried. If the amount of sarcosine oxidase is small at this time, the activity of the enzyme decreases during the drying process of the test paper, so that it may not have sufficient reactivity. If the amount is large, it may cause not only an increase in cost but also natural discoloration.
  • a water-soluble polymer polyvinylpyrrolidine 1.0-2.0 g / dL, is added so that the reagents to be added to the cellulose test paper can be fixed.When the addition amount is small, the reagent is not fixed to the test paper so that the reagents are dipped into the sample. This elution results in color contamination, and high amounts can interfere with the absorption of the sample, even with water-soluble polymers.
  • the activity of sarcosine oxidase is greatly influenced by metal ions. If excess metal ions are present in the sample, chelating them and removing them reduces the activity of sarcosine oxidase by metal ions. To prevent this, add 0.01 to 0.02 g / dL of EDTA. In other words, EDTA is to act as a metal adsorbent, so that the enzyme is activated well. In this embodiment, EDTA4NA was used, but other materials that can chelate metal ions may be used. On the other hand, in the case of EDTA, the addition amount is insufficient to remove the metal ions, on the contrary, when the amount is large, the color reaction is lowered.
  • the cellulose test paper is immersed, and the excess reagent is dried for 30 minutes at 70 to 80 ° C after removal.
  • the secondary solution is based on 0.5-1.0 molar concentration of borate-hydrochloric acid pH 6.0-7.0 buffer so that the peroxidase can be immobilized safely. 100-200 unit / dL, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine Dissolve 20 mmol (mM) concentration. At this time, if the amount of reagent is small, there is no color difference in medium and high concentration samples. On the contrary, the amount of reagent is discolored in natural state, resulting in deterioration or false positive of the product.
  • the first test solution is immersed and dried again in the second solution and dried for 30 minutes at 70 ⁇ 80 °C.
  • FIG. 6 is an experimental result for diagnosing prostate cancer using test paper prepared by the above method
  • FIG. 7 is an illustrated view for clearly expressing this, from left to right, Negative, 1000, 2000, 4000 nM It is a photograph of sarcosine detection reaction using peroxidase when 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used.

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Abstract

본 발명은 사르코신 대사산물인 포름알데히드 또는 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법에 관한 것으로, 기존의 분광광도계 등을 이용하는 방법보다 더 간편하고 신속하게 전립선암을 진단할 수 있는 것으로, 소변 중의 사르코신을 정성, 정량함에 있어서 기존의 요검사 시험지와 같이 검사 시험지를 검체 소변에 반응시켜서 색변화를 육안으로 확인할 수 있도록 함으로써, 전문인력 및 고가의 장비없이도 전립선암을 진단할 수 있는 시험지 및 그 방법을 제공한다.

Description

사르코신 대사산물 중 포름알데히드 또는 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법
본 발명은 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법에 관한 것으로, 특히, 전립선암 환자의 소변에 포함되는 사르코신이 산화되어 생성되는 포름알데히드 또는 과산화물을 이용하여 전립선암을 진단하는 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
세계보건기구(WHO)에 따르면 전립선암은 남성의 경우 페암, 위암, 간암, 대장암, 식도암 다음 6번째로 발생 빈도가 높은 암으로 미국에서는 매년 약 18만6천명의 환자가 발생해 이중 약 2만9천명이 사망하는 남성들 중에 가장 일반적으로 진단되는 암 중의 하나이나, 그 질환의 발달을 추적하기가 어렵다. 전형적인 진단은 혈액중의 전립선 특이항체 (PSA : Prostate Specific Antigen)라 불리우는 특정한 단백질을 찾는 혈액 검사와 이후에 뒤따르는 생검에 의존한다.
그러나 기존의 전립선 특이 항체의 수치는 전립선암에서 종종 높아지지만 이것이 직접적인 종양의 존재를 보여주는 것은 아니며, 항체의 수치가 높다고 하여 그 악성도를 의미하는 것은 아니다. 또한 건강한 남성의 혈액속에도 미량의 전립선 특이항체가 존재하는 것도 전립선 특이항체 검사를 통한 전립선암 진단의 신뢰도를 낮추는 이유가 되어왔다.
최근 미국 미시간대학 의과대학의 아룰 치나이얀 박사는 네이쳐에서 전립선암세포에서 만들어지는 대사물질 사르코신이 소변에서 얼마나 검출되느냐에 따라 전립선암과 그 다른 기관들로 퍼지려는 경향성 여부를 판단할 수 있다고 밝혔다.
연구자들은 초기단계, 진행성, 전이성 전립선암 환자들의 소변에서 전립선암을 탐지하고, 그 질병의 양성 및 침해성 형태를 구분하는데 사용될 수 있는 화합물을 뇨에서 확인하였다. 또한, 아미노산 글리신의 메틸화된 형태인 사르코신의 농도는 전립선암 환자들의 뇨에서 특히 암세포들이 다른 기관들로 퍼지는 경향이 더 클 때 사르코신의 농도가 더 높게 나타난다는 사실을 발표하였고, 기존의 전립선암의 진단시 현재 진단지표로 사용되고 있는 전립선 특이항체보다 사르코신의 수치가 더 정확하다는 사실을 발표하였다.
이를 이용해 소변내의 사르코신을 검출하는 방법을 개발하여 전립선암의 진단지표로 사용하고자 하는 다양한 시도가 이루어지고 있다.
기존의 방법은 HPLC법과 소변 검체에 사르코신 산화효소를 처리 후 분광광도계를 사용하는 방법이 주로 사용된다. 두 방법 모두 정량까지 가능하나, 전문적인 기술을 가진 특별한 시험자가 고가의 장비를 이용해야 하며 시료를 여러 단계에 걸쳐 처리해야 하는 복잡한 과정을 거쳐야 하므로 사용에 제약이 따르는 문제점이 있다.
기존의 전립선암 진단 수단 및 그 방법에 관한 선행기술들을 몇가지 제시하면 다음과 같다.
2010년 6월 2일 Charite Universitatsmedizin Berlin이 일본국에 출원한 일본공개특허(2012-529021)에 기재된 발명은 전립선암 또는 그 소인을 진단하는 ex vivo의 방법이며, 전립선암을 앓든가 또는 그 소인을 가진다고 의심되는 피험체의 시험 샘플만의 적어도 1개의 대사 물질을 측정하는 스텝 및 상기 적어도 1개의 대사 물질을 그것에 의해 전립선암 또는 그 소인을 진단하는 스텝을 포함하는 것이다. 상기 선행특허는 대사물질의 수집, 대사물질의 특성값을 포함한 데이터 수집, 및 상기 데이터 수집을 포함한 기억 매체를 포함한다. 또한, 상기 선행특허는 데이터 기억 매체와 작동할 수 있는 형태로 연결된, 샘플의 대사물질의 특성값을 비교하는 시스템도 제공하고 있다. 또한, 적어도 1개의 대사물질을 포함한 진단수단, 및 전립선암을 진단하는 진단수단을 제조하기 위한 1개의 대사물질의 사용을 포함하고 있다.
이러한 상기 선행발명은 전립선암에 관계하는 대사 물질을 분류하는 방법에 관한 것이며, 전립선암을 진단하기 위하여 사르코신 함량을 측정하는 점이 기재되어 있다.
상기 선행발명은 소변의 사르코신 함량을 측정하기 위하여 이미 공지된 방법, 즉, 소변의 사르코신의 직접적인 함량을 측정하기 위하여 액체 크로마토그래피(LC) 질량 분석 및/또는 가스크로마토그래피(GC) 질량 분석을 이용하고 있다.
이에 반하여 본원 발명은 사르코신 대사산물인 포름알데히드를 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법을 제공한다는 점에서 차이가 있다.
또한, 1989년 8월 9일 뵈링거 만하임 게엠베하가 한국에서 출원하여 등록된 "효소적 산화에 의한 검체의 비색적 측정방법 및 시약"(등록번호 1992-0001449)에 관한 발명은, 전자수용체의 존재 하에 검체의 효소적 산화에 의한 검체의 비색적 측정 및 검체의 양에 대한 측정치로서 색 형성에 의하여 환원된 전자수용체의 측정방법에 있어서, 직접 전자수용체로서 +1과 -1 사이의 산화단계에 있는 질소를 갖는 화합물들의 그룹에서 선택된 물질의 존재 하에서 적절한 산화 환원 효소에 의해 검체가 산화되는 것을 특징으로 하는, 검체의 효소적 산화에 의한 검체의 비색적 측정방법에 관한 것이다.
상기 선행발명은 포도당 산화환원 효소를 이용하기 때문에 사르코신 산화효소를 이용하는 본원발명과는 다르고, 검체양을 측정하기 위하여 비색적 측정방법이 기재되어 있기는 하지만, 근본적으로 사르코신 대사물질을 사용하지 않는다는 점에서 본원발명과는 차이점이 있다.
또한, 2006년 9월 1일 베스 이스라엘 데코니스 메디칼센터가 한국에서 출원한 "자간전증 또는 자간의 진단 및 치료 방법"(공개번호 2007-0001991)에 관한 발명은, VEGF 또는 PlGF 농도를 증가시키는 화합물 또는 sF1t-1 농도를 감소시키는 화합물을 이용하여 자간전증 또는 자간을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 sF1t-1, VEGF, 또는 PlGF 농도를 검출함으로써 자간전증 또는 자간의 치료를 모니터하는 방법을 특징으로 한다. 또한 대상체의 sF1t-1, VEGF, 또는 PlGF 농도를 검출함으로써 자간전증 또는 자간을 진단하는 방법을 특징으로 한다.
상기 선행발명은 자간전증 또는 자간을 진단하기 위하여 요 시료 속의 VEGF, 또는 PlGF 농도를 검출하는 구성이 기재된 반면, 본원발명은 전립선암 진단을 위해 사르코신 함량을 검출하기 위해 사르코신 산화효소를 이용하는 점에서 구성이 상이하며, 질병의 진단을 위해 비색시험지법을 이용하는 점은 일부 유사하나, 본원발명은 사르코신 산화에 의해 생성되는 포름알데히드를 검출하는 비색 시험지법을 이용한다는 점에서 상이하다.
또한, 2008년 8월 15일 Metaboton, Inc.가 출원한 "전립선암의 대사 프로파일링법"(일본공개특허 2010-537170)에 관한 발명은, 암 마커에 관한 것으로 특히, 전립선암 중에 이상적으로 존재하는 대사 산물을 제공하며, 암에 특이적인 대사 산물을 표적으로 하는 진단, 연구, 및 치료 용도를 제공하고 있다.
상기 선행발명은 전립선암을 진단하기 위해 사르코신 함량을 측정하는 점이 기재된 점에서 일부 유사하나, 사르코신 함량을 측정하기 위해 사르코신 산화효소를 이용하는 점이 기재되지 않은 점에서 본원 발명과 상이하며, 소변의 사르코신 함량을 측정하기 위해 GC-MS(가스크로트그라피/질량분석법) 및 UHPLC-MS(초고성능 액체 크로트그라피 질량 분석)을 이용하는 반면, 본원발명은 사르코신 산화에 의해 생성되는 포름알데히드를 검출하기 위해 비색 시험지법을 이용한다는 점에서 상이하다.
이에 본 발명은 상기와 같은 종래의 제반 문제점을 해소하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 소변 중의 사르코신을 정성, 정량함에 있어서 기존의 요검사 시험지와 같이 검사 시험지를 검체 소변에 반응시켜서 색변화를 육안으로 확인할 수 있도록 함으로써, 전문인력 및 고가의 장비없이도 전립선암을 진단할 수 있는 시험지 및 그 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 기술적 사상에 의한 사르코신 대사산물인 포름알데히드를 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 및 사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 4-아미노-3-하이드라지노-5-머캅토-1,2,4-트리아졸(AHMT : 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole); 을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지가 제공된다.
또한, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 및 사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 엔-메칠벤조티아조리온-2-히디드라즈온(MBTH : N-methylbenzothiszolinone-2-hydrazone); 을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지가 제공된다.
또한, 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소, 강알칼리성을 유지시키는 완충액, 사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 AHMT 용해물에 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조시켜 제조하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법이 제공된다.
또한, 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소, 강알칼리성을 유지시키는 완충액, 사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 MBTH 용해물에 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조시켜 제조하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법이 제공된다.
또한, 첨가 시약들이 고정될 수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체; 를 더 포함하는 것이 양호하다.
또한, 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시키는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 더 포함하는 것이 양호하다.
또한, 상기 사르코신 산화효소의 농도는 200 ~ 500 unit/dL의 범위인 것이 양호하다.
또한, 상기 완충액은 1.0 ~ 2.0 몰농도이고, pH 9.0 ~ 12.5 범위인 것이 양호하다.
또한, 상기 용해물은 색원체의 발색을 도드라지게 하기 위하여 타트라진이 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 위와 같은 전립선암 진단 시험지를 이용하여 전립선암을 진단하는 방법이 제공된다.
또는 본 발명의 또다른 기술적 사상에 따른 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지, 그 제조 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 상기 사르코신 대사산물 중 과산화물과 반응하여 색원체로 기능하는 과산화물 색원체; 및 촉매제의 기능을 하는 과산화효소(Peroxidase); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지를 제공한다.
또한, 상기 과산화물 색원체는, 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine); 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-다이아미노벤젠 (1,4-diaminobenzene); 1,2-다이하이드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene); 4-클로로나프톨(4-chloronapthol); 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole); 2,7'-다이아미노플로렌(2,7'-diaminofluorene); 엔,엔'-다이메칠에틸렌다이아민(N,N'-dimethylethylenediamine); 엔,엔'-비스-(4-아미노페닐)-1,3-자이렌다이아민(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine); 중 어느 하나 이상인 것이 더 양호하다.
또한, 첨가 시약들이 고정될 수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체; 를 더 포함하는 것이 양호하다.
또한, 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시켜 제거하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid); 를 더 포함하는 것이 양호하다.
또한, 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서, 사르코신 산화효소 및 과산화효소를 pH 7.5 ~ 10.0 범위를 유지하는 완충액에 용해하여 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법이 제공된다.
또한, 상기 사르코신 산화효소의 농도는 200 ~ 500 unit/dL의 범위인 것이 더 양호하다.
또한, 상기 용해물은 시약들을 고정시키는 수용성 고분자 고정체가 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 상기 용해물은 색원체의 발색을 도드라지게 하기 위하여 염료가 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 상기 용해물은 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시키는 EDTA가 더 포함되어 있는 것이 양호하다.
또한, 상기 전립선암 진단 시험지로 전립선암을 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의한 사르코신 대사산물인 포름알데히드를 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 소변 중의 사르코신을 정성, 정량함에 있어서 기존의 HPLC 방법, 분광광도계 방법과 같이 전문적인 기술을 가진 자가 실험실에서 검체와 시약을 혼합하는 등의 화학반응 이후에 이를 HPCL 또는 분광광도계를 이용하여 분석하는 것처럼 전문인력 및 고가의 장비를 필요로 하지 않고 간단하게 전립선암의 진단 지표로 이용할 수 있도록 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예들에 따른 시험지의 외관을 보여주는 구성도
도 2는 본 발명의 제 1실시예에 의한 pH에 따른 사르코신 산화효소의 활성도 변화도.
도 3 및 도 4는 본 발명의 제 1실시예의 구현을 위한 실험결과를 설명하기 위한 사진 및 이의 도시화 도면.
도 5는 본 발명의 제 2실시예에 의한 pH에 따른 사르코신 산화효소의 활성도 변화도.
도 6미 7는 본 발명의 제 2실시예의 구현을 위한 실험결과를 설명하기 위한 사진 및 이의 도시화 도면.
첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 의한 사르코신 대사산물인 포름알데히드를 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하거나, 개략적인 구성을 이해하기 위하여 실제보다 축소하여 도시한 것이다.
또한, 제1 및 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 한편, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하에서는 본 발명의 제 1 및 제 2실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조로 하여 자세히 설명하기로 한다.
먼저 본 발명의 제 1실시예에 의한 사르코신 대사산물인 포름알데히드를 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 전립선암의 진단 지표를 고가의 장비 및 전문인력 없이도 간단하게 수행할 수 있게 한다.
전립선암(Prostate Cancer) 환자의 소변에서 사르코신(Sarcosine)의 농도가 특이하게 증가한다는 사실은 2009년에 발표된 네이쳐(Nature)지 457호에 수록되어 있는 사실이다.
사르코신은 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase)에 의하여 글리신(Glycine), 과산화물(H2O2) 및 포름알데히드(Formaldehyde)로 대사되는 바, 사르코신의 대사산물로 생성된 과산화물과 포름알데히드를 정량적으로 검출함으로써 사르코신의 농도를 산출할 수 있으며, 이를 통하여 전립선암의 진단지표로 활용하는 것이 가능하다. 이러한 대사과정을 나타낸 것이 아래의 [화학식 1]이다.
화학식 1
Figure PCTKR2014009215-appb-C000001
아래의 [화학식 2]에 나타난 반응식은 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-trazole[1750-12-5](이하, AHMT라고 칭한다.)를 이용한 것이며, 이러한 화학식을 이용하여 포름알데히드를 정량하게 된다.
화학식 2
Figure PCTKR2014009215-appb-C000002
또한, 아래의 [화학식 3]에 나타난 반응식은 엔-메칠벤조티아조리온-2-히디드라즈온(N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone; 이하 MBTH라 칭함)을 이용한 것이며, 역시 이러한 화학식을 이용하여 포름알데히드를 정량하게 된다.
화학식 3
Figure PCTKR2014009215-appb-C000003
사르코신은 상기 [화학식 1]과 같이 사르코신 산화효소에 의하여 과산화물과 포름알데히드를 사르코신의 농도에 비례적으로 생성하게 된다. 이때의 사르코신 산화효소의 활성에 영향을 주는 인자로는 완충액(Buffer Solution)의 pH 및 농도, 반응온도 등이 있다.
이때의 반응온도는 실온이면 족하고, 완충액의 농도는 대략 1~2 몰농도, pH는 8 ~ 9.5가 바람직하다.
또한, 완충액으로는 트리스(Tris), 포스페이트(Phosphate), 시트레이트(Citrate), 보레이트(Borate) 등이 사용 가능하다.
사르코신 산화효소에 의해 생성된 포름알데히드는 상기 [화학식 2]와 같이 4-아미노-3-하이드라지노-5-머캅토-1,2,4-트리아졸(4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole; 이하 AHMT라 칭함), 상기 [화학식 3]과 같이 엔-메칠벤조티아조리온-2-히디드라즈온(N-methylbenzothiazolinone-2-hydrazone; 이하 MBTH라 칭함) 등과 같은 색원체와 화학반응을 통하여 색착물을 형성하게 된다. 이러한 색착물은 쉽게 육안으로 식별 가능하다. 따라서, 위와 같은 반응식을 이용한 시험지를 제조하게 되면, 쉽게 전립선암을 진단할 수 있게 된다.
이때 파란색 등과 같이 쉽게 눈에 인식되지 아니하는 색일 경우에는 노란색 염료 등을 이용하여 바탕색을 노랗게 만듦으로써, 발색의 경향이 파란색보다 색이 도드라져 보이도록 녹색, 청록색 등으로 발색시키는 추가적인 방법도 이용할 수 있다. 이와 같이 육안으로 쉽게 식별가능하도록 색처리하는 물질에는 여러가지가 있는 바, 타트라진이 본 실시예에서 사용되었다.
한편, 셀룰로오스 시험지로 제조하게 되면, 소변이 시험지에 쉽게 흡수될 수 있도록 하는 계면활성제 및 첨가되는 시약들이 상기 셀룰로오스 시험지에 고정될수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체도 첨가될 수 있다.
상기 AHMT 또는 MBTH와 포름알데히드의 반응은 강한 알카리성 환경에서 반응이 진행된다.
이때의 반응은 pH에 의존하게 되며 [도 2]와 같이 최소 pH 9.0 이상은 되어야 상기 [화학식 2]와 같은 반응이 진행되어 보라색 착물을 형성하게 된다. 또는, 상기 [화학식 3]과 같은 반응이 진행되어 청색 착물을 형성하여 시험지의 색상 변화를 통해 육안으로 확인 할 수 있게 된다.
비색 시험지법의 경우도 시험지가 가혹한 pH 조건의 시료에 담궈질 것을 고려하여 1.5 몰농도의 보레이트-수산화나트륨 pH 9.5~12 용액을 제조하여 완충액으로 이용한다. 본 실시예에서는 보레이트-수산화나트륨을 사용하였지만, 충분히 강알칼리성이 유지된다면 다른 완충용액을 사용해도 무방하다. 만일, 이보다 pH가 낮을 경우는 반응이 일어나지 않으며 이보다 높을 경우에는 이후에 셀룰로오즈 시험지를 침지할 때 용액의 강한 알카리성으로 인해 시험지가 파괴되어 침지를 할 수 없게 된다.
완충액에 사르코신 산화효소 시험지를 열 건조할 때의 효소 활성도가 떨어지는 것을 고려하여 사르코신 산화 효소 200 ~ 500 unit/dL 의 과량의 효소가 첨가되어야 한다. 만약 이때 사르코신 산화효소의 양이 적으면 시험지의 건조 과정에서 효소의 활성이 떨어져 충분한 반응성을 갖지 못하고, 첨가량이 많으면 비용의 증가 뿐만 아니라 자연변색을 초래할 수 있다.
아래의 [표 1]과 같이 사르코신 산화효소는 금속이온에 의해 그 활성도가 크게 영향을 받게 되는데 시료에 필연적으로 금속이온이 존재하므로 이를 킬레이트화 시켜 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저하를 막기 위해서, EDTA 0.01 ~ 0.02 g/dL을 첨가한다. 이때 EDTA의 경우 첨가량이 적으면 충분히 금속이온을 제거하지 못하고, 반대로 양이 많을 경우 오히려 발색 반응을 저하시키게 된다. 본 실시예에서는 EDTA4NA를 사용하였는데, 금속이온을 킬레이트화시킬 수 있는 다른 물질을 사용해도 무방하다. 이후에 색원체로 AHMT 20~50 mM을 용해시킨다. 이때 시약의 첨가량이 작으면 중농도, 고농도의 검체에서 발색 차이가 없게 되며, 반대로 첨가량이 많으면 자연상태에서 변색되어 제품의 변질이나 위양성의 결과를 초래한다.
표 1
Figure PCTKR2014009215-appb-T000001
셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 과량의 시약은 제거 후 70~80℃에서 30분간 건조시킨다.
이후에 시험지에 양면테이프를 붙히고 절단하여 지지체에 고정시킨 후 성형하여 [도 1]과 같은 형태로, 제조 후 습기에 민감하므로 제습제와 함께 밀페도가 높은 통에 보관하여 필요시 사용한다.
[도 3]은 위와 같은 방법에 의하여 제조된 시험지를 이용하여 전립선암을 진단하기 위한 실험 결과물이고 [도 4]는 이를 도시화한 도면으로서, 스트립 1개를 기준으로 흰색, 옅은 주황색, 노란색 또는 보라색의 경우 맨 위 흰색은 시료의 바탕색을 확인하기 위한 아무 처리도 하지 않은 흰색 시험지, 두 번째 옅은 주황색 시험지의 경우 요의 희석 정도를 확인하기 위한 시험지이다. 좌측부터 Negative, 1000, 2000, 4000 nM 에서의 AHMT를 이용하여 포름알데히드를 이용한 사르코신 검출반응 사진이다. (노란색, 보라색으로 변화된 시험지)
이하에서는 본 발명의 제 2실시예에 대하여 자세히 설명하기로 한다.
본 발명의 제 2실시예에 의한 사르코신 대사산물인 과산화물을 이용한 전립선암 진단 시험지 및 이를 이용한 전립선암 진단 방법은, 전립선암의 진단 지표를 고가의 장비 및 전문인력 없이도 간단하게 수행할 수 있게 한다.
전립선암(Prostate Cancer) 환자의 소변에서 사르코신(Sarcosine)의 농도가 특이하게 증가한다는 사실은 2009년에 발표된 네이쳐(Nature)지 457호에 수록되어 있는 사실이다.
즉, 사르코신은 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase)에 의하여 글리신(Glycine), 과산화물(H2O2) 및 포름알데히드(Formaldehyde)로 대사되는 바, 사르코신의 대사산물로 생성된 과산화물과 포름알데히드를 정량적으로 검출함으로써 사르코신의 농도를 산출 할 수 있으며, 이를 통하여 전립선암의 진단지표로 활용하는 것이 가능하다. 이러한 대사과정을 나타낸 것이 아래의 [화학식 4]이다.
화학식 4
Figure PCTKR2014009215-appb-C000004
한편, 기존의 과산화물을 정량하는 방법은 아래의 [화학식 5]와 같은 방법이 널리 알려져 있다.
화학식 5
Figure PCTKR2014009215-appb-C000005
위의 [화학식 4]와 [화학식 5]를 이용하여 아래 [화학식 6]의 반응식을 시험지 위에서 반응할 수 있도록 구성하면 사르코신의 농도를 비색 시험지 반응을 통하여 정량할 수 있게 된다. 이러한 방법을 이용하는 것이 본 발명의 기본적 기술내용이 된다.
화학식 6
Figure PCTKR2014009215-appb-C000006
사르코신은 위의 [화학식 4]와 같이 사르코신 산화효소에 의하여 과산화물과 포름알데히드를 사르코신의 농도에 비례적으로 생성하게 된다. 이때의 사르코신 산화효소의 활성에 영향을 주는 인자로는 완충액(Buffer Solution)의 pH 및 농도, 반응온도 등이 있다.
이때의 반응온도는 실온이면 족하고, 완충액의 농도는 대략 1~2 몰농도, pH는 8 ~ 9.5가 바람직하다.
또한, 완충액으로는 트리스(Tris), 포스페이트(Phosphate), 시트레이트(Citrate), 보레이트(Borate) 등이 사용 가능하다.
사르코신 산화효소에 의하여 생성된 과산화물 탈수소화 반응을 촉매하는 과산화효소(Peroxidase)는 상기 [화학식 6]에 그 과정이 구체적으로 표현되어 있으며, 사르코신 산화효소의 50 ~ 80% 정도의 활성도 정도의 양을 첨가하면 충분하다. 이어서 3,3'-다이아미노벤지딘 (3,3'-diaminobenzidine); 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-다이아미노벤젠 (1,4-diaminobenzene); 1,2-다이하이드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene); 4-클로로나프톨 (4-chloronapthol); 3-아미노-9-에틸카바졸 (3-amino-9-ethylcarbazole); 2,7'-다이아미노플로렌 (2,7'-diaminofluorene); 엔, 엔'-다이메칠에틸렌다이아민 (N,N'-dimethylethylenediamine); 엔,엔'-비스-(4-아미노페닐)-1,3-자이렌다이아민 N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine 등과 같은 과산화물 색원체가 산화되어, 일정한 색깔을 띠게 된다.
이때 파란색 등과 같이 쉽게 눈에 인식되지 아니하는 색일 경우에는 노란색 염료 등을 이용하여 바탕색을 노랗게 만듦으로써, 발색의 경향이 파란색이 아닌 녹색, 청록색 등으로 도드라지게 하는 추가적인 방법도 이용할 수 있다.
또한, 소변이 시험지에 쉽게 흡수될 수 있도록 하는 계면활성제가 추가될 수도 있고, 첨가 시약들이 셀룰로오즈 시험지에 고정될 수 있도록 하는 고정체(보통 수용성 폴리머 이용)도 첨가될 수 있다.
한편, 사르코신 산화 효소와 과산화효소의 2종류의 효소를 동시에 사용함에 있어서 각 효소의 pH 안정성의 차이로 인해 침지 용액을 두 차례에 나누어 제조해야 한다.
사르코신 산화효소의 경우 [도 5]와 같이 pH 8.0에서 최대 활성도를 갖게 되며, 일반적인 분광광도계법의 경우 완충액의 농도는 0.05~0.1 몰농도, pH 7.5~8.5 면 충분하다. 본 발명은 비색 시험지법으로 조제된 시험지를 시료에 담궜다 꺼냄으로서, 시료의 산성 pH 등에 가혹하게 노출된다. 이때의 가혹한 노출을 극복하기 위해 1차 용액의 완충액은 1.0 ~ 2.0 몰농도의 보레이트-수산화나트륨 pH 8.0~9.5, 용액을 제조하여 이용한다.
이후에 조제 용액에 시험지를 침지 후 시험지를 열 건조할 때의 효소 활성도가 떨어지는 것을 고려하여 사르코신 산화 효소 200 ~ 500 unit/dL 의 과량의 효소가 첨가되어야 한다. 만약 이때 사르코신 산화효소의 양이 적으면 시험지의 건조 과정에서 효소의 활성이 떨어져 충분한 반응성을 갖지 못하게 되며, 첨가량이 많으면 비용의 증가뿐만 아니라 자연변색을 초래할 수도 있다.
첨가하는 시약들이 셀룰로오즈 시험지에 고정될 수 있도록 수용성 폴리머, 폴리비닐피로리딘 1.0~2.0 g/dL을 첨가하는데, 이때 첨가량이 작으면 시약이 시험지에 고정되지 않아 완성된 시험지를 시료에 담궜을 때 시약이 용출되어 색 오염이 일어나며, 양이 많으면 수용성 폴리머라 할지라도 시료의 흡수를 방해하게 된다.
3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘을 색원체로 사용할 경우 발색이 청색계열로 일어나는데 옅은 청색의 경우 육안으로 그 차이를 확인하기가 용이하지 않다. 이러한 이유 때문에 노란색을 바탕색으로 해서 청색 계열의 발색이 진행될 경우 노란색 바탕과 청색의 혼색으로 녹색계열로 발색이 보이게 함으로써, 육안 확인이 쉽도록 하기 위해 타트라진을 0.05~0.1 g/dL를 사용한다. 이때 타르라진의 사용량이 적으면 시료 본연의 색에 묻혀 녹색이 아니 청색 계열로 발색하게 되며, 사용량이 많으면 미량의 사르코신에 의한 옅은 청색 반응이 짙은 노란색에 묻혀 위음성의 결과를 보이게 된다.
아래의 [표 2]와 같이 사르코신 산화효소는 금속이온에 의해 그 활성도가 크게 영향을 받게 되는데 시료에 금속 이온이 과량 존재할 경우 이를 킬레이트화 시켜 제거하여 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저하를 막기 위해서, EDTA 0.01 ~0.02 g/dL 를 첨가한다. 즉, EDTA는 금속 흡착제 역할을 하는 것이며, 이는 효소들의 활성화가 잘 이루어지게 하기 위함이다. 본 실시예에서는 EDTA4NA를 사용하였는데, 금속이온을 킬레이트화시킬 수 있는 다른 물질을 사용해도 무방하다. 한편, EDTA의 경우 첨가량이 적으면 충분이 금속이온을 제거하지 못하고, 반대로 양이 많을 경우 오히려 발색 반응을 저하시키게 된다.
표 2
Figure PCTKR2014009215-appb-T000002
시약이 충분히 용해되면 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후, 과량의 시약은 제거 후 70~80℃에서 30분간 건조시킨다.
2차 용액은 과산화효소를 안전하게 고정화시킬수 있도록 0.5~1.0 몰농도의 보레이트-염산 pH 6.0~7.0 완충액을 바탕으로 과산화효소 100~200 unit/dL, 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘 20 밀리몰(mM)농도를 용해시킨다. 이때 시약의 첨가량이 작으면 중농도, 고농도의 검체에서 발색차이가 없게 되며, 반대로 첨가량이 많으면 자연상태에서 변색되어 제품의 변질이나 위양성의 결과를 초래한다.
시약이 충분히 용해되면 앞서 1차 용액을 침지후 건조시킨 시험지를 2차 용액에 다시 침지시켜 70~80℃에서 30분간 건조시킨다.
이후에 시험지에 양면테이프를 붙히고 절단하여 지지체에 고정시킨 후 성형하여 [도 1]과 같은 형태로 제조하게 되며, 이 결과물은 습기에 민감하므로 제습제와 함께 밀페도가 높은 통에 보관하여 필요시 사용한다.
[도 6]은 위와 같은 방법에 의하여 제조된 시험지를 이용하여 전립선암을 진단하기 위한 실험 결과물이고 [도 7]은 이를 명확히 표현하기 위한 도시화된 도면으로서, 좌측부터 Negative, 1000, 2000, 4000 nM 에서의 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘을 이용했을 때 과산화효소를 이용한 사르코신 검출반응 사진이다.
*이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

Claims (22)

  1. 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 및
    사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 4-아미노-3-하이드라지노-5-머캅토-1,2,4-트리아졸(AHMT : 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole); 을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  2. 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase); 및
    사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 엔-메칠벤조티아조리온-2-히디드라즈온(MBTH : N-methylbenzothiszolinone-2-hydrazone); 을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
    첨가 시약들이 고정될 수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시켜 제거하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid); 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  5. 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서,
    사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소, 강알칼리성을 유지시키는 완충액, 사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 AHMT 용해물에 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조시켜 제조하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  6. 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서,
    사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소, 강알칼리성을 유지시키는 완충액, 사르코신이 산화되어 생성된 포름알데히드와 반응하여 색원체로 기능하는 MBTH 용해물에 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조시켜 제조하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사르코신 산화효소의 농도는 200 ~ 500 unit/dL의 범위인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충액은 1.0 ~ 2.0 몰농도이고, pH 9.0 ~ 12.5 범위인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  9. 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해물은 시약들을 고정시키는 수용성 고분자 고정체가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  10. 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해물은 색원체의 발색을 도드라지게 하기 위하여 타트라진이 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  11. 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해물은 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시키는 EDTA가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 의한 전립선암 진단 시험지로 전립선암을 진단하는 방법.
  13. 사르코신 대사산물을 생성하는 사르코신 산화효소(Sarcosine Oxidase);
    상기 사르코신 대사산물 중 과산화물과 반응하여 색원체로 기능하는 과산화물 색원체; 및
    촉매제의 기능을 하는 과산화효소(Peroxidase); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 과산화물 색원체는,
    3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine); 3,3',5,5'-테트라메칠벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); 1.4-다이아미노벤젠 (1,4-diaminobenzene); 1,2-다이하이드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene); 4-클로로나프톨(4-chloronapthol); 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole); 2,7'-다이아미노플로렌(2,7'-diaminofluorene); 엔,엔'-다이메칠에틸렌다이아민(N,N'-dimethylethylenediamine); 엔,엔'-비스-(4-아미노페닐)-1,3-자이렌다이아민(N,N'-bis-(4-aminophenyl)-1,3-xylylenediamine); 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지
  15. 제 13 항에 있어서,
    첨가 시약들이 고정될 수 있도록 하는 수용성 고분자 고정체; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  16. 제 13 항에 있어서,
    금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시켜 제거하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지.
  17. 전립선암 진단 시험지 제조 방법에 있어서,
    사르코신 산화효소 및 과산화효소를 pH 7.5 ~ 10.0 범위를 유지하는 완충액에 용해하여 셀룰로오즈 시험지를 침지시킨 후 건조하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 사르코신 산화효소의 농도는 200 ~ 500 unit/dL의 범위인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 용해물은 시약들을 고정시키는 수용성 고분자 고정체가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 용해물은 색원체의 발색을 도드라지게 하기 위하여 염료가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 용해물은 금속이온에 의한 사르코신 산화효소의 활성도 저해 방지를 위하여 상기 금속이온을 킬레이트화시키는 EDTA가 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 시험지 제조 방법.
  22. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 의한 전립선암 진단 시험지로 전립선암을 진단하는 방법.
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