CN112230004A - 一种b型钠尿肽的液态校准品及制备方法、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种B型钠尿肽的液态校准品及制备方法、试剂盒，液态校准品包括以下组分：pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂、防腐剂和抑肽酶。本发明所述液态校准品在2～8℃条件下可稳定12个月，不用冻干或液态条件下储存在‑20℃条件下，减少了复溶或复温过程中可能出现的不可控因素，使得临床检测结果更为准确；解决了由于校准品稳定性不好导致校准时校准曲线不正确，影响临床检测结果的问题。
Description
技术领域
本发明涉及B型钠尿肽检测技术领域，具体涉及一种B型钠尿肽的液态校准品及制备方法、试剂盒。
背景技术
B型钠尿肽(BNP)由心肌细胞分泌，其含108个氨基酸的前体(ProBNP)在分泌过程中或进入血液后可分解为具有生物活性的32个氨基酸的C端片段(BNP)和76个氨基酸的N末端片段(NT-ProBNP)。心肌细胞受牵拉和血管透壁压超负荷共同参与了BNP的合成和释放。BNP是心室最主要的利钠肽，其生物半衰期约为20分钟。血中BNP的代谢途径不受肾脏影响。BNP分子极不稳定，在心衰患者血液中存在N端或C端部分截断的多种形式的BNP分子。其中全长的1-32BNP仅占很小一部分。因此，BNP与其他利钠肽及其前体相比是评价心室超负荷更敏感和特异的指标，可用于心力衰竭(CHF)的辅助诊断。
现有的B型钠尿肽的液态校准品需要在冻干或液态条件下储存在-20℃条件下，使用时需要复溶或复温处理，复溶或复温过程中可能出现的不可控因素，使得临床检测结果更为准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种B型钠尿肽的液态校准品，该液态校准品在2～8℃条件下可稳定12个月，不用冻干或液态条件下储存在-20℃条件下，减少了复溶或复温过程中可能出现的不可控因素，使得临床检测结果更为准确；解决了由于校准品稳定性不好导致校准时校准曲线不正确，影响临床检测结果的问题。
此外，本发明还提供包括上述液态校准品的试剂盒以及上述液态校准品的制备方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种B型钠尿肽的液态校准品，包括以下组分：
pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂、防腐剂和抑肽酶。
与现有技术相比本发明的优点是：本发明中使用蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、防腐剂、抑肽酶作为分析缓冲液能有效的提高BNP抗原稳定性，使其配制的BNP液态校准品稳定性较好，可在2-8℃冷藏稳定保存12个月。
进一步地，每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂9.00-11.00g、糖类稳定剂19.00-21.00g、金属蛋白酶抑制剂0.90-1.10g、防腐剂1.0-2.0mL和抑肽酶18.0-20.0mg。
所述pH 7.2缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷12.00-13.00g和氯化钠8.50-9.50g。
进一步地，每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂10.00g、糖类稳定剂20.00g、金属蛋白酶抑制剂1.00g、防腐剂1mL和抑肽酶18.9mg。
本发明所述配方中各个组分的用量限定能够确保对B型钠尿肽这一物质在溶液中保持较长时间的稳定。
进一步地，蛋白类稳定剂包括酪蛋白。
进一步地，糖类稳定剂包括D-海藻糖。
进一步地，金属蛋白酶抑制剂包括EDTA-2Na。
进一步地，防腐剂包括TX-100。
一种包括B型钠尿肽的液态校准品的试剂盒。
进一步地，包括第一试剂R1、第二试剂R2、第三试剂R3和液态校准品；
所述第一试剂R1为包含了复溶比为1/50免疫磁珠，其中BNP单克隆抗体1免疫磁珠：5μg/mg的包被量；第二试剂R2为含有碱性磷酸酶标记的B型钠尿肽单克隆抗体2；所述第三试剂R3为牛血清白蛋白溶液。
一种B型钠尿肽的液态校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、用纯化水溶解Tris和NaCl；
B、向步骤A中所得到的溶液中加入HCl调节pH值，使pH值达到7.2；
C、向步骤B中所得到的溶液中蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂、防腐剂和抑肽酶，加入纯化水定容。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明所述液态校准品在2～8℃条件下可稳定12个月，不用冻干或液态条件下储存在-20℃条件下，减少了复溶或复温过程中可能出现的不可控因素，使得临床检测结果更为准确；解决了由于校准品稳定性不好导致校准时校准曲线不正确，影响临床检测结果的问题。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种包括B型钠尿肽的液态校准品的试剂盒，包括第一试剂R1、第二试剂R2、第三试剂R3和液态校准品；
所述第一试剂R1为包含了复溶比为1/50免疫磁珠，其中BNP单克隆抗体1免疫磁珠：5μg/mg的包被量；第二试剂R2(酶工作液)为含有碱性磷酸酶(ALP)标记的B型钠尿肽单克隆抗体2；所述第三试剂R3(分析缓冲液)为10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液；每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液(三羟甲基氨基甲烷12.00g、氯化钠9.50g)、蛋白类稳定剂10.00g、糖类稳定剂20.00g、金属蛋白酶抑制剂1.00g、防腐剂1mL和抑肽酶18.9mg，所述蛋白类稳定剂为酪蛋白，所述糖类稳定剂为D-海藻糖，所述金属蛋白酶抑制剂为EDTA-2Na；所述防腐剂为TX-100；
液态校准品的配置方法为：
A、准备干净的容器，用实验室天平称取12.11g/L Tris及9.00g/L NaCl，加入纯化水溶解。
B、往A中所得到的溶液中加入适量HCl，用HCl调节pH值，使得达到pH 7.2。
往B中依次加入20.00g/L D-海藻糖、0.04g/L 4AAP、10.00g/L酪蛋白、1mL/L TX-100、3mL/L PC-300、10mL/L丙三醇、1.00g/L EDTA-2Na、18.9mg/L抑肽酶，加入纯化水定容。
所述液态校准品用于稀释B型钠尿肽抗原。
实施例2：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液(三羟甲基氨基甲烷13.00g、氯化钠8.50g)、蛋白类稳定剂9.00g、糖类稳定剂19.00g、金属蛋白酶抑制剂0.90g、防腐剂2mL和抑肽酶18.0mg。
实施例3：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液(三羟甲基氨基甲烷12.00g、氯化钠9.50g)、蛋白类稳定剂11.00g、糖类稳定剂21.00g、金属蛋白酶抑制剂1.10g、防腐剂1mL和抑肽酶20.0mg。
对比例1：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
液态校准品中同时不含金属蛋白酶抑制剂和抑肽酶。
对比例2：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
液态校准品中不含抑肽酶。
对比例3：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
液态校准品中不含金属蛋白酶抑制剂。
为了验证本发明的技术效果，进行以下实验：
实验一：不加EDTA-2Na及抑肽酶(对比例1)、只添加EDTA-2Na(对比例2)、只添加抑肽酶(对比例3)、同时添加EDTA-2Na及抑肽酶(实施例1)的四种校准品稀释液按同样操作步骤配制能浓度相同的校准品，并在同等情况下，校准品在热加速破坏(37℃)条件下比较实验。
实验材料：BNHS，0.2mM PBS(PH7.4)缓冲液，1mmol/L Tris缓冲液，羊抗人BNP特异性单克隆抗体1，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的羊抗人BNP特异性单克隆抗体2，分析缓冲液，裸磁珠，BNP校准品S1～S6(S1到S6的浓度为0，25，100，500，2500，5000pg/mL)，底物液，清洗液，贝克曼全自动化学发光测定仪Access 2。
将实施例1、对比例1-对比例3四种BNP的液态校准品按制备方法配制而成后，分装一部分放入37℃恒温孵育箱，另一部分放在2～8℃冰箱。在第七天时取出复温，在贝克曼全自动化学发光测定仪Access 2上对比进行检测，对比同一校准品在不同环境温度下稳定的情况，再观察四组条件中哪组在37℃条件下降幅度最少，测值与4℃校准品相接近。
将上述分析缓冲液、生物素抗体包被好的磁珠以及酶工作液共同组成BNP测定试剂盒，测定以上条件校准品。
反应模式为：一步法，校准品25μL，磁珠50μL，分析缓冲液50μL，酶工作液50μL加入后混匀在37℃条件下共同孵育4.8min后，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5min，仪器光电盘内读取光子数(RLU)。
实验结果如表1所示：
表1
由表1可知：
对比例1校准品经过37℃热处理7天后与4℃对照组相比，信号下降较多；对比例2和对比例3的37℃校准品分别与其4℃对照相比信号差异在10％以内；实施例1的37℃校准品与其4℃对照相比，信号差异在5％以内，可以认为实施例1的校准品的稳定性在热加速破坏下依然很好，与4℃测试信号无差异。
实验二：不加EDTA-2Na及抑肽酶、只添加EDTA-2Na、只添加抑肽酶的三种条件经测试均没有同时添加EDTA-2Na及抑肽酶的条件稳定性好，故使用实施例1的校准品稀释液按同样操作步骤配制能浓度相同的校准品，并在同等情况下，校准品在4℃条件下放置12个月，与-20℃冰冻条件下比较实验。
实验材料：BNHS，0.2mM PBS(PH7.4)缓冲液，1mmol/L Tris缓冲液，羊抗人BNP特异性单克隆抗体1，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记的羊抗人BNP特异性单克隆抗体2，分析缓冲液，裸磁珠，BNP校准品S1～S6(S1到S6的浓度为0，25，100，500，2500，5000pg/mL)，底物液，清洗液，贝克曼全自动化学发光测定仪Access 2。
将实施例1中BNP的液态校准品按制备方法配制而成后，分装一部分放入2～8℃冰箱，另一部分放在-20℃冰箱(每支EP管内装500μL，每次在各温度条件下取用1支，避免反复取出复温影响实验结果)。在第0～13月每月取出一支复温，在贝克曼全自动化学发光测定仪Access 2上对比进行检测，对比同一校准品在不同环境温度下稳定的情况，再观察此条件在规定的2～8℃条件下是否能够保持稳定12个月。
将上述分析缓冲液、生物素抗体包被好的磁珠以及酶工作液共同组成BNP测定试剂盒，测定以上条件校准品。
反应模式为：一步法，校准品25μL，磁珠50μL，分析缓冲液50μL，酶工作液50μL加入后混匀在37℃条件下共同孵育4.8min后，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5min，仪器光电盘内读取光子数(RLU)。
实验结果如表2所示：
表2
由表2可知：
0～13个月时2-8℃与-20℃条件下的校准品信号差异均在10％以内，认为校准品稳定性是合格的，且在2-8℃条件下0月～13月的信号差异均较小。说明BNP液态校准品在2-8℃环境下能够保持稳定12个月。
综上两个实验可以得出：表明BNP液态校准品在添加了pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)、防腐剂、抑肽酶等条件下能够在2～8℃条件下稳定12个月。且目前校准品稀释液中的所有组分均是最优配方，给BNP液态校准品的稳定性提供了有力保障。将BNP液态校准品用于EDTA血浆样本中BNP的检测，检测时无需进行校准品复溶，且多次定标的校准曲线可重复性优于冻干校准品的校准曲线。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，包括以下组分：
pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂、防腐剂和抑肽酶。
2.根据权利要求1所述的一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂9.00-11.00g、糖类稳定剂19.00-21.00g、金属蛋白酶抑制剂0.90-1.10g、防腐剂1.0-2.0mL和抑肽酶18.0-20.0mg。
3.根据权利要求2所述的一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，每升液态校准品中包括以下组分：
pH 7.2缓冲液、蛋白类稳定剂10.00g、糖类稳定剂20.00g、金属蛋白酶抑制剂1.00g、防腐剂1mL和抑肽酶18.9mg。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，所述蛋白类稳定剂包括酪蛋白。
5.根据权利要求1-3任一项所述的一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，所述糖类稳定剂包括D-海藻糖。
6.根据权利要求1-3任一项所述的一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，所述金属蛋白酶抑制剂包括EDTA-2Na。
7.根据权利要求1-3任一项所述的一种B型钠尿肽的液态校准品，其特征在于，所述防腐剂包括TX-100。
8.一种包括权利要求1-7任一项所述的B型钠尿肽的液态校准品的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的B型钠尿肽的液态校准品的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂R1、第二试剂R2、第三试剂R3和液态校准品；
所述第一试剂R1为包含了复溶比为1/50免疫磁珠，其中BNP单克隆抗体1免疫磁珠：5μg/mg的包被量；第二试剂R2为含有碱性磷酸酶标记的B型钠尿肽单克隆抗体2；所述第三试剂R3为牛血清白蛋白溶液。
10.一种如权利要求1-7任一项所述的B型钠尿肽的液态校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、用纯化水溶解Tris和NaCl；
B、向步骤A中所得到的溶液中加入HCl调节pH值，使pH值达到7.2；
C、向步骤B中所得到的溶液中蛋白类稳定剂、糖类稳定剂、金属蛋白酶抑制剂、防腐剂和抑肽酶，加入纯化水定容。
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