JPH1052299A - 試薬キット及び試薬キットの使用方法 - Google Patents
試薬キット及び試薬キットの使用方法Info
- Publication number
- JPH1052299A JPH1052299A JP21283796A JP21283796A JPH1052299A JP H1052299 A JPH1052299 A JP H1052299A JP 21283796 A JP21283796 A JP 21283796A JP 21283796 A JP21283796 A JP 21283796A JP H1052299 A JPH1052299 A JP H1052299A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent
- protecting group
- component
- coa
- acetyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 試薬を安定化させ、液状で長期間使用可能な
試薬を提供する。 【解決手段】 保護基を有する試薬成分を含む第一試薬
と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬
からなる試薬キット、および保護基を有する試薬成分を
含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を
含む第二試薬とを用時に混合して、保護基を脱離させる
工程を有する試薬キットの使用方法。
試薬を提供する。 【解決手段】 保護基を有する試薬成分を含む第一試薬
と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬
からなる試薬キット、および保護基を有する試薬成分を
含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を
含む第二試薬とを用時に混合して、保護基を脱離させる
工程を有する試薬キットの使用方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試薬キット及び試薬
キットの使用方法に関する。
キットの使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床検査の生体試料分析において使用さ
れる試薬には、不安定な試薬成分を含んだものが少なか
らず存在し、こうした試薬の安定性は上記の試薬成分の
安定性に依存している。
れる試薬には、不安定な試薬成分を含んだものが少なか
らず存在し、こうした試薬の安定性は上記の試薬成分の
安定性に依存している。
【０００３】このような不安定な試薬成分の１つとして
コエンザイムＡ（以下、ＣｏＡＳＨと略す）が挙げられ
る。ＣｏＡＳＨを用いて定量される項目としては例え
ば、次式（Ｉ）で表される、ＣｏＡＳＨとアシルコエン
ザイムＡシンセターゼ（以下、ＡＣＳと略す）を使用す
る血中遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡと略す）の定量があ
る。
コエンザイムＡ（以下、ＣｏＡＳＨと略す）が挙げられ
る。ＣｏＡＳＨを用いて定量される項目としては例え
ば、次式（Ｉ）で表される、ＣｏＡＳＨとアシルコエン
ザイムＡシンセターゼ（以下、ＡＣＳと略す）を使用す
る血中遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡと略す）の定量があ
る。
【０００４】
【化１】
【０００５】また、次式（ＩＩ）で表されるピルビン酸
脱水素酵素（以下、ＰＤＨＬと略す）を用いたピルビン
酸の定量方法（特開平５−９５７９８号公報）がある。
脱水素酵素（以下、ＰＤＨＬと略す）を用いたピルビン
酸の定量方法（特開平５−９５７９８号公報）がある。
【０００６】
【化２】
【０００７】式（Ｉ）および式（ＩＩ）の定量反応に使
用される試薬に添加されるＣｏＡＳＨは熱安定性が良く
ないだけでなく、容易に酸化されて生理活性を失うこと
が知られている〔生化学データーブック（日本生化学
会；東京化学同人）〕。
用される試薬に添加されるＣｏＡＳＨは熱安定性が良く
ないだけでなく、容易に酸化されて生理活性を失うこと
が知られている〔生化学データーブック（日本生化学
会；東京化学同人）〕。
【０００８】このような不安定な試薬成分を含む試薬の
安定化方法としては、弱酸性下に保存したり、キレート
剤の添加、、スルフヒドリル化合物の添加などが行われ
ている。しかしこうした方法をもってしても、調製した
試薬は経時的に活性成分が少なくなるため、定量限界が
経時的に低下し、やがて反応しなくなるという問題点を
有している。最近の臨床検査においては、試薬を溶解す
る手間を省いた液状無調製試薬が主流となってきている
が、上記のような不安定な試薬成分を必要とする試薬に
関しては、上述した試薬成分の安定化の問題のため、未
だ液状無調製試薬は製品化されていない。
安定化方法としては、弱酸性下に保存したり、キレート
剤の添加、、スルフヒドリル化合物の添加などが行われ
ている。しかしこうした方法をもってしても、調製した
試薬は経時的に活性成分が少なくなるため、定量限界が
経時的に低下し、やがて反応しなくなるという問題点を
有している。最近の臨床検査においては、試薬を溶解す
る手間を省いた液状無調製試薬が主流となってきている
が、上記のような不安定な試薬成分を必要とする試薬に
関しては、上述した試薬成分の安定化の問題のため、未
だ液状無調製試薬は製品化されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、不安定な試薬成分を使用して物質を測定する試薬で
あって、液状で長期間使用しうる安定な試薬を提供する
ことである。本発明の他の目的は、不安定な試薬成分を
使用して物質を測定する試薬の安定化方法を提供するこ
とにある。
は、不安定な試薬成分を使用して物質を測定する試薬で
あって、液状で長期間使用しうる安定な試薬を提供する
ことである。本発明の他の目的は、不安定な試薬成分を
使用して物質を測定する試薬の安定化方法を提供するこ
とにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、不安定な試薬
成分をアシル基で保護しておき、測定時に保護基の脱離
を行い必要な試薬成分を生成させることにより、試薬を
安定化させることが可能となることを見いだした。すな
わち、不安定な試薬成分を試薬に添加する場合に、保護
基で保護された該試薬成分を含む第一試薬と該試薬成分
の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬からなる試薬
キットを作製し、用時に上記第一試薬および第二試薬を
混合し、上記の保護基を脱離せしめるという方法を用い
ることにより、液状で長期間使用できる安定な試薬を提
供することが可能となることを見い出し本発明を完成し
た。すなわち本発明は、（１）保護基を有する試薬成分
を含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分
を含む第二試薬からなる試薬キット、（２）保護基を有
する試薬成分を含む第一試薬と、該試薬成分の保護基を
脱離しうる酵素またはその基質のどちらか一方または両
方を含む第二試薬からなる試薬キット、（３）保護基を
有する試薬成分がアシルコエンザイムＡである（１）に
記載の試薬キット、（４）保護基を有する試薬成分がア
セチルコエンザイムＡである（１）に記載の試薬キッ
ト、（５）保護基を有する試薬成分がアセチルコエンザ
イムＡであり、保護基を脱離しうる成分がフォスフォト
ランスアセチラーゼである（１）に記載の試薬キット、
（６）ヒト体液中の成分の測定に用いる（１）〜（５）
のいずれかに記載の試薬キット、（７）保護基を有する
試薬成分を含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離し
うる成分を含む第二試薬とを用時に混合して、保護基を
有する試薬成分の保護基を脱離させる工程を有する試薬
キットの使用方法、（８）保護基を有する試薬成分を含
む第一試薬と、該試薬成分の保護基を脱離しうる酵素ま
たはその基質のどちらか一方または両方を含む第二試薬
とを用時に混合して、保護基を有する試薬成分の保護基
を脱離させる工程を有する試薬キットの使用方法、
（９）保護基を有する試薬成分がアシルコエンザイムＡ
である（７）に記載の試薬キットの使用方法、（１０）
保護基を有する試薬成分がアセチルコエンザイムＡであ
る（７）に記載の試薬キットの使用方法、（１１）保護
基を有する試薬成分がアセチルコエンザイムＡであり、
保護基を脱離しうる成分がフォスフォトランスアセチラ
ーゼである（７）に記載の試薬キットの使用方法、（１
２）ヒト体液中の成分の測定に用いる（７）〜（１１）
のいずれかに記載の試薬キットの使用方法、に関する。
的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、不安定な試薬
成分をアシル基で保護しておき、測定時に保護基の脱離
を行い必要な試薬成分を生成させることにより、試薬を
安定化させることが可能となることを見いだした。すな
わち、不安定な試薬成分を試薬に添加する場合に、保護
基で保護された該試薬成分を含む第一試薬と該試薬成分
の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬からなる試薬
キットを作製し、用時に上記第一試薬および第二試薬を
混合し、上記の保護基を脱離せしめるという方法を用い
ることにより、液状で長期間使用できる安定な試薬を提
供することが可能となることを見い出し本発明を完成し
た。すなわち本発明は、（１）保護基を有する試薬成分
を含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分
を含む第二試薬からなる試薬キット、（２）保護基を有
する試薬成分を含む第一試薬と、該試薬成分の保護基を
脱離しうる酵素またはその基質のどちらか一方または両
方を含む第二試薬からなる試薬キット、（３）保護基を
有する試薬成分がアシルコエンザイムＡである（１）に
記載の試薬キット、（４）保護基を有する試薬成分がア
セチルコエンザイムＡである（１）に記載の試薬キッ
ト、（５）保護基を有する試薬成分がアセチルコエンザ
イムＡであり、保護基を脱離しうる成分がフォスフォト
ランスアセチラーゼである（１）に記載の試薬キット、
（６）ヒト体液中の成分の測定に用いる（１）〜（５）
のいずれかに記載の試薬キット、（７）保護基を有する
試薬成分を含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離し
うる成分を含む第二試薬とを用時に混合して、保護基を
有する試薬成分の保護基を脱離させる工程を有する試薬
キットの使用方法、（８）保護基を有する試薬成分を含
む第一試薬と、該試薬成分の保護基を脱離しうる酵素ま
たはその基質のどちらか一方または両方を含む第二試薬
とを用時に混合して、保護基を有する試薬成分の保護基
を脱離させる工程を有する試薬キットの使用方法、
（９）保護基を有する試薬成分がアシルコエンザイムＡ
である（７）に記載の試薬キットの使用方法、（１０）
保護基を有する試薬成分がアセチルコエンザイムＡであ
る（７）に記載の試薬キットの使用方法、（１１）保護
基を有する試薬成分がアセチルコエンザイムＡであり、
保護基を脱離しうる成分がフォスフォトランスアセチラ
ーゼである（７）に記載の試薬キットの使用方法、（１
２）ヒト体液中の成分の測定に用いる（７）〜（１１）
のいずれかに記載の試薬キットの使用方法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明に使用される試薬成分は特
に限定されず、いずれの試薬成分でも使用できるが、好
ましくはＣｏＡＳＨが例示される。
に限定されず、いずれの試薬成分でも使用できるが、好
ましくはＣｏＡＳＨが例示される。
【００１２】これらの試薬成分を保護する保護基はアシ
ル基であることが好ましい。本発明で使用するアシル基
としては、アセチル基、パルミトイル基、アセトアセチ
ル基、アラキドニル基、ｎ−ブチリル基、クロトノイル
基、ｎ−デカノイル基、エイコサノイル基、グルタリル
基、ｎ−ヘプタノイル基、ｎ−ヘキサノイル基、イソブ
チリル基、イソバレリル基、ラウロイル基、リノレイル
基、マロニル基、ミリストイル基、オレイル基、プロピ
オニル基、ステアロイル基、サクシニル基等が挙げられ
るが、好ましくはアセチル基、パルミトイル基、アセト
アセチル基等を、特に好ましくはアセチル基を使用す
る。
ル基であることが好ましい。本発明で使用するアシル基
としては、アセチル基、パルミトイル基、アセトアセチ
ル基、アラキドニル基、ｎ−ブチリル基、クロトノイル
基、ｎ−デカノイル基、エイコサノイル基、グルタリル
基、ｎ−ヘプタノイル基、ｎ−ヘキサノイル基、イソブ
チリル基、イソバレリル基、ラウロイル基、リノレイル
基、マロニル基、ミリストイル基、オレイル基、プロピ
オニル基、ステアロイル基、サクシニル基等が挙げられ
るが、好ましくはアセチル基、パルミトイル基、アセト
アセチル基等を、特に好ましくはアセチル基を使用す
る。
【００１３】本発明で用いられる、保護基を有する試薬
成分から保護基を脱離する成分は特に限定されず、酵素
（例えば、脱離酵素、合成酵素、保護基の転移酵素、加
水分解酵素等）などの中から、主反応（定量反応系）に
影響を与えない成分を使用すればよい。
成分から保護基を脱離する成分は特に限定されず、酵素
（例えば、脱離酵素、合成酵素、保護基の転移酵素、加
水分解酵素等）などの中から、主反応（定量反応系）に
影響を与えない成分を使用すればよい。
【００１４】上記の保護基を有する試薬成分を添加した
試薬を第一試薬とし、該試薬成分の保護基を脱離しうる
成分を添加した試薬を第二試薬とする。本発明における
試薬キットは上記の第一試薬および第二試薬から構成さ
れ、用時にこの２つの試薬を混合することにより、該試
薬成分を保護する保護基が脱離されて該試薬成分が生成
される。このため試薬成分が不安定な物質であっても、
本発明の試薬キットではその試薬成分の活性は安定に保
たれる。
試薬を第一試薬とし、該試薬成分の保護基を脱離しうる
成分を添加した試薬を第二試薬とする。本発明における
試薬キットは上記の第一試薬および第二試薬から構成さ
れ、用時にこの２つの試薬を混合することにより、該試
薬成分を保護する保護基が脱離されて該試薬成分が生成
される。このため試薬成分が不安定な物質であっても、
本発明の試薬キットではその試薬成分の活性は安定に保
たれる。
【００１５】例えば試薬成分としてＣｏＡＳＨを用い、
アシル基で保護しアシルＣｏＡとして使用する場合、そ
れらのアシルＣｏＡを基質として利用できる酵素があれ
ば、いずれのアシルＣｏＡでも使用できる。そのような
アシルＣｏＡとして、アセチル−ＣｏＡ、パルミトイル
−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アラキドニル−Ｃ
ｏＡ、ｎ−ブチリル−ＣｏＡ、クロトノイル−ＣｏＡ、
ｎ−デカノイル−ＣｏＡ、エイコサノイル−ＣｏＡ、グ
ルタリル−ＣｏＡ、ｎ−ヘプタノイル−ＣｏＡ、ｎ−ヘ
キサノイル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ、イソバレ
リル−ＣｏＡ、ラウロイル−ＣｏＡ、リノレイル−Ｃｏ
Ａ、マロニル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、オレイ
ル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ステアロイル−Ｃ
ｏＡ、サクシニル−ＣｏＡ等が挙げられるが、好ましく
はアセチル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、アセトア
セチル−ＣｏＡ等を使用する。特に、アシル基の安定性
・溶解性、共役酵素反応、あるいは入手の容易さ等を考
慮すると、アセチル−ＣｏＡを使用することが望まし
い。
アシル基で保護しアシルＣｏＡとして使用する場合、そ
れらのアシルＣｏＡを基質として利用できる酵素があれ
ば、いずれのアシルＣｏＡでも使用できる。そのような
アシルＣｏＡとして、アセチル−ＣｏＡ、パルミトイル
−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アラキドニル−Ｃ
ｏＡ、ｎ−ブチリル−ＣｏＡ、クロトノイル−ＣｏＡ、
ｎ−デカノイル−ＣｏＡ、エイコサノイル−ＣｏＡ、グ
ルタリル−ＣｏＡ、ｎ−ヘプタノイル−ＣｏＡ、ｎ−ヘ
キサノイル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ、イソバレ
リル−ＣｏＡ、ラウロイル−ＣｏＡ、リノレイル−Ｃｏ
Ａ、マロニル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、オレイ
ル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ステアロイル−Ｃ
ｏＡ、サクシニル−ＣｏＡ等が挙げられるが、好ましく
はアセチル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、アセトア
セチル−ＣｏＡ等を使用する。特に、アシル基の安定性
・溶解性、共役酵素反応、あるいは入手の容易さ等を考
慮すると、アセチル−ＣｏＡを使用することが望まし
い。
【００１６】例えば保護基を有する試薬成分としてアセ
チルＣｏＡを用いる場合、保護基であるアセチル基を脱
離しうる成分としては、クエン酸（ｓｉ）−シンテター
ゼ（ＥＣ４．１．３．７）、ＡＴＰクエン酸（ｐｒｏ−
３ｓ）−リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）、ホモクエン
酸シンターゼ（ＥＣ４．１．３．２１）、クエン酸（ｒ
ｅ）−シンテターゼ（ＥＣ４．１．３．２８）、アセチ
ル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）、アミ
ノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．
１）、イミダゾールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
２．３．１．２）、グルコサミンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ２．３．１．３）、グルコサミン−リン酸
アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）、
アリルアミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．
３．１．５）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ
Ｃ２．３．１．６）、カルニチンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ２．３．１．７）、フォスフォトランスア
セチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）、アセチル−ＣｏＡ
アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、
硫化水素アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．
１．１０）、チオエタノールアミンアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１１）、グリシンアシルト
ランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１３）、アセチル
−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）等が挙げ
られるが、好ましくはフォスフォトランスアセチラーゼ
が用いられる。
チルＣｏＡを用いる場合、保護基であるアセチル基を脱
離しうる成分としては、クエン酸（ｓｉ）−シンテター
ゼ（ＥＣ４．１．３．７）、ＡＴＰクエン酸（ｐｒｏ−
３ｓ）−リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）、ホモクエン
酸シンターゼ（ＥＣ４．１．３．２１）、クエン酸（ｒ
ｅ）−シンテターゼ（ＥＣ４．１．３．２８）、アセチ
ル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）、アミ
ノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．
１）、イミダゾールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
２．３．１．２）、グルコサミンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ２．３．１．３）、グルコサミン−リン酸
アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）、
アリルアミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．
３．１．５）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ
Ｃ２．３．１．６）、カルニチンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ２．３．１．７）、フォスフォトランスア
セチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）、アセチル−ＣｏＡ
アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、
硫化水素アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．
１．１０）、チオエタノールアミンアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１１）、グリシンアシルト
ランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１３）、アセチル
−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）等が挙げ
られるが、好ましくはフォスフォトランスアセチラーゼ
が用いられる。
【００１７】保護基を有する試薬成分としてアシルＣｏ
Ａを使用する場合に、アシル基を脱離し、物質の測定に
必要なＣｏＡＳＨを生成させる原理を次式（ＩＩＩ）に
示す。
Ａを使用する場合に、アシル基を脱離し、物質の測定に
必要なＣｏＡＳＨを生成させる原理を次式（ＩＩＩ）に
示す。
【００１８】
【化３】
【００１９】本発明の試薬キットにおいて試薬成分とし
てアシルＣｏＡを使用する場合には、アシルＣｏＡから
アシル基を脱離しＣｏＡＳＨを反応時に生成させるため
に、アシルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、式
（ＩＩＩ）中の酵素またはその基質のどちらか一方また
は両方を上記のアシルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれ
を第二試薬とし、用時に混合して用いる。試薬が混合さ
れたとき該アシルＣｏＡは、式（ＩＩＩ）に示されるよ
うにＣｏＡＳＨを生じる。このＣｏＡＳＨが測定対象と
なる被検物質と反応して生じた生成物を公知の方法を用
いて定量することにより、被検物質の測定を行うことが
できる。第一試薬と第二試薬との混合時に上記の原理に
より生成されたＣｏＡＳＨは、臨床検査においてヒト体
液中の種々の成分、例えば、遊離脂肪酸、ピルビン酸、
尿素窒素、コリンエステラーゼ、トリグリセライド、ク
レアチニン等の測定に供せられる。
てアシルＣｏＡを使用する場合には、アシルＣｏＡから
アシル基を脱離しＣｏＡＳＨを反応時に生成させるため
に、アシルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、式
（ＩＩＩ）中の酵素またはその基質のどちらか一方また
は両方を上記のアシルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれ
を第二試薬とし、用時に混合して用いる。試薬が混合さ
れたとき該アシルＣｏＡは、式（ＩＩＩ）に示されるよ
うにＣｏＡＳＨを生じる。このＣｏＡＳＨが測定対象と
なる被検物質と反応して生じた生成物を公知の方法を用
いて定量することにより、被検物質の測定を行うことが
できる。第一試薬と第二試薬との混合時に上記の原理に
より生成されたＣｏＡＳＨは、臨床検査においてヒト体
液中の種々の成分、例えば、遊離脂肪酸、ピルビン酸、
尿素窒素、コリンエステラーゼ、トリグリセライド、ク
レアチニン等の測定に供せられる。
【００２０】例えば、アセチルＣｏＡと、酵素としてフ
ォスフォトランスアセチラーゼ（以下、ＰＡＴと略す）
を添加する系を利用して、ＮＥＦＡをＡＣＳで測定する
〔式（Ｉ）〕場合には、アセチルＣｏＡを添加した試薬
を第一試薬とし、リン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちら
か一方または両方をアセチルＣｏＡとは別の試薬に添加
し第二試薬とする。第一試薬と第二試薬が混合された
時、ＰＡＴが次式（ＩＶ）に示される反応を触媒し、ア
セチルＣｏＡは式（Ｉ）に示されるＡＣＳに必要なＣｏ
ＡＳＨを生成させることができる。
ォスフォトランスアセチラーゼ（以下、ＰＡＴと略す）
を添加する系を利用して、ＮＥＦＡをＡＣＳで測定する
〔式（Ｉ）〕場合には、アセチルＣｏＡを添加した試薬
を第一試薬とし、リン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちら
か一方または両方をアセチルＣｏＡとは別の試薬に添加
し第二試薬とする。第一試薬と第二試薬が混合された
時、ＰＡＴが次式（ＩＶ）に示される反応を触媒し、ア
セチルＣｏＡは式（Ｉ）に示されるＡＣＳに必要なＣｏ
ＡＳＨを生成させることができる。
【００２１】
【化４】
【００２２】次に、式（Ｉ）の反応によりさらに生成し
たアシルＣｏＡまたはＡＭＰまたはピロリン酸を公知の
方法で定量する。その際、一般にはＡＣＯＤを使用した
アシルＣｏＡの定量がよく利用されているが、ＡＣＯＤ
はアセチルＣｏＡを基質としないため、本発明の測定に
は影響しない。
たアシルＣｏＡまたはＡＭＰまたはピロリン酸を公知の
方法で定量する。その際、一般にはＡＣＯＤを使用した
アシルＣｏＡの定量がよく利用されているが、ＡＣＯＤ
はアセチルＣｏＡを基質としないため、本発明の測定に
は影響しない。
【００２３】また、例えばアセチルＣｏＡと、酵素とし
てＰＡＴを添加する系を利用してピルビン酸をＰＤＨＬ
で測定するとき〔式（ＩＩ）〕も同様に、反応時にアセ
チルＣｏＡからＣｏＡＳＨを生成させればよい。すなわ
ち、アセチルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、リ
ン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちらか一方または両方を
アセチルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれを第二試薬と
する。第一試薬と第二試薬が混合された時、ＰＡＴが式
（ＩＶ）に示される反応を触媒し、アセチルＣｏＡは式
（ＩＩ）に示されるＰＤＨＬに必要なＣｏＡＳＨを生成
させることができる。この場合、ＮＥＦＡの定量と異な
りＣｏＡサイクリングを形成することができるため、使
用するアセチルＣｏＡ量が低くても使用できる利点があ
る。
てＰＡＴを添加する系を利用してピルビン酸をＰＤＨＬ
で測定するとき〔式（ＩＩ）〕も同様に、反応時にアセ
チルＣｏＡからＣｏＡＳＨを生成させればよい。すなわ
ち、アセチルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、リ
ン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちらか一方または両方を
アセチルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれを第二試薬と
する。第一試薬と第二試薬が混合された時、ＰＡＴが式
（ＩＶ）に示される反応を触媒し、アセチルＣｏＡは式
（ＩＩ）に示されるＰＤＨＬに必要なＣｏＡＳＨを生成
させることができる。この場合、ＮＥＦＡの定量と異な
りＣｏＡサイクリングを形成することができるため、使
用するアセチルＣｏＡ量が低くても使用できる利点があ
る。
【００２４】ＣｏＡサイクイング反応については、生化
学実験講座５．酵素研究法 上 ｐ１２１−１３５に詳
細に記載されている。これによるとＣｏＡサイクリング
反応は増幅定量するものであって、数多くの報告がなさ
れている。また、ＰＤＨＬを用いたＣｏＡサイクリング
についても報告されている（Szutowicz A, et al, Anal
Biochem, 115, 81-87(1981) ;Coore HG, et al, Bioch
em J, 125, 115-127(1971) ;Methods in Enzymology Vo
l.9, 247-253(1966) ;特開平５−２６８９９７号公
報）。また、この測定法が２−オキソグルタル酸脱水素
酵素にも応用できることが報告されている。（Methods
in Enzymology Vol.9, 247-253(1966)) 。このようにＰ
ＤＨＬによるＣｏＡサイクリング自体は公知であるが、
本発明の方法のように臨床検査に供される試薬の安定性
を長期間維持できることを目的としてＣｏＡサイクリン
グを使用する例はない。
学実験講座５．酵素研究法 上 ｐ１２１−１３５に詳
細に記載されている。これによるとＣｏＡサイクリング
反応は増幅定量するものであって、数多くの報告がなさ
れている。また、ＰＤＨＬを用いたＣｏＡサイクリング
についても報告されている（Szutowicz A, et al, Anal
Biochem, 115, 81-87(1981) ;Coore HG, et al, Bioch
em J, 125, 115-127(1971) ;Methods in Enzymology Vo
l.9, 247-253(1966) ;特開平５−２６８９９７号公
報）。また、この測定法が２−オキソグルタル酸脱水素
酵素にも応用できることが報告されている。（Methods
in Enzymology Vol.9, 247-253(1966)) 。このようにＰ
ＤＨＬによるＣｏＡサイクリング自体は公知であるが、
本発明の方法のように臨床検査に供される試薬の安定性
を長期間維持できることを目的としてＣｏＡサイクリン
グを使用する例はない。
【００２５】
【実施例】以下、本発明を具体的な実施例を挙げてその
詳細を説明するが、本発明はこれによって限定されるも
のではない。
詳細を説明するが、本発明はこれによって限定されるも
のではない。
【００２６】実施例１．ＮＥＦＡの定量安定性 試薬Ａ〔１．２５ｍＭ １−（４’−スルフォフェニ
ル）−３−カルボエトキシ−５−ピラゾロン（以下、Ｓ
ＣＥＰと略す）、０．５ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２
ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略
す）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５Ｕ／ｍｌ Ａ
ＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（以下、Ｐ
ＯＤと略す）、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０
ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳと略す）緩衝
液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ〔５ｍＭ ４−アミノ
アンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌ ＡＣＯ
Ｄ、５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）〕を調製した。比較として試薬Ａ’
〔１．２５ｍＭ ＳＣＥＰ、０．５ｍＭ ＣｏＡＳＨ、
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ塩化マグネシウム、２．
５Ｕ／ｍｌ ＡＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、２０
ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ’〔５ｍＭ ４−ア
ミノアンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌＡＣＯ
Ｄを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を調製
した。検体として２．５ｍＥｑ／ｌ オレイン酸ナトリ
ウムを５段階希釈したものを使用した。この検体各５μ
ｌに試薬Ａ２４０μｌ及び試薬Ｂ６０μｌを加え、３７
℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬ブランクを対照
として波長５４６ｎｍで吸光度を測定した。試薬調製
後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１０、２０、３０
日間測定した結果を図１に示す。次に、比較として試薬
Ａの代わりに試薬Ａ’を、試薬Ｂの代わりに試薬Ｂ’を
用いて同様に操作し、測定を行った。その結果を図２に
示す。図１、図２の結果から明らかなように、ＣｏＡＳ
Ｈで添加するよりもアセチルＣｏＡで添加する本発明の
方法を用いた方が、試薬の安定性が優れていることがわ
かる。
ル）−３−カルボエトキシ−５−ピラゾロン（以下、Ｓ
ＣＥＰと略す）、０．５ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２
ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略
す）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５Ｕ／ｍｌ Ａ
ＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（以下、Ｐ
ＯＤと略す）、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０
ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳと略す）緩衝
液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ〔５ｍＭ ４−アミノ
アンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌ ＡＣＯ
Ｄ、５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）〕を調製した。比較として試薬Ａ’
〔１．２５ｍＭ ＳＣＥＰ、０．５ｍＭ ＣｏＡＳＨ、
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ塩化マグネシウム、２．
５Ｕ／ｍｌ ＡＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、２０
ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ’〔５ｍＭ ４−ア
ミノアンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌＡＣＯ
Ｄを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を調製
した。検体として２．５ｍＥｑ／ｌ オレイン酸ナトリ
ウムを５段階希釈したものを使用した。この検体各５μ
ｌに試薬Ａ２４０μｌ及び試薬Ｂ６０μｌを加え、３７
℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬ブランクを対照
として波長５４６ｎｍで吸光度を測定した。試薬調製
後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１０、２０、３０
日間測定した結果を図１に示す。次に、比較として試薬
Ａの代わりに試薬Ａ’を、試薬Ｂの代わりに試薬Ｂ’を
用いて同様に操作し、測定を行った。その結果を図２に
示す。図１、図２の結果から明らかなように、ＣｏＡＳ
Ｈで添加するよりもアセチルＣｏＡで添加する本発明の
方法を用いた方が、試薬の安定性が優れていることがわ
かる。
【００２７】実施例２．ピルビン酸の定量安定性 試薬Ｃ〔０．０２ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ
−システイン、０．２ｍＭ チアミンピロリン酸（以
下、ＴＰＰと略す）、２．５ｍＭ β−ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤと略
す）、１Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリ
ウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）〕、及び試薬Ｄ〔５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴ、０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ リ
ン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）〕を調製した。比較として、試薬Ｃ’〔０．
２ｍＭ ＣｏＡＳＨ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ
塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ−システイン、０．
２ｍＭ ＴＰＰ、２．５ｍＭ ＮＡＤ、１Ｕ／ｍｌ Ｐ
ＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｄ’
〔０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、
２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．０）〕を調製した。検体として１５
ｍＭピルビン酸ナトリウムを５段階希釈して使用した。
この検体各５μｌに試薬Ｃ２４０μｌ及び試薬Ｄ６０μ
ｌを加え、３７℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬
ブランクを対照として波長３４０ｎｍで吸光度を測定し
た。試薬調製後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１
０、２０、３０日間測定した結果を図３に示す。次に、
比較として試薬Ｃの代わりに試薬Ｃ’を、試薬Ｄの代わ
りに試薬Ｄ’を用いて同様に操作し、測定を行った。そ
の結果を図４に示す。ＣｏＡＳＨを添加した試薬を使用
した場合、図４に示すようにピルビン酸濃度が高いた
め、０日目から直線性を失う。しかしながら、ＣｏＡＳ
Ｈの１／１０濃度のアセチルＣｏＡを添加した試薬を使
用した場合の結果を示す図３は、３０日間問題なく試薬
が使用できたことを示している。このように、ＣｏＡＳ
Ｈで添加するよりも、アセチルＣｏＡで添加する本発明
の方法を用いた方が試薬の安定性が優れていることがわ
かる。
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ
−システイン、０．２ｍＭ チアミンピロリン酸（以
下、ＴＰＰと略す）、２．５ｍＭ β−ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤと略
す）、１Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリ
ウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）〕、及び試薬Ｄ〔５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴ、０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ リ
ン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）〕を調製した。比較として、試薬Ｃ’〔０．
２ｍＭ ＣｏＡＳＨ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ
塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ−システイン、０．
２ｍＭ ＴＰＰ、２．５ｍＭ ＮＡＤ、１Ｕ／ｍｌ Ｐ
ＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｄ’
〔０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、
２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．０）〕を調製した。検体として１５
ｍＭピルビン酸ナトリウムを５段階希釈して使用した。
この検体各５μｌに試薬Ｃ２４０μｌ及び試薬Ｄ６０μ
ｌを加え、３７℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬
ブランクを対照として波長３４０ｎｍで吸光度を測定し
た。試薬調製後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１
０、２０、３０日間測定した結果を図３に示す。次に、
比較として試薬Ｃの代わりに試薬Ｃ’を、試薬Ｄの代わ
りに試薬Ｄ’を用いて同様に操作し、測定を行った。そ
の結果を図４に示す。ＣｏＡＳＨを添加した試薬を使用
した場合、図４に示すようにピルビン酸濃度が高いた
め、０日目から直線性を失う。しかしながら、ＣｏＡＳ
Ｈの１／１０濃度のアセチルＣｏＡを添加した試薬を使
用した場合の結果を示す図３は、３０日間問題なく試薬
が使用できたことを示している。このように、ＣｏＡＳ
Ｈで添加するよりも、アセチルＣｏＡで添加する本発明
の方法を用いた方が試薬の安定性が優れていることがわ
かる。
【００２８】参考例１．参考例として、ＣｏＡＳＨとア
シルＣｏＡの安定性を比較検討した結果を以下に示す。
５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン
酸（以下、ＭＥＳと略す）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び
５０ｍＭ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフ
ォン酸（以下、ＣＨＥＳと略す）を含むｐＨ５、６、
７、８、９の緩衝液を調製し、各々に０．１ｍＭのＣｏ
ＡＳＨを溶解し、冷蔵（２〜８℃）及び３０℃に１０日
間保存後、保存液１０μｌに定量用試薬〔１０ｍＭ 塩
化アンモニウム、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化
マグネシウム、２ｍＭ Ｌ−システイン、３ｍＭ ピル
ビン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＮＡＤ、０．２ｍＭ
ＴＰＰ、０．５Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、０．５Ｕ／ｍｌ
ＰＡＴ、１０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕５００μｌを加え、
３７℃恒温下、波長３４０ｎｍの吸光度変化量を標準液
の吸光度変化量と比較することにより残存量を求めた。
その結果を図５に示す。次に、上記と同様に調製した緩
衝液に０．１ｍＭのアセチルＣｏＡを溶解し、上記と同
じ方法で保存した後、上記の定量用試薬を加え、残存量
を求めた。その結果も図５に示す。さらに、上記と同様
に調製した緩衝液に０．１ｍＭのパルミトイルＣｏＡを
溶解し、上記と同じ方法で保存を行った。パルミトイル
ＣｏＡの定量は、保存液２０μｌに定量用試薬〔１ｍＭ
ＳＣＥＰ、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、０．２
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１０Ｕ／
ｍｌ ＰＯＤ、１Ｕ／ｍｌ ＡＣＯＤを含む１００ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕３００μｌを加
え、３７℃恒温下、１０分間インキュベーション後、波
長５４６ｎｍで吸光度を測定し、標準液の吸光度と比較
することにより残存量を求めた。その結果も図５に示
す。図５から明らかなように、ＣｏＡＳＨに比べ、アセ
チルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡの安定性の方がはるか
によいことが判明した。ＣｏＡＳＨはｐＨ５以下で安定
化するようだが、このｐＨ域は通常の酵素が不安定にな
る場合が多い。また、至適酵素活性を示すｐＨからはず
れていることが多い。その点、アシルＣｏＡは中性近辺
でも十分な安定性を示すため、安定な試薬の調製に有効
に利用できる。
シルＣｏＡの安定性を比較検討した結果を以下に示す。
５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン
酸（以下、ＭＥＳと略す）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び
５０ｍＭ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフ
ォン酸（以下、ＣＨＥＳと略す）を含むｐＨ５、６、
７、８、９の緩衝液を調製し、各々に０．１ｍＭのＣｏ
ＡＳＨを溶解し、冷蔵（２〜８℃）及び３０℃に１０日
間保存後、保存液１０μｌに定量用試薬〔１０ｍＭ 塩
化アンモニウム、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化
マグネシウム、２ｍＭ Ｌ−システイン、３ｍＭ ピル
ビン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＮＡＤ、０．２ｍＭ
ＴＰＰ、０．５Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、０．５Ｕ／ｍｌ
ＰＡＴ、１０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕５００μｌを加え、
３７℃恒温下、波長３４０ｎｍの吸光度変化量を標準液
の吸光度変化量と比較することにより残存量を求めた。
その結果を図５に示す。次に、上記と同様に調製した緩
衝液に０．１ｍＭのアセチルＣｏＡを溶解し、上記と同
じ方法で保存した後、上記の定量用試薬を加え、残存量
を求めた。その結果も図５に示す。さらに、上記と同様
に調製した緩衝液に０．１ｍＭのパルミトイルＣｏＡを
溶解し、上記と同じ方法で保存を行った。パルミトイル
ＣｏＡの定量は、保存液２０μｌに定量用試薬〔１ｍＭ
ＳＣＥＰ、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、０．２
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１０Ｕ／
ｍｌ ＰＯＤ、１Ｕ／ｍｌ ＡＣＯＤを含む１００ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕３００μｌを加
え、３７℃恒温下、１０分間インキュベーション後、波
長５４６ｎｍで吸光度を測定し、標準液の吸光度と比較
することにより残存量を求めた。その結果も図５に示
す。図５から明らかなように、ＣｏＡＳＨに比べ、アセ
チルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡの安定性の方がはるか
によいことが判明した。ＣｏＡＳＨはｐＨ５以下で安定
化するようだが、このｐＨ域は通常の酵素が不安定にな
る場合が多い。また、至適酵素活性を示すｐＨからはず
れていることが多い。その点、アシルＣｏＡは中性近辺
でも十分な安定性を示すため、安定な試薬の調製に有効
に利用できる。
【００２９】
【発明の効果】本発明の方法を用いることにより、試薬
の液状安定性を長期間維持することが可能となり、液状
無調製試薬へ応用することも可能となる。
の液状安定性を長期間維持することが可能となり、液状
無調製試薬へ応用することも可能となる。
【図１】 オレイン酸ナトリウムにアセチルＣｏＡを添
加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図２】 オレイン酸ナトリウムにＣｏＡＳＨを添加し
た試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
た試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図３】 ピルビン酸ナトリウムにアセチルＣｏＡを添
加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図４】 ピルビン酸ナトリウムにＣｏＡＳＨを添加し
た試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
た試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図５】 ＣｏＡＳＨ、アセチルＣｏＡ、パルミトイル
ＣｏＡを冷蔵（２〜８℃）または３０℃に１０日間保存
後に残存量を求め、安定性を比較した図である。
ＣｏＡを冷蔵（２〜８℃）または３０℃に１０日間保存
後に残存量を求め、安定性を比較した図である。
Claims (12)
- 【請求項１】 保護基を有する試薬成分を含む第一試薬
と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬
からなる試薬キット。 - 【請求項２】 保護基を有する試薬成分を含む第一試薬
と、該試薬成分の保護基を脱離しうる酵素またはその基
質のどちらか一方または両方を含む第二試薬からなる試
薬キット。 - 【請求項３】 保護基を有する試薬成分がアシルコエン
ザイムＡである請求項１に記載の試薬キット。 - 【請求項４】 保護基を有する試薬成分がアセチルコエ
ンザイムＡである請求項１に記載の試薬キット。 - 【請求項５】 保護基を有する試薬成分がアセチルコエ
ンザイムＡであり、保護基を脱離しうる成分がフォスフ
ォトランスアセチラーゼである請求項１に記載の試薬キ
ット。 - 【請求項６】 ヒト体液中の成分の測定に用いる請求項
１〜５のいずれかに記載の試薬キット。 - 【請求項７】 保護基を有する試薬成分を含む第一試薬
と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬
とを用時に混合して、保護基を有する試薬成分の保護基
を脱離させる工程を有する試薬キットの使用方法。 - 【請求項８】 保護基を有する試薬成分を含む第一試薬
と、該試薬成分の保護基を脱離しうる酵素またはその基
質のどちらか一方または両方を含む第二試薬とを用時に
混合して、保護基を有する試薬成分の保護基を脱離させ
る工程を有する試薬キットの使用方法。 - 【請求項９】 保護基を有する試薬成分がアシルコエン
ザイムＡである請求項７に記載の試薬キットの使用方
法。 - 【請求項１０】 保護基を有する試薬成分がアセチルコ
エンザイムＡである請求項７に記載の試薬キットの使用
方法。 - 【請求項１１】 保護基を有する試薬成分がアセチルコ
エンザイムＡであり、保護基を脱離しうる成分がフォス
フォトランスアセチラーゼである請求項７に記載の試薬
キットの使用方法。 - 【請求項１２】 ヒト体液中の成分の測定に用いる請求
項７〜１１のいずれかに記載の試薬キットの使用方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21283796A JP4176843B2 (ja) | 1996-08-12 | 1996-08-12 | 試薬キット及び試薬キットの使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21283796A JP4176843B2 (ja) | 1996-08-12 | 1996-08-12 | 試薬キット及び試薬キットの使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052299A true JPH1052299A (ja) | 1998-02-24 |
| JP4176843B2 JP4176843B2 (ja) | 2008-11-05 |
Family
ID=16629177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21283796A Expired - Fee Related JP4176843B2 (ja) | 1996-08-12 | 1996-08-12 | 試薬キット及び試薬キットの使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4176843B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002051769A (ja) * | 2000-08-11 | 2002-02-19 | Azwell Inc | 遊離脂肪酸の測定に有用な液状試薬 |
| WO2006061945A1 (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. | プロピオン酸の定量方法 |
-
1996
- 1996-08-12 JP JP21283796A patent/JP4176843B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002051769A (ja) * | 2000-08-11 | 2002-02-19 | Azwell Inc | 遊離脂肪酸の測定に有用な液状試薬 |
| WO2006061945A1 (ja) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. | プロピオン酸の定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4176843B2 (ja) | 2008-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Matsubara et al. | A spectrophotometric method for the determination of free fatty acid in serum using acyl-coenzyme A synthetase and acyl-coenzyme A oxidase | |
| CN102154443B (zh) | 一种肌酸激酶mb同工酶活性测定试剂及其制备方法 | |
| US4897346A (en) | Stabilized liquid enzyme composition for glucose determination | |
| US3929581A (en) | Quantitative determination of blood ammonia | |
| JP4723311B2 (ja) | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 | |
| JP4781742B2 (ja) | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 | |
| US5278044A (en) | Stable aqueous NADH reagent and kit | |
| AU692547B2 (en) | Liquid stable thiol activator | |
| US5420008A (en) | Assay method and assay reagent for serum iron or unsaturated iron binding capacity | |
| JPH1052299A (ja) | 試薬キット及び試薬キットの使用方法 | |
| EP0603831B1 (en) | Stable single liquid reagent for the determination of carbon dioxide in serum | |
| JP5843072B2 (ja) | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット | |
| US5217890A (en) | Stabilized composition containing creatine kinase and protein having blocked sulfhydryl groups | |
| JPH10327895A (ja) | 安定なクレアチンキナーゼ活性測定用液状試薬 | |
| JP4260245B2 (ja) | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬 | |
| CN114354524B (zh) | 一种稳定的液体检测试剂盒 | |
| US7192727B2 (en) | Reagent for measuring alanine aminotransferase activity | |
| JP5982608B2 (ja) | クレアチンキナーゼ活性の測定試薬 | |
| JPS59198999A (ja) | クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 | |
| US20030162241A1 (en) | Method for determining the concentration of carnitine in fluids | |
| JP2001299389A (ja) | アデノシン３リン酸の加水分解を含む酵素反応系を利用する測定方法および該方法に使用する測定試薬 | |
| JP2011103825A (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| JPH0686693A (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| JPH078297A (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| CN105784614A (zh) | 血氨测定试剂及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20050930 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20051101 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060711 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060905 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20060905 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060905 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080422 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080616 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080729 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080821 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110829 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110829 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140829 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |