JPH11196899A - クレアチンキナーゼ測定のための方法及び試薬 - Google Patents
クレアチンキナーゼ測定のための方法及び試薬Info
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- JPH11196899A JPH11196899A JP31377298A JP31377298A JPH11196899A JP H11196899 A JPH11196899 A JP H11196899A JP 31377298 A JP31377298 A JP 31377298A JP 31377298 A JP31377298 A JP 31377298A JP H11196899 A JPH11196899 A JP H11196899A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 クレアチンリン酸とＡＤＰからのＡＴＰ
の生成,、及びグルコースと異なるヘキソース、好適な
ヘキソキナーゼ及びヘキソース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼの存在下で生成したＡＴＰの検出、及び場
合によって更にこれに続く反応による、生物学的試料物
質中におけるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の光学的、酵
素的測定のための方法または試薬の提供。 【効果】 本発明によれば、顕著な機能低下なしに２か
ら８℃で１２カ月まで安定な液状のクレアチニン測定用
試薬が提供される。
の生成,、及びグルコースと異なるヘキソース、好適な
ヘキソキナーゼ及びヘキソース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼの存在下で生成したＡＴＰの検出、及び場
合によって更にこれに続く反応による、生物学的試料物
質中におけるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の光学的、酵
素的測定のための方法または試薬の提供。 【効果】 本発明によれば、顕著な機能低下なしに２か
ら８℃で１２カ月まで安定な液状のクレアチニン測定用
試薬が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特にヒト血清また
は血漿のような生物学的試料中のクレアチンキナーゼの
光学的測定のための改良方法及び安定化された試薬に関
する。本方法及び試薬は酵素的にリン酸化され得、グル
コースと異なるヘキソースが存在することを必須の特徴
とする。
は血漿のような生物学的試料中のクレアチンキナーゼの
光学的測定のための改良方法及び安定化された試薬に関
する。本方法及び試薬は酵素的にリン酸化され得、グル
コースと異なるヘキソースが存在することを必須の特徴
とする。
【０００２】
【従来の技術】血清または血漿中のクレアチンキナーゼ
の測定は心筋梗塞の診断において重要な役割を果たして
いる。このための標準的な方法として、共役した酵素反
応でクレアチンリン酸とアデノシン−５'−二リン酸
（ＡＤＰ）から試料中に存在するクレアチンキナーゼ
（ＣＫ）によってクレアチンとアデノシン−５'−三リ
ン酸（ＡＴＰ）が生成し；グルコースとＡＴＰからヘキ
ソキナーゼ（ＨＫ）の存在下でグルコース−６−リン酸
が生成し、これがＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+がＮＡＤＨま
たはＮＡＤＰＨに同時に変換するグルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ−ＤＨ）触媒反応で
グルコン酸−６−リン酸に酸化される光学的試験が使用
されている。
の測定は心筋梗塞の診断において重要な役割を果たして
いる。このための標準的な方法として、共役した酵素反
応でクレアチンリン酸とアデノシン−５'−二リン酸
（ＡＤＰ）から試料中に存在するクレアチンキナーゼ
（ＣＫ）によってクレアチンとアデノシン−５'−三リ
ン酸（ＡＴＰ）が生成し；グルコースとＡＴＰからヘキ
ソキナーゼ（ＨＫ）の存在下でグルコース−６−リン酸
が生成し、これがＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+がＮＡＤＨま
たはＮＡＤＰＨに同時に変換するグルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ−ＤＨ）触媒反応で
グルコン酸−６−リン酸に酸化される光学的試験が使用
されている。
【０００３】
【数１】
【０００４】測定量はある温度、通常２５から３７℃の
間で予め決められた時間内に生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈで
誘起される吸光度の増加であり、これは試料体積中のＣ
Ｋ活性に比例する。測定は好ましくはチオール化合物の
ようなＣＫ活性化剤、特にＮ−アセチルシステインの存
在下で実施し、ＣＫがその酵素活性を十分発揮できるよ
うにする。
間で予め決められた時間内に生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈで
誘起される吸光度の増加であり、これは試料体積中のＣ
Ｋ活性に比例する。測定は好ましくはチオール化合物の
ようなＣＫ活性化剤、特にＮ−アセチルシステインの存
在下で実施し、ＣＫがその酵素活性を十分発揮できるよ
うにする。
【０００５】更に、アデノシン−５'−一リン酸（ＡＭ
Ｐ）及び／またはジアデノシン−五リン酸のような、試
料中に存在し得るアデニレートキナーゼの阻害剤を好ま
しくはＣＫ試験のための基準試薬中に更に添加する。そ
うしなければＡＴＰは次の反応によって非特異的にＡＤ
Ｐから生成し得る：
Ｐ）及び／またはジアデノシン−五リン酸のような、試
料中に存在し得るアデニレートキナーゼの阻害剤を好ま
しくはＣＫ試験のための基準試薬中に更に添加する。そ
うしなければＡＴＰは次の反応によって非特異的にＡＤ
Ｐから生成し得る：
【０００６】
【数２】
【０００７】この反応によって余分にＮＡＤ（Ｐ）Ｈが
生成し、これがＣＫ測定を誤ったものとさせる。クレア
チンキナーゼアイソザイムの測定のためには、特殊なＣ
Ｋアイソザイムに対する抗体のような特異的阻害剤を更
に添加することも可能である。検出感度を上げるため
に、試薬に６−ホスホグルコノラクトナーゼ及びグルコ
ネート−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを任意に含
有させることもできる；この場合、生成したＡＴＰまた
はグルコース−６−リン酸１モルあたり２モルのＮＡＤ
ＨまたはＮＡＤＰＨが生成する（R.Vormbrock及びR.Hel
ger, Enzyme38,追補 1(1987), p.20/21）。
生成し、これがＣＫ測定を誤ったものとさせる。クレア
チンキナーゼアイソザイムの測定のためには、特殊なＣ
Ｋアイソザイムに対する抗体のような特異的阻害剤を更
に添加することも可能である。検出感度を上げるため
に、試薬に６−ホスホグルコノラクトナーゼ及びグルコ
ネート−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを任意に含
有させることもできる；この場合、生成したＡＴＰまた
はグルコース−６−リン酸１モルあたり２モルのＮＡＤ
ＨまたはＮＡＤＰＨが生成する（R.Vormbrock及びR.Hel
ger, Enzyme38,追補 1(1987), p.20/21）。
【０００８】原理的には、ＣＫ測定のために必要な全て
の成分、例えば酵素及び基質は単一の試薬中に存在させ
得る。しかしながら、分析器においては、測定は好まし
くはまずクレアチンリン酸及び、Ｎ−アセチルシステイ
ン、アデニレートキナーゼ阻害剤及び任意のＣＫアイソ
ザイム阻害剤のような添加可能な補助物質を除き、検出
反応に必要な全成分を含有する第一の部分試薬で試料を
数分間プレインキュベートして行うのが好ましく、次い
で緩衝溶液中にクレアチンリン酸を必須に含有する第二
の部分試薬の添加によって検出反応を開始させる。
の成分、例えば酵素及び基質は単一の試薬中に存在させ
得る。しかしながら、分析器においては、測定は好まし
くはまずクレアチンリン酸及び、Ｎ−アセチルシステイ
ン、アデニレートキナーゼ阻害剤及び任意のＣＫアイソ
ザイム阻害剤のような添加可能な補助物質を除き、検出
反応に必要な全成分を含有する第一の部分試薬で試料を
数分間プレインキュベートして行うのが好ましく、次い
で緩衝溶液中にクレアチンリン酸を必須に含有する第二
の部分試薬の添加によって検出反応を開始させる。
【０００９】添加したチオール化合物の存在下で酵素が
活性化される相でＣＫによって生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生
成を回避することと別に、この方法はまた、例えば溶血
した試料中で生じ得るアデニレートキナーゼ阻害剤によ
って適当に阻害され得ないアデニレートキナーゼ活性の
増加による測定結果の誤りを防ぐことを可能とする。こ
の目的のために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成速度の第一の測定
を試料と第一の部分試薬の混合後に行い、その結果をク
レアチンリン酸を含有する第二の部分試薬の添加後のＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ生成速度から差し引く。
活性化される相でＣＫによって生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生
成を回避することと別に、この方法はまた、例えば溶血
した試料中で生じ得るアデニレートキナーゼ阻害剤によ
って適当に阻害され得ないアデニレートキナーゼ活性の
増加による測定結果の誤りを防ぐことを可能とする。こ
の目的のために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成速度の第一の測定
を試料と第一の部分試薬の混合後に行い、その結果をク
レアチンリン酸を含有する第二の部分試薬の添加後のＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ生成速度から差し引く。
【００１０】こうした試薬の使用者にとって特に不利に
なることは、試薬を使用前に凍結乾燥剤、顆粒剤、また
は錠剤のような固形成分を溶解してまず調製しなければ
ならないことであり、更に、この試薬は約２から８℃に
冷却して保存しても数日から数週間しか安定ではない。
ＣＫ測定のための相当する液体試薬を安定化する方法
は、例えばフォスフィン及びスルフヒドリル化合物の添
加がＥＰ0 774 514号に記載されているが、記載の安定
性は今日の必要性を完全に満たすものではない。
なることは、試薬を使用前に凍結乾燥剤、顆粒剤、また
は錠剤のような固形成分を溶解してまず調製しなければ
ならないことであり、更に、この試薬は約２から８℃に
冷却して保存しても数日から数週間しか安定ではない。
ＣＫ測定のための相当する液体試薬を安定化する方法
は、例えばフォスフィン及びスルフヒドリル化合物の添
加がＥＰ0 774 514号に記載されているが、記載の安定
性は今日の必要性を完全に満たすものではない。
【００１１】従って、特に臨床実験室での作業を更に合
理化するために、すぐ使用できる形態の、２から８℃で
少なくとも１２カ月の保存寿命及び安定性を有する試薬
が今日必要とされてきている。クレアチンキナーゼ測定
のための相当する液状安定試薬の調製を試みる際、グル
コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼが、実際に
はヘキソキナーゼ反応のための基質であるグルコース
を、ＡＴＰの非存在下でさえＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成と共
にゆっくりと、しかし持続的に変換することが見いださ
れた。更に、酵素精製段階を更に進めても、この酵素の
グルコースデヒドロゲナーゼ副活性を実質的に減じる
か、あるいは完全になくすことすらできなかった。
理化するために、すぐ使用できる形態の、２から８℃で
少なくとも１２カ月の保存寿命及び安定性を有する試薬
が今日必要とされてきている。クレアチンキナーゼ測定
のための相当する液状安定試薬の調製を試みる際、グル
コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼが、実際に
はヘキソキナーゼ反応のための基質であるグルコース
を、ＡＴＰの非存在下でさえＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成と共
にゆっくりと、しかし持続的に変換することが見いださ
れた。更に、酵素精製段階を更に進めても、この酵素の
グルコースデヒドロゲナーゼ副活性を実質的に減じる
か、あるいは完全になくすことすらできなかった。
【００１２】非−還元型補酵素の好ましくない早過ぎる
（premature）消費とは別に、特に試薬保存中に生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び、これから生成するその分解物ま
たは生成物は検出反応を阻害し、従ってクレアチンキナ
ーゼ値を誤って低く読むことにつながることがある。
（premature）消費とは別に、特に試薬保存中に生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び、これから生成するその分解物ま
たは生成物は検出反応を阻害し、従ってクレアチンキナ
ーゼ値を誤って低く読むことにつながることがある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】従って、上記の酵素反
応を必須に有するが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの早過ぎる生成の
ないクレアチンキナーゼの酵素的測定のための方法及び
試薬が必要とされている。
応を必須に有するが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの早過ぎる生成の
ないクレアチンキナーゼの酵素的測定のための方法及び
試薬が必要とされている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】この目的は、本発明によ
って、グルコースと異なり、グルコースの代わりにヘキ
ソキナーゼでリン酸化され得るヘキソースを全ＣＫ試
薬、または数種の部分試薬の少なくとも１つ、例えばプ
レインキュベーション、またはアデニレートキナーゼを
測定するために使用する部分試薬に添加することで達成
される。
って、グルコースと異なり、グルコースの代わりにヘキ
ソキナーゼでリン酸化され得るヘキソースを全ＣＫ試
薬、または数種の部分試薬の少なくとも１つ、例えばプ
レインキュベーション、またはアデニレートキナーゼを
測定するために使用する部分試薬に添加することで達成
される。
【００１５】
【発明の実施の形態】相当するヘキソースから生成する
ヘキソース−６−リン酸は、適当なヘキソース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼを用いて直接測定できる；
しかしながら、酵素的異性化の後にグルコース−６−リ
ン酸として測定するのが特に好ましい。本発明に係る好
適なヘキソース化合物は、グルコースと異なるいずれの
アルドヘキソースまたはケトヘキソースであっても良
く、例えばアロース、アルトロース、マンノース、グロ
ース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコー
ス、フルクトース、ソルボースまたはタガトースが挙げ
られる。
ヘキソース−６−リン酸は、適当なヘキソース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼを用いて直接測定できる；
しかしながら、酵素的異性化の後にグルコース−６−リ
ン酸として測定するのが特に好ましい。本発明に係る好
適なヘキソース化合物は、グルコースと異なるいずれの
アルドヘキソースまたはケトヘキソースであっても良
く、例えばアロース、アルトロース、マンノース、グロ
ース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコー
ス、フルクトース、ソルボースまたはタガトースが挙げ
られる。
【００１６】本発明において、フルクトースまたは／及
びマンノースがヘキソースとして好ましく使用される。
フルクトースを使用する場合、異性化酵素としてホスホ
グルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ，ＥＣ5.3.1.9）を使
用し、マンノースに対してはホスホマンノースイソメラ
ーゼ（ＰＭＩ，ＥＣ5.3.1.8）とＰＧＩの組み合わせを
使用する。本方法の基礎を形成する反応経路を以下の図
に示す：
びマンノースがヘキソースとして好ましく使用される。
フルクトースを使用する場合、異性化酵素としてホスホ
グルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ，ＥＣ5.3.1.9）を使
用し、マンノースに対してはホスホマンノースイソメラ
ーゼ（ＰＭＩ，ＥＣ5.3.1.8）とＰＧＩの組み合わせを
使用する。本方法の基礎を形成する反応経路を以下の図
に示す：
【００１７】
【数３】
【００１８】驚くべきことに、グルコースと異なり、フ
ルクトースまたはマンノースは、ＮＡＤ+またはＮＡＤ
Ｐ+のような非−還元型補酵素の存在下でグルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼによって全く、また
は非常にわずかしか変換されず、従ってこれらのヘキソ
ースを使用した場合にはＣＫ試薬中のＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤＰＨの早過ぎる生成が避けられる。
ルクトースまたはマンノースは、ＮＡＤ+またはＮＡＤ
Ｐ+のような非−還元型補酵素の存在下でグルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼによって全く、また
は非常にわずかしか変換されず、従ってこれらのヘキソ
ースを使用した場合にはＣＫ試薬中のＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤＰＨの早過ぎる生成が避けられる。
【００１９】必要な反応成分及び任意の更なる補助物質
は単一試薬中に組み合わせて、または数種の部分試薬中
に分配されて存在し得、数種の部分試薬中に分配される
場合には、クレアチンリン酸はクレアチンキナーゼ検出
反応を開始させるために使用する部分試薬中に含まれ
る。本発明において、分析される試料中に存在し得るア
デニレートキナーゼ活性を測定するため、及び／または
クレアチンキナーゼを活性化するために使用する部分試
薬中では、グルコースと異なるヘキソースによってグル
コースが完全に置き換わっている試薬が好ましく、また
この試薬はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼと異なるヘキソース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼか、あるいは１種以上のヘキソース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼをグルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼと共に含有する。
は単一試薬中に組み合わせて、または数種の部分試薬中
に分配されて存在し得、数種の部分試薬中に分配される
場合には、クレアチンリン酸はクレアチンキナーゼ検出
反応を開始させるために使用する部分試薬中に含まれ
る。本発明において、分析される試料中に存在し得るア
デニレートキナーゼ活性を測定するため、及び／または
クレアチンキナーゼを活性化するために使用する部分試
薬中では、グルコースと異なるヘキソースによってグル
コースが完全に置き換わっている試薬が好ましく、また
この試薬はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼと異なるヘキソース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼか、あるいは１種以上のヘキソース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼをグルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼと共に含有する。
【００２０】本発明において、試薬中のフルクトースま
たはマンノースの濃度は約０．０５から２００mmol／
ｌ、好ましくは０．１から５０mmol／ｌである。ホスホ
グルコースイソメラーゼ及びホスホマンノースイソメラ
ーゼは単位体積あたりの活性が少なくとも０．１Ｕ／ｍ
ｌで使用し、好ましくは約０．５から５０Ｕ／ｍｌ、特
に１から３０Ｕ／ｍｌの間で使用する。他の全ての成分
及び、任意に添加する６−ホスホグルコノラクトース及
びグルコネート−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを
含む、任意の更なる補助物質は、当該分野の技術者にと
って通常の濃度で使用する。記載した濃度は、それぞれ
最終の測定溶液または他の部分試薬と組み合わせる測定
溶液のための値（最終濃度）である。
たはマンノースの濃度は約０．０５から２００mmol／
ｌ、好ましくは０．１から５０mmol／ｌである。ホスホ
グルコースイソメラーゼ及びホスホマンノースイソメラ
ーゼは単位体積あたりの活性が少なくとも０．１Ｕ／ｍ
ｌで使用し、好ましくは約０．５から５０Ｕ／ｍｌ、特
に１から３０Ｕ／ｍｌの間で使用する。他の全ての成分
及び、任意に添加する６−ホスホグルコノラクトース及
びグルコネート−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを
含む、任意の更なる補助物質は、当該分野の技術者にと
って通常の濃度で使用する。記載した濃度は、それぞれ
最終の測定溶液または他の部分試薬と組み合わせる測定
溶液のための値（最終濃度）である。
【００２１】本発明に係る水性試薬は０℃以上で保存し
た時の安定性が際だっている。従って例えばグルコース
をフルクトース及び／またはマンノースで部分的にまた
は完全に置き換え、相当する試薬を４から８℃で１２カ
月までの期間にわたって保存した場合、新しく調製した
試薬で得られるものと比較してほぼ１００％のＣＫ回収
が見られた。対照的に、既知のＣＫ液状試薬は非常に品
質の低い安定性のものである。このことは、Ｎ−アセチ
ルシステインの代わりに他のスルフヒドリル化合物及び
フォスフィンを添加するＥＰ0 774 514号にかかるＣＫ
試薬にもあてはまる。更にまた、こうした添加剤は本発
明の基本的な問題、すなわちＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
の早過ぎる生成の防止を解決するためには適当ではな
い。
た時の安定性が際だっている。従って例えばグルコース
をフルクトース及び／またはマンノースで部分的にまた
は完全に置き換え、相当する試薬を４から８℃で１２カ
月までの期間にわたって保存した場合、新しく調製した
試薬で得られるものと比較してほぼ１００％のＣＫ回収
が見られた。対照的に、既知のＣＫ液状試薬は非常に品
質の低い安定性のものである。このことは、Ｎ−アセチ
ルシステインの代わりに他のスルフヒドリル化合物及び
フォスフィンを添加するＥＰ0 774 514号にかかるＣＫ
試薬にもあてはまる。更にまた、こうした添加剤は本発
明の基本的な問題、すなわちＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
の早過ぎる生成の防止を解決するためには適当ではな
い。
【００２２】本発明を以下の実施例によって更に説明す
る。
る。
【００２３】
【実施例】実施例１： ＮＡＤＰ+の存在下におけるグルコース−６−ホスフェートデヒド ロゲナーゼによる種々のヘキソースの変換 試薬： 試薬Ａ：イミダゾール・ＨＣｌ（ｐＨ６．６） １１０mmol／ｌ ヘキソース* ５０mmol／ｌ Ｇ６Ｐ−ＤＨ １０Ｕ／ｍｌ ＊）グルコース、フルクトースまたはマンノース 試薬Ｂ： ＮＡＤＰ+（蒸留水中） ２５mmol／ｌ 試験混合液：光路１ｃｍのキュベット中で試薬Ａ１．０ｍｌをそれぞれ試薬Ｂ０ ．１ｍｌと混合し、分光光度計で３７℃、３４０ｎｍで約４０分間吸光度の経時 変化を監視した。
【００２４】図１に示すように、グルコースではＮＡＤ
ＰＨの顕著な生成が生じたが、フルクトースまたはマン
ノースでは吸光度変化は測定できない。実施例２： 常套的試薬（“ＣＫ ＮＡＣ活性化(activated)”Boehringer Mann heim）による血清中のクレアチンキナーゼの測定 ２．１ 試薬組成物： 部分試薬１（“Ｒ１”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ6.7） １１０mmol／ｌ グルコース ２０．５mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ アデノシン−５'−二リン酸 ２．５mmol／ｌ アデノシン−５'−一リン酸 ６．１mmol／ｌ ジアデノシン−五リン酸 １２μmol／ｌ ＮＡＤＰ+ ２．５mmol／ｌ Ｎ−アセチルシステイン ２５mmol／ｌ ヘキソキナーゼ ５Ｕ／ml Ｇ６Ｐ−ＤＨ ３Ｕ／ml 部分試薬２（“Ｒ２”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ7.5） ２５mmol／ｌ グルコース ２０．５mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ クレアチンリン酸 １８４mmol／ｌ ２．２ 測定方法：１．測定はBoehringer Mannheim／H
itachi 717自動分析器（温度３７℃、波長４０５／３４
０ｎｍ；部分試薬１ ２５０μｌ、部分試薬２ ５０μ
ｌ、試料 ７μｌ；測定方法速度論 Ａ５−３５−５
０）で実施した。“自動化系のための較正器(calibrato
r)”（Boehringer Mannheim GmbH, No. 759 350）を較
正のために使用した。実施例３： 本発明に係る試薬を使用した血清中のクレアチンキナーゼの測定； フルクトースによるグルコースの完全な置換 ３．１ 試薬組成物： 部分試薬１（“Ｒ１”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ6.7） １１０mmol／ｌ フルクトース ２５mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ アデノシン−５'−二リン酸 ２．５mmol／ｌ アデノシン−５'−一リン酸 ６．１mmol／ｌ ジアデノシン−五リン酸 １２μmol／ｌ ＮＡＤＰ+ ２．５mmol／ｌ Ｎ−アセチルシステイン ２５mmol／ｌ ヘキソキナーゼ ５Ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ １０Ｕ／ml Ｇ６Ｐ−ＤＨ ３Ｕ／ml 部分試薬２（“Ｒ２”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ7.5） ２５mmol／ｌ フルクトース ２５mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ クレアチンリン酸 １８４mmol／ｌ ３．２ 測定方法： 実施例２と同様 図２に示すように、実施例３によるヒトまたは対照血清
中のＣＫの測定で、実施例２で得られたものと同じ結果
を得た。実施例４： 本発明に係る試薬を使用した血清中のクレアチンキナーゼの測定； 部分試薬１中のグルコースのフルクトースによる置換： ４．１ 試薬組成物： 部分試薬１（“Ｒ１”）：イミダゾールＨＣｌ（ｐＨ6.7） １１０mmol／ｌ フルクトース ２５mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ アデノシン−５'−二リン酸 ２．５mmol／ｌ アデノシン−５'−一リン酸 ６．１mmol／ｌ ジアデノシン−五リン酸 １０μmol／ｌ ＮＡＤＰ+ ２．５mmol／ｌ Ｎ−アセチルシステイン ２５mmol／ｌ ヘキソキナーゼ ５Ｕ／ml ホスホグルコース−イソメラーゼ １０Ｕ／ml Ｇ６Ｐ−ＤＨ ３Ｕ／ml 部分試薬２（“Ｒ２”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ7.5） ２５mmol／ｌ グルコース ２０．５mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ クレアチンリン酸 １８４mmol／ｌ ４．２ 測定方法： 実施例２と同様 図２に示すように、実施例４によるヒトまたは対照血清
におけるＣＫの測定では実施例２で得られたものと同じ
結果を得た。
ＰＨの顕著な生成が生じたが、フルクトースまたはマン
ノースでは吸光度変化は測定できない。実施例２： 常套的試薬（“ＣＫ ＮＡＣ活性化(activated)”Boehringer Mann heim）による血清中のクレアチンキナーゼの測定 ２．１ 試薬組成物： 部分試薬１（“Ｒ１”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ6.7） １１０mmol／ｌ グルコース ２０．５mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ アデノシン−５'−二リン酸 ２．５mmol／ｌ アデノシン−５'−一リン酸 ６．１mmol／ｌ ジアデノシン−五リン酸 １２μmol／ｌ ＮＡＤＰ+ ２．５mmol／ｌ Ｎ−アセチルシステイン ２５mmol／ｌ ヘキソキナーゼ ５Ｕ／ml Ｇ６Ｐ−ＤＨ ３Ｕ／ml 部分試薬２（“Ｒ２”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ7.5） ２５mmol／ｌ グルコース ２０．５mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ クレアチンリン酸 １８４mmol／ｌ ２．２ 測定方法：１．測定はBoehringer Mannheim／H
itachi 717自動分析器（温度３７℃、波長４０５／３４
０ｎｍ；部分試薬１ ２５０μｌ、部分試薬２ ５０μ
ｌ、試料 ７μｌ；測定方法速度論 Ａ５−３５−５
０）で実施した。“自動化系のための較正器(calibrato
r)”（Boehringer Mannheim GmbH, No. 759 350）を較
正のために使用した。実施例３： 本発明に係る試薬を使用した血清中のクレアチンキナーゼの測定； フルクトースによるグルコースの完全な置換 ３．１ 試薬組成物： 部分試薬１（“Ｒ１”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ6.7） １１０mmol／ｌ フルクトース ２５mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ アデノシン−５'−二リン酸 ２．５mmol／ｌ アデノシン−５'−一リン酸 ６．１mmol／ｌ ジアデノシン−五リン酸 １２μmol／ｌ ＮＡＤＰ+ ２．５mmol／ｌ Ｎ−アセチルシステイン ２５mmol／ｌ ヘキソキナーゼ ５Ｕ／ml ホスホグルコースイソメラーゼ １０Ｕ／ml Ｇ６Ｐ−ＤＨ ３Ｕ／ml 部分試薬２（“Ｒ２”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ7.5） ２５mmol／ｌ フルクトース ２５mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ クレアチンリン酸 １８４mmol／ｌ ３．２ 測定方法： 実施例２と同様 図２に示すように、実施例３によるヒトまたは対照血清
中のＣＫの測定で、実施例２で得られたものと同じ結果
を得た。実施例４： 本発明に係る試薬を使用した血清中のクレアチンキナーゼの測定； 部分試薬１中のグルコースのフルクトースによる置換： ４．１ 試薬組成物： 部分試薬１（“Ｒ１”）：イミダゾールＨＣｌ（ｐＨ6.7） １１０mmol／ｌ フルクトース ２５mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ アデノシン−５'−二リン酸 ２．５mmol／ｌ アデノシン−５'−一リン酸 ６．１mmol／ｌ ジアデノシン−五リン酸 １０μmol／ｌ ＮＡＤＰ+ ２．５mmol／ｌ Ｎ−アセチルシステイン ２５mmol／ｌ ヘキソキナーゼ ５Ｕ／ml ホスホグルコース−イソメラーゼ １０Ｕ／ml Ｇ６Ｐ−ＤＨ ３Ｕ／ml 部分試薬２（“Ｒ２”）：酢酸イミダゾール（ｐＨ7.5） ２５mmol／ｌ グルコース ２０．５mmol／ｌ ＥＤＴＡ ２mmol／ｌ 酢酸マグネシウム １０mmol／ｌ クレアチンリン酸 １８４mmol／ｌ ４．２ 測定方法： 実施例２と同様 図２に示すように、実施例４によるヒトまたは対照血清
におけるＣＫの測定では実施例２で得られたものと同じ
結果を得た。
【００２５】実施例３または４に記載の部分試薬２及び
／または部分試薬１でフルクトースの代わりにマンノー
スを使用した場合、ホスホグルコースイソメラーゼに加
えて部分試薬１にホスホマンノースイソメラーゼ（１０
Ｕ／ml）を更に添加すると、相当する結果が得られた。
ＣＫの回収速度に明確な影響を与えないで、実施例１の
試薬中のグルコースを例えばガラクトースに、ヘキソキ
ナーゼをガラクトキナーゼに、グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼをガラクトース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼに完全に置き換えることも同様に
可能である。
／または部分試薬１でフルクトースの代わりにマンノー
スを使用した場合、ホスホグルコースイソメラーゼに加
えて部分試薬１にホスホマンノースイソメラーゼ（１０
Ｕ／ml）を更に添加すると、相当する結果が得られた。
ＣＫの回収速度に明確な影響を与えないで、実施例１の
試薬中のグルコースを例えばガラクトースに、ヘキソキ
ナーゼをガラクトキナーゼに、グルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼをガラクトース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼに完全に置き換えることも同様に
可能である。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、顕著な機能低下なしに
２から８℃で１２カ月まで安定な液状のクレアチニンキ
ナーゼ測定用試薬が提供される。
２から８℃で１２カ月まで安定な液状のクレアチニンキ
ナーゼ測定用試薬が提供される。
【図１】 グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ及びグルコース（先行技術）またはフルクトースあ
るいはマンノース（本発明に係るもの）を含有する溶液
へのＮＡＤＰ+（試薬Ｂ）の添加
ーゼ及びグルコース（先行技術）またはフルクトースあ
るいはマンノース（本発明に係るもの）を含有する溶液
へのＮＡＤＰ+（試薬Ｂ）の添加
【図２】 クレアチンキナーゼ法の比較（Boehringer M
annheim/Hitachi 717；３７℃）；実施例２に係る先行
技術、実施例３に対応する本発明に係るもの。（ｘ：ヒ
ト血清（１０）；△：対照血清（６））
annheim/Hitachi 717；３７℃）；実施例２に係る先行
技術、実施例３に対応する本発明に係るもの。（ｘ：ヒ
ト血清（１０）；△：対照血清（６））
【図３】 クレアチンキナーゼ法の比較（Boehringer M
annheim/Hitachi 717；３７℃）；実施例２に係る先行
技術、実施例４に対応する本発明に係るもの。（ｘ：ヒ
ト血清（１０）；△：対照血清（６））
annheim/Hitachi 717；３７℃）；実施例２に係る先行
技術、実施例４に対応する本発明に係るもの。（ｘ：ヒ
ト血清（１０）；△：対照血清（６））
Claims (12)
- 【請求項１】 クレアチンリン酸及びアデノシン−５'
−二リン酸からアデノシン−５'−三リン酸を生成し、
生成したアデノシン−５'−三リン酸をグルコース、ヘ
キソキナーゼ、ヘキソース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ及びＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を使用して検出す
ることによる、生物学的試料物質中のクレアチンキナー
ゼの酵素的測定方法であって、 グルコースとは異なり、酵素的にリン酸化され得るヘキ
ソースをグルコースに加え、またはこれの代わりにヘキ
ソキナーゼの基質として使用し、ヘキソキナーゼ反応で
生成するグルコース−６−リン酸と異なるヘキソース−
６−リン酸をグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼと異なるヘキソース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼを使用して直接測定するか、または酵素的異性
体化の後にグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼによってグルコース−６−リン酸として測定する、
該方法。 - 【請求項２】 必要な反応成分及び任意の更なる補助物
質が単一試薬中に組み合わせて存在するか、数種の部分
試薬中に分配されて存在し、数種の部分試薬中に分配さ
れている場合にはクレアチンリン酸がクレアチンキナー
ゼ検出反応を開始させるために使用する部分試薬中に含
まれる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 グルコースと異なるヘキソースでグルコ
ースが完全に置き換えられ、１種以上のヘキソース−６
−ホスフェートイソメラーゼが、試料中に存在し得るア
デニレートキナーゼ活性を決定するため、及び／または
クレアチンキナーゼを活性化するために使用する部分試
薬中に存在する、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 グルコースと異なるヘキソースとしてフ
ルクトース及び／またはマンノースを使用し、ヘキソー
ス−６−ホスフェートイソメラーゼとしてホスホグルコ
ースイソメラーゼ、またはホスホマンノースイソメラー
ゼ及びホスホグルコースイソメラーゼからなる混合物を
使用する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項５】 ６−ホスホグルコノラクトナーゼ及びグ
ルコネート−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの存在
下で測定を実施する、請求項１から４のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項６】 グルコースに加え、またはこれの代わり
に、グルコースと異なり、酵素的にリン酸化され得るヘ
キソース、並びにグルコース−６−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼと異なるヘキソース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、またはグルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼを１種以上のヘキソース−６−ホスフェ
ートイソメラーゼと組み合わせて含有する、マグネシウ
ムまたはマンガンイオン、クレアチンリン酸、アデノシ
ン−５'−二リン酸、ヘキソキナーゼ、クレアチンキナ
ーゼ活性化化合物、１種以上のアデニレートキナーゼ阻
害剤並びにＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を水性緩衝培地中に
含有する生物学的試料物質中のクレアチンキナーゼ測定
のための試薬。 - 【請求項７】 グルコースに加え、またはこれの代わり
にフルクトース及び／またはマンノース並びにホスホグ
ルコースイソメラーゼまたはホスホマンノースイソメラ
ーゼとホスホグルコースイソメラーゼからなる混合物を
含有する、請求項６記載の試薬。 - 【請求項８】 少なくとも２つの部分試薬から構成さ
れ、グルコースと異なるヘキソース並びに１種以上のヘ
キソース−６−ホスフェートイソメラーゼが、クレアチ
ンキナーゼを活性化するため、及び／またはクレアチン
キナーゼに加えて試料物質中に存在し得るアデニレート
キナーゼ活性を測定するために使用する部分試薬中に存
在する、請求項６または７記載の試薬。 - 【請求項９】 フルクトース及び／またはマンノース、
及びヘキソース−６−ホスフェートイソメラーゼとして
ホスホグルコースイソメラーゼまたはホスホマンノース
イソメラーゼとホスホグルコースイソメラーゼの混合物
を含有する、請求項６から８のいずれか１項に記載の試
薬。 - 【請求項１０】 試薬または部分試薬が６−ホスホグル
コノラクトナーゼ及びグルコネート−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼを含有する、請求項６から９のいずれ
か１項に記載の試薬。 - 【請求項１１】 グルコースと異なる１種以上のヘキソ
ースの試験溶液中の濃度が約０．０５から２００mmol／
ｌである、請求項６から１０のいずれか１項に記載の試
薬。 - 【請求項１２】 それぞれのヘキソース−６−ホスフェ
ートイソメラーゼの活性が少なくとも０．１U／mlであ
る、請求項６から１１のいずれか１項に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1997148490 DE19748490A1 (de) | 1997-11-03 | 1997-11-03 | Verfahren und Reagenz zur Creatin-Kinase-Bestimmung |
| DE19748490:5 | 1997-11-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11196899A true JPH11196899A (ja) | 1999-07-27 |
Family
ID=7847445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31377298A Pending JPH11196899A (ja) | 1997-11-03 | 1998-11-04 | クレアチンキナーゼ測定のための方法及び試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0913483A2 (ja) |
| JP (1) | JPH11196899A (ja) |
| DE (1) | DE19748490A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6365366B1 (en) * | 2000-03-13 | 2002-04-02 | Tularik Inc. | T2k kinase assays |
| CN1315350A (zh) * | 2000-03-24 | 2001-10-03 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人已糖激酶蛋白13和编码这种多肽的多核苷酸 |
-
1997
- 1997-11-03 DE DE1997148490 patent/DE19748490A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-10-31 EP EP19980120725 patent/EP0913483A2/de not_active Withdrawn
- 1998-11-04 JP JP31377298A patent/JPH11196899A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19748490A1 (de) | 1999-05-06 |
| EP0913483A2 (de) | 1999-05-06 |
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