JP2011103826A - Ａｄｐまたは酵素反応でａｄｐを発生する特定物質のドライケミストリーによる測定方法およびそれに用いる検査器具 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、ドライケミストリーにより試料中のＡＤＰを正確に測定する方法およびそれに使用する検査器具を提供することにある
【解決手段】試料中のＡＤＰにＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を用いて酵素反応をさせる際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させて、ドライケミストリーにより測定することにより、ブランク値が減少し、かつ、検量線の傾きが小さくなり、かつ、結果的にＡＤＰの測定可能な濃度を広くし、正確に測定できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、試料中のＡＤＰまたは酵素反応でＡＤＰを発生する特定物質をドライケミストリーによる測定する方法およびそれに用いる検査器具に関する。

ＡＤＰの測定方法は、試料中にあらかじめ存在するＡＤＰを測定する方法、酵素反応によりＡＤＰを生成する特定物質を測定する方法等に用いるため、種々の方法が開発されてきている（例えば、特許文献１，特許文献２）。
例えば、試料中のＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸を補酵素としてＮＡＤＨ存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてＮＡＤを生成させ、波長３４０ｎｍの吸光度をもつＮＡＤＨの減少量からＡＤＰを測定する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながらこの方法は、検体中のＡＤＰが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法なので、測定できるＡＤＰの上限値が試薬中のＮＡＤＨにより制限されたりする場合がある。
さらに、試料中のＡＤＰに、マグネシウムイオン存在下でグルコースとＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、次いで、生成するグルコース−６−リン酸をＮＡＤ（Ｐ）存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量から、ＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献２）。この方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量に基づいてＡＤＰを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定することから測定値の信頼性が高く、試料中の還元物質などの影響を受けないという利点を有し、従って、生体試料中のＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができるとされている（特許文献２）。

しかし、これらの測定方法は、ＡＤＰを含む液状流体試料に液状の試薬を加えて、その混合物を紫外分光光度計で測定するものであり、そのため、高価な大型自動分析装置を使う必要がある。そのため、小さい病院でもＡＤＰやＡＤＰを発生する特定物質を測定できるようにするため、ドライケミストリーで生体試料中のＡＤＰや特定物質を測定する方法が望まれている。
他方、特許文献３には、第１の平面および第２の平面から構成される反応室であって、それらの平面には試薬が付着された反応室に、液状流体の試料を導入して、液状流体の試料中の測定対象物質と、該試料中に溶解した試薬とを反応させて測定対象物質を、所謂、ドライケミストリーの技術により測定する方法が提案されている。

特開平９−２８５２９７号公報 特開平９−２３４０９８号公報 特開２００７−２４８１０１号公報

Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８５，７（４−５），３０３−３１０

本発明の課題は、高濃度で試料中に存在するＡＤＰまたは酵素反応によりＡＤＰを発生する特定物質をドライケミストリーの技術により正確に測定する方法およびそれに用いる検査器具を提供することにある。更には、可視部での吸光度に基づく測定が可能で、ドライケミストリーの分野や小さい病院でも測定できる可視分光光度計を用いた装置に適用でき、かつ、高濃度で試料中に存在するＡＤＰまたは酵素反応によりＡＤＰを発生する特定物質を正確に測定する方法およびそれに用いる測定器具を提供することにある。

本発明者らは、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させ、次いで、生成するＡＤＰに、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を行い、ＡＤＰを正確に測定できるとされているＡＤＰの測定方法を、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いてドライケミストリーにより高濃度の尿素等の特定物質の測定に用いることを検討した。しかし、この方法では、試料中の特定物質が高濃度になったり、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いて測定したりすると、検量線の傾きが極めて大きくなり、特定物質を測定できる濃度範囲が極端に狭くなる問題があり、実用性に問題が発生する場合があることを発見した。さらに、その問題を解決するため種々検討した結果、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を用いて酵素反応をさせる際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させて、ドライケミストリーにより測定すると、意外にもブランク値が減少し、かつ、検量線の傾きが小さくなり、かつ、結果的にＡＤＰや特定物質の測定可能な濃度を広くし、正確に測定できることを見出した。本発明は、かかる経過によりなされたものである。

従って、本発明は、液状流体試料中のＡＤＰ、または酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定する方法であって、該液状流体試料と試薬とを反応させる検査器具を用いた測定方法であり、
用いる検査器具が、少なくとも反応室とその反応室を構成するための隣接する面を有し、その面の少なくとも一部に試薬が付着されており、かつ、試薬が、液状流体試料中のＡＤＰを測定するための酵素反応を行うための試薬、あるいは、酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定するための試薬であり、ＡＤＰを測定する際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させ、かつ、液状流体試料を反応室に供給し、試薬が付着された面と接触させることにより、付着された試薬を液状流体試料中に溶解させて液状流体試料と混合し、ＡＤＰまたは特定物質と試薬とによる酵素反応を液状で行い、その液状流体試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定する、測定方法に関するものである。
更に、本発明は、液状流体試料中のＡＤＰ、または酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定するための検査器具であって、
少なくとも反応室とその反応室を構成するための隣接する面を有し、その面の少なくとも一部に試薬が付着されており、かつ、試薬が、液状流体試料中のＡＤＰを測定するための酵素反応を行うための試薬、あるいは、酵素反応によりＡＤＰを発生する試料中の特定物質を測定するための試薬であり、ＡＤＰを測定する際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させ、かつ、液状流体試料を反応室に供給し、試薬が付着された面と接触させることにより、付着された試薬を液状流体試料中に溶解させて液状流体試料と混合し、ＡＤＰまたは特定物質および試薬による酵素反応を液状で行い、その液状流体試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定するための、検査器具に関するものである。

本発明においては、試料中のＡＤＰまたは酵素反応によりＡＤＰを生成する特定物質をドライケミストリーにより測定する際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰや特定物質の濃度を正確に測定できる。

本発明で用いる検査器具の一例を示す縦断面図である。 図１の検査器具の分解斜視図である。 本発明で用いる検査器具における測定室および流路の関係を示す図である。 比較例１、実施例１、実施例２で各種濃度の尿素窒素（ＢＵＮ）を測定したときの吸光度の値を示すグラフである。

本発明の測定方法は、ドライケミストリーの技術によるものである。なお、本明細書においては、ドライケミストリーとは、特定の化学反応または酵素反応を起こす試薬が乾燥状態で検査器具において用意されていて、そこに液体状の試料が添加されると、試料中の水分を溶媒として試薬が溶解されて、液体状の試料と溶解された試薬が検査器具の反応室中で反応が進行するものをいうものとする。
そのための検査器具としては、例えば、少なくとも反応室と、ＡＤＰや特定物質を測定するための試薬が付着・乾燥された面（例えば支持体で構成される面またはフィルム面）とを有していればよく、その他として、例えば、試料供給部と、前記供給部に供給された試料を前記反応室までの移送するための流路を備えていることが好ましい。試薬は、反応室を構成する面に付着されているのが好ましい。このような装置を用いて、液状流体試料を検査器具に導入することにより、付着された試薬を液体としての試料により溶解させて試料と混合し、ＡＤＰまたは特定物質を測定するための酵素反応を反応室中で液状にて行い、その試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定できる。このようなドライケミストリーによる測定の場合、付着された試薬を試料で溶解させるため、液状試薬で試料を測定する場合に比べ、試料は、試薬に対し多量に使うため、ブランクの上昇を起こしやすくその結果測定範囲が著しく狭くなる。そのため、ドライケミストリーによる測定の場合、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させる本発明の測定方法により、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰや特定物質の濃度を正確に測定できるため、本発明の測定方法が特に好適である。

このようなＡＤＰまたは特定物質を測定する方法においては、用いる検査器具が、少なくとも反応室とその反応室を構成するための隣接する面を有し、その面の少なくとも一部に試薬が付着されており、かつ、試薬が、液状流体試料中のＡＤＰを測定するための酵素反応を行うための試薬、あるいは、酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定するための試薬であり、ＡＤＰを測定する際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させ、かつ、液状流体試料を反応室に供給し、試薬が付着された面と接触させることにより、付着された試薬を液状流体試料中に溶解させて液状流体試料と混合し、ＡＤＰまたは特定物質と試薬とによる酵素反応を液状で行い、その液状流体試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定できる。

本発明に用いる検査器具は、例えば、液状流体試料を供給するための供給部、検査器具内に設けられ、液状流体試料を試薬と反応させる反応室、供給部に供給された液状流体試料を反応室までの移送するための流路を備え、流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されており、反応室は、第１の平面およびこれに対向する第２の平面、第１の平面および第２の平面それぞれに接し、第１の平面と第２の平面との間に空間を形成する第３の面で形成されており、流路と反応室とは、第３の面に連結孔が形成されることにより、連結されており、平面の少なくとも一つの面に試薬が付着させられており、供給部に供給された液状流体試料を供給部に設けられた加圧部によって加圧して、反応室内に移送する、検査器具であることが好ましい。
試薬の付着は、第１の平面および第２の平面のいずれか一方に全ての試薬が付着されていてもよく、また、試薬の一部がいずれかの面に、その他の試薬が他の面に付着されていてもよい。

本発明に用いられる試料としては、ＡＤＰまたは特定物質を含む可能性のあるサンプル、好ましくは液体であれば特に限定しないが、全血、血清、血漿、尿等の生体試料、または、それらのモデルサンプルが好ましい。
本発明において、特定物質とは、酵素反応によりＡＤＰを中間的にまたは最終的に発生させうる物質をいう。
本発明において、ＡＤＰとは、アデノシン二リン酸（Adenosine diphosphate）をいう。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）類とは、例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのいずれかを意味するが、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）反応に用いる補酵素として働くそれらに類似した構造、例えば、リング骨格が同じで補酵素として機能を有することが知られている化合物でもよい。
本明細書において、ＮＡＤとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、ＮＡＤＰとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味し、チオＮＡＤとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオＮＡＤＰとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とは、ＮＡＤ（Ｐ）類の対応する還元型であり、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）類がＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）とは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを意味し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、ＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、ＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ、ＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを意味する。
本明細書において、チオＮＡＤ（Ｐ）とは、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰを意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、チオＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）がチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。

本発明のＡＤＰの測定方法においては、例えば、下記反応式（本明細書ではこの反応をＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応と記載することもある）のように、ＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）およびＡＭＰ(Adenosine monophosphate）を生成させ、その生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定してＡＤＰを測定する方法が好ましい。

金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオンなどが好ましい。

本発明において、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定する場合、下記反応式のように、グルコース−６−リン酸に、Ｇ６ＰＤＨとＮＡＤ（Ｐ）類を作用させグルコノラクトン−６−リン酸（６−ＧＬ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を発生させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することにより行うことが好ましい。

本発明において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する３４０ｎｍ付近、例えば、波長３３０〜３５０ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。
本発明において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する４０５ｎｍ付近、例えば、波長３９０〜４１５ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。本発明においてこのチオＮＡＤ（Ｐ）を用いることは、安価で入手しやすい可視分光光度計を用いて測定できる点、ＡＤＰの測定領域を著しく改善できる点で好適である。
また、ＡＤＰの測定領域をさらに広くするため、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を共存させてＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を行い、ＮＡＤ（Ｐ）ＨとチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを発生させ、生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することによりＡＤＰを測定することが好ましい。
この場合、用いるＮＡＤ（Ｐ）の量は特に限定しないが、検量線の傾きを適度に調整するため、用いるチオＮＡＤ（Ｐ）の量の０．３〜３０倍モル数が好ましく、０．５〜２０倍モル数がさらに好ましい。

本発明において、生成するＡＭＰを測定するときには、例えば、そのＡＭＰにミオアデニル酸デアミナーゼを作用させ、生成するアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類およびα−ケトグルタール酸の存在下、グルタミン酸脱水素酵素を作用させて、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を、例えば、適当な波長、すなわち、上述したＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定するために適当な波長の吸光度の減少により測定することにより、ＡＭＰを測定することができる。

本発明においてＡＤＰを測定する場合、例えば、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる際、同時に、下記反応式のように、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を共存させてその試料中のＡＤＰと反応させる。

この場合、用いるピルビン酸キナーゼの量は、用いるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの１／２０〜２０倍ＫＵが好ましい。また、ホスホエノールピルビン酸の量は、例えば、測定対象の想定されるＡＤＰの１／２０〜２０倍モル数が好ましく、１／１０〜１０倍モル数が更に好ましく、１／５〜５倍モル数が特に好ましい。

本発明のＡＤＰの測定方法は、例えば、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオン、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰを測定するための試薬を、検査器具の反応室を構成するための隣接する面に付着させ、液状流体試料により、該試薬を溶解させて、反応室中で、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で反応させることにより実施できる。
ＡＤＰを測定するための試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。ＡＤＰを測定するための試薬は、その一部を、検査器具の反応室を構成する第１の平面に付着させ、その他の試薬を、第１の平面に対向する第２の平面に付着させてもよい。

さらに、本発明のＡＤＰの測定方法は、試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させ、そのＡＤＰを上記の測定方法に付し、そのＡＤＰの量を測定して、試料中の特定物質を測定する、特定物質の測定方法に応用できる。

本発明において、特定物質とは、酵素反応によりＡＤＰを発生させうる物質であれば特に限定しないが、尿素、クレアチン、コリン等を例示することができる。
特定物質として尿素を測定するときには、酵素反応として、試料中の尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンおよびウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、尿素を測定することができる。尿素を測定する場合に用いるウレアアミドリアーゼ反応の反応式を下記に示す。

特定物質としてクレアチンを測定するときには、酵素反応として、試料中のクレアチンにＡＴＰ、マグネシウムイオンとクレアチンキナーゼを作用させてＡＤＰを発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、クレアチンを測定することができる。そのクレアチンキナーゼ反応の反応式を下記に示す。

特定物質としてコリンを測定するときには、酵素反応として、試料中のコリンにＡＴＰ、マグネシウムイオン、コリンキナーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、コリンを測定することができる。

このように、本発明の特定物質の測定方法の場合、試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させるには、一般的に、ＡＴＰをＡＤＰに変換するための酵素、その酵素の基質及びＡＴＰを含む試薬を用いることが一般的である。この場合、ホスホエノールピルビン酸の量は、例えば、ＡＴＰの１／２０〜２０倍モル数が好ましく、１／１０〜１０倍モル数が更に好ましく、１／５〜５倍モル数が特に好ましい。また、本発明の特定物質の測定方法の場合、用いるピルビン酸キナーゼの量は、用いるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの１／２０〜２０倍ＫＵが好ましい。
本発明で特定物質を測定する場合、特定物質を酵素反応によりＡＤＰを発生するための成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオン、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質を測定するための試薬を検査器具の反応室を構成する隣接する面に付着させ、液状流体試料により、該試薬を溶解させて、反応室中で、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で反応させることにより実施できる。
特定物質を測定するための試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。特定物質を測定するための試薬は、その一部を、検査器具の反応室を構成する第１の平面に付着させ、その他の試薬を、第１の平面に対向する第２の平面に付着させてもよい。
特定物質を測定するための試薬は、一つの試薬にまとめて、検査器具の反応室を構成する隣接する面に付着させてもよいが、試薬の安定性等を考慮したうえで二試薬に分けて、第１の平面および第２の平面にそれぞれ付着させることが好ましい。

特定物質として尿素を測定する場合、例えば、第一試薬にグルコース、カリウムイオン、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸を含ませ、第２試薬にマグネシウムイオン、ＮＡＤ（Ｐ）類、ＡＴＰ依存性ヘキソキナーゼ、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼを含ませることができる。試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。
このような第一試薬と第二試薬とを用い、測定対象として、特定物質を測定するときは、例えば、次のように行うことができる。特定物質を含む液状流体試料を、前記検査器具における、試料を供給するための供給部に導入し、液状流体試料を、移送するための前記流路を通して前記反応室へ導き、液状流体試料中に、反応室を構成する第１の平面およびこれに対向する第２の平面のいずれかにそれぞれ付着した第一試薬と第二試薬とを溶解させて、０．５〜１５分酵素反応を行い、酵素反応後に、反応室に光を照射して、得られる反応液の透過光または反射光由来の吸光度を４０５ｎｍで測定する。あらかじめ作成した検量線との測定値との比較により、試料中の特定物質の濃度を測定できる。

以下に、図面に基づいて、本発明の測定方法およびそれに用いる検査器具について、更に詳細に説明する。
本発明にかかる検査器具の好ましい一実施形態として検査器具１００を図面に基づいて説明する。図１に検査器具１００の縦断面図を、図２に血液検査器具１００の分解斜視図を示す。検査器具１００は、図２に示すように、上下方向に積層された４つの第１〜第４プレート１〜４を備えている。最上層側の第１プレート１には、円形の検体供給口１１が形成されている。検体供給口１１の上部周囲には堰１２が設けられている。この堰１２には、有底円筒形状の栓体５が着脱可能に設けられている。

第１プレート１の下方に配置する第２プレート２には、供給口１１との対向部位に円形状の凹入部２０が設けられている。凹入部２０の内部には円形状の複数のリブ２１が同芯状および放射状に形成されている（図１参照）。リブ２１は、血球を分離除去する非対称孔径膜からなる血球分離膜６を支持する。

第２プレートには、リブ２１の中心部に上下方向に延びる貫通孔８１が形成されている（図１参照）。第３プレート３は、所定距離離れた位置に２つの円形の貫通部７１、８２を有している。貫通部７１、８２間は、直線状の貫通溝８３で連結されている（図１参照）。貫通部８２は、第２プレート２と重ね合わせた状態で、貫通孔８１とほぼ同心の位置に設けられる。貫通孔８１、貫通部８２及び溝８３により後述するように、液状流体試料Ａを反応室７へ導く流路８（液状流体Ａの移送用流路）が形成される。

また、第２プレート２のうち，第３プレート３と接する面には、貫通部７１に対向する位置には、貫通孔が形成された両面テープ２ｂが貼り付けられている。これにより、第２プレート側には有底状の有底部７２が形成される。また、第４プレート４のうち、第３プレート３と接する面には、貫通部７１に対向する位置には、貫通孔が形成された両面テープ４ｂが貼り付けられている。これにより、第４プレート側には有底状の有底部７３が形成される。この有底部７２，７３，および貫通部７１によって、液状流体試料Ａの反応室７が構成される。

測定室７について、図３を用いて説明する。反応室７の第１底面１７１および、第１底面１７１に対向する第２底面１７２には異なる試薬、すなわち、前記した第一試薬および第二試薬がそれぞれ所定量塗布されている。これにより、有底部７２，７３は所定量の試薬で満たされる。試薬は塗布後に乾燥させればよい。

第１プレート１と第２プレート２は、接着剤ａを介して、第２プレート２〜第４プレート４は、両面テープ２ｂ、４ｂにて、積層状態にて一体化される。また、血球分離膜６は、接着剤ａにより、前記第１プレート１および第２プレート２と固定される。

実際の測定方法について簡単に説明する。図１に示すように、検体供給口１１から液状流体試料Ａを供給する。そして、栓体５を液状流体試料供給口１１に被せ、指で加圧する（図示せず）。これにより、反応室７や流路８内の空気が、第３プレートから外部に排出されて、液状流体試料Ａが反応室７内に送り込まれる。反応室７の第１底面１７１および第２底面１７２には、それぞれ異なる試薬が塗布されており、反応室７の側面１７３の孔１７５から反応室７の空間に、液状流体試料Ａが搬送されると、液状流体試料Ａと２種類の試薬との反応が開始する。一つの空間内で２種類の試薬とまとめて混合されるので、均一に混合される。

測定室７での液状流体試料Ａの測定は、透過光を用いた光学測定が採用できる。透過光を用いる光学測定は、前記第２〜第４プレート２〜４の全体を光透過性のある樹脂で形成し、前記反応室７で試薬と液状流体試料Ａにより反応を行わせて、第４プレート４の下方から第２プレート２に向かってたとえば、波長４０５ｎｍの透過光Ｂを照射し、前記反応室７での透過光Ｂの吸収により測定すればよい。

以下、本発明を実施例および比較例を用いて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１、２、３および比較例１
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびピルビン酸キナーゼを用いた尿素窒素の測定方法

１．方法
ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた尿素窒素測定系において、ＡＤＰに作用する酵素としてピルビン酸キナーゼを組成中に含んだ測定系を実施例として示す。
ウレアアミドリアーゼを用いた測定法において、試料中の尿素はウレアアミドリアーゼによりＡＴＰ、重炭酸、カリウムの存在下により分解反応し、ＡＤＰとアンモニアを生じる。続いて、発生したＡＤＰはグルコースの存在下で、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの作用により、グルコース−６−リン酸とＡＭＰを生じる。発生したグルコース−６−リン酸はチオＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とし、グルコース−６−リン酸脱水素酵素の作用により６−ホスホグルコノラクトンとチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じる。生じたチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加量を波長４０５ｎｍで測定し、試料中の尿素を尿素窒素濃度として測定する。
上記反応において、発生した試料由来のＡＤＰに対してＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを反応させると同時に、ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼの存在下でピルビン酸キナーゼと競合反応させることにより、過剰なＡＤＰをＡＴＰに変換し、適量なＡＤＰ濃度を測定する。
比較例１として、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を含まない組成を対照とした。また、補酵素としてチオＮＡＤ単独を用いた場合、測定可能な範囲が狭かったが、補酵素としてＮＡＤ、チオＮＡＤの両方を用いたところ測定可能な範囲が広くなったので比較例および実施例では、補酵素としてその両方を加えた試薬を用いた。
検量線作製のための液状流体試料としては、尿素窒素とし２５０ ｍｇ／ｄＬ となる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。

用いた試薬、および試料は以下の通りである。
第一試薬（ｐＨ ９．０）：
２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ(トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）
６０ ｍＭ Ｄ−グルコース
６０ ｍＭ 炭酸水素カリウム
５０ ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ（アデノシン三リン酸・二ナトリウム）
５０ ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
１．０ ％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ ７．０）：
２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ
４０ ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
４０ ｍＭ ＮＡＤ
４０ ｍＭ チオＮＡＤ
１．０ ％ 界面活性剤
６００ ＫＵ／Ｌ ＨＫ（ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ）
３０ ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
３０ ＫＵ／Ｌ グルコース−６―リン酸脱水素酵素
０、６０、
６００または
６０００ＫＵ／Ｌ ＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）（比較例１、実施例１、実施例２お
よび実施例３では、それぞれ０、６０、６００、６０００ＫＵ／
Ｌの量で用いた）

表１に、比較例１、実施例１、実施例２および実施例３で用いたＨＫとＰＫの混合比およびＰＫの量を示した。

測定方法：
検査器具は、図１から３に示したように、液状流体試料を供給するための供給部、検査器具内に設けられ、液状流体試料を試薬と反応させる反応室、供給部に供給された液状流体試料を反応室までの移送するための流路を持つものを用いた。
上記の通り調製した試薬は、反応室の面を構成する上下のＰＥＴシート（透明面を有する）に、第一試薬は０．３７５μＬ、第二試薬は０．５μＬとなるように各々塗布し乾燥した。乾燥後、第一試薬、および第二試薬が塗布されたシートは、液状流体試料流路を含むシートを、はさみ貼り合わせた。液状流体試料は反応セル体積２．５容中に１容となるように導入し、試薬を溶解させた。具体的には、液状流体試料を供給部から導入後、通路を経由して、反応室に送り込み、その液状流体試料で試薬を溶解させ、その混合液を７分間、３７℃で発色反応させた。試薬が塗布された透明部分に対して波長４０５ｎｍで測光し、発色反応後の吸光度を求めた。

２．結果
得られた結果を図４に示す。図４に示されるように、ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼを使用しない比較例１に比べて、これらを使用した実施例１から３では、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲の尿素窒素の濃度を正確に測定できる。また、ＡＴＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＨＫ）に対するピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の混合比が多くなるほど、ブランクの上昇が抑制され傾き直線性範囲が広くなる傾向があることが判明した。

以上に詳細に説明したところから明らかなように、本発明においては、試料中のＡＤＰまたは酵素反応によりＡＤＰを生成する特定物質をドライケミストリーにより測定する際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰや特定物質の濃度を正確に測定できる。

１ 第１プレート
２ 第２プレート
３ 第３プレート
４ 第４プレート
７ 反応室
８ 流路
Ａ 液状流体試料

Claims (12)

1. 液状流体試料中のＡＤＰ、または酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定する方法であって、該液状流体試料と試薬とを反応させる検査器具を用いた測定方法であり、
   用いる検査器具が、少なくとも反応室とその反応室を構成するための隣接する面を有し、その面の少なくとも一部に試薬が付着されており、かつ、試薬が、液状流体試料中のＡＤＰを測定するための酵素反応を行うための試薬、あるいは、酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定するための試薬であり、ＡＤＰを測定する際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させ、かつ、液状流体試料を反応室に供給し、試薬が付着された面と接触させることにより、付着された試薬を液状流体試料中に溶解させて液状流体試料と混合し、ＡＤＰまたは特定物質と試薬とによる酵素反応を液状で行い、その液状流体試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定する、測定方法。
2. ＡＤＰを測定するための酵素反応が、そのＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法である、請求項１に記載のＡＤＰの測定方法。
3. 生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することを、生成するグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させ生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することにより行う、請求項２に記載のＡＤＰの測定方法。
4. ＮＡＤ（Ｐ）類がチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰであり、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類がチオＮＡＤＨまたはチオＮＡＤＰＨである、請求項３に記載の測定方法。
5. 補酵素としてチオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰとともにＮＡＤまたはＮＡＤＰを共存させる、請求項４に記載の測定方法。
6. 液状流体試料中の特定物質が尿素であり、尿素からＡＤＰを発生する酵素反応が、尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンおよびウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを発生させる、請求項1から５のいずれかに記載の測定方法。
7. 用いる検査器具が、
   液状流体試料を供給するための供給部；検査器具内に設けられ、液状流体試料を試薬と反応させる反応室；および供給部に供給された液状流体試料を反応室までの移送するための流路を備え、
   流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されており、
   反応室は、第１の平面およびこれに対向する第２の平面、第１の平面および第２の平面それぞれに接し、第１の平面と第２の平面との間に空間を形成する第３の面で形成されており、
   流路と反応室とは、第３の面に連結孔が形成されることにより、連結されており、
   平面の少なくとも一つの面に試薬が付着されており、
   供給部に供給された液状流体試料を供給部に設けられた加圧部によって加圧して、反応室内に移送する、
   検査器具である、請求項１から６のいずれかに記載の測定方法。
8. 第１の平面および第２の平面に、異なる試薬が付着されている、請求項７に記載の測定方法。
9. 反応後の反応室に光を照射して透過光または反射光由来の吸光度に基づいて、液状流体試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定する、請求項１から８のいずれかに記載の測定方法。
10. 液状流体試料中のＡＤＰ、または酵素反応によりＡＤＰを発生する液状流体試料中の特定物質を測定するための検査器具であって、
    少なくとも反応室とその反応室を構成するための隣接する面を有し、その面の少なくとも一部に試薬が付着されており、かつ、試薬が、液状流体試料中のＡＤＰを測定するための酵素反応を行うための試薬、あるいは、酵素反応によりＡＤＰを発生する試料中の特定物質を測定するための試薬であり、ＡＤＰを測定する際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させ、かつ、液状流体試料を反応室に供給し、試薬が付着された面と接触させることにより、付着された試薬を液状流体試料中に溶解させて液状流体試料と混合し、ＡＤＰまたは特定物質および試薬による酵素反応を液状で行い、その液状流体試料中のＡＤＰまたは特定物質を測定するための、検査器具。
11. 液状流体試料を供給するための供給部；検査器具内に設けられ、液状流体試料を試薬と反応させる反応室；および供給部に供給された液状流体試料を反応室まで移送するための流路を備え、
    流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されており、
    反応室は、第１の平面およびこれに対向する第２の平面、第１の平面および第２の平面それぞれに接し、第１の平面と第２の平面との間に空間を形成する第３の面で形成されており、
    流路と反応室とは、第３の面に連結孔が形成されることにより、連結されており、
    平面の少なくとも一つの面に試薬が付着されており、
    供給部に供給された液状流体試料を供給部に設けられた加圧部によって加圧して、反応室内に移送する、検査器具である、請求項１０に記載の検査器具。
12. 第１の平面および第２の平面のいずれか一方に全ての試薬が付着されているか、あるいは、試薬の一部がいずれかの面に、その他の試薬が他の面に付着されている、請求項１０または１１に記載の検査器具。