CN103472239A - 一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，包括染料底层、蛋白酶固定层、顶层保护层。本发明所使用的方法具有高度的选择性，作为蛋白质酶，其对反应物具有高度的特异性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反应，对其他的反应底物都没有催化活性，由于检测过程中涉及到三种高度特异性的酶，本方法的选择性更是呈指数增加，试剂盒最后给出的响应是荧光响应，相与某些检测颜色变化的方法相比，荧光响应的固有特性赋予本发明更高的灵敏度以及抗干扰的能力。

Description

一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法

本申请是一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法的分案申请，原申请申请日2011年9月20日，原申请号：2011102799693，发明创造名称：一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。

技术领域

本发明属于肌酸酐检测领域，尤其是一种肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。

背景技术

肌酸酐是磷酸肌酸代谢的产物，其化学结构是肌酸通过脱水缩合形成的内酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通过血液循环到达肾脏并被过滤掉。对于肾功能正常的人群来说，血液中的肌酸酐浓度因人因地而异。一般而言，在无大体力负担的情况下，女性的血液中的肌酸酐浓度在45-60μM；男性的血液肌酸酐浓度在60-110μM的范围内浮动。当肾功能出现问题时，肾脏过滤清除肌酸酐的能力就会降低，导致血液中肌酸酐的浓度异常升高而尿液中肌酸酐浓度降低，因此通过测量血液和尿液中肌酸酐的浓度，就可以测量肌酸酐清除率甚至肾小球率过滤，这两个参数对于衡量肾功能具有重要的意义，因此，可以快捷的测量血液和尿液中的肌酸酐浓度，对于临床和科研，都具有十分重大的应用前景。

肌酸酐的测量比较困难。目前常用的方法是质谱法（同位素稀释质谱法）、高效液相色谱法、液相色谱-质谱连用法以及抗体检测（ELISA），这些方法一般都需要昂贵的仪器，如质谱仪、液相色谱仪或酶标仪等，以及受过系统训练的分析化学操作人员的操作，极大地提高肌酸酐测量的经济成本和时间成本，以及肌酸酐测量在边远地区的应用。

质谱法通过在样品中人为加入含有某种同位素（如O-18）的肌酸酐并对此样品进行质谱分析。比对质谱结果中O-18的丰度和O-18在自然界中的丰度即可计算出肌酸酐的浓度。人为加入的肌酸酐可以严格控制，作为一种内标准（internal calibration），这种方法可以有效的降低误差。根据最新研究，用质谱法得到的肌酸酐浓度偏低，这将在临床上引起一系列问题，美国FDA也开始考虑新的肌酸酐检测手段。

液相色谱法是在质谱的基础上使用高效液相色谱对样品进行纯化并用质谱进行检测。质谱法和液相色谱法无法自动化、操作复杂，并且需要分析团队对仪器进行操作和维护，而ELISA法需要使用价格昂贵的酶标仪，虽然其灵敏度极高，但是选择性较差，经常会高估肌酸酐的浓度，导致临床用药的过量或不足。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种选择性高、灵敏度高和使用方便的肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种肌酸酐含量检测试剂，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢，在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根过氧化物酶：荧光染料的重量比为：1：50：60：5。

而且，包括如下三层结构：

⑴染料底层：将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干；

⑵蛋白酶固定层：在PVA-Sbq（聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物）的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25-40分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干；

⑶顶层保护层：最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶，并使膜层自然风干。

而且，三层结构的具体制备步骤如下：

⑴将176mg纤维素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；

⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；

⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；

⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；

⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。

一种肌酸酐含量检测试剂盒，包括上述的检测试剂。

一种肌酸酐含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤如下：

⑴将176mg纤维素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；

⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；

⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；

⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；

⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。

一种试剂盒的使用方法，其特征在于：在含有100mM HEPES，150mM氯化钠，5mM氯化钾，1.3mM氯化钙的缓冲液中，pH7.3，加入不同浓度肌酸酐，用毛细管两驱150μL的样品溶液并安插在试剂盒上并用荧光仪开始测量。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明所使用的方法具有高度的选择性，作为蛋白质酶，其对反应物具有高度的特异性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反应，对其他的反应底物都没有催化活性，由于检测过程中涉及到三种高度特异性的酶，本方法的选择性更是呈指数增加，试剂盒最后给出的响应是荧光响应，相与某些检测颜色变化的方法相比，荧光响应的固有特性赋予本发明更高的灵敏度以及抗干扰的能力。

2、本申请提供了一种新型的用于检测血液和尿液中肌酸酐含量的试剂盒，本试剂盒将对肌酸酐具有特异性的酶以及对过氧化物敏感的荧光染料固定在试剂盒上，并将酶催化的反应转化为荧光信号并得以检测，本试剂盒可以检测出10μM以上的肌酸酐，符合临床上的使用要求。

3、本发明所使用的酶共有四种：肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，样品中的肌酸酐通过前三种酶被降解为甘氨酸，同时生成少量的过氧化氢，在辣根过氧化物酶的催化下，过氧化氢可以氧化一种原本没有荧光的分子，反应产物是荧光素的衍生物，具有较强的荧光响应，通过检测荧光的增强速率，可以检测到过氧化氢的生成速率，并间接计算出肌酸酐的浓度。

4、本发明对现有的肌酸酐检测技术以及本申请所阐述的试剂盒进行了比较，作为肾功能的重要参数，肌酸酐清除率和肾小球率过滤的肌酸需要多次进行血液和尿液的肌酸酐测量，因此，本申请所提及的肌酸酐试剂盒所具有的使用简单、价格低廉且具有高度选择性的特点将具有十分重大的意义。

表1 现有肌酸酐检测方法的比较

附图说明

图1为本发明苯基乙烯吡啶的交联反应式；

图2为本发明肌酸酐传感器使用的试剂盒的结构；

图3为本发明在不同钾离子浓度下试剂盒的样品的荧光随时间的响应；图3-1与图3-2分别是用两种方式表示时间相应。

图4为根据图4计算得到的荧光增加强度和钾离子浓度间的相关性。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

以下实施例提到的百分比如果没有特殊标明均为重量百分比，单位mM表示毫摩尔每升。

一、肌酸酐试剂盒的化学原理

本发明所阐述的肌酸酐试剂盒包括四种酶和一种荧光染料，他们分别是：肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶。荧光染料的化学名称是5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯（结构如下A），该荧光染料的荧光产率很低，因此在一般条件下，其荧光发射效率很低，该荧光染料可以被氧化成为2,7-二氯荧光素（结构式见B），2,7-二氯荧光素具有很高的量子产率，因此该荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯的氧化过程可以通过对荧光的测定来监测。

5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯（A）及其氧化后产物（B）的结构

本发明对肌酸酐的检测的化学过程叙述如下：肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢（以上过程的反应方程式如下），在辣根氧化物酶的催化下，上述过程中形成的过氧化氢催化氧化了5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，可以间接的获得肌酸酐浓度的信息。

二、蛋白质酶和荧光染料的固定

在试剂盒中，酶和荧光染料将被固定在固相底物中。最底层是D4水凝胶（一种聚氨酯-聚乙二醇水凝胶，具体见以下专利:US 2008/0152864 A1）支持层，主要成分是聚乙二醇和聚酰胺酯的线性聚合物。鉴于荧光染料（结构式为A）的不稳定性，它通过共价键被固定在纤维素上，而荧光染料-纤维素的颗粒被均匀的分散在D4水凝胶层中。蛋白质酶被固定在第二层，其主要成分是聚乙烯醇和苯基乙烯吡啶的共聚物。聚乙烯醇-苯基乙烯吡啶的水溶胶和蛋白质酶混合均匀后成溶胶状态。当混合物被紫外照射后，苯基乙烯吡啶产生交联，使混合物固化；而蛋白质酶也将被物理固定在凝胶中，其反应式见图1。

由于蛋白质酶被固定在固体中并被干燥保存，所以其水解和降解相对来说会困难很多：首先由于缺水，水解发生的可能性大大降低；其次由于固相保护层的存在，蛋白质分解酶接触蛋白质分子比较困难，导致于其催化的水解反应不能发生，因此可以预期，被固定的蛋白质酶也将比较稳定。

三、试剂盒的制作方法：

⑴染料底层：将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌一小时，随即在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干。

⑵蛋白酶固定层：在PVA-Sbq（聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物）的水溶液中混入10%的牛血清蛋白以及反应所需的四种酶（肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶）并搅拌30分钟以上，该溶液将用于酶的固定化，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干。

⑶顶层保护层：最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶（一种聚氨酯-聚乙二醇水凝胶，具体见以下专利:US 2008/0152864 A1）并使膜层自然风干。

⑷使用切割机割取直径约为5mm的圆片并安装于空试剂盒中。最后的试剂盒的形状见图2。血样通过毛细管从试剂盒右部进入试剂盒并通过黑色的阀门和传感器接触并产生信号而被荧光仪接收。目前试剂盒上预留了其他五个其他传感器的位置已达到一次检测多个检测物的目的。

四、具体制备实例：

1、试剂盒制备步骤：

⑴将176mg纤维素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；

⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；

⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；

⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；

⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干；

⑹割取步骤⑸中所制备的薄膜并安装在试剂盒上即可进行测量。

鉴于荧光染料（结构式为A）的不稳定性，它通过共价键被固定在纤维素上，固定方法如下：

将1g氨基纤维素和50mg荧光染料在二甲基甲酰胺溶剂中混合并搅拌均匀，缓缓加入约200mg的二环己基碳二亚胺和100mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌混合物四小时后过滤并用二甲基亚酰胺冲洗滤渣并干燥。

2、样品测量：

在含有100mM HEPES，150mM氯化钠，5mM氯化钾，1.3mM氯化钙的缓冲液中（pH7.3）加入不同浓度肌酸酐，用毛细管两驱约150μL的样品溶液并安插在试剂盒上并用便携式荧光仪OPTI CCA-TS开始测量。

3、数据分析：

和荧光仪相连的电脑将记录反应产生的光子发射强度和时间的曲线，根据该曲线可以求得反应速率，该速率就是试剂盒对肌酸酐的响应，根据标准曲线可以求得肌酸酐的浓度。

4、实验数据：试剂盒对肌酸酐的响应：

上述步骤得到的试剂盒对肌酸酐响应在图3、图4表明。图3是在不同肌酸酐浓度下试剂盒的样品的荧光随时间的响应。可以看到，在不同的肌酸酐浓度下，荧光上升的速度是不一样的。当溶液中不存在肌酸酐时，在六十秒内荧光强度上升了约40%。而当溶液中含有0.5mM的肌酸酐时，在六十秒内荧光强度上升了约80%。所以荧光增强的速度和肌酸酐的浓度是密切相关的，也可以使用荧光增加的速率来计算肌酸酐的浓度。

图4表示根据图3计算得到的荧光增加强度和肌酸酐浓度间的相关性。可以更明显的看到，肌酸酐和荧光增加速率的相关性。肌酸酐浓度和荧光增加速率呈线性关系。这将极大的方便标准曲线的计算。根据3σ法计算所得的灵敏度为10μM。

5、结论

本专利申请阐述了一种新型的用于检测血液和尿液中肌酸酐含量的试剂盒。本试剂盒将对肌酸酐具有特异性的酶以及对过氧化物敏感的荧光染料固定在试剂盒上，并将酶催化的反应转化为荧光信号并得以检测。

本试剂盒可以很容易地检测出10μM以上的肌酸酐，符合临床上的使用要求。

Claims (2)

1.一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法，其特征在于：

检测试剂包括：肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢，在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根过氧化物酶：荧光染料的重量比为：1：50：60：5；

三层结构为：

⑴染料底层：将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干；

⑵蛋白酶固定层：在PVA-Sbq（聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物）的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25-40分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干；

⑶顶层保护层：最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶，并使膜层自然风干；

三层结构的具体制备步骤如下：

⑴将176mg纤维素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；

⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；

⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；

⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；

⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。

2.一种肌酸酐含量检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述制备的三层结构的肌酸酐含量检测试剂。

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