CN102288747B

CN102288747B - 去除干扰的干化学定量测试试条、谷丙或谷草转氨酶定量测试试条及检测方法

Info

Publication number: CN102288747B
Application number: CN2011102399262A
Authority: CN
Inventors: 吉翔; 谢光; 李宗祥; 车宏莉
Original assignee: CHANGSHA SINOCARE Inc
Current assignee: Sinocare Inc
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2031-08-19
Also published as: CN102288747A

Abstract

本发明公开了一种去除干扰的干化学定量测试试条，包括底衬，其上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区，还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区，加样区和启动区是以在通常状态下保持非接触、在测试状态下可互相接触的方式布设在测试试条上。测试方法是将待测样品液添加到加样区，加样区上固定的物质复溶到待测样品液中，开始进行信号反应获取背景信号值；再使启动区与加样区接触，启动区上固定的物质复溶，开始测试反应，产物再进行二次信号反应，根据测得的二次特征值和前述背景信号值测算出待测生物酶的含量。本发明的检测方法操作简便、测试成本较低、检测结果准确、检测精度高，能够具体用于谷丙或谷草转氨酶的定量测试。

Description

去除干扰的干化学定量测试试条、谷丙或谷草转氨酶定量测试试条及检测方法

技术领域

本发明涉及一种干化学测试试条及测试方法，尤其涉及一种转氨酶的干化学测试试条及检测方法。

背景技术

干化学测试中的干扰物很多，比如氧化还原反应测定中的尿酸、抗坏血酸等的干扰，转氨酶检测中的丙酮酸干扰，尤其以转氨酶中的丙酮酸干扰较为严重。

转氨酶的种类很多，其中以谷丙转氨酶(GPT/ALT)和谷草转氨酶(GOT/AST)最为重要。谷丙转氨酶又称丙氨酸氨基转移酶，是催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用；谷草转氨酶又称门冬氨酸氨基转移酶，是催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用。临床上，全血、血清、血浆、组织液中这两种转氨酶的测定，是心脏病、肌肉疾病、尤其是肝病诊断中非常重要的指标。

临床上测定上述两种转氨酶的方法，主要是使用生化分析仪的液体试剂的方法，此方法是利用乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶分别催化谷丙转氨酶产物丙酮酸和谷草转氨酶产物草酰乙酸脱氢，消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，引起吸光值在340nm的变化。此变化率与谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性有比例关系，从而得出酶活性。

上文提到的反应如下：

谷丙转氨酶：

谷草转氨酶：

此方法耗时、操作复杂、需要比较大型的仪器；并且在该方法中，随着反应的进行，NADH不断消耗，340nm的吸光度不断减少。因为仪器等方面的原因，初始的NADH不能太高，这使得该方法的测试范围受到影响，在测试转氨酶高值样品时容易出现假阴性。

干化学方法具有方便、灵活、污染小、操作简便等特点。目前，干化学方法大致可以分为以下几类：以雅培为代表的电化学方法(如美国专利US6565738)。富士、柯达、强生为代表的多层膜片法(如美国专利US4897347、US5508173、US5462858)。以罗氏为代表的横向流动干化学法(如美国专利US4591553、US5508173、US4665023)。然而，前述方法都存在部分缺陷，比如雅培电化学法测试谷丙转氨酶，采用谷氨酸氧化酶法氧化反应(1)产生的L-谷氨酸，但是存在内源性的丙氨酸干扰(比内源性的丙酮酸更为常见)，影响测试结果。而富士为代表的多层膜片法、罗氏为代表的干化学方法，均采用偶联丙酮酸氧化酶法。采用偶联丙酮酸氧化酶方法的反应过程如下：

谷丙转氨酶，在反应(1)后偶联

谷草转氨酶，在反应(3)后偶联

根据专利US4665023，其试条的结构如图1所示，血液样品加在扩散层1上，经过滤血膜3滤血后，血浆流到流动垫5上。加样后1min，下压透明的保护层9，试剂层6和酶结合垫4与流动垫相接触。固定在试剂层6上的显色剂、酶底物和固定在酶结合垫4上的丙酮酸氧化酶、过氧化物酶复溶到样品中，从而产生可检测的颜色信号。

从测试原理中可以清晰地看出，该方法存在内源性丙酮酸的干扰。提供颜色信号的丙酮酸，既有酶催化产生的，也有样品中本身存在的内源性丙酮酸。而采用速率法(即测试显色的变化率)，去除内源性干扰需要比较复杂的光学仪器，常常采用积分球等光学器件，并且转氨酶的正常值一般很低，谷丙转氨酶为5U/L～40U/L，谷草转氨酶为8U/L～40U/L，而丙酮酸的正常参考值相对较高，为65μmol/L(相当于65U/L转氨酶在1min产生的丙酮酸)，在较短的干化学测试时间(2min～3min)内，显色剂显色的变化率也会在一定程度上受内源性丙酮酸的影响，容易出现假阳性结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种测量结果准确、制备简单、测试成本低、检测操作方便的去除干扰的干化学定量测试试条及特别针对谷丙或谷草转氨酶的定量测试试条，还提供一种操作简便、测试成本较低、检测结果准确、检测精度高的用该谷丙或谷草转氨酶的定量测试试条定量检测血液中谷丙或谷草转氨酶的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种去除干扰的干化学定量测试试条，所述测试试条包括底衬，所述底衬上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区，所述底衬上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区，所述加样区和启动区是以在通常状态下保持非接触、在测试状态下可互相接触的方式布设在所述测试试条上。所述的去干扰试剂主要是指能够去除待测样品中内源性干扰物质的反应试剂，所述信号提供试剂是指能够基于内源性干扰物质的反应进而提供背景信号的相应试剂，所述的测试反应启动试剂则优选包括有能够启动分析物反应的反应试剂、信号产生试剂以及分析反应需要的一些生物酶试剂等。

作为对上述去除干扰的干化学定量测试试条的第一种改进，所述加样区直接固定在所述底衬上，所述启动区通过一粘结件连接在所述底衬上，该粘结件具有足够的高度使所述启动区的大部分区域悬置于所述加样区上方。在该优选的技术方案中，由于启动区悬置于加样区上方，因此在通常情况下，加样区和启动区是以非接触的状态存在；在用该测试试条进行检测时，只需将启动区向下按压，便可使启动区与加样区保持接触，以启动相应的检测反应。

作为对上述去除干扰的干化学定量测试试条的第二种改进，所述加样区和启动区被一分隔层隔开，该分隔层设置为可抽离式的连接方式，以使得该分隔层抽离出测试试条后所述加样区和启动区能保持接触。在该优选的技术方案中，由于启动区和加样区分设于分隔层的正反面上，因此在通常情况下，加样区和启动区之间通过分隔层隔离并以非接触的状态存在；在用该测试试条进行检测时，只需将该分隔层单独抽离出测试试条，便可使启动区与加样区保持接触，以启动相应的检测反应。

作为对上述去除干扰的干化学定量测试试条的第三种改进，所述加样区可直接固定在所述底衬上，所述启动区则通过一铰接件铰接于所述底衬的一端，所述铰接件的转轴轴向与水平面平行或垂直，以使得启动区通过旋转后能与所述的加样区保持接触。当转轴轴向与水平面平行时，所述启动区是通过在竖直平面内的翻转实现与加样区由非接触到接触；当转轴轴向与水平面垂直时，所述启动区是通过在水平面内的旋转实现与加样区由非接触到接触，此时铰接件的高度应当适当，以便于启动区在旋转平移后能够刚好接触到加样区。

作为对上述去除干扰的干化学定量测试试条的第四种改进，所述加样区和启动区分别固定在所述底衬同一面的不同区域(相互保持一定距离)，所述加样区和启动区中间的底衬上设有一折痕线，以使得所述底衬沿折痕线弯折后能使启动区与加样区保持接触。

上述的各种去除干扰的干化学定量测试试条中，启动区可以设置一试剂层，其作用是启动转氨酶反应，优选的材料为聚碳酸酯或尼龙，也可以将试剂层上物质直接固定在纤维材料中作为试剂层，此时可根据需要在试剂层上增设一层透明的保护层，所述保护层优选用透明的聚碳酸酯或聚氯乙烯材料制作。

上述的各种去除干扰的干化学定量测试试条中，具体到加样区和启动区的结构，所述加样区可以根据待检测样品的需要，由样品流动垫、扩散层、样品垫、滤血膜、酶结合垫中的全部或者几种构成，所述加样区优选包括固定于底衬上的流动垫和固定于流动垫上的酶结合垫，所述酶结合垫上设有滤血膜、样品垫、扩散层中的一种或叠加设置其中的多种。例如，所述的酶结合垫上可依次叠加设置滤血膜、样品垫和扩散层，又如，在用该测试试条检测血清时，便可取消滤血膜层。所述启动区也可以根据待检测样品的需要，包含试剂层、酶结合垫、保护层中的一种或者多种。

上述的去除干扰的干化学定量测试试条中，所述底衬可以采用(透明或者不透明的)高分子聚合材料(如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯等)制作，但优选采用聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯、聚酰胺高分子聚合材料制作，底衬的厚度优选为50μm～300μm。所述流动垫可以采用的材料包括玻璃纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、聚砜膜、聚醚砜膜等，优选采用玻璃纤维、硝酸纤维素膜、聚酯纤维膜或滤纸制作，其厚度优选为0.04mm～0.2mm。所述酶结合垫优选采用玻璃纤维、纤维素滤纸、聚酯纤维或滤纸制作。所述滤血膜的作用是过滤血细胞，如果待测试样品为血浆、血清则可不设置该层，其材料可以是各种玻璃纤维和一些厂家提供的专用滤血膜，优选采用不对称聚砜膜或玻璃纤维制作。所述样品垫的作用为保持样品，不让样品溢流出来(非必要设置)，其材料可以为玻璃纤维、聚酯纤维等，优选采用玻璃纤维制作。所述扩散层的作用是使待测样品均匀地渗滤到下层中(非必要设置)，优选采用聚酯纤维或尼龙纤维制成的网布形式，网布孔径优选为40目～150目，纤维直径优选为100μm～500μm，网布优选为亲水性的或亲水处理的。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述的去除干扰的干化学定量测试试条检测生物酶的方法，包括以下步骤：首先将待测样品液添加到所述测试试条的加样区，所述加样区上固定的去干扰试剂和信号提供试剂均复溶到待测样品液中，所述待测样品液中含有的内源性干扰物质与待测样品液中的去干扰试剂和信号提供试剂开始进行信号反应，经过一段孵化过程后(通常保持1min即可)，获取该信号反应的特征值，并以该特征值设定为内源性干扰物质的背景信号值；再使所述测试试条的启动区与加样区相接触，启动区上固定的测试反应启动试剂复溶到待测样品液中，并开始启动分析物的测试反应，测试反应启动后生成的产物再与所述信号提供试剂进行二次信号反应，根据二次信号反应测得的二次特征值和前述测得的背景信号值，测算出待测生物酶的含量。

上述的检测方法中，所述信号反应所产生的可识别信号优选为显色信号、荧光信号、化学发光信号中的一种，最优选为显色信号，尤其是采用吸收波长为600nm～700nm的显色信号。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，该定量测试试条是由上述的干化学定量测试试条制成，所述启动区上固定的测试反应启动试剂主要是指能够启动转氨酶反应的底物，所述加样区上固定的去干扰试剂包括丙酮酸氧化酶和过氧化物酶(POD)，所述加样区上固定的信号提供试剂包括适用于所述过氧化物酶的显色底物、荧光底物或化学发光底物。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条检测谷丙或谷草转氨酶的方法(不设置滤血膜、样品垫和扩散层的情形)，包括以下步骤：首先将待测样品液添加到所述测试试条的加样区，所述加样区上固定的丙酮酸氧化酶、过氧化物酶及显色底物均复溶到待测样品液中，所述待测样品液中含有的内源性干扰物质丙酮酸与待测样品液中的酶及显色底物开始进行显色反应，经过一段孵化过程后，获取该显色底物显色的反射率值，该反射率值即设定为内源性干扰物质的背景显色值；再使所述测试试条的启动区与加样区相接触，启动区上固定的底物复溶到待测样品液中，并开始启动转氨酶反应，转氨酶反应启动后生成的丙酮酸参与偶联反应，偶联反应后生成的双氧水与所述显色底物进行二次显色反应，根据显色底物显色的二次反射率值的终点或者变化率和所述背景显色值，通过终点法或速率法测定出谷丙或谷草转氨酶的含量。终点法计算含量时，先根据库贝尔卡-蒙克(Kubelka-Monk)定理，将两次的反射率值先转化成

然后将二者相减即可。

作为一个总的技术构思，本发明还提供另一种谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，所述定量测试试条是由上述具有特定加样区结构的(该加样区内包括酶结合垫、滤血膜、样品垫和扩散层)干化学定量测试试条制成，所述启动区上固定的测试反应启动试剂主要是指能够启动转氨酶反应的底物，所述加样区上固定的去干扰试剂包括丙酮酸氧化酶和过氧化物酶，所述加样区上固定的信号提供试剂包括适用于所述过氧化物酶的显色底物、荧光底物或化学发光底物；所述酶结合垫上设有滤血膜，所述滤血膜上设有样品垫，所述样品垫上设有扩散层。扩散层、样品垫和滤血膜中可添加缓冲体系、表面活性剂、防溶血试剂(如糖类)、盐类(如氯化钠)等。

作为一个总的技术构思，本发明还提供用上述第二种的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条检测谷丙或谷草转氨酶的方法，包括以下步骤：首先将待测样品液滴加到所述测试试条加样区的扩散层上，使待测样品液依次流经样品垫和滤血膜并逐渐浸润到所述酶结合垫上，所述加样区上固定的丙酮酸氧化酶、过氧化物酶及显色底物均复溶到待测样品液中，所述待测样品液中含有的内源性干扰物质丙酮酸与待测样品液中的酶及显色底物开始进行显色反应，经过一段孵化过程后，获取显色底物显色的反射率值，该反射率值即设定为内源性干扰物质的背景显色值；再使所述测试试条的启动区与加样区相接触，启动区上固定的底物复溶到待测样品液中，并开始启动转氨酶反应，转氨酶反应启动后生成的丙酮酸参与偶联反应，偶联反应后生成的双氧水与所述显色底物进行二次显色反应，根据显色底物显色的二次反射率值的终点或者变化率和所述背景显色值，通过终点法或速率法测定出谷丙或谷草转氨酶的含量。

上述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条中，所述丙酮酸氧化酶的浓度优选为30KU/L～300KU/L。上述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条中，所述过氧化物酶的浓度优选为30KU/L～200KU/L。上述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条中，所述显色底物、荧光底物或化学发光底物的浓度优选为1mM～50mM。上述技术方案中，显色剂的选用可根据实际需要进行确定(已有US4591553、US5274095、US5162200、US4666023等美国专利文献提及)，加样区上至少应固定一种显色剂体系。

上述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条中，所述启动转氨酶反应的底物优选包括α-酮戊二酸，所述α-酮戊二酸的浓度优选为5mM～300mM；所述启动转氨酶反应的底物还优选包括用于检测谷丙转氨酶的L-丙氨酸或者用于检测谷草转氨酶的L-门冬氨酸。事实上，如果固定于启动区的启动转氨酶反应的底物包括了α-酮戊二酸，那么诸如L-丙氨酸、L-门冬氨酸等物质也可以固定在加样区上。

如无特别提及，本发明中试条上所附着物质的浓度均是指在制备该试条时用于润湿载体膜所选用的该物质溶液的浓度，例如上述的显色剂浓度即是指在制备试条时用于润湿载体膜所选用的该显色剂溶液的浓度。

综上所述，本发明的测试试条中反应体系可以包括缓冲体系、转氨酶反应底物、防溶血试剂、丙酮酸氧化酶(浓度优选为30KU/L～300KU/L)、过氧化物酶(浓度优选为30KU/L～200KU/L)、转氨酶激活剂、焦磷酸硫胺素(TPP，浓度优选为0.4mg/ml～1mg/ml)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，浓度优选为0.1mg/ml～0.2mg/ml)、表面活性剂、显色剂、丙酮酸激活剂(如Mg²⁺、Mn²⁺，优选为0.01M～0.1M的Mg²⁺)、谷丙、谷草转氨酶激活剂(优选为1mM～500mM的5’-磷酸吡哆醛)、稳定剂等。其中，包括缓冲体系在内的各非主要组分的选择、浓度及酶的活性均可以由本领域人员根据现有技术自行确定(可参考US4271265、US4666832、US4591553等美国专利文献)。TPP、FAD、表面活性剂、激活剂等物质均可固定在加样区上。

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过采用本发明的测试试条和检测方法可以更加准确、便捷地对谷丙转氨酶或谷草转氨酶进行定性检测和定量分析，而且本发明的测试试条结构简单，便于制作，检测方法操作方便、快捷，无需新增其他仪器或设备，符合床边的诊断(POCT)要求，适合医院急诊、病房、用户自己、社区医院等使用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为现有技术中干化学定量测试试条的结构示意图。

图2为本发明实施例1提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图。

图3为本发明实施例2提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图。

图4为本发明实施例3提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图。

图5为本发明实施例4提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图。

图6为本发明实施例5提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图。

图7为本发明实施例6提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图(俯视)。

图8为本发明实施例6提供的去干扰的干化学定量测试试条的结构示意图(主视)。

图9为本发明实施例7和对比例1中E值的对比图。

图10为本发明实施例8和对比例2中E值的对比图。

图例说明：

1、扩散层；2、样品垫；3、滤血膜；4、酶结合垫；5、流动垫；6、试剂层；7、底衬；8、粘结件；9、保护层；10、铰接件；11、折痕线；12、分隔层；13、加样区；14、启动区。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：

一种如图2所示的去除干扰的干化学定量测试试条，该测试试条包括底衬7，底衬7上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区13(本实施例中具体包括扩散层1、样品垫2、滤血膜3、酶结合垫4和流动垫5)，加样区13直接固定在底衬7上；底衬7上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区14，启动区14包括一试剂层6，试剂层6通过一粘结件8连接在底衬7的一端，该粘结件8具有足够的高度使试剂层6的大部分区域悬置于加样区13的上方。加样区13和启动区14在通常状态下保持非接触，在测试状态下可通过向下按压启动区14(试剂层6)使其与加样区13(具体为加样区13的流动垫5)互相接触。

本实施例中，加样区13包括固定于底衬7上的流动垫5，流动垫5的一端固定酶结合垫4，酶结合垫4的上方依次设置滤血膜3、样品垫2和扩散层1，且扩散层1、样品垫2、滤血膜3、酶结合垫4和流动垫5的一侧通过粘结件8相互连接，并最终固定在底衬7上。启动区14的试剂层6具体设置在加样区13的流动垫5上方。去干扰试剂和信号提供试剂固定在酶结合垫4或流动垫5上。

一种用上述的去除干扰的干化学定量测试试条检测生物酶的方法(适合全血测试、血清、血浆等)，包括以下步骤：首先将待测样品液(如：全血)添加到测试试条加样区13的扩散层1上，经过样品垫2、滤血膜3以过滤血细胞，血浆复溶酶结合垫4或流动垫5上的去干扰试剂和信号提供试剂，最后渗透到流动垫5上，待测样品液中含有的内源性干扰物质与复溶的去干扰试剂和信号提供试剂开始进行信号反应，经过1min左右的孵化过程后，获取该信号反应的特征值(例如显色反应的反射率值)，并以该特征值设定为内源性干扰物质的背景信号值；再使测试试条的启动区14的试剂层6与加样区13的流动垫5相接触，启动区14上固定的测试反应启动试剂(包括反应底物等)复溶到待测样品液中，并开始启动分析物的测试反应，测试反应启动后生成的产物再与信号提供试剂进行二次信号反应，根据二次信号反应测得的二次特征值和前述测得的背景信号值，测算出待测生物酶的含量。

实施例2：

一种如图3所示的去除干扰的干化学定量测试试条，该测试试条包括底衬7，底衬7上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区13(本实施例中具体包括扩散层1、样品垫2、滤血膜3、酶结合垫4和流动垫5)，加样区13直接固定在底衬7上；底衬7上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区14，启动区14包括一试剂层6，试剂层6通过一粘结件8连接在底衬7的一端，该粘结件8具有足够的高度使试剂层6的大部分区域悬置于加样区13的上方。加样区13和启动区14在通常状态下保持非接触，在测试状态下可通过向下按压启动区14(试剂层6)使其与加样区13(具体指加样区13中的酶结合垫4)互相接触。

本实施例中，加样区13包括固定于底衬7上的流动垫5，流动垫5的一端(靠近启动区14的一端)固定有酶结合垫4，另一端固定有滤血膜3，滤血膜3的上方依次设置有样品垫2和扩散层1，且扩散层1、样品垫2、滤血膜3和流动垫5的一侧通过粘结件8相互连接，并最终固定在底衬7上。启动区14的试剂层6具体设置在加样区13的酶结合垫4上方。去干扰试剂和信号提供试剂固定在酶结合垫4或流动垫5上。

由上可见，相比于实施例1，实施例2仅仅是将酶结合垫4的位置作了调整和优化，即将酶结合垫4固定在流动垫5靠近启动区14的一端，在进行检测时，通过向下按压启动区14可以使其先与酶结合垫4接触，本实施例可以很好地避免酶释放的不同引起的偏差。

实施例3：

一种如图4所示的去除干扰的干化学定量测试试条，相比于实施例1提供的测试试条，本实施例的测试试条不设酶结合垫4，其余的结构及应用方式与实施例1相同。由于不设酶结合垫4，原先固定在酶结合垫4上的物质(例如各种催化反应酶)可以直接固定在加样区13的其他结构(例如流动垫5)上。

以上几个实施例的测试试条，在斩切成条的时候，可能会使启动区和加样区接触，启动区中固定的启动反应的试剂可能会部分地粘附在加样区中的流动垫上，导致启动反应不可控地被提前。这类问题可以通过多种方法解决，例如，在启动区和加样区之间设置一种隔层结构，使用时撕掉隔层结构即可。以下给出了几种更优选的实施例，从而能有效避免前述问题的发生。

实施例4：

一种如图5所示的去除干扰的干化学定量测试试条，该测试试条包括底衬7，底衬7上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区13(包括流动垫5、酶结合垫4、滤血膜3、样品垫2和扩散层1等)，加样区13直接固定在底衬7上；底衬7上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区14，启动区14包括一试剂层6，试剂层6也直接固定在底衬7上，加样区13和启动区14通过一分隔层12相互隔离。分隔层12设置为可抽离式的连接方式，加样区13和启动区14在通常状态下保持非接触，在测试状态下可通过抽离分隔层12使位于其正、反面的加样区13与启动区14互相保持接触。

本实施例中，加样区13的流动垫5一部分直接固定于底衬7上的，一部分则位于分隔层12上方，流动垫5的一端上方设置有酶结合垫4，酶结合垫4的上方依次设置有滤血膜3、样品垫2和扩散层1。去干扰试剂和信号提供试剂固定在酶结合垫4上。

本实施例的测试试条用于检测时的操作方法与实施例1相似，即首先将待测样品液(全血)添加到测试试条加样区13的扩散层1上，经过样品垫2、滤血膜3以过滤血细胞，血浆复溶酶结合垫4(或流动垫5)上的去干扰试剂和信号提供试剂，最后渗透到流动垫5上，待测样品液中含有的内源性干扰物质与复溶的去干扰试剂和信号提供试剂开始进行信号反应，经过1min左右的孵化过程后，获取该信号反应的特征值(例如显色反应的反射率值)，并以该特征值设定为内源性干扰物质的背景信号值；再抽离分隔层12使测试试条的启动区14的试剂层6与加样区13的流动垫5相接触，启动区14上固定的测试反应启动试剂(包括反应底物和信号提供试剂等)复溶到待测样品液中，并开始启动分析物的测试反应，测试反应启动后生成的产物再与信号提供试剂进行二次信号反应，根据二次信号反应测得的二次特征值和前述测得的背景信号值，测算出待测生物酶的含量。

实施例5：

一种如图6所示的去除干扰的干化学定量测试试条，该测试试条包括透明的底衬7，底衬7上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区13(包括扩散层1、样品垫2、滤血膜3、酶结合垫4、流动垫5等)，加样区13直接固定在底衬7上的一端；底衬7上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区14，启动区14包括一试剂层6，试剂层6直接固定在底衬7的另一端。加样区13和启动区14相互隔开一定距离，使加样区13和启动区14在通常状态下保持非接触，加样区13和启动区14中间的底衬7上还设有一折痕线11，在测试状态下可沿该折痕线11翻折，使位于一端的启动区14与另一端的加样区13互相接触。本实施例中，加样区13的流动垫5直接固定于底衬7上，流动垫5上依次设置有酶结合垫4、滤血膜3、样品垫2和扩散层1。去干扰试剂和信号提供试剂固定在酶结合垫4上。

实施例6：

一种如图7和图8所示的去除干扰的干化学定量测试试条，该测试试条包括底衬7，底衬7上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区13(包括扩散层1、样品垫2、滤血膜3、酶结合垫4、流动垫5等)，加样区13直接固定在底衬7上；底衬7上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区14，启动区14包括一试剂层6和保护层9，保护层9位于试剂层6的上方，试剂层6通过一铰接件10连接在底衬7的一端，该铰接件10具有适当的高度，使启动区14经水平旋移后试剂层6的大部分区域能刚好与加样区13相接触。在通常状态下，启动区14旋转偏离于加样区13(如图7所示)，与加样区13保持非接触状态，在测试状态下可通过绕铰接件10旋转启动区14使其与加样区13互相接触。

本实施例中，加样区13的流动垫5直接固定于底衬7上，流动垫5的一端固定有酶结合垫4，酶结合垫4的上方依次设置有滤血膜3、样品垫2和扩散层1。酶结合垫4、滤血膜3、样品垫2和扩散层1均设置于流动垫5的一侧，另一侧余出的空间便于与启动区14的试剂层6进行接触。去干扰试剂和信号提供试剂固定在流动垫5上。

实施例7：

一种本发明的谷丙转氨酶定量测试试条(GPT测试试条)，该定量测试试条是由上述实施例5的干化学定量测试试条制成。该测试试条包括底衬7，底衬7采用透明的聚碳酸酯(PC)板，其厚度为0.3mm。

底衬7上方的中部设有流动垫5，本实施例中流动垫5的制作方法为：将含有5mM 4-氨基安替比林(第一显色剂)、2mM THBHA(色原剂)、0.5M的L-丙氨酸的PBS溶液(浓度为0.1M，pH＝7.2)喷涂在约10μm孔径的硝酸纤维素膜上，干燥。

流动垫5上方的一端设有酶结合垫4，本实施例中酶结合垫4的制作方法为：将含有100KU/L过氧化物酶、200KU/L丙酮酸氧化酶的PBS溶液(浓度为0.1M，pH＝7.2)喷涂在0.09mm厚的聚酯纤维膜上，干燥。

酶结合垫4上设有滤血膜3，材料为玻璃纤维，不处理。

滤血膜3上设有样品垫2，本实施例中样品垫2的制作方法为：将含1％(w/w)NaCl溶液喷涂在厚为0.36mm的玻璃纤维上，干燥。

样品垫2上还设有扩散层1，扩散层1为聚酯纤维制成的网布形式，孔径为80目。

底衬7上的另一端还设有启动区14，启动区14中试剂层6的制作方法为：将含有0.1M α-酮戊二酸喷涂在厚度为0.175mm的单面磨砂的聚碳酸酯薄片上，干燥。该试剂层6是通过粘合方式组装在底衬7的一端。由图6可见，该试剂层6位于流动垫5的一侧，且在常态下(即未用于检测前)加样区13和启动区14相互隔开一定距离，试剂层6与流动垫5保持非接触方式，由于加样区13和启动区14中间的底衬7上还设有一折痕线11，在进行检测过程中，当待测样品液渗透到流动垫5上时，试剂层6可通过包括翻折之类的任何方式与流动垫5相接触。

其中，启动区14固定的测试反应启动试剂主要是指能够启动转氨酶反应的底物，具体到本实施例中，试剂层6上固定有能够启动转氨酶反应的底物(即上述的α-酮戊二酸)。加样区13上固定的去干扰试剂主要包括上述酶结合垫4上固定的丙酮酸氧化酶和过氧化物酶(POD)等，加样区13上固定的信号提供试剂主要包括上述流动垫5上固定的适用于过氧化物酶的显色剂等。

将一系列不同浓度的谷丙转氨酶使用生化分析仪试剂盒定值(浓度值见下表1)，然后分别取30μL不同浓度的谷丙转氨酶溶液作为待测样品，各待测样品中均含有干扰物丙酮酸(浓度为100μM)，通过上述的本实施例的测试试条和以下方法步骤测试待测样品中的谷丙转氨酶含量：待测样品液首先滴加到测试试条的扩散层1上，使待测样品液依次流经样品垫2和滤血膜3并逐渐浸润到酶结合垫4上，酶结合垫4上固定的催化反应酶(包括上述的丙酮酸氧化酶、过氧化物酶等)及显色剂等物质复溶到待测样品液中，待测样品液中含有的内源性干扰物质丙酮酸与前述的催化反应酶进行反应，待测样品液继续渗透到流动垫5上，经过一段孵化过程(通常为1min)后，内源性的丙酮酸已经显色完全，读取此时的反射率R1(见下表2)。接着使测试试条的试剂层6与流动垫5相接触，试剂层6上固定的底物(α-酮戊二酸)复溶到待测样品液中，并开始启动转氨酶反应，转氨酶反应启动后生成的丙酮酸参与偶联反应，偶联反应后生成的双氧水与显色剂进行显色反应，2min读取此时的反射率R2(见下表1)，根据R1和R2值可测算出谷丙转氨酶的含量(测算过程及公式见下文)。在上述的检测方法中，谷丙转氨酶还没有启动反应之前，内源性干扰物丙酮酸已经通过催化反应去除。

同样取以上系列不同浓度的谷丙转氨酶溶液作为待测样品液，但各待测样品液中不含干扰物丙酮酸，同样采用上述的测试试条及测试方法对这些待测样品液进行测试，测试结果如下表1所示，作为上述实施例的对比例1。

表1：实施例7和对比例1测得的不同浓度待测样品液的反射率值

根据库贝尔卡-蒙克(Kubelka-Monk)定理，反射率与待测样品浓度有下列线性关系：

上式中：R为反射率；k、b为常数；C为待分析物浓度。因此，酶活性与

(以下简写为E)有线性比例关系。根据各个GPT浓度的R1、R2值计算E值，列于下表2.。

表2：实施例7与对比例1的E值比较图

根据上表2中的数值建立直线回归方程，如图9所示。从图9中可以看出，本实施例的E值与对比例1的E值吻合的非常好，可见其去干扰效果很好。

为了进一步考察，继续用本实施例的GPT测试试条测试以下待测液：A液(31u/L GPT)、B液(31u/L GPT，含100μM丙酮酸)、C液(31U/L GPT，含150μM丙酮酸)、D液(31U/LGPT，含200μM丙酮酸)，结果如下表3所示：

表3：测试相同GPT活性、不同丙酮酸浓度的样品对比

从上表3可以看出，200μM的丙酮酸对本发明测试试条及测试方法的准确性和精确度基本没有影响。

实施例8：

一种本发明的谷草转氨酶定量测试试条(GOT测试试条)，该定量测试试条同样是由上述实施例7的干化学定量测试试条制成。本实施例测试试条各层的结构、连接方式及位置分布与实施例7相同，而且，底衬7、试剂层6、滤血膜3、样品垫2、扩散层1的制作材料、制作试剂及处理方法均与实施例7相同，仅仅是流动垫5和酶结合垫4的制作方法有少许差异。

本实施例中流动垫5的制作方法为：将含有5mM 4-氨基安替比林(第一显色剂)、2mMTHBHA(色原剂)、0.2M的L-门冬氨酸、0.2％(w/w)的PBS溶液(浓度为0.1M，pH＝7.2)喷涂在约10μm孔径的硝酸纤维素膜上，干燥。

本实施例中酶结合垫4的制作方法为：将含有100KU/L过氧化物酶、200KU/L丙酮酸氧化酶、200KU/L草酰乙酸脱羧酶喷涂在0.09mm厚的聚酯纤维膜上，干燥。

将一系列不同浓度的谷草转氨酶使用生化分析仪试剂盒定值(浓度值见下表4)，然后分别取30μL不同浓度的谷草转氨酶溶液作为待测样品，各待测样品中均含有干扰物丙酮酸(浓度为100μM)，通过上述的本实施例的测试试条测试谷草转氨酶含量，测试方法同实施例7，读取R1、R2，结果如表4所示。

同样取以上系列不同浓度的谷草转氨酶溶液作为待测样品液，但各待测样品液中不含干扰物丙酮酸，同样采用上述的测试试条及测试方法对这些待测样品液进行测试，测试结果如表4所示，作为上述实施例的对比例2。

表4：实施例8和对比例2测得的不同浓度待测样品液的反射率值

(以下简写为E)有线性关系。根据各个GOT浓度的R1、R2值计算E值，列于下表5.。

表5：实施例8与对比例2的E值比较图

根据上表5中的数值建立直线回归方程，如图10所示。从图10中可以看出，实施例8的E值与对比例2的E值吻合的非常好，可见其去干扰效果很好。

为了进一步考察，继续分别用本实施例的GOT测试试条测试以下待测液：A液(35u/LGOT)、B液(35u/L GOT，含100μM丙酮酸)、C液(35u/L GOT，含150μM丙酮酸)、D液(35u/L GOT，含200μM丙酮酸)，结果如下表6：

表6：测试相同GOT活性、不同丙酮酸浓度的样品对比

从上表6可以看出，200μM的丙酮酸对本发明测试试条及测试方法的准确性和精确度基本没有影响。

上述各实施例仅是对本发明技术方案的具体描述，而不能解释为对本发明的限制。本领域的技术人员应该理解，在不脱离本发明技术方案的实质精神和保护范围的情况下，对本发明所作的任何形式或细节的各种修改及等同替换，均在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述定量测试试条包括底衬，所述底衬上设置一固定有去干扰试剂和信号提供试剂的加样区，所述底衬上还设置一固定有测试反应启动试剂的启动区，所述加样区和启动区是以在通常状态下保持非接触、在测试状态下可互相接触的方式布设在所述定量测试试条上，所述启动区上固定的测试反应启动试剂主要是指能够启动转氨酶反应的底物，所述加样区上固定的去干扰试剂包括丙酮酸氧化酶和过氧化物酶，所述加样区上固定的信号提供试剂包括适用于所述过氧化物酶的显色底物、荧光底物或化学发光底物。

2.根据权利要求1所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述加样区包括叠加设置、且固定于底衬上的流动垫、酶结合垫、滤血膜、样品垫和扩散层；所述酶结合垫上设有滤血膜，所述滤血膜上设有样品垫，所述样品垫上设有扩散层。

3.根据权利要求2所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述底衬选用聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺高分子聚合材料制作，所述流动垫选用玻璃纤维、硝酸纤维素膜、聚酯纤维膜或滤纸制作，所述酶结合垫选用玻璃纤维、纤维素滤纸、聚酯纤维或滤纸制作，所述滤血膜选用不对称聚砜膜或玻璃纤维制作，所述样品垫选用玻璃纤维或聚酯纤维制作，所述扩散层选用聚酯纤维或尼龙纤维制成的网布形式。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述加样区直接固定在所述底衬上，所述启动区通过一粘结件连接在所述底衬上，该粘结件具有足够的高度使所述启动区的大部分区域悬置于所述加样区上方，且该启动区可通过下压与所述加样区保持接触。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述加样区和启动区被一分隔层隔开，该分隔层为可抽离式连接方式，以使得该分隔层被抽离出测试试条后所述加样区和启动区能保持接触。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述加样区直接固定在所述底衬上，所述启动区通过一铰接件铰接于所述底衬的一端，所述铰接件的转轴轴向与水平面平行或垂直，以使得启动区通过旋转后能与所述的加样区保持接触。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述加样区和启动区分别固定在所述底衬同一面的不同区域，所述加样区和启动区中间的底衬上设有一折痕线，以使得所述底衬沿折痕线弯折后能使启动区与加样区保持接触。

8.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述启动区上方覆盖有一保护层，所述保护层选用透明的聚碳酸酯或聚氯乙烯材料制作。

9.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述丙酮酸氧化酶的浓度为30 KU/L～600KU/L，所述过氧化物酶的浓度为30KU/L～600KU/L，所述显色底物、荧光底物或化学发光底物的浓度为1mM～50mM。

10.根据权利要求1～3中任一项所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条，其特征在于：所述启动转氨酶反应的底物包括α—酮戊二酸，所述α—酮戊二酸的浓度为5mM～300mM；所述启动转氨酶反应的底物还包括用于检测谷丙转氨酶的L—丙氨酸或者用于检测谷草转氨酶的L—门冬氨酸，所述L—丙氨酸的浓度为0.01M～1M，所述L—门冬氨酸的浓度为0.01M～1M。

11.一种用权利要求1所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条检测谷丙或谷草转氨酶的方法，包括以下步骤：首先将待测样品液添加到所述测试试条的加样区，所述加样区上固定的丙酮酸氧化酶、过氧化物酶及显色底物均复溶到待测样品液中，所述待测样品液中含有的内源性干扰物质丙酮酸与待测样品液中的酶及显色底物开始进行显色反应，经过一段孵化过程后，获取该显色底物显色的反射率值，该反射率值即设定为内源性干扰物质的背景显色值；再使所述测试试条的启动区与加样区相接触，启动区上固定的底物复溶到待测样品液中，并开始启动转氨酶反应，转氨酶反应启动后生成的丙酮酸参与偶联反应，偶联反应后生成的双氧水与所述显色底物进行二次显色反应，根据显色底物显色的二次反射率值的终点或者变化率和所述背景显色值，通过终点法或速率法测定出谷丙或谷草转氨酶的含量。

12.一种用权利要求2所述的谷丙或谷草转氨酶定量测试试条检测谷丙或谷草转氨酶的方法，包括以下步骤：首先将待测样品液滴加到所述测试试条加样区的扩散层上，使待测样品液依次流经样品垫和滤血膜并逐渐浸润到所述酶结合垫上，所述加样区上固定的丙酮酸氧化酶、过氧化物酶及显色底物均复溶到待测样品液中，所述待测样品液中含有的内源性干扰物质丙酮酸与待测样品液中的酶及显色底物开始进行显色反应，经过一段孵化过程后，获取显色剂显色的反射率值，该反射率值即设定为内源性干扰物质的背景显色值；再使所述测试试条的启动区与加样区相接触，启动区上固定的底物复溶到待测样品液中，并开始启动转氨酶反应，转氨酶反应启动后生成的丙酮酸参与偶联反应，偶联反应后生成的双氧水与所述显色底物进行二次显色反应，根据显色底物显色的二次反射率值的终点或者变化率和所述背景显色值，通过终点法或速率法测定出谷丙或谷草转氨酶的含量。