ES2272037T3

ES2272037T3 - Reactivo liquido para la deteccion de creatina cinasa.

Info

Publication number: ES2272037T3
Application number: ES99124783T
Authority: ES
Inventors: Gerhard Dr. Gunzer; Frank Dr. Kretzschmar; Katy Wrynn
Original assignee: Olympus Life and Material Science Europa GmbH
Current assignee: Olympus Life Science Research Europa GmbH
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2019-12-14
Also published as: EP1013774A3; EP1013774B8; JP2000189195A; US6306617B1; JP4558119B2; EP1013774B1; DE59913906D1; EP1013774A2

Abstract

Reactivo líquido para la detección de la actividad creatina cinasa, en el que al menos están contenidas las siguientes sustancias: G6PDH, hexoquinasa, fosfato de creatina, glucosa, ADP, NAD(P) y tioglicerol, estando repartidas las sustancias en dos preparaciones de reactivo separadas, y mezclándose las preparaciones de reactivo entre sí para la detección, caracterizado porque la G6PDH está contenida en una de las preparaciones y el tioglicerol está contenido en la otra preparación con al menos otra sustancia.

Description

Reactivo líquido para la detección de creatina cinasa.

La invención se refiere a un reactivo líquido según el preámbulo de la reivindicación 1.

La creatina cinasa en el cuerpo cataliza la fosforilación de creatina dependiente del ATP a fosfato de creatina (reacción directa e inversa). En el cuerpo, está presente, entre otros sitios, en el cerebro, en el músculo cardíaco y en la musculatura esquelética. En el caso de infarto de miocardio, existen valores elevados de creatina cinasa en el músculo cardíaco; en la musculatura esquelética, estos valores elevados indican enfermedades musculares (por ejemplo, distrofia muscular). Por ejemplo, la insuficiencia renal está acompañada de un incremento de la actividad creatina cinasa en el suero, etc.

Por ello, la actividad creatina cinasa es un parámetro importante en el análisis clínico y se determina de forma rutinaria.

Un sistema de detección usual para la actividad creatina cinasa funciona según el siguiente esquema de reacción:

Fosfato de creatina + ADP	^{creatina \ cinasa}	creatina + ATP
ATP + glucosa	^{hexoquinasa}	ADP + glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato + NAD(P)	^{G6PDH}	6-fosfogluconato + NAD(P)H

En esta detección, se determina la actividad creatina cinasa de forma indirecta mediante el contenido de NAD(P)H, por medición de la absorción a 340 nm.

Los reactivos líquidos tradicionales, con los que es posible una detección de creatina cinasa, por ejemplo, según el esquema mostrado anteriormente, contienen los sustratos, cosustratos y enzimas necesarios y, dado el caso, otras sustancias, por ejemplo, estabilizantes o bactericidas, etc. En muchos casos, los reactivos necesarios para las reacciones de detección se distribuyen en 2 preparaciones separadas, de tal manera que durante el almacenamiento no transcurran reacciones enzimáticas de degradación no deseadas. Para la detección, se mezclan las preparaciones de reactivo entre sí para formar el reactivo líquido (reactivo de ensayo) y sólo entonces comienzan las reacciones de detección, dependiendo de la actividad creatina cinasa en la muestra examinada.

El procedimiento de detección descrito es relativamente fiable y es la base de muchos ensayos de la actividad creatina cinasa.

Sin embargo es un problema que la creatina cinasa, por ejemplo en el suero sea inactivada rápidamente. Por este motivo, los reactivos líquidos genéricos contienen un reactivante para la creatina cinasa. Como reactivante, se añaden componentes que contienen grupos SH, habitualmente N-acetilcisteína (en lo sucesivo, abreviada NAC), porque es apropiada para la liofilización.

Sin embargo, en la bibliografía se valora la NAC como reactivante apropiado sólo de forma condicionada (Morin, CLINICAL CHEMISTRY, vol. 23, Nº 9, septiembre de 1977, páginas 1569-1575). En particular se demostró que el efecto de la NAC como reactivante disminuye después de un almacenamiento prolongado por la formación de inhibidores, por lo que en algunos sistemas de detección conocidos que contienen NAC se prevén sustancias especiales para estabilizar la NAC.

Por ello, en la publicación citada se recomiendan otros reactivantes, en particular, tioglicerol, al que se atribuye un rendimiento reactivante y una estabilidad de almacenamiento notablemente aumentados en comparación con los de la NAC.

Sin embargo, en investigaciones de la solicitante, se demostró que tampoco está exento de problemas el uso del tioglicerol en reactivos líquidos para la detección de la creatina cinasa, en particular, en cuanto a la estabilidad.

Por ello, en reactivos líquidos conocidos, preponderantemente se usa el tioglicerol por separado. Así, el documento DE 3138602 da a conocer un reactivo líquido con dos preparaciones de reactivo, de las cuales, una preparación de reactivo esencialmente es un tampón de tioglicerol. En esta preparación, el tioglicerol no está previsto como reactivante. Más bien, la preparación de reactivo que contiene tioglicerol se añade a una muestra, antes del análisis propiamente dicho, para eliminar turbidez. La muestra aclarada entonces se mezcla con la segunda preparación de reactivo, la preparación de reactivo, que contiene el reactivo de detección propiamente dicho.

El documento WO 95/30769 describe un reactivo líquido, del cual una preparación sirve como solución de activador y contiene tioglicerol como componente principal. Las otras sustancias necesarias para la detección están contenidas en las otras preparaciones de reactivo. En el reactivo líquido descrito, se logra una estabilidad mejorada del tioglicerol. Sin embargo, mediante una preparación adicional (normalmente, el reactivo líquido conocido está constituido en total por tres preparaciones separadas), se dificulta la manipulación.

Por ello, el objetivo de la invención es crear un reactivo líquido del tipo nombrado al comienzo de la descripción, que contenga tioglicerol como reactivante, sea estable durante un tiempo prolongado, y que posibilite una detección poco costosa.

Se alcanza el objetivo mediante un reactivo que presenta las propiedades caracterizadoras de la reivindicación 1.

Por tanto, está previsto un reactivo líquido para la detección de la actividad creatina cinasa que contiene las siguientes sustancias: glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (en lo sucesivo, abreviada G6PDH), hexoquinasa, fosfato de creatina, glucosa, ADP, NAD(P) y tioglicerol, estando, según la invención, separadas las sustancias en dos preparaciones de reactivo, de tal manera que el tioglicerol, y al menos otra sustancia, estén contenidos en una preparación, y la G6PDH y sustancias eventualmente remanentes, estén contenidas en la otra preparación de reactivo.

Se demostró que mediante la separación según la invención de la G6PDH del tioglicerol y, dado el caso, otras sustancias usadas habitualmente como NADP, glucosa, hexoquinasa, ADP, AMP o MG, puede aumentarse significativamente la estabilidad de almacenamiento de ambas preparaciones de reactivo, y con ello, del reactivo líquido en total.

Otras configuraciones de la invención, se citan en las reivindicaciones subordinadas.

En vista de que la estabilidad de al menos algunas de las sustancias contenidas en el reactivo líquido depende del valor de pH, otra configuración prevé que las preparaciones de reactivo presenten diferentes valores de pH. Con una distribución correspondiente de las sustancias en las preparaciones de esta manera puede optimizarse la estabilidad de almacenamiento.

A este respecto, preferentemente, una de las preparaciones de reactivo se ajusta a un valor de pH débilmente básico en un intervalo de entre 8,0 y 10,0 (medido a 20ºC), mientras que la otra preparación de reactivo presenta un valor de pH de entre 5,5 y 7,0. Basado en esto, otra configuración prevé que se añadan G6PDH y/o ADP convenientemente a la preparación débilmente básica, ya que estas sustancias son más estables a valores más elevados de
pH.

Preferentemente, se eligen de tal manera los valores de pH y las relaciones de las cantidades de las preparaciones de reactivo, que después de mezclar éstas, resulte un valor de pH de aproximadamente 6,0 - 7,0, en particular, de 6,5, en el reactivo líquido terminado (reactivo de ensayo).

Resulta especialmente ventajoso, en este contexto, que se prevea en una de las preparaciones de reactivo un tampón anfótero, con un valor de pK que se encuentre en los valores de pH de entre 8,0 y 10,0, y cuyo otro valor de pK se encuentre entre aproximadamente 5,5 y 7,0. Durante el almacenamiento, este tampón ajusta la preparación de reactivo a un valor de pH básico y, después de mezclar con la otra preparación de reactivo, ajusta el valor de pH deseado para la detección, de 6,0 - 7,0, en particular, de 6,5. Al usar un tampón anfótero, por ejemplo, un tampón de bis-tris-propano, con valores de pK que se encuentran en el intervalo de los valores de pH indicados anteriormente, puede reducirse el volumen del tampón en comparación con el uso de tampones habituales conocidos.

Además, se constató que la G6PDH usada tradicionalmente, en presencia de glucosa y NAD(P) muestra reacciones no deseadas. Por esto, otra configuración ventajosa de la invención prevé que las tres sustancias nombradas no estén previstas para estar juntas en una preparación de reactivo.

Otro problema se refiere a la estabilidad del tioglicerol. Las proteínas usadas tradicionalmente para la estabilización de enzimas y de compuestos que contienen SH como, por ejemplo, BSA o gelatina en el caso del tioglicerol más bien conducen a una reducción de la estabilidad. Por ello, en lugar de proteínas, preferentemente, se añaden derivados de azúcares como, por ejemplo, manitol o polietilenglicol 6000, o también compuestos de alquilo de cadena larga, que pueden adquirirse con el nombre comercial Synperonic, que conservan la estabilidad de las enzimas auxiliares (hexoquinasa y G6PDH), y no contienen componentes que degraden al tioglicerol.

Además, se ha demostrado, que la hexoquinasa se estabiliza por la presencia de glucosa. Por ello, estas dos sustancias se prevén preferentemente en una preparación de reactivo.

El reactivo según la invención puede contener otras sustancias como, por ejemplo, EDTA, como protector contra la oxidación, NaN_{3} y sulfato de gentamicina como aditivos bactericidas y/o fungicidas. Además, pueden añadirse AMP y AP_{5}A, que como inhibidores competitivos de la adenilato cinasa contribuyen a reducir el riesgo de señales falsas positivas. Además, puede estar contenido acetato de magnesio, que con el ADP forma un complejo previo, y de esta manera, aumenta la actividad de la creatina cinasa.

En la preparación que no contiene tioglicerol, finalmente, puede preverse otra proteína, por ejemplo, gelatina o BSA, para estabilizar la G6PDH.

Finalmente, la invención no está limitada al uso exclusivo de tioglicerol. También es posible prever adicionalmente otros reactivantes, por ejemplo la NAC, nombrada al comienzo de esta descripción.

Reactivos de detección que pueden usarse según la invención pueden presentar, por ejemplo, las siguientes composiciones:

Preparación de reactivo 1

	Concentración preferida	Intervalo posible de
	en la preparación	concentraciones

Tampón imidazol	82 mmol/l	50 - 150 mmol/l
EDTA	2,5 mmol/l	2 - 3 mmol/l
Glucosa	25 mmol/l	20 - 50 mmol/l
Acetato de
magnesio	12,5 mmol/l	10 - 15 mmol/l
AMP	6,5 mmol/l	5 - 10 mmol/l
AP_{5}A	0,013 mmol/l	0,01 - 0,05 mmol/l
NADP	2,5 mmol/l	2 - 5 mmol/l
NaN_{3}	0,095%
Sulfato de gentamicina	0,005%
PEG 6000	2,0%	0,5 - 5%
Manitol	1,0%	1 - 5%
Synperonic	0,1%	0,05 - 0,2%
Hexoquinasa	7,5 kU/l	3 - 10 kU/l
Tioglicerol	26 mmol/l	20 - 100 mmol/l
NAC	0,2 mmol/l	0 - 2,0 mmol/l

Se ajusta el valor de pH a 6,20 \pm 0,20, a 20ºC.

Preparación de reactivo 2

G6P-DH	20 kU/l	10 - 30 kU/l
Bis-tris-propano	70 mmol/l	50 - 100 mmol/l
CP	50 mmol/l	30 - 70 mmol/l
ADP	5 mmol/l	3 - 6 mmol/l
NaN_{3}	0,095%
Sulfato de gentamicina	0,005%
Gelatina	0,2%	0,1 - 0,5%
Manitol	1%	1 - 5%
Synperonic	0,1%	0,05 - 0,2%

Se ajusta el valor de pH a 9,20 \pm 0,20, a 20ºC.

Se mezclan las preparaciones de reactivo entre sí, en la relación 4 + 1 (4 partes de la preparación de reactivo 1 + 1 parte de la preparación de reactivo 2), para preparar el reactivo para ensayo.

Los datos anteriores se refieren a una realización preferida del reactivo según la invención. Se entiende, que la invención también abarca otras composiciones, que contengan menos u otras sustancias, por ejemplo, otros tampones o reactivos estabilizantes, etc.

Claims

1. Reactivo líquido para la detección de la actividad creatina cinasa, en el que al menos están contenidas las siguientes sustancias: G6PDH, hexoquinasa, fosfato de creatina, glucosa, ADP, NAD(P) y tioglicerol, estando repartidas las sustancias en dos preparaciones de reactivo separadas, y mezclándose las preparaciones de reactivo entre sí para la detección, caracterizado porque la G6PDH está contenida en una de las preparaciones y el tioglicerol está contenido en la otra preparación con al menos otra sustancia.

2. Reactivo según la reivindicación 1, caracterizado porque una de las preparaciones de reactivo está ajustada a un valor de pH débilmente ácido de entre 5,5 y 7,0, y la otra preparación de reactivo está ajustada a un valor de pH débilmente básico de entre 8,0 y 10,0.

3. Reactivo según la reivindicación 2, caracterizado porque las relaciones de las cantidades y los valores de pH de las preparaciones de reactivo están seleccionados de tal manera que después de mezclar las preparaciones, en el reactivo de ensayo resulte un valor de pH en un intervalo de 6,0 - 7,0, en particular, de aproximadamente 6,5.

4. Reactivo según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque en la preparación básica de reactivo está previsto un tampón anfótero, cuyo un valor de pK se encuentra en valores de entre pH 8,0 y 10,0, y cuyo otro valor de pK se encuentra en valores de pH de entre 5,5 y 7,0.

5. Reactivo según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la G6PDH y el ADP están previstos para ser añadidos a la preparación con el valor de pH básico.

6. Reactivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el NAD(P), la glucosa y la G6PDH no están previstos conjuntamente en una preparación.

7. Reactivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la glucosa y la hexoquinasa están previstas en una preparación de reactivo.