JP4176843B2 - 試薬キット及び試薬キットの使用方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は試薬キット及び試薬キットの使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の生体試料分析において使用される試薬には、不安定な試薬成分を含んだものが少なからず存在し、こうした試薬の安定性は上記の試薬成分の安定性に依存している。
【０００３】
このような不安定な試薬成分の１つとしてコエンザイムＡ（以下、ＣｏＡＳＨと略す）が挙げられる。ＣｏＡＳＨを用いて定量される項目としては例えば、次式（Ｉ）で表される、ＣｏＡＳＨとアシルコエンザイムＡシンセターゼ（以下、ＡＣＳと略す）を使用する血中遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡと略す）の定量がある。
【０００４】
【化１】
【０００５】
また、次式（ＩＩ）で表されるピルビン酸脱水素酵素（以下、ＰＤＨＬと略す）を用いたピルビン酸の定量方法（特開平５−９５７９８号公報）がある。
【０００６】
【化２】
【０００７】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）の定量反応に使用される試薬に添加されるＣｏＡＳＨは熱安定性が良くないだけでなく、容易に酸化されて生理活性を失うことが知られている〔生化学データーブック（日本生化学会；東京化学同人）〕。
【０００８】
このような不安定な試薬成分を含む試薬の安定化方法としては、弱酸性下に保存したり、キレート剤の添加、、スルフヒドリル化合物の添加などが行われている。しかしこうした方法をもってしても、調製した試薬は経時的に活性成分が少なくなるため、定量限界が経時的に低下し、やがて反応しなくなるという問題点を有している。
最近の臨床検査においては、試薬を溶解する手間を省いた液状無調製試薬が主流となってきているが、上記のような不安定な試薬成分を必要とする試薬に関しては、上述した試薬成分の安定化の問題のため、未だ液状無調製試薬は製品化されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、不安定な試薬成分を使用して物質を測定する試薬であって、液状で長期間使用しうる安定な試薬を提供することである。
本発明の他の目的は、不安定な試薬成分を使用して物質を測定する試薬の安定化方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、不安定な試薬成分をアシル基で保護しておき、測定時に保護基の脱離を行い必要な試薬成分を生成させることにより、試薬を安定化させることが可能となることを見いだした。すなわち、不安定な試薬成分を試薬に添加する場合に、保護基で保護された該試薬成分を含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬からなる試薬キットを作製し、用時に上記第一試薬および第二試薬を混合し、上記の保護基を脱離せしめるという方法を用いることにより、液状で長期間使用できる安定な試薬を提供することが可能となることを見い出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）アシルコエンザイムＡを含む第一試薬とアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素を含む第二試薬からなる試薬キット、
（２）第二試薬がさらにアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素の基質を含む（１）に記載の試薬キット、
（３）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡである（１）に記載の試薬キット、
（４）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡであり、アシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素がフォスフォトランスアセチラーゼである（１）に記載の試薬キット、
（５）ヒト体液中の成分の測定に用いる（１）〜（４）のいずれかに記載の試薬キット、
（６）アシルコエンザイムＡを含む第一試薬とアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素を含む第二試薬とを混合して、アシルコエンザイムＡのアシル基を脱離させる工程を有する試薬キットの使用方法、
（７）第二試薬がさらにアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素の基質を含む（６）に記載の試薬キットの使用方法、
（８）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡである（６）に記載の試薬キットの使用方法、
（９）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡであり、アシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素がフォスフォトランスアセチラーゼである（６）に記載の試薬キットの使用方法、
（１０）ヒト体液中の成分の測定に用いる（６）〜（９）のいずれかに記載の試薬キットの使用方法、
に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される試薬成分は特に限定されず、いずれの試薬成分でも使用できるが、好ましくはＣｏＡＳＨが例示される。
【００１２】
これらの試薬成分を保護する保護基はアシル基であることが好ましい。
本発明で使用するアシル基としては、アセチル基、パルミトイル基、アセトアセチル基、アラキドニル基、ｎ−ブチリル基、クロトノイル基、ｎ−デカノイル基、エイコサノイル基、グルタリル基、ｎ−ヘプタノイル基、ｎ−ヘキサノイル基、イソブチリル基、イソバレリル基、ラウロイル基、リノレイル基、マロニル基、ミリストイル基、オレイル基、プロピオニル基、ステアロイル基、サクシニル基等が挙げられるが、好ましくはアセチル基、パルミトイル基、アセトアセチル基等を、特に好ましくはアセチル基を使用する。
【００１３】
本発明で用いられる、保護基を有する試薬成分から保護基を脱離する成分は特に限定されず、酵素（例えば、脱離酵素、合成酵素、保護基の転移酵素、加水分解酵素等）などの中から、主反応（定量反応系）に影響を与えない成分を使用すればよい。
【００１４】
上記の保護基を有する試薬成分を添加した試薬を第一試薬とし、該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を添加した試薬を第二試薬とする。本発明における試薬キットは上記の第一試薬および第二試薬から構成され、用時にこの２つの試薬を混合することにより、該試薬成分を保護する保護基が脱離されて該試薬成分が生成される。このため試薬成分が不安定な物質であっても、本発明の試薬キットではその試薬成分の活性は安定に保たれる。
【００１５】
例えば試薬成分としてＣｏＡＳＨを用い、アシル基で保護しアシルＣｏＡとして使用する場合、それらのアシルＣｏＡを基質として利用できる酵素があれば、いずれのアシルＣｏＡでも使用できる。そのようなアシルＣｏＡとして、アセチル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アラキドニル−ＣｏＡ、ｎ−ブチリル−ＣｏＡ、クロトノイル−ＣｏＡ、ｎ−デカノイル−ＣｏＡ、エイコサノイル−ＣｏＡ、グルタリル−ＣｏＡ、ｎ−ヘプタノイル−ＣｏＡ、ｎ−ヘキサノイル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ、イソバレリル−ＣｏＡ、ラウロイル−ＣｏＡ、リノレイル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、オレイル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ステアロイル−ＣｏＡ、サクシニル−ＣｏＡ等が挙げられるが、好ましくはアセチル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ等を使用する。特に、アシル基の安定性・溶解性、共役酵素反応、あるいは入手の容易さ等を考慮すると、アセチル−ＣｏＡを使用することが望ましい。
【００１６】
例えば保護基を有する試薬成分としてアセチルＣｏＡを用いる場合、保護基であるアセチル基を脱離しうる成分としては、クエン酸（ｓｉ）−シンテターゼ（ＥＣ４．１．３．７）、ＡＴＰクエン酸（ｐｒｏ−３ｓ）−リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）、ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ４．１．３．２１）、クエン酸（ｒｅ）−シンテターゼ（ＥＣ４．１．３．２８）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１）、イミダゾールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２）、グルコサミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３）、グルコサミン−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）、アリルアミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．６）、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７）、フォスフォトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、硫化水素アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１０）、チオエタノールアミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１１）、グリシンアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１３）、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）等が挙げられるが、好ましくはフォスフォトランスアセチラーゼが用いられる。
【００１７】
保護基を有する試薬成分としてアシルＣｏＡを使用する場合に、アシル基を脱離し、物質の測定に必要なＣｏＡＳＨを生成させる原理を次式（ＩＩＩ）に示す。
【００１８】
【化３】
【００１９】
本発明の試薬キットにおいて試薬成分としてアシルＣｏＡを使用する場合には、アシルＣｏＡからアシル基を脱離しＣｏＡＳＨを反応時に生成させるために、アシルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、式（ＩＩＩ）中の酵素またはその基質のどちらか一方または両方を上記のアシルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれを第二試薬とし、用時に混合して用いる。試薬が混合されたとき該アシルＣｏＡは、式（ＩＩＩ）に示されるようにＣｏＡＳＨを生じる。このＣｏＡＳＨが測定対象となる被検物質と反応して生じた生成物を公知の方法を用いて定量することにより、被検物質の測定を行うことができる。
第一試薬と第二試薬との混合時に上記の原理により生成されたＣｏＡＳＨは、臨床検査においてヒト体液中の種々の成分、例えば、遊離脂肪酸、ピルビン酸、尿素窒素、コリンエステラーゼ、トリグリセライド、クレアチニン等の測定に供せられる。
【００２０】
例えば、アセチルＣｏＡと、酵素としてフォスフォトランスアセチラーゼ（以下、ＰＡＴと略す）を添加する系を利用して、ＮＥＦＡをＡＣＳで測定する〔式（Ｉ）〕場合には、アセチルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、リン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちらか一方または両方をアセチルＣｏＡとは別の試薬に添加し第二試薬とする。第一試薬と第二試薬が混合された時、ＰＡＴが次式（ＩＶ）に示される反応を触媒し、アセチルＣｏＡは式（Ｉ）に示されるＡＣＳに必要なＣｏＡＳＨを生成させることができる。
【００２１】
【化４】
【００２２】
次に、式（Ｉ）の反応によりさらに生成したアシルＣｏＡまたはＡＭＰまたはピロリン酸を公知の方法で定量する。その際、一般にはＡＣＯＤを使用したアシルＣｏＡの定量がよく利用されているが、ＡＣＯＤはアセチルＣｏＡを基質としないため、本発明の測定には影響しない。
【００２３】
また、例えばアセチルＣｏＡと、酵素としてＰＡＴを添加する系を利用してピルビン酸をＰＤＨＬで測定するとき〔式（ＩＩ）〕も同様に、反応時にアセチルＣｏＡからＣｏＡＳＨを生成させればよい。すなわち、アセチルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、リン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちらか一方または両方をアセチルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれを第二試薬とする。第一試薬と第二試薬が混合された時、ＰＡＴが式（ＩＶ）に示される反応を触媒し、アセチルＣｏＡは式（ＩＩ）に示されるＰＤＨＬに必要なＣｏＡＳＨを生成させることができる。この場合、ＮＥＦＡの定量と異なりＣｏＡサイクリングを形成することができるため、使用するアセチルＣｏＡ量が低くても使用できる利点がある。
【００２４】
ＣｏＡサイクイング反応については、生化学実験講座５．酵素研究法 上 ｐ１２１−１３５に詳細に記載されている。これによるとＣｏＡサイクリング反応は増幅定量するものであって、数多くの報告がなされている。また、ＰＤＨＬを用いたＣｏＡサイクリングについても報告されている（Szutowicz A, et al, Anal Biochem, 115, 81-87(1981) ;Coore HG, et al, Biochem J, 125, 115-127(1971) ;Methods in Enzymology Vol.9, 247-253(1966) ;特開平５−２６８９９７号公報）。また、この測定法が２−オキソグルタル酸脱水素酵素にも応用できることが報告されている。（Methods in Enzymology Vol.9, 247-253(1966)) 。このようにＰＤＨＬによるＣｏＡサイクリング自体は公知であるが、本発明の方法のように臨床検査に供される試薬の安定性を長期間維持できることを目的としてＣｏＡサイクリングを使用する例はない。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げてその詳細を説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２６】
実施例１．
ＮＥＦＡの定量安定性
試薬Ａ〔１．２５ｍＭ １−（４’−スルフォフェニル）−３−カルボエトキシ−５−ピラゾロン（以下、ＳＣＥＰと略す）、０．５ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５Ｕ／ｍｌ ＡＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳと略す）緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ〔５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌ ＡＣＯＤ、５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を調製した。比較として試薬Ａ’〔１．２５ｍＭ ＳＣＥＰ、０．５ｍＭ ＣｏＡＳＨ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５Ｕ／ｍｌ ＡＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ’〔５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌＡＣＯＤを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を調製した。
検体として２．５ｍＥｑ／ｌ オレイン酸ナトリウムを５段階希釈したものを使用した。この検体各５μｌに試薬Ａ２４０μｌ及び試薬Ｂ６０μｌを加え、３７℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬ブランクを対照として波長５４６ｎｍで吸光度を測定した。試薬調製後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１０、２０、３０日間測定した結果を図１に示す。次に、比較として試薬Ａの代わりに試薬Ａ’を、試薬Ｂの代わりに試薬Ｂ’を用いて同様に操作し、測定を行った。その結果を図２に示す。
図１、図２の結果から明らかなように、ＣｏＡＳＨで添加するよりもアセチルＣｏＡで添加する本発明の方法を用いた方が、試薬の安定性が優れていることがわかる。
【００２７】
実施例２．
ピルビン酸の定量安定性
試薬Ｃ〔０．０２ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ−システイン、０．２ｍＭ チアミンピロリン酸（以下、ＴＰＰと略す）、２．５ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤと略す）、１Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｄ〔５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕を調製した。比較として、試薬Ｃ’〔０．２ｍＭ ＣｏＡＳＨ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ−システイン、０．２ｍＭ ＴＰＰ、２．５ｍＭ ＮＡＤ、１Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｄ’〔０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕を調製した。
検体として１５ｍＭピルビン酸ナトリウムを５段階希釈して使用した。この検体各５μｌに試薬Ｃ２４０μｌ及び試薬Ｄ６０μｌを加え、３７℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬ブランクを対照として波長３４０ｎｍで吸光度を測定した。試薬調製後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１０、２０、３０日間測定した結果を図３に示す。次に、比較として試薬Ｃの代わりに試薬Ｃ’を、試薬Ｄの代わりに試薬Ｄ’を用いて同様に操作し、測定を行った。その結果を図４に示す。
ＣｏＡＳＨを添加した試薬を使用した場合、図４に示すようにピルビン酸濃度が高いため、０日目から直線性を失う。しかしながら、ＣｏＡＳＨの１／１０濃度のアセチルＣｏＡを添加した試薬を使用した場合の結果を示す図３は、３０日間問題なく試薬が使用できたことを示している。このように、ＣｏＡＳＨで添加するよりも、アセチルＣｏＡで添加する本発明の方法を用いた方が試薬の安定性が優れていることがわかる。
【００２８】
参考例１．
参考例として、ＣｏＡＳＨとアシルＣｏＡの安定性を比較検討した結果を以下に示す。
５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（以下、ＭＥＳと略す）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（以下、ＣＨＥＳと略す）を含むｐＨ５、６、７、８、９の緩衝液を調製し、各々に０．１ｍＭのＣｏＡＳＨを溶解し、冷蔵（２〜８℃）及び３０℃に１０日間保存後、保存液１０μｌに定量用試薬〔１０ｍＭ 塩化アンモニウム、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２ｍＭ Ｌ−システイン、３ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＮＡＤ、０．２ｍＭ ＴＰＰ、０．５Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、０．５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴ、１０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕５００μｌを加え、３７℃恒温下、波長３４０ｎｍの吸光度変化量を標準液の吸光度変化量と比較することにより残存量を求めた。その結果を図５に示す。
次に、上記と同様に調製した緩衝液に０．１ｍＭのアセチルＣｏＡを溶解し、上記と同じ方法で保存した後、上記の定量用試薬を加え、残存量を求めた。その結果も図５に示す。
さらに、上記と同様に調製した緩衝液に０．１ｍＭのパルミトイルＣｏＡを溶解し、上記と同じ方法で保存を行った。パルミトイルＣｏＡの定量は、保存液２０μｌに定量用試薬〔１ｍＭ ＳＣＥＰ、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、１Ｕ／ｍｌ ＡＣＯＤを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕３００μｌを加え、３７℃恒温下、１０分間インキュベーション後、波長５４６ｎｍで吸光度を測定し、標準液の吸光度と比較することにより残存量を求めた。その結果も図５に示す。
図５から明らかなように、ＣｏＡＳＨに比べ、アセチルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡの安定性の方がはるかによいことが判明した。ＣｏＡＳＨはｐＨ５以下で安定化するようだが、このｐＨ域は通常の酵素が不安定になる場合が多い。また、至適酵素活性を示すｐＨからはずれていることが多い。その点、アシルＣｏＡは中性近辺でも十分な安定性を示すため、安定な試薬の調製に有効に利用できる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることにより、試薬の液状安定性を長期間維持することが可能となり、液状無調製試薬へ応用することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 オレイン酸ナトリウムにアセチルＣｏＡを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図２】 オレイン酸ナトリウムにＣｏＡＳＨを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図３】 ピルビン酸ナトリウムにアセチルＣｏＡを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図４】 ピルビン酸ナトリウムにＣｏＡＳＨを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図５】 ＣｏＡＳＨ、アセチルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡを冷蔵（２〜８℃）または３０℃に１０日間保存後に残存量を求め、安定性を比較した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は試薬キット及び試薬キットの使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の生体試料分析において使用される試薬には、不安定な試薬成分を含んだものが少なからず存在し、こうした試薬の安定性は上記の試薬成分の安定性に依存している。
【０００３】
このような不安定な試薬成分の１つとしてコエンザイムＡ（以下、ＣｏＡＳＨと略す）が挙げられる。ＣｏＡＳＨを用いて定量される項目としては例えば、次式（Ｉ）で表される、ＣｏＡＳＨとアシルコエンザイムＡシンセターゼ（以下、ＡＣＳと略す）を使用する血中遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡと略す）の定量がある。
【０００４】
【化１】
また、次式（ＩＩ）で表されるピルビン酸脱水素酵素（以下、ＰＤＨＬと略す）を用いたピルビン酸の定量方法（特開平５−９５７９８号公報）がある。
【０００６】
【化２】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）の定量反応に使用される試薬に添加されるＣｏＡＳＨは熱安定性が良くないだけでなく、容易に酸化されて生理活性を失うことが知られている〔生化学データーブック（日本生化学会；東京化学同人）〕。
【０００８】
このような不安定な試薬成分を含む試薬の安定化方法としては、弱酸性下に保存したり、キレート剤の添加、、スルフヒドリル化合物の添加などが行われている。しかしこうした方法をもってしても、調製した試薬は経時的に活性成分が少なくなるため、定量限界が経時的に低下し、やがて反応しなくなるという問題点を有している。
最近の臨床検査においては、試薬を溶解する手間を省いた液状無調製試薬が主流となってきているが、上記のような不安定な試薬成分を必要とする試薬に関しては、上述した試薬成分の安定化の問題のため、未だ液状無調製試薬は製品化されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、不安定な試薬成分を使用して物質を測定する試薬であって、液状で長期間使用しうる安定な試薬を提供することである。
本発明の他の目的は、不安定な試薬成分を使用して物質を測定する試薬の安定化方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、不安定な試薬成分をアシル基で保護しておき、測定時に保護基の脱離を行い必要な試薬成分を生成させることにより、試薬を安定化させることが可能となることを見いだした。すなわち、不安定な試薬成分を試薬に添加する場合に、保護基で保護された該試薬成分を含む第一試薬と該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を含む第二試薬からなる試薬キットを作製し、用時に上記第一試薬および第二試薬を混合し、上記の保護基を脱離せしめるという方法を用いることにより、液状で長期間使用できる安定な試薬を提供することが可能となることを見い出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）アシルコエンザイムＡを含む第一試薬とアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素を含む第二試薬からなる試薬キット、
（２）第二試薬がさらにアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素の基質を含む（１）に記載の試薬キット、
（３）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡである（１）に記載の試薬キット、
（４）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡであり、アシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素がフォスフォトランスアセチラーゼである（１）に記載の試薬キット、
（５）ヒト体液中の成分の測定に用いる（１）〜（４）のいずれかに記載の試薬キット、
（６）アシルコエンザイムＡを含む第一試薬とアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素を含む第二試薬とを混合して、アシルコエンザイムＡのアシル基を脱離させる工程を有する試薬キットの使用方法、
（７）第二試薬がさらにアシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素の基質を含む（６）に記載の試薬キットの使用方法、
（８）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡである（６）に記載の試薬キットの使用方法、
（９）アシルコエンザイムＡがアセチルコエンザイムＡであり、アシルコエンザイムＡのアシル基を脱離しうる酵素がフォスフォトランスアセチラーゼである（６）に記載の試薬キットの使用方法、
（１０）ヒト体液中の成分の測定に用いる（６）〜（９）のいずれかに記載の試薬キットの使用方法、
に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に使用される試薬成分は特に限定されず、いずれの試薬成分でも使用できるが、好ましくはＣｏＡＳＨが例示される。
【００１２】
これらの試薬成分を保護する保護基はアシル基であることが好ましい。
本発明で使用するアシル基としては、アセチル基、パルミトイル基、アセトアセチル基、アラキドニル基、ｎ−ブチリル基、クロトノイル基、ｎ−デカノイル基、エイコサノイル基、グルタリル基、ｎ−ヘプタノイル基、ｎ−ヘキサノイル基、イソブチリル基、イソバレリル基、ラウロイル基、リノレイル基、マロニル基、ミリストイル基、オレイル基、プロピオニル基、ステアロイル基、サクシニル基等が挙げられるが、好ましくはアセチル基、パルミトイル基、アセトアセチル基等を、特に好ましくはアセチル基を使用する。
【００１３】
本発明で用いられる、保護基を有する試薬成分から保護基を脱離する成分は特に限定されず、酵素（例えば、脱離酵素、合成酵素、保護基の転移酵素、加水分解酵素等）などの中から、主反応（定量反応系）に影響を与えない成分を使用すればよい。
【００１４】
上記の保護基を有する試薬成分を添加した試薬を第一試薬とし、該試薬成分の保護基を脱離しうる成分を添加した試薬を第二試薬とする。本発明における試薬キットは上記の第一試薬および第二試薬から構成され、用時にこの２つの試薬を混合することにより、該試薬成分を保護する保護基が脱離されて該試薬成分が生成される。このため試薬成分が不安定な物質であっても、本発明の試薬キットではその試薬成分の活性は安定に保たれる。
【００１５】
例えば試薬成分としてＣｏＡＳＨを用い、アシル基で保護しアシルＣｏＡとして使用する場合、それらのアシルＣｏＡを基質として利用できる酵素があれば、いずれのアシルＣｏＡでも使用できる。そのようなアシルＣｏＡとして、アセチル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アラキドニル−ＣｏＡ、ｎ−ブチリル−ＣｏＡ、クロトノイル−ＣｏＡ、ｎ−デカノイル−ＣｏＡ、エイコサノイル−ＣｏＡ、グルタリル−ＣｏＡ、ｎ−ヘプタノイル−ＣｏＡ、ｎ−ヘキサノイル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ、イソバレリル−ＣｏＡ、ラウロイル−ＣｏＡ、リノレイル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、ミリストイル−ＣｏＡ、オレイル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ステアロイル−ＣｏＡ、サクシニル−ＣｏＡ等が挙げられるが、好ましくはアセチル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ等を使用する。特に、アシル基の安定性・溶解性、共役酵素反応、あるいは入手の容易さ等を考慮すると、アセチル−ＣｏＡを使用することが望ましい。
【００１６】
例えば保護基を有する試薬成分としてアセチルＣｏＡを用いる場合、保護基であるアセチル基を脱離しうる成分としては、クエン酸（ｓｉ）−シンテターゼ（ＥＣ４．１．３．７）、ＡＴＰクエン酸（ｐｒｏ−３ｓ）−リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）、ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ４．１．３．２１）、クエン酸（ｒｅ）−シンテターゼ（ＥＣ４．１．３．２８）、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１）、イミダゾールアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２）、グルコサミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３）、グルコサミン−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）、アリルアミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．６）、カルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７）、フォスフォトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、硫化水素アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１０）、チオエタノールアミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１１）、グリシンアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１３）、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）等が挙げられるが、好ましくはフォスフォトランスアセチラーゼが用いられる。
【００１７】
保護基を有する試薬成分としてアシルＣｏＡを使用する場合に、アシル基を脱離し、物質の測定に必要なＣｏＡＳＨを生成させる原理を次式（ＩＩＩ）に示す。
【００１８】
【化３】
本発明の試薬キットにおいて試薬成分としてアシルＣｏＡを使用する場合には、アシルＣｏＡからアシル基を脱離しＣｏＡＳＨを反応時に生成させるために、アシルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、式（ＩＩＩ）中の酵素またはその基質のどちらか一方または両方を上記のアシルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれを第二試薬とし、用時に混合して用いる。試薬が混合されたとき該アシルＣｏＡは、式（ＩＩＩ）に示されるようにＣｏＡＳＨを生じる。このＣｏＡＳＨが測定対象となる被検物質と反応して生じた生成物を公知の方法を用いて定量することにより、被検物質の測定を行うことができる。
第一試薬と第二試薬との混合時に上記の原理により生成されたＣｏＡＳＨは、臨床検査においてヒト体液中の種々の成分、例えば、遊離脂肪酸、ピルビン酸、尿素窒素、コリンエステラーゼ、トリグリセライド、クレアチニン等の測定に供せられる。
【００２０】
例えば、アセチルＣｏＡと、酵素としてフォスフォトランスアセチラーゼ（以下、ＰＡＴと略す）を添加する系を利用して、ＮＥＦＡをＡＣＳで測定する〔式（Ｉ）〕場合には、アセチルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、リン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちらか一方または両方をアセチルＣｏＡとは別の試薬に添加し第二試薬とする。第一試薬と第二試薬が混合された時、ＰＡＴが次式（ＩＶ）に示される反応を触媒し、アセチルＣｏＡは式（Ｉ）に示されるＡＣＳに必要なＣｏＡＳＨを生成させることができる。
【００２１】
【化４】
次に、式（Ｉ）の反応によりさらに生成したアシルＣｏＡまたはＡＭＰまたはピロリン酸を公知の方法で定量する。その際、一般にはＡＣＯＤを使用したアシルＣｏＡの定量がよく利用されているが、ＡＣＯＤはアセチルＣｏＡを基質としないため、本発明の測定には影響しない。
【００２３】
また、例えばアセチルＣｏＡと、酵素としてＰＡＴを添加する系を利用してピルビン酸をＰＤＨＬで測定するとき〔式（ＩＩ）〕も同様に、反応時にアセチルＣｏＡからＣｏＡＳＨを生成させればよい。すなわち、アセチルＣｏＡを添加した試薬を第一試薬とし、リン酸（Ｐｉ）またはＰＡＴのどちらか一方または両方をアセチルＣｏＡとは別の試薬に添加しこれを第二試薬とする。第一試薬と第二試薬が混合された時、ＰＡＴが式（ＩＶ）に示される反応を触媒し、アセチルＣｏＡは式（ＩＩ）に示されるＰＤＨＬに必要なＣｏＡＳＨを生成させることができる。この場合、ＮＥＦＡの定量と異なりＣｏＡサイクリングを形成することができるため、使用するアセチルＣｏＡ量が低くても使用できる利点がある。
【００２４】
ＣｏＡサイクイング反応については、生化学実験講座５．酵素研究法 上 ｐ１２１−１３５に詳細に記載されている。これによるとＣｏＡサイクリング反応は増幅定量するものであって、数多くの報告がなされている。また、ＰＤＨＬを用いたＣｏＡサイクリングについても報告されている（Szutowicz A, et al, Anal Biochem, 115, 81-87(1981) ;Coore HG, et al, Biochem J, 125, 115-127(1971) ;Methods in Enzymology Vol.9, 247-253(1966) ;特開平５−２６８９９７号公報）。また、この測定法が２−オキソグルタル酸脱水素酵素にも応用できることが報告されている。（Methods in Enzymology Vol.9, 247-253(1966)) 。このようにＰＤＨＬによるＣｏＡサイクリング自体は公知であるが、本発明の方法のように臨床検査に供される試薬の安定性を長期間維持できることを目的としてＣｏＡサイクリングを使用する例はない。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げてその詳細を説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２６】
実施例１．
ＮＥＦＡの定量安定性
試薬Ａ〔１．２５ｍＭ １−（４’−スルフォフェニル）−３−カルボエトキシ−５−ピラゾロン（以下、ＳＣＥＰと略す）、０．５ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５Ｕ／ｍｌ ＡＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォン酸（以下、ＨＥＰＥＳと略す）緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ〔５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌ ＡＣＯＤ、５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を調製した。比較として試薬Ａ’〔１．２５ｍＭ ＳＣＥＰ、０．５ｍＭ ＣｏＡＳＨ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２．５Ｕ／ｍｌ ＡＣＳ、１２．５Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｂ’〔５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、５ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ／ｍｌＡＣＯＤを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を調製した。
検体として２．５ｍＥｑ／ｌ オレイン酸ナトリウムを５段階希釈したものを使用した。この検体各５μｌに試薬Ａ２４０μｌ及び試薬Ｂ６０μｌを加え、３７℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬ブランクを対照として波長５４６ｎｍで吸光度を測定した。試薬調製後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１０、２０、３０日間測定した結果を図１に示す。次に、比較として試薬Ａの代わりに試薬Ａ’を、試薬Ｂの代わりに試薬Ｂ’を用いて同様に操作し、測定を行った。その結果を図２に示す。
図１、図２の結果から明らかなように、ＣｏＡＳＨで添加するよりもアセチルＣｏＡで添加する本発明の方法を用いた方が、試薬の安定性が優れていることがわかる。
【００２７】
実施例２．
ピルビン酸の定量安定性
試薬Ｃ〔０．０２ｍＭ アセチルＣｏＡ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ−システイン、０．２ｍＭ チアミンピロリン酸（以下、ＴＰＰと略す）、２．５ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤと略す）、１Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｄ〔５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕を調製した。比較として、試薬Ｃ’〔０．２ｍＭ ＣｏＡＳＨ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化アンモニウム、２．５ｍＭ Ｌ−システイン、０．２ｍＭ ＴＰＰ、２．５ｍＭ ＮＡＤ、１Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕、及び試薬Ｄ’〔０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 塩化マグネシウム、２０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕を調製した。
検体として１５ｍＭピルビン酸ナトリウムを５段階希釈して使用した。この検体各５μｌに試薬Ｃ２４０μｌ及び試薬Ｄ６０μｌを加え、３７℃の恒温槽で５分間反応させた後、試薬ブランクを対照として波長３４０ｎｍで吸光度を測定した。試薬調製後、冷蔵（２〜８℃）に保管して０、１０、２０、３０日間測定した結果を図３に示す。次に、比較として試薬Ｃの代わりに試薬Ｃ’を、試薬Ｄの代わりに試薬Ｄ’を用いて同様に操作し、測定を行った。その結果を図４に示す。
ＣｏＡＳＨを添加した試薬を使用した場合、図４に示すようにピルビン酸濃度が高いため、０日目から直線性を失う。しかしながら、ＣｏＡＳＨの１／１０濃度のアセチルＣｏＡを添加した試薬を使用した場合の結果を示す図３は、３０日間問題なく試薬が使用できたことを示している。このように、ＣｏＡＳＨで添加するよりも、アセチルＣｏＡで添加する本発明の方法を用いた方が試薬の安定性が優れていることがわかる。
【００２８】
参考例１．
参考例として、ＣｏＡＳＨとアシルＣｏＡの安定性を比較検討した結果を以下に示す。
５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（以下、ＭＥＳと略す）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（以下、ＣＨＥＳと略す）を含むｐＨ５、６、７、８、９の緩衝液を調製し、各々に０．１ｍＭのＣｏＡＳＨを溶解し、冷蔵（２〜８℃）及び３０℃に１０日間保存後、保存液１０μｌに定量用試薬〔１０ｍＭ 塩化アンモニウム、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２ｍＭ Ｌ−システイン、３ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＮＡＤ、０．２ｍＭ ＴＰＰ、０．５Ｕ／ｍｌ ＰＤＨＬ、０．５Ｕ／ｍｌ ＰＡＴ、１０ｍＭ リン酸一カリウムを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕５００μｌを加え、３７℃恒温下、波長３４０ｎｍの吸光度変化量を標準液の吸光度変化量と比較することにより残存量を求めた。その結果を図５に示す。
次に、上記と同様に調製した緩衝液に０．１ｍＭのアセチルＣｏＡを溶解し、上記と同じ方法で保存した後、上記の定量用試薬を加え、残存量を求めた。その結果も図５に示す。
さらに、上記と同様に調製した緩衝液に０．１ｍＭのパルミトイルＣｏＡを溶解し、上記と同じ方法で保存を行った。パルミトイルＣｏＡの定量は、保存液２０μｌに定量用試薬〔１ｍＭ ＳＣＥＰ、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、１Ｕ／ｍｌ ＡＣＯＤを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）〕３００μｌを加え、３７℃恒温下、１０分間インキュベーション後、波長５４６ｎｍで吸光度を測定し、標準液の吸光度と比較することにより残存量を求めた。その結果も図５に示す。
図５から明らかなように、ＣｏＡＳＨに比べ、アセチルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡの安定性の方がはるかによいことが判明した。ＣｏＡＳＨはｐＨ５以下で安定化するようだが、このｐＨ域は通常の酵素が不安定になる場合が多い。また、至適酵素活性を示すｐＨからはずれていることが多い。その点、アシルＣｏＡは中性近辺でも十分な安定性を示すため、安定な試薬の調製に有効に利用できる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることにより、試薬の液状安定性を長期間維持することが可能となり、液状無調製試薬へ応用することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 オレイン酸ナトリウムにアセチルＣｏＡを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図２】 オレイン酸ナトリウムにＣｏＡＳＨを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図３】 ピルビン酸ナトリウムにアセチルＣｏＡを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図４】 ピルビン酸ナトリウムにＣｏＡＳＨを添加した試薬を加え、吸光度を測定した結果を示す。
【図５】 ＣｏＡＳＨ、アセチルＣｏＡ、パルミトイルＣｏＡを冷蔵（２〜８℃）または３０℃に１０日間保存後に残存量を求め、安定性を比較した図である。
Claims (8)
- アセチルコエンザイムＡを含む第一試薬とアセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離しうる酵素を含む第二試薬からなる試薬キット。
- 第二試薬がさらにアセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離しうる酵素の基質を含む請求項１に記載の試薬キット。
- アセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離しうる酵素がフォスフォトランスアセチラーゼである請求項１又は２に記載の試薬キット。
- ヒト体液中の成分の測定に用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬キット。
- アセチルコエンザイムＡを含む第一試薬とアセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離しうる酵素を含む第二試薬とを混合して、アセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離させる工程を有する試薬キットの使用方法。
- 第二試薬がさらにアセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離しうる酵素の基質を含む請求項５に記載の試薬キットの使用方法。
- アセチルコエンザイムＡのアセチル基を脱離しうる酵素がフォスフォトランスアセチラーゼである請求項５又は６に記載の試薬キットの使用方法。
- ヒト体液中の成分の測定に用いる請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬キットの使用方法。
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