CN113740522B - 一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用 - Google Patents

一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用，属于生物技术领域。该抗原修复液是浓度为1～1000mM的铵盐缓冲液，所述铵盐缓冲液能够与醛基反应。本发明首次将铵盐缓冲液用于固定后细胞的抗原修复上，有效的恢复或暴露被屏蔽或封闭的抗原(或抗原表位)，因此避免了检测当中假阴性结果的出现，增加了检测的正确率，同时有助于寻找的新的自身抗体。本发明还公开了采用上述抗原修复液制备细胞爬片的方法，具有操作时间短，步骤简单、细胞不掉片、实验结果一致性好等特点，制备得到的细胞爬片保质期长，抗原的信号在较长的一段时间维持不变。

Description

一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用。
背景技术
在生物科学领域中，利用免疫细胞化学方法检测细胞和组织中的抗原，为抗原的定位及定性提供了重要信息，因此广泛被用于诊断与鉴别诊断中。由于组织或细胞爬片在制作过程中，使用化学试剂去进行固定，固定后的部分抗原在进行后续染色时可能不会被检测到，因此产生了抗原“屏蔽或封闭”的概念，在此情况下，抗原(或特定的表位)被隐藏起来，从而导致识别该抗原(或特定的表位)的抗体无法与其结合。为了解决上述问题，更好地暴露出抗原，所采取的方法就是进行抗原修复。
目前主要的抗原修复方法有热修复和酶法修复，这两种方法在以组织为载体的免疫组化上应用较多，而针对于以细胞为载体的免疫荧光法的修复，研究和应用的比较少。究其原因可能是：(1)热修复在高温下易导致细胞爬片掉片且耗时长，操作繁琐；(2)酶法修复易受酶的种类、作用时长、作用温度等因素影响，从而导致结果一致性较差；(3)即便是使用了热修复法或酶法进行修复，且难以达到好的修复效果。1992年，Soltys B J等人将SDS应用至固定后细胞的抗原修复上，其原理是基于十二烷基苯磺酸钠(SDS)的变性作用(Interrelationships of endoplasmic reticulum,mitochondria,intermediatefilaments,and microtubules&ndash；a quadruple fluorescence labelingstudy.Biochem Cell Biol,70:1174-1186.)。J.M.Robinson在其文章中指出，虽然SDS可以修复某些抗原表位，但并非所有的抗原表位都能被修复(J.M.Robinson,D.D.Vandré.Department Antigen retrieval in cells and tissues:enhancement with sodiumdodecyl sulfate.Histochem Cell Biol 2001,116:119–130)。使用SDS进行抗原修复，如果SDS不能彻底的清洗，会导致孵育的抗体变性，进而影响实验结果。
当前的检测技术主要存在的问题如下：
(1)以细胞为底物的免疫荧光法，因固定剂的使用导致抗原(或特定的表位)被封闭，严重降低了检测的正确率和灵敏度；
(2)以细胞为底物的免疫荧光法，因固定剂的使用导致抗原(或特定的表位)被封闭，限制了该法在寻找新的自身抗体上的应用；
(3)现有的修复抗原的方法，操作步骤繁琐，修复条件及修复结果受多种因素的影响，不利于得到稳定且效果好的实验结果。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种抗原修复液，该抗原修复液是浓度为1～1000mM的铵盐缓冲液，所述铵盐缓冲液能够与醛基反应。
优选地，所述的铵类抗原修复液中还加入十二烷基磺酸钠，且十二烷基磺酸钠占该抗原修复液质量的0.025％～0.25％。
优选地，所述铵盐包括NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)2CO3、NH4COOH、NH4HCO3和三羟甲基氨基甲烷。
本发明还公开了采用上述的抗原修复液制备细胞爬片的方法，包括以下步骤：
1)将生长好细胞的爬片使用甲醛溶液、多聚甲醛溶液或戊二醛溶液进行固定，固定后进行洗涤；
2)将经过步骤1)处理的爬片采用所述的抗原修复液进行终止处理；
3)将经过步骤2)处理的细胞爬片使用磷酸盐缓冲液进行洗涤；
4)将经过步骤3)洗涤后的爬片干燥后保存，即获得细胞爬片。
优选地，所述生长好细胞的爬片，其制备方法如下：
向已铺好细胞的爬片通过瞬时转染转入重组载体，待细胞生长至24～72h即得；或者，
将通过稳定转染获得的稳定细胞系复苏，铺至爬片上，待细胞密度生长至≥80％即得。
优选地，步骤1)中：
使用的甲醛、多聚甲醛或戊二醛浓度为大于0.5％时，修复液的使用可恢复阳性信号，延长保质期；
使用的甲醛、多聚甲醛或戊二醛浓度为0.5％及低于0.5％的浓度时，修复液的使用可延长保质期。
优选地，步骤2)中，终止处理时间为1～10min。
优选地，步骤4)中，干燥的方法包括烘箱干燥、微波炉干燥、金属浴干燥、热风吹及其他可用的干燥仪器，干燥时间为细胞爬片彻底干燥即可，将干燥后的细胞爬片于≤4℃下密封保存。
本发明还公开了采用上述的制备细胞爬片的方法制备得到的细胞爬片。
本发明还公开了采用上述的细胞爬片在制备免疫荧光法自身抗体诊断试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的抗原修复液，首次将铵类盐缓冲液用于固定后细胞的抗原修复上，铵类盐可与带有醛基的固定剂发生中和反应，有效的恢复或暴露被屏蔽或封闭的抗原(或抗原表位)，避免了检测当中假阴性结果的出现，增加了检测的正确率，同时也有助于寻找的新的自身抗体。
进一步优选地，将铵盐缓冲液与SDS混合后，对细胞和组织进行修复也具有很好的效果。
本发明还公开了采用上述抗原修复液制备细胞爬片的方法，具有操作时间短，步骤简单、细胞不掉片、实验结果一致性好等特点，制备得到的细胞爬片保质期长，抗原的信号在较长的一段时间维持不变，能够将其应用至免疫荧光法自身抗体诊断试剂盒，拓展诊断试剂盒的研发与应用。
附图说明
图1为不同浓度甲醛固定的细胞爬片荧光照片；
图2为经50mM(NH4)2SO4修复的不同浓度甲醛固定的细胞爬片荧光照片；
图3为加入不同种类的抗原修复液修复后的细胞爬片荧光照片；
图4为对比例1分别采用0.1％胰蛋白酶和0.4％胃蛋白酶修复的细胞爬片荧光照片；
图5为对比例2采用热修复法修复的细胞爬片荧光照片。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
实施例1
1、重组载体的获得
对本实验室构建好的重组载体pCDNA3.1-MOG进行质粒大提，备用；
2、细胞转染
(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％的FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代至6孔板中，每孔铺满直径1cm的细胞爬片，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)基因转染：将步骤1提取好的pCDNA3.1-MOG质粒按照PEI转染方法进行转染，转染4～6小时更换新鲜培养液，48小时后固定染色终止生长。
实施例2
实验步骤如下：
1、洗涤：将实施例1转染好质粒pCDNA3.1-MOG的细胞爬片使用PBS洗涤2次；
2、固定：加入不同浓度的甲醛固定4min；不同浓度的甲醛浓度分别为0.5％、1.5％、2.5％、3.5％、4.5％加入5.5％。
3、洗涤：甲醛固定后的细胞爬片用PBS洗涤3次；
4、烘干：使用37℃烘箱干燥烘干；
5、一抗孵育：孵育阳性样本，一抗时间1小时；
6、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
7、二抗孵育：二抗孵育时间40min；
8、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
9、观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：不同浓度甲醛固定的结果如图1所示，由实验结果可知，甲醛浓度越高，对信号的封闭程度越严重。
实施例3
实验步骤
1、取实施例2步骤2不同浓度的甲醛固定好的细胞爬片，PBS洗涤3次；
2、加入50mM(NH4)2SO4缓冲液进行终止4min；
3、洗涤：终止后的细胞爬片用PBS洗涤3次；
4、烘干：使用37℃烘箱干燥烘干；
5、一抗孵育：孵育阳性样本，一抗时间1小时；
6、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
7、二抗孵育：二抗孵育时间40min；
8、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
9、观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：由图2可知，与实施例1相比，不同浓度固定的甲醛爬片经过50mM(NH4)2SO4终止后的细胞爬片阳性信号明显增强，说明(NH4)2SO4对MOG抗原的修复具有很好的作用。
实施例4
1、取实施例2步骤2的3.5％甲醛固定好的细胞爬片，PBS洗涤3次；
2、分别用50mM不同种类的铵盐缓冲液、0.25％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.25％十二烷基磺酸钠与(NH4)2SO4的混合缓冲液，终止4min；
其中，不同种类的铵盐缓冲液及铵盐包括(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2CO3、NH4COOH和Tris；
3、洗涤：终止后的细胞爬片用PBS洗涤3次；
4、烘干：使用37℃烘箱干燥烘干；
5、一抗孵育：孵育阳性样本，一抗时间1小时；
6、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
7、二抗孵育：二抗孵育时间40min；
8、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
9、观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：由图3可知，与实施例1对比，NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)2CO3、NH4COOH、Tris、十二烷基磺酸钠缓冲液、(NH4)2SO4和十二烷基磺酸钠的混合缓冲液均起到了很好的抗原修复效果，阳性信号明显。
实施例5
取实施例2干燥后的0.5％的甲醛固定的细胞爬片，实施例3的经50mM的(NH4)2SO4修复的0.5％的甲醛固定爬片放置不同的温度即，37℃、4℃和-20℃保存，定期取出爬片验证阳性信号。结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003241834310000071
由表1可以看出，经过铵类盐终止后的细胞爬片，阳性信号持续时间明显增加。
对比例1
1、取实施例2步骤2的3.5％甲醛固定好的细胞爬片，PBS洗涤3次；
2、将0.1％胰蛋白酶液(PBST配制，含有0.2％的tween20)、0.4％胃蛋白酶液(PBST配制，含有0.2％的tween20)置37℃培养箱提前预热，固定好的爬片也放置37℃培养箱预热，待温度约为37℃时，将酶液加至细胞爬片上，于37℃消化20min；
3、洗涤：酶液消化后的爬片用PBS洗涤3次；
4、烘干：使用37℃烘箱干燥烘干；
5、一抗孵育：孵育阳性样本，一抗时间1小时；
6、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
7、二抗孵育：二抗孵育时间40min；
8、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
9、观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：参见图4，从图4中可以看出，与实施例2的3.5％甲醛固定细胞爬片对比，酶法修复后阳性信号并未得到明显的改善。
对比例2
1、取实施例2步骤2的3.5％甲醛固定好的细胞爬片，PBS洗涤3次；
2、将抗原修复缓冲液(100mM Tris，5％[w/v]尿素，pH9.5)预热至95℃。具体方法为：将装有缓冲液的载玻片染色缸置于水浴锅中，水浴锅的温度设为95℃；
3、在95℃下加热细胞爬片10分钟；
4、洗涤：修复后的爬片用PBS洗涤3次；
5、烘干：使用37℃烘箱干燥烘干；
6、一抗孵育：孵育阳性样本，一抗时间1小时；
7、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
8、二抗孵育：二抗孵育时间40min；
9、洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
10、观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
实验结果：参见图5，由图5可以看出，虽然热修复法信号有明显的修复，但是细胞爬片掉片严重。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种采用抗原修复液制备细胞爬片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将生长好细胞的爬片使用甲醛溶液、多聚甲醛溶液或戊二醛溶液进行固定，固定后进行洗涤；
2）将经过步骤1）处理的爬片采用抗原修复液进行终止处理；
3）将经过步骤2）处理的细胞爬片使用磷酸盐缓冲液进行洗涤；
4）将经过步骤3）洗涤后的爬片干燥后保存，即获得细胞爬片；
其中，所述的抗原修复液是浓度为1~1000mM的铵盐缓冲液，所述铵盐缓冲液能够与醛基反应；所述铵盐为(NH4)2SO4；在所述的铵盐缓冲液中加入十二烷基磺酸钠，且十二烷基磺酸钠占该抗原修复液质量的0.025%~0.25%；
使用的甲醛、多聚甲醛或戊二醛浓度为大于0.5%时，修复液的使用能够恢复阳性信号，延长保质期；
使用的甲醛、多聚甲醛或戊二醛浓度为小于等于0.5%的浓度时，修复液的使用能够延长保质期；
所述生长好细胞的爬片，其制备方法如下：
向已铺好细胞的爬片通过瞬时转染转入重组载体，待细胞生长至24~72h即得；或者，将通过稳定转染获得的稳定细胞系复苏，铺至爬片上，待细胞密度生长至≥80%即得。
2.根据权利要求1所述的采用抗原修复液制备细胞爬片的方法，其特征在于，步骤2）中，终止处理时间为1~10min。
3.根据权利要求1所述的采用抗原修复液制备细胞爬片的方法，其特征在于，步骤4）中，干燥的方法包括烘箱干燥、微波炉干燥、金属浴干燥、热风吹干燥，干燥时间为细胞爬片彻底干燥即可，将干燥后的细胞爬片于≤4℃下密封保存。
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