CN109283340A - 一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒 - Google Patents
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109283340A CN109283340A CN201811157021.9A CN201811157021A CN109283340A CN 109283340 A CN109283340 A CN 109283340A CN 201811157021 A CN201811157021 A CN 201811157021A CN 109283340 A CN109283340 A CN 109283340A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- natriuretic peptide
- parts
- brain natriuretic
- reagent
- chitosan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，其具有操作简单、准确度高、保存时间长的优点。本发明采用山梨酸钾作为防腐剂，极大降低毒害作用，并且山梨酸钾与巴比妥氯化钠缓冲液的相容性较高，均属于亲水类物质，能够更进一步促进R1试剂和R2试剂的结合。并且释放速率会明显下降，进而增加R1试剂和R2试剂的保存时间，这是因为壳聚糖的厚度较大，并且壳聚糖的交联度较大，容易形成致密的网状结构，起到延长保存时间的作用。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测的技术领域，更具体的说，它涉及一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒。
背景技术
脑钠肽又称B型利钠肽，是心脏细胞产生的结构相关的肽类激素家族钠尿肽中的一种。由32个氨基酸组成，其中含一个17个氨基酸通过一对二硫键组成的环状结构。BNP广泛分布于脑、脊髓、心肺等组织，其中以心脏含量最高。脑内以延髓含量最高，心脏内BNP主要存在于左、右心房，其中右心房含量为左心房3倍多，心室的BNP含量约不足心房的1/20，在房间隔、房室瓣、主动脉、肝动脉与肺静脉壁内亦含有少量BNP。当心功率不全时，由于心脏容量负荷或压力负荷增加，心肌受到牵张或室壁压力增大，会使血中BNP的指标浓度增高，而这恰恰是诊断心衰较为敏感的指标。可以独立预测左心室舒张末期压力升高状况。因此，测定BNP的临床意义主要有助急性呼吸困难的鉴别诊断；可预测心源性猝死。可对心里衰竭病人的危险分层；可监测心力衰竭的治疗；BNP水平还可提示心力衰竭病人的预后。在2001年修订的欧洲心脏病学会心衰诊疗指南中，已经把脑钠肽作为心衰诊断的工具。2005年欧洲和美国的指南，均进一步肯定了脑钠肽在心衰诊断中的作用。可以作为一个更好的预示心衰状况的指标。
已知测定脑钠肽的方法有放射免疫法、免疫放射测量法、电化学发光法、酶联免疫法；放射免疫法不经提取血浆BNP直接测量，此测定系统采用两种抗人BNP单克隆抗体，一种识别BNP的C端序列，一种识别其环状结构，即应用夹心法测定血浆BNP浓度，此法虽然较为敏感、准确、易于操作；但是此法与免疫放射测量法一样都存在着放射线辐射和污染等问题。电化学发光法较放射免疫法更为敏感、准确，精密但成本昂贵，需要配套化学发光仪才能检测。酶免疫法存在着操作繁琐，样品需要预处理等缺点。
一篇中国授权公告号为CN101819208B的专利公布了一种测定血清中的脑钠肽的试剂盒，其技术方案是：一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒，包含a、试剂R1；缓冲液、防腐剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2；缓冲液、结合有脑钠肽抗体的纳米微球及防腐剂，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：缓冲液、稳定剂、防腐剂以及根据所需要的BNP参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水。该技术方案虽然简单，便捷，但是存放时间较短，不利于保存与输送。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，其具有操作简单、准确度高、保存时间长的优点。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括5-200mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1-5mmol/L山梨酸钾、0.5-5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50-200mmol/LNaCL、0.1-4mmol/L吐温-20、3-10mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO100-200mmol/L、稳定剂160-180mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，其特征是：所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，所述改性稳定剂包括蛋白胨10-15份、山梨醇10-15份、氨基酸类2-8份、多肽10-30份、甘油5-15份、离子螯合剂1-5份、三氮化钠0.01-1份、硫酸亚铁20-40份。
通过采用上述技术方案，本发明采用山梨酸钾作为防腐剂，极大降低毒害作用，并且山梨酸钾与巴比妥氯化钠缓冲液的相容性较高，均属于亲水类物质，能够更进一步促进R1试剂和R2试剂的结合。
本发明进一步设置为：所述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠40-60份，加氯化钠30-45份及适量水直至溶解，另取明胶2-10份加水适量，加热溶解后加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5-200mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液。
通过采用上述技术方案，值得注意的是，适量的水分为本领域的人的公知技术手段，只需达到溶解即可。采用上述方法能够很轻松地制备得到巴比妥氯化钠缓冲液。
本发明进一步设置为：还包括有壳聚糖30-50份。
本发明进一步设置为：对壳聚糖进行改性，所述改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30-50份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
通过采用上述技术方案，释放速率会明显下降，进而延长R1试剂和R2试剂未使用的保存时间，这是因为壳聚糖的厚度较大，并且壳聚糖的交联度较大，容易形成致密的网状结构，进而减缓处于壳聚糖内的药物的释放速度。
本发明进一步设置为：所述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
通过采用上述技术方案，利用上述方法可以很方便地得到R2试剂。
本发明进行检测的原理是：利用抗原抗体反应，先加入试剂1，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露；然后加入抗人BNP抗体的纳米微球溶液，使BNP抗体的纳米微球与样本中相应的BNP抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的BNP含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与已知浓度的BNP参考校准品进行比较，则可计算出样本中BNP的含量。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的保存时间长，能够长距离和长时间的运输。
2、本发明添加了改性稳定剂，极大地增强了R1试剂，R2试剂和参考校准品的稳定性，从而达到了延长保存时间的目的，并且释放速率会明显下降，进而增加R1试剂和R2试剂的保存时间，这是因为壳聚糖的厚度较大，并且壳聚糖的交联度较大，容易形成致密的网状结构，大大延长保存时间，值得注意的是，这并不影响检测时的速率。
具体实施方式
实施例1：
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括5mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1mmol/L山梨酸钾、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50mmol/LNaCL、0.1mmol/L吐温-20、3mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括5mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO100mmol/L、稳定剂160mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，三者重量比为1:1:1，所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，上述改性稳定剂包括蛋白胨10份、山梨醇10份、氨基酸类2份、多肽10份、甘油5份、离子螯合剂1份、三氮化钠0.01份、硫酸亚铁20份、壳聚糖30份。
上述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠40份，加氯化钠30份及适量水直至溶解，另取明胶2份加水适量，加热溶解后并加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5mmol/L的巴比妥氯化钠缓冲液。
对壳聚糖进行改性，所述改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
上述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒的制备方法，按相应的浓度称取5mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1mmol/L山梨酸钾、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50mmol/LNaCL、0.1mmol/L吐温-20、3mmol/LPEG-6000，其余为纯化水混合即可得到R1；用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂，即可得到R2。
按相应的浓度称取CAPSO100mmol/L、稳定剂160mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水，混合即可得到参考校准品。
按重量份数称取蛋白胨10份、山梨醇10份、氨基酸类2份、多肽10份、甘油5份、离子螯合剂1份、三氮化钠0.01份、硫酸亚铁20份、壳聚糖30份，并对壳聚糖进行改性，改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。随后混合即可得到改性稳定剂。并在R1/R2和参考校准品中加入改性稳定剂直至重量百分比占比为5%。另外壳聚糖对抗脑钠肽抗体的亲和度非常高，起到让抗脑钠肽抗体延缓释放的速率作用。
本发明可以根据实际需要调整壳聚糖的厚度进而调整缓释速率。
实施例2：一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括50mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、1.5mmol/L山梨酸钾、1.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、75mmol/LNaCL、1mmol/L吐温-20、5mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO125mmol/L、稳定剂165mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，三者重量比为1:1:1，所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，所述改性稳定剂包括蛋白胨11份、山梨醇11份、氨基酸类3.5份、多肽15份、甘油7.5份、离子螯合剂1.5份、三氮化钠0.25份、硫酸亚铁25份、壳聚糖35份。
上述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠45份，加氯化钠33份及适量水直至溶解，另取明胶4份加水适量，加热溶解后并加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5mmol/L的巴比妥氯化钠缓冲液。
对壳聚糖进行改性，所述改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒35份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
上述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒的制备方法，按相应的浓度称取5mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1mmol/L山梨酸钾、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50mmol/LNaCL、0.1mmol/L吐温-20、3mmol/LPEG-6000，其余为纯化水混合即可得到R1；用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂，即可得到R2。
按相应的浓度称取CAPSO100mmol/L、稳定剂160mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水，混合即可得到参考校准品。
按重量份数称取蛋白胨10份、山梨醇10份、氨基酸类2份、多肽10份、甘油5份、离子螯合剂1份、三氮化钠0.01份、硫酸亚铁20份、壳聚糖30份，并对壳聚糖进行改性，改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。随后混合即可得到改性稳定剂。并在R1/R2和参考校准品中加入改性稳定剂直至重量百分比占比为5%。
实施例3：一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括100mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、2.5mmol/L山梨酸钾、2.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、125mmol/LNaCL、2mmol/L吐温-20、6.5mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括100mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO150mmol/L、稳定剂170mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，三者重量比为1:1:1，所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，所述改性稳定剂包括蛋白胨12.5份、山梨醇12.5份、氨基酸类5份、多肽20份、甘油10份、离子螯合剂2.5份、三氮化钠0.5份、硫酸亚铁30份、壳聚糖40份。
上述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠50份，加氯化钠35份及适量水直至溶解，另取明胶6份加水适量，加热溶解后并加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5mmol/L的巴比妥氯化钠缓冲液。
对壳聚糖进行改性，所述改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒40份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
上述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒的制备方法，按相应的浓度称取5mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1mmol/L山梨酸钾、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50mmol/LNaCL、0.1mmol/L吐温-20、3mmol/LPEG-6000，其余为纯化水混合即可得到R1；用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂，即可得到R2。
按相应的浓度称取CAPSO100mmol/L、稳定剂160mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水，混合即可得到参考校准品。
按重量份数称取蛋白胨10份、山梨醇10份、氨基酸类2份、多肽10份、甘油5份、离子螯合剂1份、三氮化钠0.01份、硫酸亚铁20份、壳聚糖30份，并对壳聚糖进行改性，改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。随后混合即可得到改性稳定剂。并在R1/R2和参考校准品中加入改性稳定剂直至重量百分比占比为5%。
实施例4：一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括150mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、3.5mmol/L山梨酸钾、3.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、150mmol/LNaCL、3mmol/L吐温-20、8mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括150mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO150mmol/L、稳定剂175mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，三者重量比为1:1:1，所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，所述改性稳定剂包括蛋白胨14份、山梨醇14份、氨基酸类6份、多肽25份、甘油12份、离子螯合剂3.5份、三氮化钠0.75份、硫酸亚铁35份、壳聚糖45份。
上述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠55份，加氯化钠42份及适量水直至溶解，另取明胶8份加水适量，加热溶解后并加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5mmol/L的巴比妥氯化钠缓冲液。
对壳聚糖进行改性，所述改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒45份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
上述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒的制备方法，按相应的浓度称取5mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1mmol/L山梨酸钾、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50mmol/LNaCL、0.1mmol/L吐温-20、3mmol/LPEG-6000，其余为纯化水混合即可得到R1；用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂，即可得到R2。
按相应的浓度称取CAPSO100mmol/L、稳定剂160mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水，混合即可得到参考校准品。
按重量份数称取蛋白胨10份、山梨醇10份、氨基酸类2份、多肽10份、甘油5份、离子螯合剂1份、三氮化钠0.01份、硫酸亚铁20份、壳聚糖30份，并对壳聚糖进行改性，改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。随后混合即可得到改性稳定剂。并在R1/R2和参考校准品中加入改性稳定剂直至重量百分比占比为5%。
实施例5：一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括200mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、5mmol/L山梨酸钾、5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、200mmol/LNaCL、4mmol/L吐温-20、10mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO200mmol/L、稳定剂180mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，三者重量比为1:1:1，所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，所述改性稳定剂包括蛋白胨15份、山梨醇15份、氨基酸类8份、多肽30份、甘油15份、离子螯合剂5份、三氮化钠1份、硫酸亚铁40份、壳聚糖50份。
上述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠60份，加氯化钠45份及适量水直至溶解，另取明胶10份加水适量，加热溶解后并加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5mmol/L的巴比妥氯化钠缓冲液。
对壳聚糖进行改性，所述改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒50份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
上述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒的制备方法，按相应的浓度称取5mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1mmol/L山梨酸钾、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50mmol/LNaCL、0.1mmol/L吐温-20、3mmol/LPEG-6000，其余为纯化水混合即可得到R1；用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂，即可得到R2。
按相应的浓度称取CAPSO100mmol/L、稳定剂160mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水，混合即可得到参考校准品。
按重量份数称取蛋白胨10份、山梨醇10份、氨基酸类2份、多肽10份、甘油5份、离子螯合剂1份、三氮化钠0.01份、硫酸亚铁20份、壳聚糖30份，并对壳聚糖进行改性，改性过程为：称取上述壳聚糖，并溶于300ml体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。随后混合即可得到改性稳定剂。并在R1/R2和参考校准品中加入改性稳定剂直至重量百分比占比为5%。
实施例1-5中的离子螯合剂选取三聚磷酸钾，并可向连云港东泰食品配料有限公司购买得到。
实施例1-5中的抗人脑钠肽多克隆抗体，外购或委托浙江伊利康生物技术研发中心按常规方法制备；该抗体仅与人脑钠肽反应，与其他抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试剂要求。纳米微球，市场上有许多商品化的纳米微球可供选择，包括美国Sigma公司、德国默克公司、日本UNF公司；可选择多种直径的纳米微球，本实施例采用了直径为80-120nm的微球进行实验，相应的试剂检测波长为600nm。重组脑钠肽纯品可外购或由浙江伊利康生物技术研发中心制备，用于制备本试剂所需参考校准品。其余生化原料均可外购。离子螯合剂选取磷酸二氢钙，氨基酸类选取甘氨酸，壳聚糖可向山东陆海蓝圣生物科技股份有限公司购买。
本发明添加了改性稳定剂，极大地增强了R1试剂，R2试剂和参考校准品的稳定性，并且释放速率会明显下降，进而增加R1试剂和R2试剂的保存时间，这是因为壳聚糖的厚度较大，并且壳聚糖的交联度较大，容易形成致密的网状结构，进而减缓处于壳聚糖内的药物的释放速度。
测试例1：与实施例3的区别在于去除改性稳定剂，其余部分与实施例3相同。
测试实验1：按照相同重量份数称取实施例1-5及测试例1，并在25℃的条件下持续观察90D（天）用肉眼观察得到表1
表1为实施例1-5及测试例1的性能表
实施例3与测试例1对比可以得到缺少改性稳定剂后，稳定性下降明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的设计构思之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，包括试剂R1、试剂R2，参考校准品，R1：一种使样品中脑钠肽抗原位点充分暴露，有利于与抗脑钠肽抗体试剂充分结合的脑钠肽溶液，包括5-200mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液、0.1-5mmol/L山梨酸钾、0.5-5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、50-200mmol/LNaCL、0.1-4mmol/L吐温-20、3-10mmol/LPEG-6000，其余为纯化水；b、试剂R2：一种结合有抗人脑钠肽抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、重量比例0.1%-5%的脑钠肽抗体的纳米微球及与脑钠肽抗体重量比为3:1的山梨酸钾，微球直径为50-150nm；c、参考校准品：一种用来与样品比较，进行结果计算的脑钠肽参考校准品，包括CAPSO100-200mmol/L、稳定剂160-180mmol/L、与稳定剂重量比为3:1的山梨酸钾以及根据所需要的脑钠肽参考校准品浓度添加的相应量的重组脑钠肽纯品，其余为纯化水；其中，所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠的混合，其特征是：所述试剂R1、试剂R2，参考校准品均含有重量百分比为5%的改性稳定剂；按照重量份数，所述改性稳定剂包括蛋白胨10-15份、山梨醇10-15份、氨基酸类2-8份、多肽10-30份、甘油5-15份、离子螯合剂1-5份、三氮化钠0.01-1份、硫酸亚铁20-40份。
2.根据权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，其特征是：所述巴比妥氯化钠缓冲液的制备方法为：取巴比妥钠40-60份，加氯化钠30-45份及适量水直至溶解，另取明胶2-10份加水适量，加热溶解并加入上述溶液中，然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再用水稀释至5-200mmol/L巴比妥氯化钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，其特征在于，还包括：壳聚糖30-50份。
4.根据权利要求2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，其特征是：对壳聚糖进行改性，所述改性过程为，称取上述壳聚糖，并溶于体积比为1:1的盐酸与醋酸的混合溶液中，盐酸和醋酸的浓度均为5%，将含有三聚磷酸钠的茶碱颗粒30-50份倒入壳聚糖盐酸溶液中制成一种多聚电解质的混合膜，三聚磷酸钠与茶碱颗粒的重量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒，其特征是：所述R2制备方法是：用pH7.4的三羟基甲基氨基甲烷缓冲液在室温下稀释重量比例为1:1的抗人脑钠肽抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混匀后室温震荡吸附2小时，加入含0.1%BSA缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811157021.9A CN109283340A (zh) | 2018-09-30 | 2018-09-30 | 一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811157021.9A CN109283340A (zh) | 2018-09-30 | 2018-09-30 | 一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109283340A true CN109283340A (zh) | 2019-01-29 |
Family
ID=65182572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811157021.9A Withdrawn CN109283340A (zh) | 2018-09-30 | 2018-09-30 | 一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109283340A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110596367A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-12-20 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法 |
-
2018
- 2018-09-30 CN CN201811157021.9A patent/CN109283340A/zh not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110596367A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-12-20 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Björn-Rasmussen et al. | Food iron absorption in man. I. Isotopic exchange between food iron and inorganic iron salt added to food: studies on maize, wheat, and eggs | |
| Speich et al. | Reference values for ionized, complexed, and protein-bound plasma magnesium in men and women. | |
| CN102621332B (zh) | 基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒 | |
| CN101949942B (zh) | 游离三碘甲状腺原氨酸定量检测试剂盒 | |
| CN106932589A (zh) | 测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法 | |
| CN102944679A (zh) | 一种胶乳比浊法进行视黄醇结合蛋白检测的试剂盒 | |
| CN101717814A (zh) | 测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒 | |
| CN102608325B (zh) | 心型脂肪酸结合蛋白(h-fabp)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法) | |
| CN101819208B (zh) | 一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒 | |
| CN104215772A (zh) | 心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN103389383A (zh) | 一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒 | |
| CN109187971A (zh) | 神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN104714031A (zh) | 一种心肌梗死快速检测试剂盒 | |
| Rose et al. | Long-chain fatty acid-binding to albumin: re-evaluation with directly measured concentrations | |
| CN109283340A (zh) | 一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试盒 | |
| Hood | A–Z of clinical chemistry: a guide for the trainee | |
| JPS6069557A (ja) | 不飽和鉄結合能の測定方法 | |
| Hippe et al. | Solid-phase cobalamin assay using cobalamin-binding protein from dog stomach | |
| CN106443004A (zh) | 一种快速定量同时检测cTnI、H‑FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 | |
| CN102998289B (zh) | 基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| CN108107222A (zh) | 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白免疫检测试剂及其制备和检测方法 | |
| CN105974129A (zh) | 一步均相h-fabp检测试剂盒及其制备和使用方法 | |
| Lin et al. | A rapid assay for actin-associated high-affinity cytochalasin binding sites based on isoelectric precipitation of soluble protein | |
| CN109239357A (zh) | Ⅳ型胶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
| Bilić et al. | An improved fluorometric method for measurement of alloxan in biological fluids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190129 |