JPH0440000B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は定量すべき成分（Ｘ）がオキシダーゼ
（Ａ）で酸化されない成分であつて、定量すべき
成分をオキシダーゼ（Ａ）を利用して過酸化水素
を生成させ、生成した過酸化水素を定量すること
によつて成分（Ｘ）を定量する方法において、
オキシダーゼ（Ａ）、パーオキシダーゼ、下
記一般式（Ｉ） 〔式中、ＺはOH又はNR₄R₅（R₄，R₅は同一又
は異なつてよく水素、置換又は非置換の炭素数１
−５のアルキル）置換基はヒドロキシル、アミ
ノ、炭素数２−５のアルカノイルアミノを示す又
は炭素数２−５のアルカノイルを示す）を示し、
R₁，R₂，R₃は同一又は異なつてよく、水素、ハ
ロゲン、炭素数１−５のアルキル、炭素数１−５
のアルコキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシル、
スルホン酸基を示す。但しＺがOHのときR₁とR₂
とR₃は同時に水素ではない。〕で表わされる化合
物を含む液からなる第１試薬液を試料に加えて試
料中のオキシダーゼ（Ａ）の基質を酸化して生成
する過酸化水素を分解した後、一般式（Ｉ）で
表される化合物と共同して発色するカツプラー及
び定量すべき成分（Ｘ）からオキシダーゼ
（Ａ）の基質に導びくのに要する酵素を含む液か
らなる第２試薬液を加えて生成する過酸化水素を
定量することを特徴とする試料中の成分（Ｘ）の
定量方法に関する。 過酸化水素は食品その他の漂白、殺菌等に用い
られているが残存する過酸化水素を除くため一般
にカタラーゼ（EC 1.11.1.6）用いて過酸化水素
を分解する方法が知られている。しかしこの方法
では微量の過酸化水素が残り且つ分解速度も遅
く、さらに優れた方法の開発が望まれている。 過酸化水素の反応性について検討の結果、化合
物（Ｉ）がパーオキシダーゼの存在下に過酸化水
素と極めて迅速に反応し過酸化水素が極めて短時
間に分解されることがわかつた。 さらに検討の結果、上記の原理を酵素を用いて
試料中の特定の物質を定量する方法に適用するこ
とによつて該物質が極めて簡単に定量できること
がわかつた。 即ち試料中に存在するある物質を定量する方法
としてその物質を基質とするオキシダーゼの作用
によつてその物質を酸化し、化学量論的に生成す
る過酸化水素を定量することによつて該物質を定
量する方法が知られている。定量されるべき物質
に作用して直接過酸化水素を生成しない場合でも
その物質に適当な酵素等を作用させてオキシダー
ゼによつて直接酸化されうる物質に変換せしめれ
ば、この物質は上記方法によつて定量されること
ができる。 しかしながら、試料中に定量されるべき物質の
正確な定量を阻害する物質が含まれている場合に
は阻害物質をあらかじめ直接除去するか分解して
おく必要がある。 例えば従来物質の遊離形とエステル形の両物質
を含有する試料中のエステル形のみを定量す場
合、一般にまず該物質に作用するエステラーゼの
作用によつてエステル形を遊離形とし、次いでオ
キシダーゼによつて遊離形を酸化して生成する過
酸化水素の量からエステル形に由来する遊離形と
試料中の遊離形の合計量を定量する。次いで元の
試料にエテスラーゼを加えないでオキシダーゼの
みを用いて試料中の遊離形のみを定量し、合計量
から遊離形を差引くことによつてエステル形の定
量が行われている。 本発明方法を利用してこの定量を行うと、以下
に示されるように簡単に行うことができる。即
ち、試料にまずオキシダーゼ、パーオキシダーゼ
及び化合物（Ｉ）を加えて反応させると遊離形の
化合物は酸化され、生成する過酸化水素は色素に
導かれることなく分解される。 この反応物に該化合物のエステラーゼ及び発色
剤を加えて反応させ生成する色素によつて着色し
た反応液の吸収を測ることによつてエステル形化
合物の定量が簡単にできる。 本発明方法の原理は遊離形とエステル形の化合
物を含有する試料中のエステル形の定量のみなら
ず、試料中の特定の物質の定量において該物質に
由来しない過酸化水素の消去に適用できる。かか
る適用によつて定量分析が正確に、速く、簡単に
できる。 一般式（Ｉ）においてR₁〜R₅におけるアルキ
ルは炭素数１〜５のアルキル例えばメチル、エチ
ル、プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル等を含
む。R₄及びR₅における置換アルキルの置換基は
ヒドロキシル、アミノ、アルカノイルアミノを示
し、アルカノイルアミノにおけるアルカノイルは
R₄におけるアルカノイルと同一の意義を有する。 R₄，R₅におけるアルカノイルは炭素数２−５
のアルカノイル例えばアセチル、プロピオニル、
プチリル等を含む。 R₁〜R₃においてハロゲンはクロル、ブロム、
ヨードを示し、アルコキシは炭素数１−５のアル
コキシ例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、
ブトキシ等を含む。 本発明で用いられる化合物（Ｉ）の具体例が次
に示される。 ２，４−ジクロルフエノール、ｐ−クロルフエ
ノール、２，４−ジブロムフエノール、Ｐ−ブロ
ムフエノール、２，３−ジクロルフエノール、２
−ニトロフエノール、３−ニトロフエノール、２
−アミノフエノール、３−アミノフエノール、ア
ニリン、２−ブロムアニリン、３−ブロムアニリ
ン、２−クロルアニリン、３−クロルアニリン、
オルトトルイジン、メタトルイジン、ジメチルア
ニリン、ジエチルアニリン、ｏ−フエニレンジア
ミン、Ｎ，Ｎ−ｐ−フエニレンジアミン、ｏ−ア
ニシジン、メタアニシジン、ｏ−クレゾール、ｍ
−クレゾール、２−メチル−２，６−ジニトロフ
エノール、２−メトキシ−5′−ニトロアニリン、
２−メチル−５−ニトロアニリン、３，５−ジヒ
ドロキシトルエン、３−メトキシフエノール、２
−アミノ−５−メチルフエノール、２−ヒドロキ
シー３−メチルベンゾイツクアシツド、２−ヒド
ロキシフエニル酢酸、２，３−ジメチルフエノー
ル、２，５−ジメチルフエノール、２−エチルフ
エノール、３−エチルフエノール、２−メトキシ
メチルフエノール、２，３−ジメチルアニリン、
２，５−ジメチルアニリン、３，５−ジエチルア
ニリン、３−（ジメチルアミノ）フエノール、３
−メトキシーＮ，Ｎ−ジメチルアアニリン、Ｎ，
Ｎ−ジエチル−１，３−フエニレンジアミン、
３，５−ジメチル−1.2−フエニレンジアミン。 本発明方法によつて過酸化水素を消去するに際
しては少なくとも消去されるべき過酸化水素と当
量、通常10〜100倍当量の化合物（Ｉ）を加え、
適当量、通常１〜30U／mlのパーオキシターゼ
を含むように調整すれば極めて短時間に過酸化水
素は消去される。 本発明で用いられる化合物（Ｉ）と過酸化水素
との反応によつて過酸化水素が分解される時間を
次の方法によつて測定した。 各種のPHのグツドバツフア3mlに30mgのトリト
ンX100、パーオキシダーゼ（POD）40Uを加え、
この液に４−アミノアンチビリン（４−AA）0.3
mg、又はは第１表に示す化合物（Ｉ）0.9mgを加
え、過酸化水素0.06μlを加えて攪拌し、加えた過
酸化水素の消長を確認するために化合物（Ｉ）に
は４−AA 0.3mg、４−AAには化合物（Ｉ）0.9
mgを加えて径時的に呈色を追跡した。 ４−AAは化合物（Ｉ）、過酸化水素及びPOD
の存在下で反応して色素を生成するので過酸化水
素が化合物（Ｉ）によつて分解されていれば着色
がみられないことを利用している。 比色は化合物（Ｉ）がアニリン系の場合550nm
でフエノール系の場合500nmで測定した。 吸光度の増加がなくなる最少時間が第１表に示
される。又第１及び２図に化合物１，11又は13及
び４−AAを用いたときの過酸化水素の消去速度
を示す。

【表】

【表】

【表】 試料中の特定の物質（物質Ａという）又は試料
中の定量されるべき物質（物質Ｂという）から特
定の物質Ａを生成する反応系における該物質Ａを
オキシダーゼを用いて分解し、生成する過酸化水
素の量から定量する方法において、該物質Ａ以外
の物質（物質Ｅという）の分解に由来する過酸化
水素を消去するために、試料中もしくは反応系の
物質Ｅに由来する過酸化水素と化合物（Ｉ）とを
パーオキシダーゼの存在下に反応させて該過酸化
水素を分解し、次いで物質Ａ又は物質Ｂから定量
的に過酸化水素を生成せしめうる酵素を上記反応
物に加えて生成する過酸化水素を定量することに
よつて物質Ａ又は物質Ｂが簡単に定量できる。 物質Ａの例としてコレステロールエステルある
いはグリセロールエステルが含まれる。一般にこ
れらの物質を含有する試料特に血清中にはこれら
の遊離形の物質を含有し、それ故前述の如くエス
テル形の定量は複雑となる。 そこでこの場合試料にオキシダーゼ、化合物
（Ｉ）及びパーオキシダーゼを加えて遊離形を分
解し生成する過酸化水素も分解し、次いでエステ
ル形を分解して遊離形とする酵素及び発色剤を加
えて生成する過酸化水素を色素に導びき発色した
反応液の吸収を測ることによつてエステル形が定
量できる。 又、遊離コリンとコリン含有リン脂質を含有す
る試料からコリン含有リン脂質を求めるときには
コリン・オキシダーゼ、パーオキシダーゼ及び化
合物Ｉを試料に加えて遊離コリン分解し、生成す
る過酸化水素も分解し、次いでホスホリパーゼＤ
及び発色剤を加えてコリン含有リン脂質を分解し
てコリンを生成させ、このコリンが分解されて生
成する過酸化すいそ定量すればコリン含有リン脂
質が簡単に定量できる。 その他血清中のクレアチニン、シアル酸等の定
量にも本発明方法の適用によつて容易に定量でき
る。 本発明方法を適用して試料中の特定の物質を定
量するに際しては該物質を過酸化水素に導く工程
上で該物質以外の物質から過酸化水素を生成する
ような物質分解する酵素、化合物（Ｉ）及びパー
オキシターゼを試料に加え、必要に応じてバツフ
アーを加えて酵素反応させる。試料と酵素との親
和性をよくするために必要に応じてトリトン
X100等の界面活性剤を加える。これらの試薬等
は前述の過酸化水素消去における量が用いられ
る。 次いで該定量されるべき物質の分解酵素及び発
色剤を通常この種の定量で用いられる量加えた後
発色した反応液の可視部通常400〜700nmの発色
化合物の特徴的吸収波長における吸収が測定され
る。 用いられる発色剤としては４−AAと置換アニ
リン等過酸化水素の量に比例して化合物（Ｉ）と
共同で発色する全ての化合物を用いることができ
る。化合物（Ｉ）は発色化合物の１部として働
き、これと共同で発色する化合物（以下、カツプ
ラーという）として４−AAの他多くの公知のカ
ツプラーが利用できる。 バツフアーとしてはリン酸バツフアー等、用い
られる酵素の至適PHに応じて適宜選択して用いら
れる。 以下に本発明の態様を示す実施例を説明する。 実施例 １ 試験管３本（A.B.C）にＮ−エチル−Ｎ−（３
−メチルフエニル）−N′−アセチルエチレンジア
ミン2μmol、トリトンX100 60mg、パーオキシダ
ーゼ10U、コレステロールオキシダーゼ10Uを含
む0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）2.0mlを加え、試験
管Ａに血清20μl添加し、37℃５分間インキベート
する。加温後４−アミノアンチピリン1μmol、コ
レステロールエステラーゼ5Uを含む0.1Mリン酸
緩衝液（PH6.0）1.0mlを試験管Ａ，Ｂ，Ｃに加え
る。しかるのち、Ｂにコレステロール標準液（コ
レステロール100mg／dl水溶液）20μl、Ｃに精製
水20μlを添加後37℃５分反応し、しかるのちダブ
ルビーム分光光度計にてＣを対照Ａ，Ｂの550nm
の吸光度値を測定し0.372、0.235を得、コレステ
ロールエステル値158.30mg／dlを算出した。 実施例 ２ 試験管３本（Ａ，Ｂ，Ｃ）にｐ−クロルフエノ
ール10μmol、トリトンX100 30mg、パーキシダ
ーゼ20U、コリン・オキシダーゼ5Uを含むPH7.5
0.1Mトリス・塩酸緩衝液2.0mlを加え、試験管Ａ
に血清20μlを加えて、Ａ，Ｂ，Ｃを37℃５分間イ
ンキベートする。 その後、４−アミノアンチピリン1μmol、ホス
フオリバーゼＤ（EC3.1.4.4）0.6Uを含有するPH7.5
0.1Mトリスー塩酸緩衝液1.0mlを加え、Ｂに標準
液（コリン水溶液300mg／dlレシチン換算）20μl、
Ｃに精製水20μlを加えて、37℃５分間インキベー
トし、しかるのちダブルビーム分光光度計にてＣ
を対照にＡ，Ｂの505nmの吸光度値0.323、0.563
を得、コリン含有リン脂質値172.11mg／dlを算出
した。 尚従来は遊離コリンと総コリン（遊離コリン＋
コリン含有リン脂質）を各々求め、その差よりコ
リン含有リン脂質を求めていた。次に従来法で測
定した結果を述べる。 遊離コリン値：試験管３本（Ａ，Ｂ，Ｃ）にｐ
−クロルフエノール10μmol、トリトンX10030
mg、パーオキシダーゼ20U、コリンオキシダーゼ
5U、４−アミノアンチピリン1μmolを含む0.1M
トリス塩酸緩衝液（PH7.5）3.0mlを加え、Ａに血
清20μl、Ｂに標準液（コリン水溶液300mg／dlレ
シチン換算20μl、Ｃに精製水20μlを添加し、37℃
５分間インキベート後、ダブルビーム分光光度計
にてＣを対照にＡ，Ｂの505nmの吸光度を測定し
た。その結果0.026、0.559を得、遊離コリン（レ
シチン換算）13.59mg／dlを算出した。 総コリン値：試験管３本（Ａ，Ｂ，Ｃ）にｐ−
クロルフエノール10μ mol、トリトンX100 30
mg、パーオキシダーゼ20U、コリンオキシダーゼ
5U、ホスフオリパーゼD0.6U、４−アミノアン
チピリン1μ molを含む0.1Mトリス・塩酸緩衝液
（PH7.5）3.0mlを分注し、Ａに血清20μl、Ｂに標準
液（コリン水溶液300mg／dlレシチン換算）20μl、
Ｃに精製水20μlを添加し、37℃５分間インキベー
ト後ダブルビーム分光光度計にてＣを対照にＡ，
Ｂの505nm吸光度を測定し0.351、0.560を得た。
総コリン含有リン脂質（レシチン換算）188.04
mg／dlを算出した。以上より、188.04−13.19＝
174.45mg／dlとなり、従来法と前述の本発明法と
が一致した値が得られることを確認した。 実施例 ３ 試験管３本（Ａ，Ｂ，Ｃ）にジメチルアニリン
5μ mol、トリトンX100 30mg、パーオキシダー
ゼ40U、グリセロールオキシダーゼ50Uを含む
50mMリン酸緩衝液（PH7.0）2.0mlを分注し、Ａ
に血清20μl添加、37℃10分間インキベート後、４
−アミノアンチピリン1μ mol、リポプロテイン
リパーゼ（EC3.1.1.3）0.5Uを含む50mMリン酸
緩衝液（PH7.0）1.0mlを加え、Ｂにグリセロール
標準液（200mg／dlトリオレイン相当）20μl、Ｃ
に精製水20μlを添加して37℃10分間インキベート
後ダブルビーム分光光度計にてＣを対照にＡ，Ｂ
の550nmにおける吸光度0.163、0.223を得、中性
脂肪値146.19mg／dlを算出した。 従来は血中の遊離グリセロールと総グリセロー
ル（遊離グリセロール＋中性脂肪）を別々に求
め、その差から真の中性脂肪値を求めていた。 そこで従来法と本発明法の測定値を比較した。
遊離グリセロール値：試験管３本（Ａ，Ｂ，Ｃ）
にジメチルアニリン5μ mol、トリトンX100 30
mg、パーオキシダーゼ40U、グリセロールオキシ
ダーゼ50U、４−アミノアンチピリン1μmolを含
む50mMリン酸緩衝液（PH7.0）、3.0mlを分注し、
Ａに血清20μl、Ｂに標準液（グリセロール水溶液
200mg／dlトリオレイン相当）20μl、Ｃは精製水
20μlを添加し、10分間インキベートし、ダブルビ
ーム分光光度計にて、Ｃを対照にＡ，Ｂの550nm
の吸光度を測定し、0.010、0.225を得、遊離グリ
セロール8.89mg／dlを算出した。 総グリセロール：試験管３本（Ａ，Ｂ，Ｃ）に
ジメチルアニリン5μ mol、トリトンX100 30mg、
パーオキシダーゼ40U、グリセロールオキシダー
ゼ50U、リポプロテインリパーゼ0.5U、４−アミ
ノアンチピリン1μ molを含むPH7.0 50mMリン酸
緩衝液3.0mlを分注し、Ａに血清20μl、Ｂに標準
液（グリセロール水溶液200mg／dlトリオンイン
相当）20μl、Ｃに精製水20μlを加え、37℃10分間
加温後ダブルビーム分光光度計にてＣを対照に
Ａ，Ｂの550nmにおける吸光度を求めた結果
0.173、0.224を得、総グリセロール値145.46mg／
dl（トリオレイン換算）を算出した。以上の結果
から154.46−8.89＝154.57mg／dlが中性脂肪とし
て算出され、従来法と法発明法がよく一致した。

【図面の簡単な説明】

第１及び２図は、次の化合物を用いて過酸化水
素を消去したときの過酸化水素濃度（縦軸：μ
mol／ml）と反応時間（横軸：秒）との関係を示
す。 第１図：化合物No.１，PH６、第１図：化合
物No.13，PH6.75、第１図：化合物No.11，PH５、
第２図 4AA，PH６。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 定量すべき成分（Ｘ）がオキシダーゼ（Ａ）
   で酸化されない成分であつて、定量すべき成分を
   オキシダーゼ（Ａ）を利用して過酸化水素を生成
   させ、生成した過酸化水素を定量することによつ
   て成分（Ｘ）を定量する方法において、オキシ
   ダーゼ（Ａ）、パーオキシダーゼ、下記一般
   式（Ｉ） 〔式中、ＺはOH又はNR₄R₅（R₄，R₅は同一又
   は異なつてよく水素、置換又は非置換の炭素数１
   −５のアルキル（置換基はヒドロキシル、アミ
   ノ、炭素数２−５のアルカノイルアミノを示す）
   又は炭素数２−５のアルカノイルを示す）を示
   し、R₁，R₂，R₃は同一又は異なつてよく、水素、
   ハロゲン、炭素数１−５のアルキル、炭素数１−
   ５のアルコキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ
   ル、スルホン酸基を示す。但しＺがOHのときR₁
   とR₂とR₃は同時に水素ではない。〕で表わされる
   化合物を含む液からなる第１試薬液を試料に加え
   て試料中のオキシダーゼ（Ａ）の基質を酸化して
   生成する過酸化水素を分解した後、一般式
   （Ｉ）で表される化合物と共同して発色するカツ
   プラー及び定量すべき成分（Ｘ）からオキシダ
   ーゼ（Ａ）の基質に導びくのに要する酵素を含む
   液からなる第２試薬液を加えて生成する過酸化水
   素を定量することを特徴とする試料中の成分
   （Ｘ）の定量方法。