JP7446875B2 - L-カルニチン測定方法及びl-カルニチン測定キット - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Description
1.β-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(Thio-NAD+)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)の存在下、又は、β-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(Thio-NADH)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(NAD+)の存在下で、測定対象から取り出した試料中のL-カルニチンを、カルニチンデヒドロゲナーゼ(CDH)と反応させる反応工程を含み、前記反応工程の反応系にトレハロースを共存させる、L-カルニチン測定方法。
2.前記反応工程が、Thio-NAD+及びNADHの存在下で実施される、1のL-カルニチン測定方法。
3.前記CDHが、(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDH、又は(b)配列番号2で表されるアミノ酸と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつThio-NAD+の存在下でL-カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びThio-NADHの存在下でデヒドロカルニチンからL-カルニチンへの反応を触媒する活性を有するCDHである、1又は2のL-カルニチン測定方法。
4.前記糖類の反応時終濃度が5~50重量%である、1~3のいずれかのL-カルニチン測定方法。
5.Thio-NAD+又はNAD+を含有する水溶液からなる第1反応試液と、NADH又はThio-NADHを含有する水溶液からなる第2反応試液と、を備え、前記第1反応試液がThio-NAD+を含有する場合は、前記第2反応試液はNADHを含有し、前記第1反応試液がNAD+を含有する場合は、前記第2反応試液はThio-NADHを含有し、前記第1反応試液と第2反応試液の少なくとも1つがCDHを含有し、前記第1反応試液と第2反応試液の少なくとも1つがトレハロースを含有する、L-カルニチン測定キット。
6.前記第1反応試液がThio-NAD+を含有する水溶液からなり、前記第2反応試液がNADHを含有する水溶液からなる、5のL-カルニチン測定キット。
7.前記CDHと、前記トレハロースとが、別の反応試液にそれぞれ含まれる、5又は6のL-カルニチン測定キット。
8.トレハロースを共存させて、Thio-NAD+の存在下でL-カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応及び/又はThio-NADHの存在下でデヒドロカルニチンからL-カルニチンへの反応を促進する、カルニチンデヒドロゲナーゼの反応促進方法。
本発明のL-カルニチン測定方法は、Thio-NAD+及びNADHの存在下、又は、Thio-NADH及びNAD+の存在下で、測定対象から取り出した試料中のL-カルニチンを、カルニチンデヒドロゲナーゼ(CDH)と反応させる反応工程を含み、前記反応工程の反応系にトレハロースを共存させる、ことを特徴とする。CDHの反応系にトレハロースを共存させることで、CDHの反応促進等により、得られるシグナル(例えば、吸光度)が亢進する、という効果が得られる。
本発明のL-カルニチン測定キットは、Thio-NAD+又はNAD+を含有する水溶液からなる第1反応試液と、NADH又はThio-NADHを含有する水溶液からなる第2反応試液と、を備え、前記第1反応試液がThio-NAD+を含有する場合は前記第2反応試液はNADHを含有し、前記第1反応試液がNAD+を含有する場合は前記第2反応試液はThio-NADH含有し、前記第1反応試液と第2反応試液の少なくとも1つがカルニチンデヒドロゲナーゼを含有し、前記第1反応試液と第2反応試液の少なくとも1つが糖類を含有する、ことを特徴とする。
本発明のカルニチンデヒドロゲナーゼの反応促進方法は、Thio-NAD+及びNADHの存在下、又は、Thio-NADH及びNAD+の存在下で、さらに糖類を存在させてL-カルニチンとカルニチンデヒドロゲナーゼとを反応させる、ことを特徴とする。
以下の実施例に使用したCDHは、以下の通りに調製した。配列番号2に示すCDHのアミノ酸配列をコードするDNA配列として、大腸菌に対してコドン最適化した配列番号1の966bpのDNAを合成した。合成したDNAをプラスミド(pTRP ベクター)にクローニングし、大腸菌を形質転換した後、培養した。使用したプラスミド、形質転換の手法、培養条件等は、特許文献3と同様とした。培養液から集菌した菌体を破砕した後、バッファーで懸濁して遠心分離で残渣を除き、細胞抽出液を得た。細胞抽出液のCDH活性を、基質混合反応液(0.1M Tris-HCl、100mM カルニチン、10mM NAD+、pH9.0)を用いて確認した。細胞抽出液を基質混合反応液に加え、CDHの反応で得られるNADHによる340nmの吸光度を経時的に測定し、NADHのモル吸光計数を用いて1分間あたりのNADH産出量を算出した。その結果、培養液1mL相当量の細胞抽出液が、1分間あたり10~30mmolのNADHを生成するCDH活性を有することを確認した。
50μmol/LのL-カルニチン標準液(「F-Carnitine試薬カイノス」カイノス社)について、臨床検査用自動分析機(日立7170型、日立製作所製)を使用して測定を行った。
カルニチン標準液7.2μLを、0、100、200、300、400、500g/Lのトレハロース2水和物を含む第1反応試液(4.9g/L Thio-NAD+を含む、pH6.4)120μLとそれぞれ混合し、37℃で5分間インキュベートした。次いで、第2反応試液(0.2g/L NADH2Na、600kU/L CDHを含む、pH9.0)60μLを加え、37℃でインキュベートした。上記操作の間、反応液の405nm、600nmの吸光度を断続的に測定した。
下記の3種類の組換えCDHを含む第2反応試液を調製した。
第2反応試液a:NADH2Na 0.4g/L、組換えCDH600kU/Lを含む、pH9.0
第2反応試液b:NADH2Na 0.2g/L、組換えCDH600kU/Lを含む、pH9.0
第2反応試液c:NADH2Na 0.4g/L、組換えCDH800kU/Lを含む、pH9.0
第2反応試液a~cは、液体の状態で、4℃で0、8、11か月保存した。
L-カルニチンを、生理食塩水に溶解して、0~300μmol/Lの11濃度のカルニチン溶液を調製した。11ヶ月冷蔵保存した第2反応試液bcと、0、150、450g/Lのトレハロース2水和物を含む第1反応試液とを用いて、実施例2と同様の条件で反応させ、各カルニチン溶液反応時の405nmの吸光度変化量(ΔAbs/min×10,000)を測定した。50μmol/Lの測定値を標準として、各カルニチン溶液濃度の実測濃度値を算出した。
Claims (7)
- β-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(Thio-NAD+)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)の存在下、又は、
β-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(Thio-NADH)及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型(NAD+)の存在下で、
測定対象から取り出した試料中のL-カルニチンを、カルニチンデヒドロゲナーゼ(CDH)と反応させる反応工程を含み、
前記CDHが、(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDH、又は(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつThio-NAD+の存在下でL-カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びThio-NADHの存在下でデヒドロカルニチンからL-カルニチンへの反応を触媒する活性を有するCDHであり、
前記反応工程の反応系にトレハロースを共存させる、L-カルニチン測定方法。 - 前記反応工程が、Thio-NAD+及びNADHの存在下で実施される、請求項1に記載のL-カルニチン測定方法。
- 前記トレハロースの反応時終濃度が5~50重量%である、請求項1又は2に記載のL-カルニチン測定方法。
- Thio-NAD+又はNAD+を含有する水溶液からなる第1反応試液と、
NADH又はThio-NADHを含有する水溶液からなる第2反応試液と、を備え、
前記第1反応試液がThio-NAD+を含有する場合は、前記第2反応試液はNADHを含有し、前記第1反応試液がNAD+を含有する場合は、前記第2反応試液はThio-NADHを含有し、
前記第1反応試液と第2反応試液の少なくとも1つがCDHを含有し、ここで、前記CDHが、(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDH、又は(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつThio-NAD+の存在下でL-カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びThio-NADHの存在下でデヒドロカルニチンからL-カルニチンへの反応を触媒する活性を有するCDHであり、
前記第1反応試液と第2反応試液の少なくとも1つがトレハロースを含有する、
L-カルニチン測定キット。 - 前記第1反応試液がThio-NAD+を含有する水溶液からなり、前記第2反応試液がNADHを含有する水溶液からなる、請求項4に記載のL-カルニチン測定キット。
- 前記CDHと、前記トレハロースとが、別の反応試液にそれぞれ含まれる、請求項4又は5に記載のL-カルニチン測定キット。
- カルニチンデヒドロゲナーゼ(CDH)とトレハロースを共存させて、Thio-NAD+の存在下でL-カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応及び/又はThio-NADHの存在下でデヒドロカルニチンからL-カルニチンへの反応を促進する、CDHの反応促進方法であって、ここで、前記CDHが、(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるCDH、又は(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつThio-NAD+の存在下でL-カルニチンからデヒドロカルニチンへの反応を触媒する活性及びThio-NADHの存在下でデヒドロカルニチンからL-カルニチンへの反応を触媒する活性を有するCDHである、方法。
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