ES2272037T3 - Reactivo liquido para la deteccion de creatina cinasa. - Google Patents
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Abstract
Reactivo líquido para la detección de la actividad creatina cinasa, en el que al menos están contenidas las siguientes sustancias: G6PDH, hexoquinasa, fosfato de creatina, glucosa, ADP, NAD(P) y tioglicerol, estando repartidas las sustancias en dos preparaciones de reactivo separadas, y mezclándose las preparaciones de reactivo entre sí para la detección, caracterizado porque la G6PDH está contenida en una de las preparaciones y el tioglicerol está contenido en la otra preparación con al menos otra sustancia.
Description
Reactivo líquido para la detección de creatina
cinasa.
La invención se refiere a un reactivo líquido
según el preámbulo de la reivindicación 1.
La creatina cinasa en el cuerpo cataliza la
fosforilación de creatina dependiente del ATP a fosfato de creatina
(reacción directa e inversa). En el cuerpo, está presente, entre
otros sitios, en el cerebro, en el músculo cardíaco y en la
musculatura esquelética. En el caso de infarto de miocardio, existen
valores elevados de creatina cinasa en el músculo cardíaco; en la
musculatura esquelética, estos valores elevados indican enfermedades
musculares (por ejemplo, distrofia muscular). Por ejemplo, la
insuficiencia renal está acompañada de un incremento de la
actividad creatina cinasa en el suero, etc.
Por ello, la actividad creatina cinasa es un
parámetro importante en el análisis clínico y se determina de forma
rutinaria.
Un sistema de detección usual para la actividad
creatina cinasa funciona según el siguiente esquema de reacción:
| Fosfato de creatina + ADP | ^{creatina \ cinasa} | creatina + ATP |
| ATP + glucosa | ^{hexoquinasa} | ADP + glucosa-6-fosfato |
| Glucosa-6-fosfato + NAD(P) | ^{G6PDH} | 6-fosfogluconato + NAD(P)H |
En esta detección, se determina la actividad
creatina cinasa de forma indirecta mediante el contenido de
NAD(P)H, por medición de la absorción a 340 nm.
Los reactivos líquidos tradicionales, con los
que es posible una detección de creatina cinasa, por ejemplo, según
el esquema mostrado anteriormente, contienen los sustratos,
cosustratos y enzimas necesarios y, dado el caso, otras sustancias,
por ejemplo, estabilizantes o bactericidas, etc. En muchos casos,
los reactivos necesarios para las reacciones de detección se
distribuyen en 2 preparaciones separadas, de tal manera que durante
el almacenamiento no transcurran reacciones enzimáticas de
degradación no deseadas. Para la detección, se mezclan las
preparaciones de reactivo entre sí para formar el reactivo líquido
(reactivo de ensayo) y sólo entonces comienzan las reacciones de
detección, dependiendo de la actividad creatina cinasa en la muestra
examinada.
El procedimiento de detección descrito es
relativamente fiable y es la base de muchos ensayos de la actividad
creatina cinasa.
Sin embargo es un problema que la creatina
cinasa, por ejemplo en el suero sea inactivada rápidamente. Por
este motivo, los reactivos líquidos genéricos contienen un
reactivante para la creatina cinasa. Como reactivante, se añaden
componentes que contienen grupos SH, habitualmente
N-acetilcisteína (en lo sucesivo, abreviada NAC),
porque es apropiada para la liofilización.
Sin embargo, en la bibliografía se valora la
NAC como reactivante apropiado sólo de forma condicionada (Morin,
CLINICAL CHEMISTRY, vol. 23, Nº 9, septiembre de 1977, páginas
1569-1575). En particular se demostró que el efecto
de la NAC como reactivante disminuye después de un almacenamiento
prolongado por la formación de inhibidores, por lo que en algunos
sistemas de detección conocidos que contienen NAC se prevén
sustancias especiales para estabilizar la NAC.
Por ello, en la publicación citada se
recomiendan otros reactivantes, en particular, tioglicerol, al que
se atribuye un rendimiento reactivante y una estabilidad de
almacenamiento notablemente aumentados en comparación con los de la
NAC.
Sin embargo, en investigaciones de la
solicitante, se demostró que tampoco está exento de problemas el uso
del tioglicerol en reactivos líquidos para la detección de la
creatina cinasa, en particular, en cuanto a la estabilidad.
Por ello, en reactivos líquidos conocidos,
preponderantemente se usa el tioglicerol por separado. Así, el
documento DE 3138602 da a conocer un reactivo líquido con dos
preparaciones de reactivo, de las cuales, una preparación de
reactivo esencialmente es un tampón de tioglicerol. En esta
preparación, el tioglicerol no está previsto como reactivante. Más
bien, la preparación de reactivo que contiene tioglicerol se añade a
una muestra, antes del análisis propiamente dicho, para eliminar
turbidez. La muestra aclarada entonces se mezcla con la segunda
preparación de reactivo, la preparación de reactivo, que contiene el
reactivo de detección propiamente dicho.
El documento WO 95/30769 describe un reactivo
líquido, del cual una preparación sirve como solución de activador
y contiene tioglicerol como componente principal. Las otras
sustancias necesarias para la detección están contenidas en las
otras preparaciones de reactivo. En el reactivo líquido descrito, se
logra una estabilidad mejorada del tioglicerol. Sin embargo,
mediante una preparación adicional (normalmente, el reactivo líquido
conocido está constituido en total por tres preparaciones
separadas), se dificulta la manipulación.
Por ello, el objetivo de la invención es crear
un reactivo líquido del tipo nombrado al comienzo de la descripción,
que contenga tioglicerol como reactivante, sea estable durante un
tiempo prolongado, y que posibilite una detección poco costosa.
Se alcanza el objetivo mediante un reactivo que
presenta las propiedades caracterizadoras de la reivindicación
1.
Por tanto, está previsto un reactivo líquido
para la detección de la actividad creatina cinasa que contiene las
siguientes sustancias:
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (en
lo sucesivo, abreviada G6PDH), hexoquinasa, fosfato de creatina,
glucosa, ADP, NAD(P) y tioglicerol, estando, según la
invención, separadas las sustancias en dos preparaciones de
reactivo, de tal manera que el tioglicerol, y al menos otra
sustancia, estén contenidos en una preparación, y la G6PDH y
sustancias eventualmente remanentes, estén contenidas en la otra
preparación de reactivo.
Se demostró que mediante la separación según la
invención de la G6PDH del tioglicerol y, dado el caso, otras
sustancias usadas habitualmente como NADP, glucosa, hexoquinasa,
ADP, AMP o MG, puede aumentarse significativamente la estabilidad
de almacenamiento de ambas preparaciones de reactivo, y con ello,
del reactivo líquido en total.
Otras configuraciones de la invención, se citan
en las reivindicaciones subordinadas.
En vista de que la estabilidad de al menos
algunas de las sustancias contenidas en el reactivo líquido depende
del valor de pH, otra configuración prevé que las preparaciones de
reactivo presenten diferentes valores de pH. Con una distribución
correspondiente de las sustancias en las preparaciones de esta
manera puede optimizarse la estabilidad de almacenamiento.
A este respecto, preferentemente, una de las
preparaciones de reactivo se ajusta a un valor de pH débilmente
básico en un intervalo de entre 8,0 y 10,0 (medido a 20ºC), mientras
que la otra preparación de reactivo presenta un valor de pH de
entre 5,5 y 7,0. Basado en esto, otra configuración prevé que se
añadan G6PDH y/o ADP convenientemente a la preparación débilmente
básica, ya que estas sustancias son más estables a valores más
elevados de
pH.
pH.
Preferentemente, se eligen de tal manera los
valores de pH y las relaciones de las cantidades de las
preparaciones de reactivo, que después de mezclar éstas, resulte un
valor de pH de aproximadamente 6,0 - 7,0, en particular, de 6,5, en
el reactivo líquido terminado (reactivo de ensayo).
Resulta especialmente ventajoso, en este
contexto, que se prevea en una de las preparaciones de reactivo un
tampón anfótero, con un valor de pK que se encuentre en los valores
de pH de entre 8,0 y 10,0, y cuyo otro valor de pK se encuentre
entre aproximadamente 5,5 y 7,0. Durante el almacenamiento, este
tampón ajusta la preparación de reactivo a un valor de pH básico y,
después de mezclar con la otra preparación de reactivo, ajusta el
valor de pH deseado para la detección, de 6,0 - 7,0, en particular,
de 6,5. Al usar un tampón anfótero, por ejemplo, un tampón de
bis-tris-propano, con valores de pK
que se encuentran en el intervalo de los valores de pH indicados
anteriormente, puede reducirse el volumen del tampón en comparación
con el uso de tampones habituales conocidos.
Además, se constató que la G6PDH usada
tradicionalmente, en presencia de glucosa y NAD(P) muestra
reacciones no deseadas. Por esto, otra configuración ventajosa de
la invención prevé que las tres sustancias nombradas no estén
previstas para estar juntas en una preparación de reactivo.
Otro problema se refiere a la estabilidad del
tioglicerol. Las proteínas usadas tradicionalmente para la
estabilización de enzimas y de compuestos que contienen SH como,
por ejemplo, BSA o gelatina en el caso del tioglicerol más bien
conducen a una reducción de la estabilidad. Por ello, en lugar de
proteínas, preferentemente, se añaden derivados de azúcares como,
por ejemplo, manitol o polietilenglicol 6000, o también compuestos
de alquilo de cadena larga, que pueden adquirirse con el nombre
comercial Synperonic, que conservan la estabilidad de las enzimas
auxiliares (hexoquinasa y G6PDH), y no contienen componentes que
degraden al tioglicerol.
Además, se ha demostrado, que la hexoquinasa se
estabiliza por la presencia de glucosa. Por ello, estas dos
sustancias se prevén preferentemente en una preparación de
reactivo.
El reactivo según la invención puede contener
otras sustancias como, por ejemplo, EDTA, como protector contra la
oxidación, NaN_{3} y sulfato de gentamicina como aditivos
bactericidas y/o fungicidas. Además, pueden añadirse AMP y
AP_{5}A, que como inhibidores competitivos de la adenilato cinasa
contribuyen a reducir el riesgo de señales falsas positivas.
Además, puede estar contenido acetato de magnesio, que con el ADP
forma un complejo previo, y de esta manera, aumenta la actividad de
la creatina cinasa.
En la preparación que no contiene tioglicerol,
finalmente, puede preverse otra proteína, por ejemplo, gelatina o
BSA, para estabilizar la G6PDH.
Finalmente, la invención no está limitada al uso
exclusivo de tioglicerol. También es posible prever adicionalmente
otros reactivantes, por ejemplo la NAC, nombrada al comienzo de esta
descripción.
Reactivos de detección que pueden usarse según
la invención pueden presentar, por ejemplo, las siguientes
composiciones:
| Concentración preferida | Intervalo posible de | |
| en la preparación | concentraciones | |
| Tampón imidazol | 82 mmol/l | 50 - 150 mmol/l |
| EDTA | 2,5 mmol/l | 2 - 3 mmol/l |
| Glucosa | 25 mmol/l | 20 - 50 mmol/l |
| Acetato de | ||
| magnesio | 12,5 mmol/l | 10 - 15 mmol/l |
| AMP | 6,5 mmol/l | 5 - 10 mmol/l |
| AP_{5}A | 0,013 mmol/l | 0,01 - 0,05 mmol/l |
| NADP | 2,5 mmol/l | 2 - 5 mmol/l |
| NaN_{3} | 0,095% | |
| Sulfato de gentamicina | 0,005% | |
| PEG 6000 | 2,0% | 0,5 - 5% |
| Manitol | 1,0% | 1 - 5% |
| Synperonic | 0,1% | 0,05 - 0,2% |
| Hexoquinasa | 7,5 kU/l | 3 - 10 kU/l |
| Tioglicerol | 26 mmol/l | 20 - 100 mmol/l |
| NAC | 0,2 mmol/l | 0 - 2,0 mmol/l |
| Se ajusta el valor de pH a 6,20 \pm 0,20, a 20ºC. |
| G6P-DH | 20 kU/l | 10 - 30 kU/l |
| Bis-tris-propano | 70 mmol/l | 50 - 100 mmol/l |
| CP | 50 mmol/l | 30 - 70 mmol/l |
| ADP | 5 mmol/l | 3 - 6 mmol/l |
| NaN_{3} | 0,095% | |
| Sulfato de gentamicina | 0,005% | |
| Gelatina | 0,2% | 0,1 - 0,5% |
| Manitol | 1% | 1 - 5% |
| Synperonic | 0,1% | 0,05 - 0,2% |
| Se ajusta el valor de pH a 9,20 \pm 0,20, a 20ºC. |
Se mezclan las preparaciones de reactivo entre
sí, en la relación 4 + 1 (4 partes de la preparación de reactivo 1
+ 1 parte de la preparación de reactivo 2), para preparar el
reactivo para ensayo.
Los datos anteriores se refieren a una
realización preferida del reactivo según la invención. Se entiende,
que la invención también abarca otras composiciones, que contengan
menos u otras sustancias, por ejemplo, otros tampones o reactivos
estabilizantes, etc.
Claims (7)
1. Reactivo líquido para la detección de la
actividad creatina cinasa, en el que al menos están contenidas las
siguientes sustancias: G6PDH, hexoquinasa, fosfato de creatina,
glucosa, ADP, NAD(P) y tioglicerol, estando repartidas las
sustancias en dos preparaciones de reactivo separadas, y mezclándose
las preparaciones de reactivo entre sí para la detección,
caracterizado porque la G6PDH está contenida en una de las
preparaciones y el tioglicerol está contenido en la otra
preparación con al menos otra sustancia.
2. Reactivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque una de las preparaciones de reactivo
está ajustada a un valor de pH débilmente ácido de entre 5,5 y 7,0,
y la otra preparación de reactivo está ajustada a un valor de pH
débilmente básico de entre 8,0 y 10,0.
3. Reactivo según la reivindicación 2,
caracterizado porque las relaciones de las cantidades y los
valores de pH de las preparaciones de reactivo están seleccionados
de tal manera que después de mezclar las preparaciones, en el
reactivo de ensayo resulte un valor de pH en un intervalo de 6,0 -
7,0, en particular, de aproximadamente 6,5.
4. Reactivo según una de las reivindicaciones
2 ó 3, caracterizado porque en la preparación básica de
reactivo está previsto un tampón anfótero, cuyo un valor de pK se
encuentra en valores de entre pH 8,0 y 10,0, y cuyo otro valor de
pK se encuentra en valores de pH de entre 5,5 y 7,0.
5. Reactivo según una de las reivindicaciones
2 a 4, caracterizado porque la G6PDH y el ADP están previstos
para ser añadidos a la preparación con el valor de pH básico.
6. Reactivo según una de las reivindicaciones
1 a 5, caracterizado porque el NAD(P), la glucosa y la
G6PDH no están previstos conjuntamente en una preparación.
7. Reactivo según una de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizado porque la glucosa y la hexoquinasa están
previstas en una preparación de reactivo.
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