JPH08242894A - 尿素窒素測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 溶液状態で長期間安定な尿素窒素測定用試薬
を提供する。 【構成】 （ａ）α−ケトグルタル酸又はその塩、
（ｂ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、（ｃ）グルタミン酸脱
水素酵素、及び（ｄ）牛血清アルブミン及び／又はアデ
ノシン−５’−三リン酸を含有する第一試薬と、ウレア
ーゼを含有する第二試薬とからなり、それぞれ液状試薬
である。 【効果】 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びグルタミン酸脱水素酵素
が共に安定化し、溶液状態で長期間保存可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、尿素窒素（以下、ＵＮ
と略称する）測定用試薬組成物に関する。更に詳しく
は、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用の改良された液
状試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】病院の検査室や検査センターで使用され
ている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用して
いる試薬は、安定化を図るため、凍結乾燥品にし、使用
時に溶解使用するのが主流になっている。しかしなが
ら、このような臨床検査施設では、多項目を測定し、検
体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になる事
が多い。そのため、使用時に試薬を調製する必要のな
い、溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれ
ている。ＵＮ測定用試薬に関しても例外ではなく、溶液
状態で長期間安定なＵＮ測定用試薬の開発が望まれてい
る。

【０００３】現在、よく用いられているＵＮ測定方法
は、（１）検体試料をα−ケトグルタル酸（以下、α−
ＫＧと略称する）又はその塩、及び還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略称す
る）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略称する）の存在下に、グ
ルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧｌＤＨと略称する）を
作用させ、検体試料中に最初から存在する微量の内因性
アンモニアを予め除去する予備工程と、（２）その反応
液にウレアーゼを加え、検体試料中の尿素をアンモニア
に分解し、このアンモニアの生成量に対応するＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨ〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略称する〕の
減少速度を測定する主工程とからなり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の減少速度からＵＮ量を求めることを特徴とするＵＮ測
定方法である。

【０００４】この測定方法の主工程の基礎となる反応式
を以下に示す。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記ＵＮ測定方法に用
いられるＵＮ測定用試薬は、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する予備工程反応を実
施するための第一溶液と、ウレアーゼを含有する第二溶
液とから構成するのが一般的であるが、第一溶液に含ま
れるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨの溶液中での安定性の
条件が異なるため、溶液状態で長期間安定に保存するこ
とができるＵＮ測定用試薬の開発は困難であった。例え
ば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、アルカリ性領域で安定で、ｐＨ
８．５〜１１．０が好ましく、ＧｌＤＨは、中性から弱
アルカリ性領域で安定で、ｐＨ６．５〜９．５が好まし
く、α−ＫＧは、広いｐＨ領域で安定であることがわか
っている。そこで、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する溶液において、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈが安定で、且つＧｌＤＨも安定である条件は、
弱アルカリ性からアルカリ性領域、特にｐＨ８．５〜
９．５が好ましいことが予想される。しかしながら、後
述する比較例に示すように、ｐＨ条件のみでは、α−Ｋ
Ｇ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨの全てを
十分に安定化することはできなかった。従って、本発明
の目的は、溶液中においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨ
を共存させた条件で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨとα
−ＫＧとを共に安定化させ、溶液状態で長期間安定なＵ
Ｎ測定用試薬を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、少な
くとも、（ａ）α−ケトグルタル酸又はその塩、（ｂ）
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、
（ｃ）グルタミン酸脱水素酵素、及び（ｄ）牛血清アル
ブミン及び／又はアデノシン−５’−三リン酸を含有す
る第一試薬と、少なくとも、ウレアーゼを含有する第二
試薬とからなり、それぞれ液状試薬であることを特徴と
する尿素窒素測定用試薬に関する。また、本発明は、第
一試薬が、更に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸を補酵素とする脱水素酵素と、この脱水素酵
素の基質とを含有する前記尿素窒素測定用試薬にも関す
る。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。第一試薬
に含まれるα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）又はその塩
は、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、更に好ましくは、
１．０〜１０ｍＭの濃度の範囲で用いる。０．１ｍＭ未
満だとＵＮ値の高い検体で不足してしまい、５０ｍＭを
越えると溶解性が悪くなる。用いることのできるα−Ｋ
Ｇの塩は、グルタミン酸脱水素酵素の基質となるもので
ある限り特に限定されないが、例えば、アルカリ金属
（特にナトリウム、カリウム）との塩を用いるのが好ま
しい。

【０００８】第一試薬に含まれるグルタミン酸脱水素酵
素（ＧｌＤＨ）は、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ、更
に好ましくは、１０〜５０Ｕ／ｍｌの濃度の範囲で用い
る。１Ｕ／ｍｌ未満だと反応速度が遅くなり、１００Ｕ
／ｍｌを越えると、プロテアーゼや他の脱水素酵素のコ
ンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こること
がある。用いることのできるＧｌＤＨは、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを補酵素とし、α−ケトグルタル酸とアンモニアを基
質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体
的には、例えば、酵母やプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕ
ｓ）に属する微生物由来のＧｌＤＨを好適に使用するこ
とができる。

【０００９】第一試薬に含まれる還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）
は、好ましくは０．１〜１．０ｍＭ、更に好ましくは、
０．２〜０．５ｍＭの濃度の範囲で用いる。０．１ｍＭ
未満だとＵＮ値の高い検体で不足してしまい、１．０ｍ
Ｍを越えると吸光度が分光光度計の限界を越える。ＮＡ
ＤＨを補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤ
Ｈを用い、ＮＡＤＰＨを補酵素とするＧｌＤＨを使用す
る場合にはＮＡＤＰＨを用い、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを
両方共に補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨを用いる。

【００１０】第一試薬に、少なくとも一方、又は両方同
時に含まれる牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称す
る）及びアデノシン−５’−三リン酸（以下、ＡＴＰと
略称する）は、ＧｌＤＨを安定化させる作用がある。そ
れぞれ単独でも安定化作用があり、ＢＳＡとＡＴＰとを
共存させると相加的な効果を得ることができる。ＢＳＡ
を単独で用いる場合は、好ましくは０．０１重量％以
上、更に好ましくは０．１重量％〜１．０重量％の範囲
で用いることができる。０．０１重量％未満だとＧｌＤ
Ｈを安定化させる作用が不充分になり、１．０重量％を
越えると試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くな
いことがある。ＡＴＰを単独で用いる場合は、好ましく
は０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ〜５０ｍ
Ｍの範囲で用いることができる。０．１ｍＭ未満だとＧ
ｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、５０ｍＭを
越えると溶解性が悪くなることがある。ＢＳＡとＡＴＰ
とを共存させる場合には、好ましくはＢＳＡ０．００５
重量％以上とＡＴＰ０．０５ｍＭ以上、更に好ましくは
ＢＳＡ０．０５％〜１．０重量％とＡＴＰ０．２５ｍＭ
〜５０ｍＭの範囲で用いることができる。ＢＳＡが０．
００５重量％未満でＡＴＰが０．０５ｍＭ未満だとＧｌ
ＤＨを安定化させる作用が不充分になり、ＢＳＡが１．
０重量％を越え、ＡＴＰが５０ｍＭを越えると、試薬の
粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことや、溶解
性が悪くなることがある。

【００１１】第一試薬に含まれる緩衝液は、特に限定さ
れないが、ｐＨ８．５〜９．５の範囲の任意の緩衝液
を、測定条件に応じて選択することが可能である。例え
ば、トリエタノールアミン若しくはその塩酸塩、トリス
ヒドロキシメチルアミノメタン、又はグッド（Ｇｏｏ
ｄ’ｓ）緩衝液（例えば、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎ
ｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ）等の緩衝液を用
いることが可能であり、特に、トリエタノールアミン塩
酸塩が好ましい。

【００１２】また、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下、ＮＡＤと略称する）又は酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡ
ＤＰと略称する）を補酵素とする脱水素酵素及びその基
質の組合せを第一試薬に含ませることにより、保存期間
中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑えることができる。それ
らの組合せは特に限定されないが、例えば、グルコース
−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略称す
る）及びグルコース−６−リン酸（以下、Ｇ６Ｐと略称
する）又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム
塩、バリウム塩）、イソクエン酸脱水素酵素（以下、Ｉ
ＣＤＨと略称する）及びイソクエン酸又はその塩（例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩）、又はＧｌＤＨ及びＬ
−グルタミン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カ
リウム塩、塩酸塩）を用いることができる。ＮＡＤ又は
ＮＡＤＰ〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）と略称する〕を補酵素と
する脱水素酵素が、金属イオン等の補因子を必要とする
場合、適当な補因子を加えることが好ましい。例えば、
ＩＣＤＨ及びイソクエン酸又はその塩を用いる場合、マ
グネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオン
を加えることが好ましい。

【００１３】ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素及
び基質は、微量でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑制すること
ができる。例えば、Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐ又はその塩を
用いる場合、Ｇ６ＰＤＨ活性は、０．００１Ｕ／ｌ以上
でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に０．
０１Ｕ／ｌ〜１．０Ｕ／ｌが好ましい。Ｇ６Ｐ又はその
塩は、０．０５ｍＭ以上で効果があり、特に０．１ｍＭ
〜１０ｍＭが好ましい。Ｇ６ＰＤＨ活性が１．０Ｕ／ｌ
を越えると、検体試料中の尿素をウレアーゼによりアン
モニア生成させ、アンモニアの生成速度に対するＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。Ｇ６Ｐが１
０ｍＭを越えると、検体試料中の尿素をウレアーゼによ
りアンモニア生成させ、アンモニアの生成速度に対する
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。な
お、Ｇ６ＰＤＨとしては、Ｇ６Ｐ又はその塩を基質と
し、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするものである限り特に限
定されないが、例えば、酵母（ｙｅａｓｔ）、ロイコノ
ストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＧ６ＰＤＨを好適
に使用することができる。

【００１４】ＩＣＤＨ、マグネシウムイオン又はマンガ
ンイオンなどの金属イオン及びイソクエン酸又はその塩
を用いる場合、ＩＣＤＨ活性は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上
でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に０．
１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌが好ましい。金属イオンと
して塩化マグネシウムを用いる場合、０．１ｍＭ以上で
効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。
イソクエン酸又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果が
みられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。ＩＣＤ
Ｈ活性が１００Ｕ／ｌを越えるとプロテアーゼや他の脱
水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化
が起こることがあり、塩化マグネシウムが５０ｍＭを越
えると溶解性が悪くなることがあり、イソクエン酸又は
その塩が５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがあ
る。ＩＣＤＨ活性が高くなると、ＵＮ反応時のＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。この場合、
第２試薬にＩＣＤＨの活性が無くなるように阻害剤を添
加することができる。ＩＣＤＨ阻害剤としては、具体的
には、キレート剤（特開昭６２−６６９９号公報）、胆
汁酸又はその塩類（特開平６−７１６２号公報）を添加
することができる。なお、ＩＣＤＨとしては、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを補酵素とし、イソクエン酸又はその塩を基質
とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的
には、例えば、ウシ心臓等の動物組織や酵母由来のＩＣ
ＤＨを好適に使用することができる。

【００１５】ＧｌＤＨ及びＬ−グルタミン酸又はその塩
（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）を用いる場合、
ＧｌＤＨ活性は、０．１Ｕ／ｍｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の減少を抑える効果があり、特に１．０Ｕ／ｍｌ〜１０
０Ｕ／ｍｌが好ましい。Ｌ−グルタミン酸又はその塩
は、０．０５ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ
〜５０ｍＭが好ましい。ＧｌＤＨ活性が１００Ｕ／ｌを
越えるとプロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネー
ションによる、組成成分の劣化が起こることがあり、Ｌ
−グルタミン酸又はその塩が５０ｍＭを越えると溶解性
が悪くなることがある。なお、ＧｌＤＨとしては、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、α−ケトグルタル酸とアンモ
ニアを基質とするものであれば、由来は特に限定されな
い。具体的には、例えば、酵母やプロテウス属（Ｐｒｏ
ｔｅｕｓ）に属する微生物を好適に使用することができ
る。

【００１６】ウレアーゼを含有する第二試薬のｐＨは、
中性が好ましく、特にｐＨ６．０〜８．０が好ましい。
ｐＨが６．０未満や８．０より大きいと、ウレアーゼの
安定性は良くない。ウレアーゼ濃度は、好ましくは０．
１〜５．０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２．０Ｕ
／ｍｌの範囲で用いることができる。なお、ウレアーゼ
としては、尿素を加水分解し、アンモニアを生成するも
のである限り特に限定されないが、ナタマメやバクテリ
ア由来のものを用いることができる。また、必要に応じ
て、アセトヒドロキサム酸（以下、ＡＨＡと略称する）
（特公平２−２５５０９号公報）やＢＳＡを共存させて
ウレアーゼを更に安定化することができる。ＡＨＡやＢ
ＳＡはそれぞれ単独でも安定化作用があり、ＡＨＡとＢ
ＳＡとを共存させると相加的な効果を得ることができ
る。ＡＨＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１
〜１０ｍＭ、更に好ましくは０．１〜１ｍＭの範囲で用
いることができる。０．０１ｍＭ未満だとウレアーゼを
安定化する効果が不十分になることがあり、１０ｍＭを
越えるとウレアーゼの必要量が増え、コストの面で好ま
しくない。ＢＳＡを単独で用いる場合は、好ましくは
０．０１重量％以上、更に好ましくは０．１〜１重量％
の範囲で用いることができる。０．０１重量％未満だと
ウレアーゼを安定化する効果が不十分になることがあ
り、１重量％を越えると試薬の粘性が高くなり、反応の
再現性が良くないことや、溶解性が悪くなることがあ
る。更に、ＡＨＡとＢＳＡとを共存させる場合において
も、至適量はそれぞれ単独で用いる場合と同じ量であ
り、至適量からはずれたときの問題も同様に起こる。

【００１７】本発明の尿素窒素測定用試薬は、尿素をウ
レアーゼによってアンモニアに分解し、α−ケトグルタ
ル酸又はその塩及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸の存在下に、グルタミン酸脱水素酵素を作
用させ、前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸の減少量を測定することからなる尿素窒素測定法
の測定用試薬として用いることができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ＧｌＤＨ活性の残存率測定 表１に示した組成の本発明の尿素窒素測定用試薬の第一
試薬（以下、本発明第一試薬１と称する）、表１に示し
た組成からＧ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐを除いた本発明の尿素
窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬
２）、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ及びＡ
ＴＰを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬
（以下、本発明第一試薬３）、並びに表１に示した組成
からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ及びＢＳＡを除いた本発明の尿
素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬
４）を調製し、更に、比較のために、表１に示した組成
からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ、ＢＳＡ及びＡＴＰを除いた尿
素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、比較用第一試薬
１）を調製した。また、本発明の尿素窒素測定用試薬の
第二試薬を表２に示した組成に従って調製した。調製
後、それぞれの第一試薬及び第二試薬を溶液状態で１０
℃で保存し、調製直後、更に保存開始から１月後、２月
後、４月後及び６月後に、以下に示す方法により、それ
ぞれの第一試薬に残存するＧｌＤＨ活性を測定した。

【００１９】

【表１】 トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．２０） ５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３４ｍＭ ＧｌＤＨ ２０Ｕ／ｍｌ α−ＫＧ ５．０ｍＭ Ｇ６ＰＤＨ ０．１Ｕ／ｌ Ｇ６Ｐ １．０ｍＭ ＢＳＡ ０．２％ ＡＴＰ １．０ｍＭ ＮａＮ₃ ０．０５％

【００２０】

【表２】 トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．８０） ０．１Ｍ ウレアーゼ １．３Ｕ／ｍｌ ＡＨＡ ０．４ｍＭ ＢＳＡ ０．２％

【００２１】ＧｌＤＨ活性測定に用いるために、表３に
示した組成の試薬Ａ及び表４に示した組成の試薬Ｂを調
製した。

【００２２】

【表３】 トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．２０） ５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．４ｍＭ α−ＫＧ ５．０ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ １．０ｍＭ ＮａＮ₃ ０．０５％ （注：ＥＤＴＡ２Ｎａは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムである）

【００２３】

【表４】 トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．２０） ５０ｍＭ 塩化アンモニウム ５．０ｍＭ

【００２４】前記の試薬Ａ３２０μｌに、前記の第一試
薬２μｌを加え、３７℃で５分間加温した後、更に前記
の試薬Ｂ８０μｌを加えて、３４０ｎｍにおける１分間
当たりの吸光度変化を測定し、ＧｌＤＨ活性を求めた。
調製直後の吸光度変化を１００％とし、１０℃で１月、
２月、４月及び６月間保存した後のＧｌＤＨ活性の残存
率（％）を表５に示す。比較用第一試薬では、６月後に
ＧｌＤＨ活性が半分にまで減少したのに対し、本発明の
尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１
〜４では、ＧｌＤＨ活性の残存率ははるかに高かった。

【００２５】

【表５】 保存期間（月） ０ １ ２ ４ ６ 比較用第一試薬１ １００ ８７ ７４ ６３ ４９ 本発明第一試薬１ １００ ９８ ９７ ９４ ９１ 本発明第一試薬２ １００ ９８ ９５ ９３ ８７ 本発明第一試薬３ １００ ９７ ９４ ９２ ８２ 本発明第一試薬４ １００ ９２ ８６ ７５ ６９

【００２６】実施例２：ＮＡＤＰＨの残存率測定 前記実施例１で調製したそれぞれの第一試薬について、
３４０ｎｍの吸光度を測定し、ＮＡＤＰＨの残存量を求
めた。調製直後の吸光度を１００％とし、１０℃で１
月、２月、４月及び６月間保存した後のＮＡＤＰＨの残
存率（％）を表６に示す。比較用第一試薬では、６月後
にＮＡＤＰＨ残存量が６７％にまで減少したのに対し、
本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第
一試薬１〜４では、ＮＡＤＰＨの残存率は高かった。

【００２７】

【表６】 保存期間（月） ０ １ ２ ４ ６ 比較用第一試薬１ １００ ９３ ８８ ７８ ６７ 本発明第一試薬１ １００ ９７ ９５ ９４ ９１ 本発明第一試薬２ １００ ９２ ９０ ７９ ７０ 本発明第一試薬３ １００ ９６ ９４ ９２ ８９ 本発明第一試薬４ １００ ９７ ９４ ９０ ８８

【００２８】実施例３：ＵＮ量測定値の残存率 尿素窒素量が１５０ｍｇ／ｄｌである尿素水溶液を調製
し、被検試料として用いた。被験試料４μｌと前記実施
例１で調製した第一試薬３２０μｌとを攪拌混合し、３
７℃で５分間加温した後、前記実施例１で調製した第二
試薬８０μｌを添加し、３７℃で撹拌混合した。第二試
薬を添加して１分後から３分後の３４０ｎｍにおける１
分間当たりの吸光度変化を測定した。調製直後の吸光度
変化量を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び
６月間保存した後の吸光度変化量（％）を表７に示す。
比較用第一試薬では、６月後に吸光度変化量は半分以下
にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬
の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、吸光度変
化量ははるかに高かった。

【００２９】

【表７】 保存期間（月） ０ １ ２ ４ ６ 比較用第一試薬１ １００ ９５ ９１ ７８ ４４ 本発明第一試薬１ １００ ９７ ９５ ９４ ９１ 本発明第一試薬２ １００ ９８ ９６ ８７ ７９ 本発明第一試薬３ １００ ９６ ９４ ９１ ８９ 本発明第一試薬４ １００ ９６ ９３ ８９ ８５

【００３０】

【発明の効果】本発明の尿素窒素測定用試薬は、溶液状
態で、長期間安定に保存することができる。すなわち、
本発明によれば、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する溶液に、牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）及び／又はアデノシン−５’−三リン酸（Ａ
ＴＰ）を添加することにより、α−ＫＧ又はその塩、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを同時に液状で長期間安定
に保存することができる。また、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ
〔ＮＡＤ（Ｐ）〕を補酵素とする脱水素酵素及びその基
質を、更に添加することによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少
を抑えることができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも、（ａ）α−ケトグルタル酸
   又はその塩、（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドリン酸、（ｃ）グルタミン酸脱水素酵素、及び
   （ｄ）牛血清アルブミン及び／又はアデノシン−５’−
   三リン酸を含有する第一試薬と、 少なくとも、ウレアーゼを含有する第二試薬とからな
   り、それぞれ液状試薬であることを特徴とする尿素窒素
   測定用試薬。
2. 【請求項２】 第一試薬が、更に、酸化型ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とする脱水素酵素
   と、この脱水素酵素の基質とを含有する請求項１に記載
   の尿素窒素測定用試薬。