JP2000236874A - 酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 - Google Patents
酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 安定化された尿素窒素測定試薬を提供する。
【解決手段】 ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を補酵素とす
る酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素と、Ｌ−シス
テイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジンおよびヒド
ラジン類縁体からからなる群から選ばれる少なくとも１
種の化合物とを共存させる。
る酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素と、Ｌ−シス
テイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジンおよびヒド
ラジン類縁体からからなる群から選ばれる少なくとも１
種の化合物とを共存させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は酵素の安定化方法及
びその応用に関し、さらに詳しくはＡＤＰ−リボースに
より不安定化される酵素例えばウレアアミドリアーゼ、
グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキ
ソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナ
ーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸
脱水素酵素の保存時又は反応時の安定化が確保された酵
素の安定化方法及び測定試薬に関する。又、本発明は安
定化された尿素測定試薬に関するものである。
びその応用に関し、さらに詳しくはＡＤＰ−リボースに
より不安定化される酵素例えばウレアアミドリアーゼ、
グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキ
ソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナ
ーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸
脱水素酵素の保存時又は反応時の安定化が確保された酵
素の安定化方法及び測定試薬に関する。又、本発明は安
定化された尿素測定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする
酵素としては種々のものが知られており、例えばグルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素等がある。ＮＡＤ＋又はＮ
ＡＤＰ ＋を補酵素とする酵素反応系に用いられる酵素が
保存時又は反応時に不安定化することが多いが、その原
因についてはこれまでよく知られていなかった。
酵素としては種々のものが知られており、例えばグルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素等がある。ＮＡＤ＋又はＮ
ＡＤＰ ＋を補酵素とする酵素反応系に用いられる酵素が
保存時又は反応時に不安定化することが多いが、その原
因についてはこれまでよく知られていなかった。
【０００３】ウレアーゼは尿素窒素の測定において尿素
をアンモニアと二酸化炭素（ＣＯ２）に分解するのに用
いられている。尿素はアミノ酸の脱アミノ化によって生
じたアンモニアとＣＯ２とから主として肝で尿素サイク
ルによって合成され、血中では血漿と血球の水分中に平
等に含有されている。尿素窒素（以下、ＢＵＮと略称す
ることがある）は、正常では、血清中の蛋白以外の窒素
化合物である非蛋白窒素（以下、ＮＰＮと略称すること
がある）の約５０％であるが、尿毒症では８０〜９０％
に達する。ＢＵＮの測定はＮＰＮとほとんど同じ臨床的
意義をもっているが、病態における変動が大きく、測定
法が簡単であることからＢＵＮ測定が主として行われて
いる。
をアンモニアと二酸化炭素（ＣＯ２）に分解するのに用
いられている。尿素はアミノ酸の脱アミノ化によって生
じたアンモニアとＣＯ２とから主として肝で尿素サイク
ルによって合成され、血中では血漿と血球の水分中に平
等に含有されている。尿素窒素（以下、ＢＵＮと略称す
ることがある）は、正常では、血清中の蛋白以外の窒素
化合物である非蛋白窒素（以下、ＮＰＮと略称すること
がある）の約５０％であるが、尿毒症では８０〜９０％
に達する。ＢＵＮの測定はＮＰＮとほとんど同じ臨床的
意義をもっているが、病態における変動が大きく、測定
法が簡単であることからＢＵＮ測定が主として行われて
いる。
【０００４】ＢＵＮの測定用試薬の測定法としては、ネ
スラー法（Ｃ．Ｊ．Ｇｅｎｔｚｋｏｗ， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，１４３，５３１−５４４（１９４
２））、比色法（Ａ．Ａ． Ｏｒｍｓｂｙ， Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１４６，５９５−６０４（１９
４２））、 カラー法（Ｒ．Ｌ．Ｓｅａｒｃｙ ｅｔ
ｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，１２，１
７０−１７５（１９６５））、 インドフェノール法
（Ａ．Ｌ．Ｃｈａｎｅｙ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．，８，１３０−１３２（１９６２））、グルタミ
ン酸脱水素酵素法（Ｂ．Ａ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ ｅｔ
ｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，２５，２６−３０
（１９７９））がある。通常、グルタミン酸脱水素酵素
法が用いられている。
スラー法（Ｃ．Ｊ．Ｇｅｎｔｚｋｏｗ， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，１４３，５３１−５４４（１９４
２））、比色法（Ａ．Ａ． Ｏｒｍｓｂｙ， Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１４６，５９５−６０４（１９
４２））、 カラー法（Ｒ．Ｌ．Ｓｅａｒｃｙ ｅｔ
ｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，１２，１
７０−１７５（１９６５））、 インドフェノール法
（Ａ．Ｌ．Ｃｈａｎｅｙ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．，８，１３０−１３２（１９６２））、グルタミ
ン酸脱水素酵素法（Ｂ．Ａ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ ｅｔ
ｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，２５，２６−３０
（１９７９））がある。通常、グルタミン酸脱水素酵素
法が用いられている。
【０００５】一方、修飾によりタンパク質の性質の変化
あるいは機能の低下ないしは喪失がおきることが多くの
タンパク質において知られている。例えば、ヘキソース
によるタンパク質の糖質化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が多
くの疾病の病理や老化過程に関与していることが示唆さ
れている（Ｄ．Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅｎｔ
ｓ，Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｔｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓｏ
ｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１５２８−１
５３４（１９９３））。
あるいは機能の低下ないしは喪失がおきることが多くの
タンパク質において知られている。例えば、ヘキソース
によるタンパク質の糖質化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が多
くの疾病の病理や老化過程に関与していることが示唆さ
れている（Ｄ．Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅｎｔ
ｓ，Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｔｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓｏ
ｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１５２８−１
５３４（１９９３））。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】例えばウレアアミドリ
アーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依
存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビ
ン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、
及び乳酸脱水素酵素の少なくとも一種を含む酵素反応系
に用いられる酵素が保存時又は反応時に不安定化する原
因物質をつきとめ、この原因物質を除去することなく、
あるいは補酵素等を精製することなく、簡単にその不安
定化作用を回避する手段が望まれている。
アーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依
存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビ
ン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、
及び乳酸脱水素酵素の少なくとも一種を含む酵素反応系
に用いられる酵素が保存時又は反応時に不安定化する原
因物質をつきとめ、この原因物質を除去することなく、
あるいは補酵素等を精製することなく、簡単にその不安
定化作用を回避する手段が望まれている。
【０００７】また、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素と
する酵素を含む酵素反応系の応用の一例である、ウレア
アミドリアーゼを用いた尿素窒素測定方法において用い
られる酵素を安定化すること、及びそのような酵素反応
を利用した尿素窒素測定試薬の保存時又は反応時におけ
る安定性を向上させることが望まれている。
する酵素を含む酵素反応系の応用の一例である、ウレア
アミドリアーゼを用いた尿素窒素測定方法において用い
られる酵素を安定化すること、及びそのような酵素反応
を利用した尿素窒素測定試薬の保存時又は反応時におけ
る安定性を向上させることが望まれている。
【０００８】従って、本発明の目的は、ウレアアミドリ
アーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依
存性ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系に用
いられる酵素の保存時又は反応時の不安定化を回避する
方法を提供することである。
アーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依
存性ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系に用
いられる酵素の保存時又は反応時の不安定化を回避する
方法を提供することである。
【０００９】本発明の別の目的は、ウレアアミドリアー
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性
ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系におい
て、酵素の安定化手段が導入された測定試薬ならびに、
特に尿素窒素測定試薬を提供することである。
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性
ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系におい
て、酵素の安定化手段が導入された測定試薬ならびに、
特に尿素窒素測定試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意検討し
た結果、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミ
ン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の少なくとも
一種の、保存時又は反応時の不安定化は、ＮＡＤ＋又は
ＮＡＤＰ＋の分解生成物が原因で起きていること、これ
ら分解生成物のうち、特にＡＤＰ−リボースが原因物質
であること、ＡＤＰ−リボースによる酵素の不安定化は
酵素タンパク質のＡＤＰ−リボースによる修飾によるも
のであり、各種の酵素を利用した測定法の場合、このよ
うな酵素の不安定化は測定結果の信頼性を損なうので、
例えば、尿素窒素の測定法において、尿素を分解する酵
素の安定性が重要であることを見出した。
た結果、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミ
ン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の少なくとも
一種の、保存時又は反応時の不安定化は、ＮＡＤ＋又は
ＮＡＤＰ＋の分解生成物が原因で起きていること、これ
ら分解生成物のうち、特にＡＤＰ−リボースが原因物質
であること、ＡＤＰ−リボースによる酵素の不安定化は
酵素タンパク質のＡＤＰ−リボースによる修飾によるも
のであり、各種の酵素を利用した測定法の場合、このよ
うな酵素の不安定化は測定結果の信頼性を損なうので、
例えば、尿素窒素の測定法において、尿素を分解する酵
素の安定性が重要であることを見出した。
【００１１】本発明の一は、ＡＤＰ−リボースが測定反
応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応
系において、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこ
る測定反応系に関与する酵素の不安定化を阻止する手段
を導入することを特徴とする生体内成分の測定試薬に関
し、さらに詳しくはウレアアミドリアーゼ、グルコース
−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナー
ゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の
少なくとも一種を含む酵素反応系を用いる試薬において
ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる該酵素の不
安定化を阻止する手段を導入することからなる。
応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応
系において、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこ
る測定反応系に関与する酵素の不安定化を阻止する手段
を導入することを特徴とする生体内成分の測定試薬に関
し、さらに詳しくはウレアアミドリアーゼ、グルコース
−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナー
ゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の
少なくとも一種を含む酵素反応系を用いる試薬において
ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる該酵素の不
安定化を阻止する手段を導入することからなる。
【００１２】さらに、本発明の別の一はＮＡＤ＋又はＮ
ＡＤＰ＋の分解生成物あるいはＡＤＰ−リボースによる
これら酵素（ＡＤＰ−リボースにより不安定化される酵
素）の不安定化がＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁
体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選
ばれる少なくとも１種の化合物を共存させることにより
回避されることを見出し、本発明を完成した。
ＡＤＰ＋の分解生成物あるいはＡＤＰ−リボースによる
これら酵素（ＡＤＰ−リボースにより不安定化される酵
素）の不安定化がＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁
体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選
ばれる少なくとも１種の化合物を共存させることにより
回避されることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】本発明の酵素の不安定化を阻止する手段
は、ＡＤＰ−リボースによる作用を阻止することであ
り、その阻止の手段とは該酵素の安定化に有効な量のＬ
−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及び
ヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１
種の化合物とを共存させるものである。
は、ＡＤＰ−リボースによる作用を阻止することであ
り、その阻止の手段とは該酵素の安定化に有効な量のＬ
−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及び
ヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１
種の化合物とを共存させるものである。
【００１４】本発明の酵素の例としてはウレアアミドリ
アーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６
−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビ
ン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、
及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少なくとも一種の酵素
を含むものであってもよい。しかし、ＡＤＰ−リボース
によって影響をうける酵素であれば、これらに限定され
るものではなく、広く適用可能である。
アーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６
−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビ
ン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、
及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少なくとも一種の酵素
を含むものであってもよい。しかし、ＡＤＰ−リボース
によって影響をうける酵素であれば、これらに限定され
るものではなく、広く適用可能である。
【００１５】本発明の酵素の安定化方法は、β−ＮＡＤ
（Ｐ）＋等と、その分解生成物により阻害作用を受ける
酵素を含む酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースによる修飾
によっておこる酵素の不安定化を阻止する手段を導入す
ることであり、その手段の一例として有効量のＬ−シス
テイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラ
ジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化
合物を添加することで、前記β−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生
成物による前記酵素不安定化作用を回避するものであ
る。
（Ｐ）＋等と、その分解生成物により阻害作用を受ける
酵素を含む酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースによる修飾
によっておこる酵素の不安定化を阻止する手段を導入す
ることであり、その手段の一例として有効量のＬ−シス
テイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラ
ジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化
合物を添加することで、前記β−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生
成物による前記酵素不安定化作用を回避するものであ
る。
【００１６】本発明の安定化された試薬は、ＡＤＰ−リ
ボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内
成分の測定反応系において、ＡＤＰ−リボースによる修
飾によっておこる測定反応系に関与する酵素の不安定化
を阻止する手段を導入することを特徴とする生体内成分
の測定試薬である。ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分
解産物として産生される生体内成分の測定反応系とは、
ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ，ＦＡＤ
等を補酵素として使用する反応系である。酵素の例とし
てはウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸
脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少
なくとも一種の酵素を含むものであってもよい。
ボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内
成分の測定反応系において、ＡＤＰ−リボースによる修
飾によっておこる測定反応系に関与する酵素の不安定化
を阻止する手段を導入することを特徴とする生体内成分
の測定試薬である。ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分
解産物として産生される生体内成分の測定反応系とは、
ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ，ＦＡＤ
等を補酵素として使用する反応系である。酵素の例とし
てはウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸
脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少
なくとも一種の酵素を含むものであってもよい。
【００１７】酵素の不安定化を阻止する手段の一例とし
ては、有効量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁
体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選
ばれる少なくとも１種の化合物安定化剤として使用する
ものである。
ては、有効量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁
体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選
ばれる少なくとも１種の化合物安定化剤として使用する
ものである。
【００１８】上記ＡＤＰ−リボースによる修飾によって
おこる酵素の不安定化を阻止する手段としてＬ−システ
インを用いる場合は、Ｌ−システインが酸化されてシス
チンになり沈澱を生成することを回避するための安定化
補助手段を導入することが好ましく、該安定化補助手段
としては酸化防止剤、例えばＬ−システインを除くスル
フヒドリル化合物が好ましい。
おこる酵素の不安定化を阻止する手段としてＬ−システ
インを用いる場合は、Ｌ−システインが酸化されてシス
チンになり沈澱を生成することを回避するための安定化
補助手段を導入することが好ましく、該安定化補助手段
としては酸化防止剤、例えばＬ−システインを除くスル
フヒドリル化合物が好ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素
とする酵素を含む酵素反応系の例としては、ウレアアミ
ドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−Ｈ
Ｋ）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた複
合酵素系がある。この酵素反応系では、図１に示すよう
に、次のように反応がおきる。
とする酵素を含む酵素反応系の例としては、ウレアアミ
ドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−Ｈ
Ｋ）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた複
合酵素系がある。この酵素反応系では、図１に示すよう
に、次のように反応がおきる。
【００２０】まず、（１）ＡＴＰとマグネシウムイオン
（Ｍｇ２＋）及びカリウムイオン（Ｋ＋）の存在下でウ
レアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）が尿素に作用してこれを
アンモニアとＣＯ２とに分解し、その際ＡＴＰがＡＤＰ
に加水分解される。次に、（２）ＡＤＰ依存性ヘキソキ
ナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）及びＭｇ２＋の存在下、グルコ
ースを基質としてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）が
生成し、ＡＤＰはさらにＡＭＰに加水分解する。さら
に、（３）補酵素β−ＮＡＤＰ＋の存在下でグルコース
−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＤＰＨ）の作用でＧ６Ｐ
から６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンが生成し、その
際、酸化型補酵素β−ＮＡＤＰ＋は還元型補酵素β−Ｎ
ＡＤＰＨに変化する。この補酵素の変化量を３４０ｎｍ
における吸光度の測定を行い、その変化から尿素窒素量
を得ることができる。
（Ｍｇ２＋）及びカリウムイオン（Ｋ＋）の存在下でウ
レアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）が尿素に作用してこれを
アンモニアとＣＯ２とに分解し、その際ＡＴＰがＡＤＰ
に加水分解される。次に、（２）ＡＤＰ依存性ヘキソキ
ナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）及びＭｇ２＋の存在下、グルコ
ースを基質としてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）が
生成し、ＡＤＰはさらにＡＭＰに加水分解する。さら
に、（３）補酵素β−ＮＡＤＰ＋の存在下でグルコース
−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＤＰＨ）の作用でＧ６Ｐ
から６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンが生成し、その
際、酸化型補酵素β−ＮＡＤＰ＋は還元型補酵素β−Ｎ
ＡＤＰＨに変化する。この補酵素の変化量を３４０ｎｍ
における吸光度の測定を行い、その変化から尿素窒素量
を得ることができる。
【００２１】ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋（併せてＮＡＤ
（Ｐ）＋と略称することがある）を補酵素とする酵素を
含む酵素反応系に用いられる酵素、例えばウレアアミド
リアーゼ（ＵＲＬ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素（Ｇ６ＰＤＨ）は、保存時又は該酵素反応系において
不安定化する現象がみられる。本発明者等による検討の
結果、かかる不安定化は酵素自体が不安定であることに
加え、β−ＮＡＤ＋又はβ−ＮＡＤＰ＋の分解生成物が
主たる原因となっていることが判明した。
（Ｐ）＋と略称することがある）を補酵素とする酵素を
含む酵素反応系に用いられる酵素、例えばウレアアミド
リアーゼ（ＵＲＬ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素（Ｇ６ＰＤＨ）は、保存時又は該酵素反応系において
不安定化する現象がみられる。本発明者等による検討の
結果、かかる不安定化は酵素自体が不安定であることに
加え、β−ＮＡＤ＋又はβ−ＮＡＤＰ＋の分解生成物が
主たる原因となっていることが判明した。
【００２２】例えば、ＵＲＬ酵素溶液にβ−ＮＡＤ＋又
はβ−ＮＡＤＰ＋を３ｍＭ添加して３０℃、５日間保存
すると、無添加の場合に比較して残存活性（％）が低下
したが、ニコチンアミド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍ
Ｍ）、ＡＤＰ（１ｍＭ）をそれぞれ添加した場合は残存
活性（％）は低下しないか又は若干低下したにすぎない
（図３）。そこで、β−ＮＡＤ＋の分解生成物を逆相Ｈ
ＰＬＣ（ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー）を用
いて分析したところ、ＡＤＰ−リボースが無視できない
量存在することを確認し、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの
不安定化の原因物質であるとの示唆を得た。これを検証
するために、ＡＤＰ−リボースをＵＲＬ酵素溶液に添加
したところ、ＮＡＤ＋分解生成物を添加した場合と同等
のいちじるしい残存活性（％）の低下がみられた。この
ため、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの不安定化の原因物質
であることが確認された（図３）。
はβ−ＮＡＤＰ＋を３ｍＭ添加して３０℃、５日間保存
すると、無添加の場合に比較して残存活性（％）が低下
したが、ニコチンアミド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍ
Ｍ）、ＡＤＰ（１ｍＭ）をそれぞれ添加した場合は残存
活性（％）は低下しないか又は若干低下したにすぎない
（図３）。そこで、β−ＮＡＤ＋の分解生成物を逆相Ｈ
ＰＬＣ（ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー）を用
いて分析したところ、ＡＤＰ−リボースが無視できない
量存在することを確認し、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの
不安定化の原因物質であるとの示唆を得た。これを検証
するために、ＡＤＰ−リボースをＵＲＬ酵素溶液に添加
したところ、ＮＡＤ＋分解生成物を添加した場合と同等
のいちじるしい残存活性（％）の低下がみられた。この
ため、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの不安定化の原因物質
であることが確認された（図３）。
【００２３】同様に、ＡＤＰ−ＨＫも上記反応系におい
て残存活性低下がみられることを確認した。
て残存活性低下がみられることを確認した。
【００２４】さらに検討した結果、本発明者等は、ＡＤ
Ｐ−リボースによる上述の酵素の不安定化は特定の化合
物を酵素と共存させることで回避し得ることを見出し
た。このような化合物としては、Ｌ−システイン、Ｌ−
システイン類縁体、ヒドラジン、及びセミカルバジド、
ヒドロキシルアミンのようなヒドラジン類縁体があり、
特にＬ−システインとヒドロキシルアミンが好ましい。
これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよ
い。
Ｐ−リボースによる上述の酵素の不安定化は特定の化合
物を酵素と共存させることで回避し得ることを見出し
た。このような化合物としては、Ｌ−システイン、Ｌ−
システイン類縁体、ヒドラジン、及びセミカルバジド、
ヒドロキシルアミンのようなヒドラジン類縁体があり、
特にＬ−システインとヒドロキシルアミンが好ましい。
これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよ
い。
【００２５】ＵＲＬ、Ｇ６ＰＤＨ等の不安定化を回避す
るのに使用できる安定化剤としては、Ｌ−システイン、
Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁
体、例えば塩酸ヒドロキシルアミン、塩酸セミカルバジ
ド等があげられる。これらの安定化剤の使用量は酵素反
応の温度、用いるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度等に応じて変わ
り、予備試験を行うことにより適宜決めることができる
が、一般に０．１〜５０ｍＭであり、好ましくは１〜２
５ｍＭである。安定化剤としてＬ−システインを用いる
場合、Ｌ−システインの安定化補助剤として酸化防止
剤、例えばＬ−システインを除くスルフヒドリル化合物
を用いることが好ましい。
るのに使用できる安定化剤としては、Ｌ−システイン、
Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁
体、例えば塩酸ヒドロキシルアミン、塩酸セミカルバジ
ド等があげられる。これらの安定化剤の使用量は酵素反
応の温度、用いるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度等に応じて変わ
り、予備試験を行うことにより適宜決めることができる
が、一般に０．１〜５０ｍＭであり、好ましくは１〜２
５ｍＭである。安定化剤としてＬ−システインを用いる
場合、Ｌ−システインの安定化補助剤として酸化防止
剤、例えばＬ−システインを除くスルフヒドリル化合物
を用いることが好ましい。
【００２６】本発明による尿素窒素の測定は用手法、自
動分析法のいずれによってもよい。
動分析法のいずれによってもよい。
【００２７】Ｌ−システイン、システイン類縁体、ヒド
ラジン及びヒドラジン類縁体は非酵素的にＡＤＰ−リボ
ースと結合し、ＡＤＰ−リボースの酵素に対する修飾作
用（ＡＤＰ−リボシル化作用）を阻害するものと考えら
れる。理論に縛られるつもりはないが、この阻害作用
は、システイン、ヒドラジン又はそれらの類縁体のＡＤ
Ｐ−リボース又はその構造類似物に対する非酵素的結合
によるものと考えられる。いずれにしても、酵素タンパ
ク質がＡＤＰ−リボース又はその構造類似物と結合する
部位に対するＡＤＰ−リボース又はその構造類似物のア
クセスがこれらの化合物により妨げられる結果、タンパ
ク質の修飾が阻害され、酵素タンパク質の不安定化又は
失活が回避されるものと考えられる。
ラジン及びヒドラジン類縁体は非酵素的にＡＤＰ−リボ
ースと結合し、ＡＤＰ−リボースの酵素に対する修飾作
用（ＡＤＰ−リボシル化作用）を阻害するものと考えら
れる。理論に縛られるつもりはないが、この阻害作用
は、システイン、ヒドラジン又はそれらの類縁体のＡＤ
Ｐ−リボース又はその構造類似物に対する非酵素的結合
によるものと考えられる。いずれにしても、酵素タンパ
ク質がＡＤＰ−リボース又はその構造類似物と結合する
部位に対するＡＤＰ−リボース又はその構造類似物のア
クセスがこれらの化合物により妨げられる結果、タンパ
ク質の修飾が阻害され、酵素タンパク質の不安定化又は
失活が回避されるものと考えられる。
【００２８】このように、ＵＲＬ、Ｇ６ＰＤＨ、ＡＤＰ
−ＨＫに限らず、ＡＤＰ−リボースにより修飾されて不
安定化又は失活する酵素であれば、Ｇ１ｕＤＨ（グルタ
ミン酸脱水素酵素）、ＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、Ｈ
Ｋ（ヘキソキナーゼ）、ＭＤＨ（リンゴ酸脱水素酵
素）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）など上述の本発明によ
る安定化剤を酵素と共存させることで不安定化を回避す
ることができる。
−ＨＫに限らず、ＡＤＰ−リボースにより修飾されて不
安定化又は失活する酵素であれば、Ｇ１ｕＤＨ（グルタ
ミン酸脱水素酵素）、ＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、Ｈ
Ｋ（ヘキソキナーゼ）、ＭＤＨ（リンゴ酸脱水素酵
素）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）など上述の本発明によ
る安定化剤を酵素と共存させることで不安定化を回避す
ることができる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３０】実施例１ 尿素窒素測定試薬の組成 図１の反応系による尿素窒素の測定に用いる試薬の組成
の一例をあげると次の通りである。第一試薬及び第二試
薬のそれぞれの成分を下記の濃度になるように精製水に
溶解して調製した。
の一例をあげると次の通りである。第一試薬及び第二試
薬のそれぞれの成分を下記の濃度になるように精製水に
溶解して調製した。
【００３１】
【表１】 ＨＥＰＥＳ： Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−２−エタンスルホン酸 ＴＡＰＳ： Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸 Ｇ６ＰＤＨ： グルコース−６−リン酸脱水素酵素
Ｎ’−２−エタンスルホン酸 ＴＡＰＳ： Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸 Ｇ６ＰＤＨ： グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００３２】実施例２ ＵＲＬの安定性試験 ＵＲＬの安定性試験を次のようにして行った。β−ＮＡ
ＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３．３ｍＭ）とＬ−
システイン（０ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，１５ｍＭ，２
０ｍＭ，２５ｍＭ，３０ｍＭ，３５ｍＭ，４０ｍＭ，４
５ｍＭ，又は５０ｍＭ）を添加した以外は実施例１と同
様の組成の第一試薬を調製し、−８０℃、２〜８℃又は
３０℃の各温度で７日間保存した場合について、ＵＲＬ
の残存活性（％）を求めた（−８０℃での残存活性を１
００％とした）ところ、図２に示す結果が得られた。２
〜８℃では約１５ｍＭで残存活性がほぼ１００％に達す
る。３０℃では約５ｍＭで残存活性が約５０％に達し、
約３７ｍＭで１００％に達する。従って、温度によって
Ｌ−システインの使用量は変わるが、約１５〜４０ｍ以
上で残存活性がよく、３０℃以下で保存した場合は約３
７ｍＭで残存活性が１００％になる。他の化合物も同様
の傾向を示した。
ＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３．３ｍＭ）とＬ−
システイン（０ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，１５ｍＭ，２
０ｍＭ，２５ｍＭ，３０ｍＭ，３５ｍＭ，４０ｍＭ，４
５ｍＭ，又は５０ｍＭ）を添加した以外は実施例１と同
様の組成の第一試薬を調製し、−８０℃、２〜８℃又は
３０℃の各温度で７日間保存した場合について、ＵＲＬ
の残存活性（％）を求めた（−８０℃での残存活性を１
００％とした）ところ、図２に示す結果が得られた。２
〜８℃では約１５ｍＭで残存活性がほぼ１００％に達す
る。３０℃では約５ｍＭで残存活性が約５０％に達し、
約３７ｍＭで１００％に達する。従って、温度によって
Ｌ−システインの使用量は変わるが、約１５〜４０ｍ以
上で残存活性がよく、３０℃以下で保存した場合は約３
７ｍＭで残存活性が１００％になる。他の化合物も同様
の傾向を示した。
【００３３】実施例３〜６ ＵＲＬの安定性試験 ＵＲＬの安定性試験を次のようにして行った。実施例１
に示す第一試薬において、Ｌ−システイン及びβ−ＮＡ
ＤＰ＋を除いたもの（無添加）、Ｌ−システインを除
き、β−ＮＡＤＰ＋の代わりにβ−ＮＡＤ＋（３ｍ
Ｍ）、ＡＤＰ−リボース（０．３ｍＭ）、ニコチンアミ
ド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍＭ）、ＡＤＰ（１ｍ
Ｍ）、β−ＮＡＤＰ＋（１ｍＭ）を添加したものを作成
し、３０℃・５日間保存した場合のＵＲＬの安定性につ
いて検討した。その結果を図３に示す。この結果から明
らかなように、ニコチンアミド、アデノシン、ＡＤＰは
無添加とほぼ同じ安定性を示したのに対し、β−ＮＡＤ
＋、ＡＤＰ−リボース、β−ＮＡＤＰ＋を添加すること
によりＵＲＬの顕著な不安定化が起こった。β−ＮＡＤ
＋が加水分解されるとＡＤＰ−リボースとニコチンアミ
ドを生じるが、この内ＡＤＰ−リボースにより顕著に不
安定化されたことから、ＡＤＰ−リボースにより酵素の
不安定化が引き起こされると考えられる。
に示す第一試薬において、Ｌ−システイン及びβ−ＮＡ
ＤＰ＋を除いたもの（無添加）、Ｌ−システインを除
き、β−ＮＡＤＰ＋の代わりにβ−ＮＡＤ＋（３ｍ
Ｍ）、ＡＤＰ−リボース（０．３ｍＭ）、ニコチンアミ
ド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍＭ）、ＡＤＰ（１ｍ
Ｍ）、β−ＮＡＤＰ＋（１ｍＭ）を添加したものを作成
し、３０℃・５日間保存した場合のＵＲＬの安定性につ
いて検討した。その結果を図３に示す。この結果から明
らかなように、ニコチンアミド、アデノシン、ＡＤＰは
無添加とほぼ同じ安定性を示したのに対し、β−ＮＡＤ
＋、ＡＤＰ−リボース、β−ＮＡＤＰ＋を添加すること
によりＵＲＬの顕著な不安定化が起こった。β−ＮＡＤ
＋が加水分解されるとＡＤＰ−リボースとニコチンアミ
ドを生じるが、この内ＡＤＰ−リボースにより顕著に不
安定化されたことから、ＡＤＰ−リボースにより酵素の
不安定化が引き起こされると考えられる。
【００３４】更に、実施例１に示す第一試薬において、
β−ＮＡＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３ｍＭ）を
添加し、Ｌ−システインを８ｍＭ、２０ｍＭ添加したも
の（実施例３）及び、Ｌ−システインの代わりにセミカ
ルバジド（実施例４）、ヒドラジン（実施例５）、ヒド
ロキシルアミン（実施例６）をそれぞれ、８ｍＭ、２０
ｍＭ添加したものを３０℃・５日間保存したときのＵＲ
Ｌの安定性を検討した。その結果を図３に示す。
β−ＮＡＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３ｍＭ）を
添加し、Ｌ−システインを８ｍＭ、２０ｍＭ添加したも
の（実施例３）及び、Ｌ−システインの代わりにセミカ
ルバジド（実施例４）、ヒドラジン（実施例５）、ヒド
ロキシルアミン（実施例６）をそれぞれ、８ｍＭ、２０
ｍＭ添加したものを３０℃・５日間保存したときのＵＲ
Ｌの安定性を検討した。その結果を図３に示す。
【００３５】これらの結果から、明らかなように、安定
化剤はいずれの濃度でも６０％以上の残存活性を示し
た。Ｌ−システインとセミカルバジドは２０ｍＭの濃度
で７０％を越える残存活性を示し、ヒドロキシルアミン
は８ｍＭの濃度で約７７％の残存活性を示した。
化剤はいずれの濃度でも６０％以上の残存活性を示し
た。Ｌ−システインとセミカルバジドは２０ｍＭの濃度
で７０％を越える残存活性を示し、ヒドロキシルアミン
は８ｍＭの濃度で約７７％の残存活性を示した。
【００３６】実施例７〜９ ＵＲＬの安定性試験 Ｌ−システイン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例７）、塩
酸セミカルバジド（０．２％、１％）（実施例８）、塩
酸ヒドロキシルアミン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例
９）を用いて実施例２と同様にして第一試薬をそれぞれ
調製した。対照として上述の安定化剤を含まずＮＡＤＰ
の代わりにＡＤＰ−リボース（４０μＭ）を含む以外は
実施例２と同じ組成のもの、及び安定化剤もＡＤＰ−リ
ボースも含まないものを調製した。これらの試薬を用い
て２〜８℃、２５℃又は３７℃の各温度で５日間保存し
た場合のＵＲＬの安定性について検討した。
酸セミカルバジド（０．２％、１％）（実施例８）、塩
酸ヒドロキシルアミン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例
９）を用いて実施例２と同様にして第一試薬をそれぞれ
調製した。対照として上述の安定化剤を含まずＮＡＤＰ
の代わりにＡＤＰ−リボース（４０μＭ）を含む以外は
実施例２と同じ組成のもの、及び安定化剤もＡＤＰ−リ
ボースも含まないものを調製した。これらの試薬を用い
て２〜８℃、２５℃又は３７℃の各温度で５日間保存し
た場合のＵＲＬの安定性について検討した。
【００３７】得られた結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】 ＊残存活性は各々を２−８℃で保存したものを１００％
として算出した。
として算出した。
【００３９】実施例１０〜１３ Ｇ６ＰＤＨの安定性試
験 Ｇ６ＰＤＨの安定性試験を次のようにして行った。実施
例１に示す第一試薬において、Ｌ−システインを２．５
ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの（実施例１０）及びＬ−シ
ステインの代わりにヒドラジン（実施例１１）、ヒドロ
キシルアミン（実施例１２）、セミカルバジド（実施例
１３）を、それぞれ２．５ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの
更に、前記試薬からβ−ＮＡＤＰ＋を除いたものを作成
し、３７℃・４日間保存したときのＧ６ＰＤＨの安定性
を検討した。その結果を表３に示す。
験 Ｇ６ＰＤＨの安定性試験を次のようにして行った。実施
例１に示す第一試薬において、Ｌ−システインを２．５
ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの（実施例１０）及びＬ−シ
ステインの代わりにヒドラジン（実施例１１）、ヒドロ
キシルアミン（実施例１２）、セミカルバジド（実施例
１３）を、それぞれ２．５ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの
更に、前記試薬からβ−ＮＡＤＰ＋を除いたものを作成
し、３７℃・４日間保存したときのＧ６ＰＤＨの安定性
を検討した。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】 Ｇ６ＰＤＨ： グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００４１】表３の結果から明らかなように、安定化剤
及びβ−ＮＡＤＰのいずれも添加しなかったときは残存
活性が９６．４％であったが、β−ＮＡＤＰが２．５ｍ
Ｍ存在すると残存活性は６９．５％に低下した。これに
対して、安定化剤としてＬ−システイン、ヒドラジン、
ヒドロキシルアミン、セミカルバジドが存在すると、β
−ＮＡＤＰ無添加の場合は残存活性は安定化剤添加量が
２．５ｍＭ、１０ｍＭのいずれにおいても無添加の場合
とほぼ同じである。これに対して、２．５ｍＭのβ−Ｎ
ＡＤＰ存在化ではβ−ＮＡＤＰ無添加の場合に比べて安
定化剤の安定化効果は若干の低下がみられるものの、安
定化剤が存在せず２．５ｍＭのβ−ＮＡＤＰが存在する
場合に比べていちじるしい安定化効果がみられた。
及びβ−ＮＡＤＰのいずれも添加しなかったときは残存
活性が９６．４％であったが、β−ＮＡＤＰが２．５ｍ
Ｍ存在すると残存活性は６９．５％に低下した。これに
対して、安定化剤としてＬ−システイン、ヒドラジン、
ヒドロキシルアミン、セミカルバジドが存在すると、β
−ＮＡＤＰ無添加の場合は残存活性は安定化剤添加量が
２．５ｍＭ、１０ｍＭのいずれにおいても無添加の場合
とほぼ同じである。これに対して、２．５ｍＭのβ−Ｎ
ＡＤＰ存在化ではβ−ＮＡＤＰ無添加の場合に比べて安
定化剤の安定化効果は若干の低下がみられるものの、安
定化剤が存在せず２．５ｍＭのβ−ＮＡＤＰが存在する
場合に比べていちじるしい安定化効果がみられた。
【００４２】実施例１４ ＡＤＰ−ＨＫの安定性試験 表１に示す試薬組成でＬ−システインを添加したものと
添加していないものを作成し、ＡＤＰ−ＨＫの安定性を
検討した。各温度で３０日間保存したときの酵素残存活
性（％）を表４に示す。
添加していないものを作成し、ＡＤＰ−ＨＫの安定性を
検討した。各温度で３０日間保存したときの酵素残存活
性（％）を表４に示す。
【表４】 ＡＤＰ−ＨＫ：ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
【００４３】２５℃及び３０℃でＡＤＰ−ＨＫを保存す
ると酵素残存活性はそれぞれ６８、５９％に低下する。
Ｌ−システイン添加により残存活性はそれぞれ９１、８
２％と維持された。
ると酵素残存活性はそれぞれ６８、５９％に低下する。
Ｌ−システイン添加により残存活性はそれぞれ９１、８
２％と維持された。
【００４４】実施例１５ １−チオグリセロールによ
るＬ−システインの酵素安定化作用の増強試験 Ｌ−システインは実施例２及び図２に示すように、保存
時における安定化剤としての作用が保存温度により異な
り、３０℃では１０ｍＭ以下の低濃度で効果が低い。表
５に示すように 尿素窒素測定用の試薬にＬ−システイ
ン０，２，４，６，８，１０ｍＭを安定化剤として単独
添加し、３７℃で１１日間保存した場合、酵素（ＵＲ
Ｌ）の残存活性は、それぞれ２，１２，１５，１９，２
８，４２％であった。１−チオグリセロールは本酵素系
では単独では酵素安定化作用をほとんど示さないが、Ｌ
−システインとともにその補助剤として試薬に加える
と、Ｌ−システインの酵素安定化作用を著しく増強し
た。２ｍＭ Ｌ−システイン存在下の酵素残存活性が１
−チオグリセロール１０ｍＭ添加により６４％に、２５
ｍＭ添加により８７％に増加した。さらに、Ｌ−システ
イン１０ｍＭ存在下では１０ｍＭ以上の１−チオグリセ
ロール添加により酵素残存活性はほぼ１００％となっ
た。従って、Ｌ−システインを前記酵素の安定化剤とし
て使用する場合、１−チオグリセロールをその安定化補
助物質として用いることで著しい効果が得られる。
るＬ−システインの酵素安定化作用の増強試験 Ｌ−システインは実施例２及び図２に示すように、保存
時における安定化剤としての作用が保存温度により異な
り、３０℃では１０ｍＭ以下の低濃度で効果が低い。表
５に示すように 尿素窒素測定用の試薬にＬ−システイ
ン０，２，４，６，８，１０ｍＭを安定化剤として単独
添加し、３７℃で１１日間保存した場合、酵素（ＵＲ
Ｌ）の残存活性は、それぞれ２，１２，１５，１９，２
８，４２％であった。１−チオグリセロールは本酵素系
では単独では酵素安定化作用をほとんど示さないが、Ｌ
−システインとともにその補助剤として試薬に加える
と、Ｌ−システインの酵素安定化作用を著しく増強し
た。２ｍＭ Ｌ−システイン存在下の酵素残存活性が１
−チオグリセロール１０ｍＭ添加により６４％に、２５
ｍＭ添加により８７％に増加した。さらに、Ｌ−システ
イン１０ｍＭ存在下では１０ｍＭ以上の１−チオグリセ
ロール添加により酵素残存活性はほぼ１００％となっ
た。従って、Ｌ−システインを前記酵素の安定化剤とし
て使用する場合、１−チオグリセロールをその安定化補
助物質として用いることで著しい効果が得られる。
【表５】
【００４５】実施例１６〜２０ Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、
ＨＫ、ＭＤＨ、ＬＤＨの安定性試験（１） ０．１％ＢＳＡ、３．３ｍＭ β−ＮＡＤ及び安定化剤
として１０ｍＭ Ｌ−システイン塩酸塩及び３３ｍＭ
１−チオグリセロール、１０ｍＭ塩酸ヒドラジン、１０
ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミンをそれぞれ含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０を負荷液とした。それそれ
の負荷液に１．０Ｕ／ｍＬになるようにＧ１ｕＤＨ（実
施例１６）、ＰＫ（実施例１７）、ＨＫ（ヘキソキナー
ゼ）（実施例１８）、ＭＤＨ（実施例１９）、ＬＤＨ
（実施例２０）をそれぞれ溶解し、ＨＫ、ＭＤＨは３０
℃で７日間負荷を行い、一方Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＬＤＨ
は３７℃で７日間の負荷を行い、それぞれ安定性を検討
した。また、対照として安定化物質及び不安定化物質を
含まないものも検討した。負荷前の活性を１００％とし
た時の酵素の残存率を表６に示す。
ＨＫ、ＭＤＨ、ＬＤＨの安定性試験（１） ０．１％ＢＳＡ、３．３ｍＭ β−ＮＡＤ及び安定化剤
として１０ｍＭ Ｌ−システイン塩酸塩及び３３ｍＭ
１−チオグリセロール、１０ｍＭ塩酸ヒドラジン、１０
ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミンをそれぞれ含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０を負荷液とした。それそれ
の負荷液に１．０Ｕ／ｍＬになるようにＧ１ｕＤＨ（実
施例１６）、ＰＫ（実施例１７）、ＨＫ（ヘキソキナー
ゼ）（実施例１８）、ＭＤＨ（実施例１９）、ＬＤＨ
（実施例２０）をそれぞれ溶解し、ＨＫ、ＭＤＨは３０
℃で７日間負荷を行い、一方Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＬＤＨ
は３７℃で７日間の負荷を行い、それぞれ安定性を検討
した。また、対照として安定化物質及び不安定化物質を
含まないものも検討した。負荷前の活性を１００％とし
た時の酵素の残存率を表６に示す。
【表６】 実施例２１〜２５ Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＨＫ、ＭＤ
Ｈ、ＬＤＨの安定性試験（２） 実施例２１〜２５としてそれぞれ実施例１６〜２０の
３．３ｍＭ β−ＮＡＤの代わりに０．３３ｍＭ ＡＤ
Ｐ−リボースを用いて、実施例１６〜２０と同様に安定
性の検討を行った。その結果を酵素の残存率として表７
に示す。残存率を表７に示す。
Ｈ、ＬＤＨの安定性試験（２） 実施例２１〜２５としてそれぞれ実施例１６〜２０の
３．３ｍＭ β−ＮＡＤの代わりに０．３３ｍＭ ＡＤ
Ｐ−リボースを用いて、実施例１６〜２０と同様に安定
性の検討を行った。その結果を酵素の残存率として表７
に示す。残存率を表７に示す。
【表７】
【００４６】
【発明の効果】本発明に従い、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋
を補酵素とする酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素
と、安定化剤としてＬ−システイン、Ｌ−システイン類
縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から
選ばれる少なくとも１種の化合物とを共存させること
で、系外にβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生成物とシステイン
等の化合物との複合体を取り出すことなく、簡単に酵素
の修飾を防止でき、酵素の不安定化を回避することがで
きるので、試薬測定の自動化が可能である。また、本発
明を尿素窒素の測定試薬キットに適用する場合は、試薬
に用いるβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋を精製することなく、その
まま使用できるので試薬製造のプロセスを減らすことが
でき、コスト的にも有利である。
を補酵素とする酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素
と、安定化剤としてＬ−システイン、Ｌ−システイン類
縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から
選ばれる少なくとも１種の化合物とを共存させること
で、系外にβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生成物とシステイン
等の化合物との複合体を取り出すことなく、簡単に酵素
の修飾を防止でき、酵素の不安定化を回避することがで
きるので、試薬測定の自動化が可能である。また、本発
明を尿素窒素の測定試薬キットに適用する場合は、試薬
に用いるβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋を精製することなく、その
まま使用できるので試薬製造のプロセスを減らすことが
でき、コスト的にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に従う尿素窒素測定方法に
用いる複合酵素系の反応（測定原理）を説明する反応行
程図である。
用いる複合酵素系の反応（測定原理）を説明する反応行
程図である。
【図２】異なる温度におけるＬ−システインとウレアア
ミドリアーゼ残存活性（％）との関係を示すグラフであ
る。
ミドリアーゼ残存活性（％）との関係を示すグラフであ
る。
【図３】ウレアアミドリアーゼに対する安定化剤の効果
を示すグラフである。
を示すグラフである。
ＵＲＬ ウレアアミドリアーゼ ＡＤＰ−ＨＫ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ Ｇ６ＰＤＨ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
Claims (8)
- 【請求項１】 ＡＤＰ−リボースにより不安定化される
酵素と、該酵素の安定化に有効な量のＬ−システイン、
Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁
体からなる群から選ばれる少なくとも１種のＡＤＰ−リ
ボースによる修飾によって起こる酵素の不安定化を阻止
する化合物とを共存させることを特徴とする酵素の安定
化方法。 - 【請求項２】 前記酵素がウレアアミドリアーゼ、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキ
ナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱
水素酵素からなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素
であることを特徴とする請求項１記載の酵素の安定化方
法。 - 【請求項３】 ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産
物として産生される生体内成分の測定反応系において、
ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる測定反応系
に関与する酵素の不安定化を阻止する手段を導入するこ
とを特徴とする生体内成分の測定試薬。 - 【請求項４】 前記測定反応系に関与する酵素が、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、ウレアアミドリアーゼ
及びＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼからなる群から選ばれ
る少なくとも一種の酵素を用いる尿素窒素測定系である
請求項３記載の測定試薬。 - 【請求項５】 前記測定反応系が、ＮＡＤ＋又はＮＡＤ
Ｐ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系である請求項
３又は４記載の測定試薬 - 【請求項６】 前記不安定化を阻止する手段が、安定化
に有効な量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、
ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれ
る少なくとも１種のＡＤＰ−リボースによる修飾によっ
て起こる酵素の不安定化を阻止する化合物を使用するこ
とである請求項３又は４又は５記載の測定試薬。 - 【請求項７】 前記ＡＤＰ−リボースによる修飾によっ
て起こる酵素の不安定化を阻止する化合物がＬ−システ
インであり、Ｌ−システインの安定化補助物質として酸
化防止剤を用いる請求項３又は４又は５又は６記載の測
定試薬。 - 【請求項８】 前記ＡＤＰ−リボースによる修飾によっ
て起こる酵素の不安定化を阻止する化合物がＬ−システ
インであり、Ｌ−システインの安定化補助物質として酸
化防止剤を用いる請求項１又は２記載の酵素の安定化方
法。
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|---|---|---|---|---|
| JP2011024513A (ja) * | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Nitto Boseki Co Ltd | ドライケミストリーによるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法およびそれに用いる検査器具 |
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-
1999
- 1999-11-05 JP JP31490799A patent/JP4413340B2/ja not_active Expired - Fee Related
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