JP2001258595A - Ｇｐｔ測定用試薬 - Google Patents
Ｇｐｔ測定用試薬Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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- Genetics & Genomics (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 長期間に亘って安定なグルタミン酸ピルビン
酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）測定用試薬を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−ア
ラニンとα−ケトグルタル酸にＧＰＴを作用させて生成
するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）の作用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ
減少量に基づいてＧＰＴを測定する２試薬系のＧＰＴ測
定用キットであって、第一試薬と第二試薬のいずれか
に、ピリドキサールリン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグ
ルタル酸、ＬＤＨ及びＮＡＤＨが必須成分として含有さ
れ、一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサー
ルリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸
を含まずＬ−アラニンを含有するＧＰＴ測定用キット
を、調製することにより、長期間に亘って安定なＧＰＴ
測定用キットが得られる。
酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）測定用試薬を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−ア
ラニンとα−ケトグルタル酸にＧＰＴを作用させて生成
するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）の作用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ
減少量に基づいてＧＰＴを測定する２試薬系のＧＰＴ測
定用キットであって、第一試薬と第二試薬のいずれか
に、ピリドキサールリン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグ
ルタル酸、ＬＤＨ及びＮＡＤＨが必須成分として含有さ
れ、一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサー
ルリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸
を含まずＬ−アラニンを含有するＧＰＴ測定用キット
を、調製することにより、長期間に亘って安定なＧＰＴ
測定用キットが得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグルタミン酸ピルビン酸
トランスアミナーゼ（以下、ＧＰＴと略す）測定用試薬
に関する。より詳細には、長期間に亘って安定に保存す
ることが出来るＧＰＴ測定用の改良されたキットに関す
る。
トランスアミナーゼ（以下、ＧＰＴと略す）測定用試薬
に関する。より詳細には、長期間に亘って安定に保存す
ることが出来るＧＰＴ測定用の改良されたキットに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＧＰＴは、日常臨床検査で種々の臓器の
細胞障害、なかでも心、肝疾患を検出するための鋭敏な
検査法として重要な項目となっており、古くから用いら
れている。ＧＰＴの測定法としては、分析機器の性能の
向上に従い、ＵＶ法といわれる方法が広く使用されてい
る。このＵＶ法は、ＧＰＴの基質であるＬ−アラニンと
α−ケトグルタル酸に、ＧＰＴを作用させて生成される
ピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤＨと略す）の共存下に乳酸脱水素
酵素（以下、ＬＤＨと略す）を作用させて乳酸に変換
し、このときのＮＡＤＨの減少量を波長３４０ｎｍ付近
で測定することによりＧＰＴを測定する方法である。
細胞障害、なかでも心、肝疾患を検出するための鋭敏な
検査法として重要な項目となっており、古くから用いら
れている。ＧＰＴの測定法としては、分析機器の性能の
向上に従い、ＵＶ法といわれる方法が広く使用されてい
る。このＵＶ法は、ＧＰＴの基質であるＬ−アラニンと
α−ケトグルタル酸に、ＧＰＴを作用させて生成される
ピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤＨと略す）の共存下に乳酸脱水素
酵素（以下、ＬＤＨと略す）を作用させて乳酸に変換
し、このときのＮＡＤＨの減少量を波長３４０ｎｍ付近
で測定することによりＧＰＴを測定する方法である。
【０００３】この測定法を反応式で表すと以下の通りで
ある。
ある。
【化１】
【０００４】広くＧＰＴが測定されるようになると、測
定者間で測定値が異なり、その測定値の互換性がないた
め患者データの比較ができず、診断に支障をきたす恐れ
があるといった問題が発生し始めた。そこで各国におい
て、試薬濃度などが規定された勧告法と呼ばれる測定方
法が提唱されるようになった。国際的には、国際臨床化
学連合（ＩＦＣＣ）が、標準測定法として、ピリドキサ
ールリン酸の存在下にＬ−アラニンとα−ケトグルタル
酸にＧＰＴを作用させるＩＦＣＣ勧告法（IFCCScientif
ic Committee：Expert panel on Enzymes, IFCC method
for alanineaminotransferase, Clinica Chemica Act
a, 105, 147F-157F (1980)）を提示し、また日本臨床化
学会（ＪＳＣＣ）も1989年に、ピリドキサールリン酸を
用いないでＧＰＴを測定するＪＳＣＣ勧告法を公表した
（日本臨床化学会：ヒト血清中酵素活性測定の勧告法−
アラニンアミノトランスフェラーゼ−（1989−08−3
0）, 臨床化学, 18(4), 250-262 (1989)）。
定者間で測定値が異なり、その測定値の互換性がないた
め患者データの比較ができず、診断に支障をきたす恐れ
があるといった問題が発生し始めた。そこで各国におい
て、試薬濃度などが規定された勧告法と呼ばれる測定方
法が提唱されるようになった。国際的には、国際臨床化
学連合（ＩＦＣＣ）が、標準測定法として、ピリドキサ
ールリン酸の存在下にＬ−アラニンとα−ケトグルタル
酸にＧＰＴを作用させるＩＦＣＣ勧告法（IFCCScientif
ic Committee：Expert panel on Enzymes, IFCC method
for alanineaminotransferase, Clinica Chemica Act
a, 105, 147F-157F (1980)）を提示し、また日本臨床化
学会（ＪＳＣＣ）も1989年に、ピリドキサールリン酸を
用いないでＧＰＴを測定するＪＳＣＣ勧告法を公表した
（日本臨床化学会：ヒト血清中酵素活性測定の勧告法−
アラニンアミノトランスフェラーゼ−（1989−08−3
0）, 臨床化学, 18(4), 250-262 (1989)）。
【０００５】以下に、ＩＦＣＣ勧告法とＪＳＣＣ勧告法
とを比較して示す。
とを比較して示す。
【０００６】
【表１】
【０００７】ＩＦＣＣ勧告法に用いられるピリドキサー
ルリン酸は、ビタミンＢ６リン酸エステル化合物の一つ
であり、熱、光に不安定とされている。生体内では、ア
ミノ酸代謝にあずかる酵素（ＧＰＴなど）のリシンのε
−アミノ基とシッフ塩基を形成し結合して、補酵素とし
て働くもっとも重要な化合物である。ＧＰＴは補酵素と
結合した状態で酵素として働くが、何らかの原因で補酵
素の外れ去ったものをアポ型ＧＰＴという。一方、補酵
素の結合しているものはホロ型ＧＰＴという。従って、
ピリドキサールリン酸を試薬に添加することにより、ア
ポ型ＧＰＴが活性化されるため、ホロ型ＧＰＴと合わせ
て測定することができる。したがって、ＩＦＣＣ勧告法
ではアポ型、ホロ型ＧＰＴを共に測定することができる
が、ＪＳＣＣ勧告法では、ピリドキサールリン酸を添加
しないため、ホロ型ＧＰＴを主に測定している。
ルリン酸は、ビタミンＢ６リン酸エステル化合物の一つ
であり、熱、光に不安定とされている。生体内では、ア
ミノ酸代謝にあずかる酵素（ＧＰＴなど）のリシンのε
−アミノ基とシッフ塩基を形成し結合して、補酵素とし
て働くもっとも重要な化合物である。ＧＰＴは補酵素と
結合した状態で酵素として働くが、何らかの原因で補酵
素の外れ去ったものをアポ型ＧＰＴという。一方、補酵
素の結合しているものはホロ型ＧＰＴという。従って、
ピリドキサールリン酸を試薬に添加することにより、ア
ポ型ＧＰＴが活性化されるため、ホロ型ＧＰＴと合わせ
て測定することができる。したがって、ＩＦＣＣ勧告法
ではアポ型、ホロ型ＧＰＴを共に測定することができる
が、ＪＳＣＣ勧告法では、ピリドキサールリン酸を添加
しないため、ホロ型ＧＰＴを主に測定している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】近年、臨床検査薬を液
状化する技術が発展し、長期間安定性を有する液状試薬
を提供できるようになってきている。これに対して、ピ
リドキサールリン酸の存在下で、ＧＰＴを測定する試薬
では、ピリドキサールリン酸が不安定であるため、液状
化を達成できていない。例えば、ピリドキサールリン酸
を錠剤として添付し使用前に試薬で溶解するキットや、
凍結乾燥品とした試薬などが現在用いられている。ＩＦ
ＣＣ勧告法では、ピリドキサールリン酸水溶液を２週間
ごとに調製することになっている。また、溶液状態では
ピリドキサールリン酸特有の黄色に呈色しているが、安
定性の劣化と共に無色となってしまう。このように、Ｇ
ＰＴ測定系で使用するピリドキサールリン酸は、現状で
は溶液状態で長期間安定化させるのが困難であり、溶解
後数日程度しか安定性を有していない。本発明者らは、
こうした従来の問題点を解消すべく種々鋭意検討した結
果、液状試薬としての充分な保存安定性を有するＧＰＴ
測定試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見に基
づくものである。
状化する技術が発展し、長期間安定性を有する液状試薬
を提供できるようになってきている。これに対して、ピ
リドキサールリン酸の存在下で、ＧＰＴを測定する試薬
では、ピリドキサールリン酸が不安定であるため、液状
化を達成できていない。例えば、ピリドキサールリン酸
を錠剤として添付し使用前に試薬で溶解するキットや、
凍結乾燥品とした試薬などが現在用いられている。ＩＦ
ＣＣ勧告法では、ピリドキサールリン酸水溶液を２週間
ごとに調製することになっている。また、溶液状態では
ピリドキサールリン酸特有の黄色に呈色しているが、安
定性の劣化と共に無色となってしまう。このように、Ｇ
ＰＴ測定系で使用するピリドキサールリン酸は、現状で
は溶液状態で長期間安定化させるのが困難であり、溶解
後数日程度しか安定性を有していない。本発明者らは、
こうした従来の問題点を解消すべく種々鋭意検討した結
果、液状試薬としての充分な保存安定性を有するＧＰＴ
測定試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見に基
づくものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＧＰＴ測
定用試薬の試薬組成を種々検討した結果、使用する酵素
や基質のうち、Ｌ−アラニンとピリドキサールリン酸を
共存させておいた場合に、保存中にピリドキサールリン
酸特有の黄色の呈色が失われ、測定値も低下するといっ
た安定性の低下が起こることを見出した。特に、２試薬
系で構成する場合には、一方の試薬は、Ｌ−アラニンを
含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬
は、ピリドキサールリン酸を含まず、Ｌ−アラニンを含
有する、２試薬系のキットとすることで、安定な液状Ｇ
ＰＴ測定試薬を供給することが可能となった。従って、
本発明は、ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−アラニ
ンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させて生成するピルビ
ン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作
用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ減少量に基
づいてＧＰＴを測定するＧＰＴ測定用キットであって、 １）第一試薬と第二試薬からなる２試薬系のキットであ
り； ２）第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサール
リン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ＬＤＨ及
びＮＡＤＨが必須成分として含有され； ３）一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサー
ルリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸
を含まずＬ−アラニンを含有する、ＧＰＴ測定用キット
である。
定用試薬の試薬組成を種々検討した結果、使用する酵素
や基質のうち、Ｌ−アラニンとピリドキサールリン酸を
共存させておいた場合に、保存中にピリドキサールリン
酸特有の黄色の呈色が失われ、測定値も低下するといっ
た安定性の低下が起こることを見出した。特に、２試薬
系で構成する場合には、一方の試薬は、Ｌ−アラニンを
含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬
は、ピリドキサールリン酸を含まず、Ｌ−アラニンを含
有する、２試薬系のキットとすることで、安定な液状Ｇ
ＰＴ測定試薬を供給することが可能となった。従って、
本発明は、ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−アラニ
ンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させて生成するピルビ
ン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作
用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ減少量に基
づいてＧＰＴを測定するＧＰＴ測定用キットであって、 １）第一試薬と第二試薬からなる２試薬系のキットであ
り； ２）第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサール
リン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ＬＤＨ及
びＮＡＤＨが必須成分として含有され； ３）一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサー
ルリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸
を含まずＬ−アラニンを含有する、ＧＰＴ測定用キット
である。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のＧＰＴ測定用キットは、一方の試薬は、Ｌ−ア
ラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方
の試薬は、ピリドキサールリン酸を含まず、Ｌ−アラニ
ンを含有する、２つの試薬から構成される２試薬系の測
定用キットである。本発明のＧＰＴ測定用キットは、凍
結乾燥品の形態であってもよいが、液状の形態にした場
合であっても、長期間安定であり、ピリドキサールリン
酸特有の黄色も長期間維持される。
本発明のＧＰＴ測定用キットは、一方の試薬は、Ｌ−ア
ラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方
の試薬は、ピリドキサールリン酸を含まず、Ｌ−アラニ
ンを含有する、２つの試薬から構成される２試薬系の測
定用キットである。本発明のＧＰＴ測定用キットは、凍
結乾燥品の形態であってもよいが、液状の形態にした場
合であっても、長期間安定であり、ピリドキサールリン
酸特有の黄色も長期間維持される。
【００１１】一般的に、第一試薬として、ピリドキサー
ルリン酸と共に、ＬＤＨ及びＮＡＰＤＨを必須成分とし
て含有する試薬を調製し、第二試薬として、Ｌ−アラニ
ンとα−ケトグルタル酸を必須成分として含有する試薬
を調製してキットとするのが好ましい。第一試薬に含有
させるＬＤＨとその補酵素であるＮＡＤＨは、ＧＰＴの
測定誤差の原因となる検体中のピルビン酸を消去できる
利点がある。
ルリン酸と共に、ＬＤＨ及びＮＡＰＤＨを必須成分とし
て含有する試薬を調製し、第二試薬として、Ｌ−アラニ
ンとα−ケトグルタル酸を必須成分として含有する試薬
を調製してキットとするのが好ましい。第一試薬に含有
させるＬＤＨとその補酵素であるＮＡＤＨは、ＧＰＴの
測定誤差の原因となる検体中のピルビン酸を消去できる
利点がある。
【００１２】Ｌ−アラニンを含まず、ピリドキサールリ
ン酸を含有する第一試薬のｐＨは、ｐＨ７〜１０に調整
するのが好ましい。そして、第二試薬のｐＨおよび緩衝
液濃度を適当に調節し、第一試薬と混合してＧＰＴの測
定の際に、ＧＰＴ反応時のｐＨが７〜８、好ましくは
７．３付近となるように設定するのが好ましい。このよ
うにｐＨを調整した第一試薬と第二試薬を調製すること
により、各試薬中の構成成分を長期間安定に保存するこ
とができる。
ン酸を含有する第一試薬のｐＨは、ｐＨ７〜１０に調整
するのが好ましい。そして、第二試薬のｐＨおよび緩衝
液濃度を適当に調節し、第一試薬と混合してＧＰＴの測
定の際に、ＧＰＴ反応時のｐＨが７〜８、好ましくは
７．３付近となるように設定するのが好ましい。このよ
うにｐＨを調整した第一試薬と第二試薬を調製すること
により、各試薬中の構成成分を長期間安定に保存するこ
とができる。
【００１３】第一試薬の緩衝液は、ｐＨを前記の範囲内
にすることができれば、従来公知の緩衝液を適宜選択し
て使用することができる。具体的には、ＩＦＣＣ及びＪ
ＳＣＣ勧告法に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンやｐＨ７〜１０に緩衝能を持つ緩衝液であ
れば何ら問題なく使用することができる。また、複数の
緩衝液を組み合わせて第一試薬のｐＨをｐＨ７〜１０に
設定することもできる。第一試薬のｐＨは、前記したよ
うにｐＨ７〜１０、ＮＡＤＨの安定性を鑑み、ｐＨ８．
５〜９．０が特に好ましい。
にすることができれば、従来公知の緩衝液を適宜選択し
て使用することができる。具体的には、ＩＦＣＣ及びＪ
ＳＣＣ勧告法に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンやｐＨ７〜１０に緩衝能を持つ緩衝液であ
れば何ら問題なく使用することができる。また、複数の
緩衝液を組み合わせて第一試薬のｐＨをｐＨ７〜１０に
設定することもできる。第一試薬のｐＨは、前記したよ
うにｐＨ７〜１０、ＮＡＤＨの安定性を鑑み、ｐＨ８．
５〜９．０が特に好ましい。
【００１４】第二試薬の緩衝液は、ＧＰＴ反応時のｐＨ
を前記範囲内にすることができる公知の緩衝液を適宜選
択して使用することができる。具体的には、第一試薬と
同様にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどが
使用できる。また、緩衝液のｐＨは特に規定されない
が、第一試薬と混合した際にｐＨ７〜８付近となるよう
にｐＨおよび緩衝液濃度を設定するのが好ましい。
を前記範囲内にすることができる公知の緩衝液を適宜選
択して使用することができる。具体的には、第一試薬と
同様にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどが
使用できる。また、緩衝液のｐＨは特に規定されない
が、第一試薬と混合した際にｐＨ７〜８付近となるよう
にｐＨおよび緩衝液濃度を設定するのが好ましい。
【００１５】第一試薬中のピリドキサールリン酸の添加
量は、通常０．０１〜１ｍＭ、好ましくは０．１〜０．
３ｍＭである。また、ＮＡＤＨは通常０．０５〜５ｍ
Ｍ、好ましくは、０．１〜１ｍＭである。本発明に用い
られるＬＤＨとしては、その由来は特に限定されない。
ＬＤＨの添加量としては、通常１０００Ｕ以上を適宜選
択して使用すればよい。第二試薬に用いるＬ−アラニン
の添加量は、通常１０〜２０００ｍＭ、好ましくは、５
００〜１５００ｍＭである。また、α−ケトグルタル酸
の添加濃度は、通常１〜２００ｍＭ、好ましくは、１０
〜５０ｍＭである。これらの試薬の添加量は、第一試薬
と第二試薬の混合比によって変動するため、上記範囲外
であってもよい。
量は、通常０．０１〜１ｍＭ、好ましくは０．１〜０．
３ｍＭである。また、ＮＡＤＨは通常０．０５〜５ｍ
Ｍ、好ましくは、０．１〜１ｍＭである。本発明に用い
られるＬＤＨとしては、その由来は特に限定されない。
ＬＤＨの添加量としては、通常１０００Ｕ以上を適宜選
択して使用すればよい。第二試薬に用いるＬ−アラニン
の添加量は、通常１０〜２０００ｍＭ、好ましくは、５
００〜１５００ｍＭである。また、α−ケトグルタル酸
の添加濃度は、通常１〜２００ｍＭ、好ましくは、１０
〜５０ｍＭである。これらの試薬の添加量は、第一試薬
と第二試薬の混合比によって変動するため、上記範囲外
であってもよい。
【００１６】第一試薬および第二試薬には、上記の成分
の他に、必要により、一般的に添加される成分である、
ＥＤＴＡ等のキレート化剤やアジ化ナトリウムなどの防
腐剤、各種界面活性化剤等を適宜添加することができ
る。
の他に、必要により、一般的に添加される成分である、
ＥＤＴＡ等のキレート化剤やアジ化ナトリウムなどの防
腐剤、各種界面活性化剤等を適宜添加することができ
る。
【００１７】このように構成されたＧＰＴ測定用キット
を用いて検体中のＧＰＴを測定することによって、検体
中のＧＰＴはピリドキサールリン酸の作用でアポ型ＧＰ
Ｔがホロ型ＧＰＴへと活性化される。そして、検体中に
存在しているホロ型ＧＰＴに、ＧＰＴの基質であるＬ−
アラニンとα−ケトグルタル酸を作用させると、グルタ
ミン酸とピルビン酸が生成される。ピルビン酸は、共役
酵素であるＬＤＨにより、ＮＡＤＨを酸化して乳酸とＮ
ＡＤになる。この反応で酸化されるＮＡＤＨの減少量を
波長３４０ｎｍ付近の吸光度で測定することで、ＧＰＴ
活性を求めることができる。
を用いて検体中のＧＰＴを測定することによって、検体
中のＧＰＴはピリドキサールリン酸の作用でアポ型ＧＰ
Ｔがホロ型ＧＰＴへと活性化される。そして、検体中に
存在しているホロ型ＧＰＴに、ＧＰＴの基質であるＬ−
アラニンとα−ケトグルタル酸を作用させると、グルタ
ミン酸とピルビン酸が生成される。ピルビン酸は、共役
酵素であるＬＤＨにより、ＮＡＤＨを酸化して乳酸とＮ
ＡＤになる。この反応で酸化されるＮＡＤＨの減少量を
波長３４０ｎｍ付近の吸光度で測定することで、ＧＰＴ
活性を求めることができる。
【００１８】
【実施例】以下に、実施例によって本発明を更に具体的
に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するもので
はない。 実施例１ピリドキサールリン酸のＬ−アラニンに対する安定性 ピリドキサールリン酸のＬ−アラニンに対する安定性を
検証した。３６．６ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液（ｐＨ８．７０）にピリドキサールリ
ン酸を０．１２５ｍＭ添加し、さらにＬＤＨ、β−ＮＡ
ＤＨ、界面活性剤を添加した試薬に、Ｌ−アラニンを２
００ｍＭ又は４００ｍＭ添加後、ｐＨを４Ｎ−ＮａＯＨ
にてｐＨ８．７０に再調整した第一試薬と、対照として
Ｌ−アラニンを添加しない第一試薬を調製した。第二試
薬は、３６６ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液（ｐＨ４．００）に、Ｌ−アラニン、α−ケ
トグルタル酸及び界面活性剤を添加し、２Ｎ−ＨＣｌに
てｐＨを調整した。試薬組成は下記に記した。
に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するもので
はない。 実施例１ピリドキサールリン酸のＬ−アラニンに対する安定性 ピリドキサールリン酸のＬ−アラニンに対する安定性を
検証した。３６．６ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液（ｐＨ８．７０）にピリドキサールリ
ン酸を０．１２５ｍＭ添加し、さらにＬＤＨ、β−ＮＡ
ＤＨ、界面活性剤を添加した試薬に、Ｌ−アラニンを２
００ｍＭ又は４００ｍＭ添加後、ｐＨを４Ｎ−ＮａＯＨ
にてｐＨ８．７０に再調整した第一試薬と、対照として
Ｌ−アラニンを添加しない第一試薬を調製した。第二試
薬は、３６６ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液（ｐＨ４．００）に、Ｌ−アラニン、α−ケ
トグルタル酸及び界面活性剤を添加し、２Ｎ−ＨＣｌに
てｐＨを調整した。試薬組成は下記に記した。
【００１９】第一試薬組成 トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン ３６．６ｍＭ ｐＨ８．７０ β−ＮＡＤＨ ０．０２ｍＭ ＬＤＨ ２５６７Ｕ／Ｌ 界面活性剤 ０．０１％ ピリドキサールリン酸 ０．１２５ｍＭ Ｌ−アラニン ０、２００又は４００ｍＭ
【００２０】第二試薬組成 トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン ３６６ｍＭ ｐＨ４．００ α−ケトグルタル酸 ７７ｍＭ Ｌ−アラニン １０００ｍＭ 界面活性剤 ０．０１％
【００２１】ＧＰＴの活性は日立７１５０型自動分析装
置を用い、試料として血清または生理食塩水１０μＬに
対し第一試薬３００μＬ、第二試薬７５μＬを反応さ
せ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析
装置の機能で３０〜５０測光ポイント間（R2添加後１分
後から５分後に相当）において吸光度変化率を追跡し
た。試料中のＧＰＴの活性値は下記式より算出した。
置を用い、試料として血清または生理食塩水１０μＬに
対し第一試薬３００μＬ、第二試薬７５μＬを反応さ
せ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析
装置の機能で３０〜５０測光ポイント間（R2添加後１分
後から５分後に相当）において吸光度変化率を追跡し
た。試料中のＧＰＴの活性値は下記式より算出した。
【００２２】
【式１】ＧＰＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）＝（ΔＥ／ｍｉｎ）
／ε×（Ｖ／ｖ）×１０6 ΔＥ／ｍｉｎ：１分間あたりの吸光度変化率 ε：モル分子吸光係数（ＮＡＤＨの場合、６．２２×１
０3Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ） Ｖ：全反応液量（試料＋第一試薬＋第二試薬） ｖ：試料液量
／ε×（Ｖ／ｖ）×１０6 ΔＥ／ｍｉｎ：１分間あたりの吸光度変化率 ε：モル分子吸光係数（ＮＡＤＨの場合、６．２２×１
０3Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ） Ｖ：全反応液量（試料＋第一試薬＋第二試薬） ｖ：試料液量
【００２３】ピリドキサールリン酸の安定性は、調製当
日のコントロール血清の測定値を１００％として、第一
試薬を４℃および３７℃保存し、測定値の変化率を算出
した。結果を表２に示す。ピリドキサールリン酸の呈色
の変化としても確認した。結果を表３に示す。
日のコントロール血清の測定値を１００％として、第一
試薬を４℃および３７℃保存し、測定値の変化率を算出
した。結果を表２に示す。ピリドキサールリン酸の呈色
の変化としても確認した。結果を表３に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】表２は、コントロール血清の測定値を調製
当日と比較した相対活性として示した表である。表２に
示されるように、３７℃保存では、Ｌ−アラニンを第一
試薬に添加し、ピリドキサールリン酸と共存させておい
た場合、コントロール血清の測定値が測定日ごとに低下
していき、試薬の安定性が失われていることが分かる。
しかし、Ｌ−アラニン無添加の試薬では３７℃保存にお
いても、ほとんど測定値に変化は見られず試薬が安定性
を保っていることがわかる。
当日と比較した相対活性として示した表である。表２に
示されるように、３７℃保存では、Ｌ−アラニンを第一
試薬に添加し、ピリドキサールリン酸と共存させておい
た場合、コントロール血清の測定値が測定日ごとに低下
していき、試薬の安定性が失われていることが分かる。
しかし、Ｌ−アラニン無添加の試薬では３７℃保存にお
いても、ほとんど測定値に変化は見られず試薬が安定性
を保っていることがわかる。
【００２６】
【表３】
【００２７】表中の記号「＋＋」は黄色の呈色を示し、
「＋」は淡黄色、「−」は無色を表す。表３からも同様
に、濃度に関わらずＬ−アラニンが試薬中に存在する場
合には、呈色が失われ無色となってしまい、ピリドキサ
ールリン酸が変化してしまったものと推測できる。しか
しながら、Ｌ−アラニンを含まない試薬では、呈色も維
持し続けた。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、
Ｌ−アラニンによって失われることは明らかであり、Ｌ
−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有する
試薬が安定性において優れていることがわかる。
「＋」は淡黄色、「−」は無色を表す。表３からも同様
に、濃度に関わらずＬ−アラニンが試薬中に存在する場
合には、呈色が失われ無色となってしまい、ピリドキサ
ールリン酸が変化してしまったものと推測できる。しか
しながら、Ｌ−アラニンを含まない試薬では、呈色も維
持し続けた。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、
Ｌ−アラニンによって失われることは明らかであり、Ｌ
−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有する
試薬が安定性において優れていることがわかる。
【００２８】実施例２ピリドキサールリン酸のｐＨに対する安定性 ピリドキサールリン酸のｐＨによる安定性の変化を検証
した。１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液にピリドキサールリン酸を０．２０５ｍＭ添
加し、さらにＬＤＨ、β−ＮＡＤＨ、塩化ナトリウム、
界面活性剤を添加した試薬のｐＨを４Ｎ−ＮａＯＨおよ
び２Ｎ−ＨＣｌにてｐＨ７〜１０に調整した第一試薬
と、１０５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液（ｐＨ４．２０）にＬ−アラニンおよびα−ケ
トグルタル酸、界面活性剤を添加し、２Ｎ−ＨＣｌにて
ｐＨを調整した第二試薬を調製した。試薬組成は下記に
記した。
した。１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液にピリドキサールリン酸を０．２０５ｍＭ添
加し、さらにＬＤＨ、β−ＮＡＤＨ、塩化ナトリウム、
界面活性剤を添加した試薬のｐＨを４Ｎ−ＮａＯＨおよ
び２Ｎ−ＨＣｌにてｐＨ７〜１０に調整した第一試薬
と、１０５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液（ｐＨ４．２０）にＬ−アラニンおよびα−ケ
トグルタル酸、界面活性剤を添加し、２Ｎ−ＨＣｌにて
ｐＨを調整した第二試薬を調製した。試薬組成は下記に
記した。
【００２９】第一試薬組成 トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン １００ｍＭ ｐＨ７、８、 ９又は１０ 塩化ナトリウム １００ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ ０．２ｍＭ β−ＮＡＤＨ ０．３６９ｍＭ ＬＤＨ ２４６０Ｕ／Ｌ 界面活性剤 ０．０１％ ピリドキサールリン酸 ０．２０５ｍＭ
【００３０】第二試薬組成 トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン １０５ｍＭ ｐＨ４．２ α−ケトグルタル酸 ３０．７５ｍＭ Ｌ−アラニン １０２５ｍＭ 界面活性剤 ０．０１％
【００３１】ＧＰＴの活性は日立７１５０型自動分析装
置を用い、試料として血清または生理食塩水１０μＬに
対し第一試薬２００μＬ、第二試薬２００μＬを反応さ
せ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析
装置の機能で３０〜５０測光ポイント間（R2添加後１分
後から５分後に相当）において吸光度変化率を追跡し
た。ＧＰＴ活性値は、実施例１と同様に求めた。
置を用い、試料として血清または生理食塩水１０μＬに
対し第一試薬２００μＬ、第二試薬２００μＬを反応さ
せ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析
装置の機能で３０〜５０測光ポイント間（R2添加後１分
後から５分後に相当）において吸光度変化率を追跡し
た。ＧＰＴ活性値は、実施例１と同様に求めた。
【００３２】実施例１と同様に、ピリドキサールリン酸
の安定性は、保存当日のコントロール血清の測定値を１
００％として、第一試薬を３７℃保存し、測定値の変化
率を算出した。結果を表４に示す。また、ピリドキサー
ルリン酸の呈色の変化としても確認した。結果を表５に
示す。
の安定性は、保存当日のコントロール血清の測定値を１
００％として、第一試薬を３７℃保存し、測定値の変化
率を算出した。結果を表４に示す。また、ピリドキサー
ルリン酸の呈色の変化としても確認した。結果を表５に
示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】表４は、コントロール血清の測定値を調製
当日と比較した相対活性として示した表である。表４に
示されるように、ｐＨ７〜１０、特にｐＨ７〜９ではコ
ントロール血清の測定値も変わらず、安定であることが
示される。
当日と比較した相対活性として示した表である。表４に
示されるように、ｐＨ７〜１０、特にｐＨ７〜９ではコ
ントロール血清の測定値も変わらず、安定であることが
示される。
【００３５】
【表５】
【００３６】表中の記号「＋＋」は黄色の呈色を示し、
「＋」は淡黄色、「−」は無色を表す。ｐＨ７〜１０、
特にｐＨ７〜９とした第一試薬では、呈色は維持し続け
た。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、特にｐＨ
７〜９において保持されることがわかる。
「＋」は淡黄色、「−」は無色を表す。ｐＨ７〜１０、
特にｐＨ７〜９とした第一試薬では、呈色は維持し続け
た。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、特にｐＨ
７〜９において保持されることがわかる。
【００３７】
【発明の効果】以上の実施例にも示した通り、本発明の
試薬は自動分析装置への適用に即し、しかも液状試薬と
して供することが可能となり、操作性および安定性が格
段に向上したものである。すなわち、本発明の方法によ
り、従来不可能であった液状でのピリドキサールリン酸
の安定性を図ることが可能となり、長期間にわたって使
用可能な試薬を供給できるようになった。
試薬は自動分析装置への適用に即し、しかも液状試薬と
して供することが可能となり、操作性および安定性が格
段に向上したものである。すなわち、本発明の方法によ
り、従来不可能であった液状でのピリドキサールリン酸
の安定性を図ることが可能となり、長期間にわたって使
用可能な試薬を供給できるようになった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片山 勝博 福島県郡山市富田町字大十内80−21 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BA11 BB54 CA25 CA26 DA03 DA20 FA29 GC10 4B063 QA01 QA19 QQ26 QR04 QS03 QX01
Claims (4)
- 【請求項１】 ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−ア
ラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸
トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させて生成するピ
ルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
の作用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ減少量
に基づいてＧＰＴを測定するＧＰＴ測定用キットであっ
て、 １）第一試薬と第二試薬からなる２試薬系のキットであ
り； ２）第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサール
リン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ＬＤＨ及
びＮＡＤＨが必須成分として含有され； ３）一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサー
ルリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸
を含まずＬ−アラニンを含有する、 ＧＰＴ測定用キット。 - 【請求項２】 第一試薬と第二試薬とが液状である、請
求項１記載のＧＰＴ測定用キット。 - 【請求項３】 一方の試薬が、ピリドキサールリン酸、
ＬＤＨ及びＮＡＤＨを必須成分として含み、他方の試薬
が、Ｌ−アラニン及びα−ケトグルタル酸を必須成分と
して含む、請求項１又は２記載のＧＰＴ測定用キット。 - 【請求項４】 第一試薬が、ピリドキサールリン酸、Ｌ
ＤＨ及びＮＡＤＨを必須成分として含み、かつｐＨが７
〜１０であり、第二試薬が、Ｌ−アラニン及びα−ケト
グルタル酸を必須成分として含む、請求項１〜３のいず
れかに記載のＧＰＴ測定用キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000078432A JP3674450B2 (ja) | 2000-03-21 | 2000-03-21 | Ｇｐｔ測定用試薬 |
| DE60115978T DE60115978T2 (de) | 2000-03-21 | 2001-03-12 | Reagens für Glutamat-Pyruvat-Transaminase-Assay |
| EP01105408A EP1136564B1 (en) | 2000-03-21 | 2001-03-12 | Reagent for glutamic-pyruvic transaminase assay |
| US09/805,193 US6645735B2 (en) | 2000-03-21 | 2001-03-14 | Reagent for GPT assay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000078432A JP3674450B2 (ja) | 2000-03-21 | 2000-03-21 | Ｇｐｔ測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001258595A true JP2001258595A (ja) | 2001-09-25 |
| JP3674450B2 JP3674450B2 (ja) | 2005-07-20 |
Family
ID=18595845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000078432A Expired - Lifetime JP3674450B2 (ja) | 2000-03-21 | 2000-03-21 | Ｇｐｔ測定用試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6645735B2 (ja) |
| EP (1) | EP1136564B1 (ja) |
| JP (1) | JP3674450B2 (ja) |
| DE (1) | DE60115978T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006075111A (ja) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Toyobo Co Ltd | ビタミンｂ６酵素を用いた試薬の安定化法およびその試薬 |
| JP2020018204A (ja) * | 2018-07-31 | 2020-02-06 | 株式会社エンザイム・センサ | γ−アミノ酪酸の測定方法、及びそのためのキット |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100541201C (zh) * | 2005-02-01 | 2009-09-16 | 上海市血液中心 | 谷丙转氨酶质控品的稀释液母液 |
| CN100547390C (zh) * | 2006-03-03 | 2009-10-07 | 中国科学院电子学研究所 | 光学快速检测谷丙转氨酶试剂 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1143835A (ja) * | 1965-05-11 | 1900-01-01 | ||
| US4235962A (en) * | 1978-08-21 | 1980-11-25 | The Dow Chemical Company | Combination kit for transaminase assay of a body fluid |
| CA1187388A (en) * | 1978-09-20 | 1985-05-21 | American Monitor Corporation | Stabilization of working reagent solutions containing nadh, nadph, and/or enzymes, and the use of such stabilized reagents in enzymes or substrate assays |
| US4575488A (en) * | 1982-06-25 | 1986-03-11 | Technicon Instruments Corp. | Interference free transaminase assay |
| US4547465A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-15 | Eastman Kodak Company | Analytical element having improved spreading zone and method of use |
-
2000
- 2000-03-21 JP JP2000078432A patent/JP3674450B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-12 EP EP01105408A patent/EP1136564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-12 DE DE60115978T patent/DE60115978T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-14 US US09/805,193 patent/US6645735B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006075111A (ja) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Toyobo Co Ltd | ビタミンｂ６酵素を用いた試薬の安定化法およびその試薬 |
| JP2020018204A (ja) * | 2018-07-31 | 2020-02-06 | 株式会社エンザイム・センサ | γ−アミノ酪酸の測定方法、及びそのためのキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1136564A3 (en) | 2004-01-21 |
| EP1136564A2 (en) | 2001-09-26 |
| JP3674450B2 (ja) | 2005-07-20 |
| DE60115978T2 (de) | 2006-08-17 |
| US6645735B2 (en) | 2003-11-11 |
| DE60115978D1 (de) | 2006-01-26 |
| EP1136564B1 (en) | 2005-12-21 |
| US20020009763A1 (en) | 2002-01-24 |
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