JPH05505239A - 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 改良されｔ：免疫組織化学的染色法およびそのための試薬発明の分野 本発明はスライドの免疫組織化学的に染色する改良された方法、と（に自動化さ れた方法、およびそのための試薬に関する。

発明の背景 現在、免疫染色のために、一般にペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を使用する４つ の主な方法が認識されている。これらの方法は試料の中の検出すべき抗原に対し て特異的な抗体と複合化する、その抗原の免疫反応に基づく。これらの方法は、 主として、抗原−抗体の複合体を検出する方法において異なる。これらの方法は 直接的方法、間接的方法−次または第１抗体の種に対して特異的な酵素接合二次 抗体を使用する間接的方法、ベルオキシダーゼー抗ベルオキシダーゼ（ＰＡＰ） 　、およびビオチン接合二次抗体およびビオチン接合ペルオキシダーゼおよびア ビジンまたはストレプトアビジンの複合体を使用する、間接的ビオチン−アビジ ン法である。

免疫組織化学的方法のすべて、ならびに他の免疫化学的方法は、試薬の添加、イ ンキュベーションおよび洗浄の７−ケンスから成る、多工捏の手順である。これ らの手順の大部分は高度に訓練した人員を必要とし、そして結果は実験室の間で 有意に変化することがある。自動化されたシステムはコストの節約、スライドの 調製の均一性、および手順のヒトの誤差の減少を探索してきている。

自動化された方法およびマニュアルの方法の両者について、ある数の考膚すべき 重要な点が存在する。スライドから試料の損失を回避するために注意しなくては ならない。試薬の適用の間に試料をよく洗浄することは、残留物が増幅されるの で、とくに、結合しない抗体を除去することは必須である。過剰の液体を除去し て望ましくない抗体の希釈を回避し、なお試料は決して乾燥させないようになく てはならない。十分な抗体な試薬を適用して、試料が存在しつるスライドの区域 を完全にカバーしなくてはならないが、不用なものは絶対最小値に保持しなくて はならない。

さらに、免疫組織化学的方法ならびに免疫化学的方法において使用される試薬の 多数、例えば、酵素溶液およびペルオキシダーゼの発色試薬は、使用温度におい ておよび室温においてさえ制限された安定性を有する。これは試薬の頻繁な調製 を必要とする。さらに、非特異的抗体の結合は誤まった結果に導き、問題を残す 。

結果を改良し、そして試薬の調製を最小とする方法および試薬は、マニュアルお よび自動化の両者の免疫組織化学的方法を促進するであろう。

改良の多くは、関係する免疫化学的、例えば、酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬ ＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイおよび正常部位ハイブリダイゼーションに容易に適 用することができる。

先行技術の説明 コスグロウブ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）ら、ＡＣＬ　ｐｐ２３−２７　（１９８９年 １２月）は、免疫染色法、と（にペルオキシダーゼ染色法、および自動化染色装 置を記載している。ブリカチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）および同僚達しブリカチ（Ｂｒ ｉｇａｔｉ）ら、ジャーナル・オブ・ヒストテクノロジ−（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ）↓１：］−６５−１８３　（１，９８８）；ウンガー（Ｕｎ ｇｅｒ）ら、ジ＋−ナル・、ｉブ・ヒストテクノロジー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ）１１．：２５３−２５８　（１９８８）コは、フィンシャー（ Ｆｉｓｈｅｒ）の自動化ワークステーション（これは免疫組織化学的染色法およ び正常部位ハイブリダイゼーション法）および自動化法において使用する試薬を 記載している。さらに、このシステムおよび試薬は米国特許第４．７７７．０２ ０号、米国特許第４．７９８．７０６号および米国特許第４．８０１．４３１号 に記載されている。それらの装置の各々は、高価な（抗体含有）試薬を保存する 異なる方法を使用する。

ストロス（Ｓｔｒｏｓｓ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（Ｊ 、Ｃ１ｉ、Ｐａｔｈｏｌ、）４２＋１０６−１１２　（１９８９）は、抗体含有 試薬のマニュアル適用に従いスライドをプロセシングする、自動化された組織染 色システムを記載している。スターク（Ｓｔａｒｋ）ら、ジャーナル・オブ・イ ムノロジカル・メソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．Ｍｅ　ｔｈｏｄｓ）１０７　 ：８９−９２　（１９８８）は、マイクロプロセンサー制御の自動化染色システ ムを記載している。

前述の参考文献の各々の全体はここに引用によって加える。

発明の要約 本発明は、免疫化学的試薬を使用してスライドを染色する改良された方法を提供 する。好ましい実施態様において、この方法は自動化されたプロセスにおいて使 用される。この方法は次の工程からなる。スライドのアッセイ領域（組織の切片 を含有する領域）を水および洗浄剤からなる改良されたリンス溶液で洗浄する。

蒸発抑制液体をスライドに適用してアッセイ領域をカバーする。アンマスキング を必要とする抗原について、組織の切片を改良された、安定化されたタンパク質 分解酵素の溶液と組み合わせる。スライドをリンスし、そして蒸発抑制液体をス ライドに再度適用する。第２抗体と同一の種からのグロブリンを含有する改良さ れた希釈剤の中の一次抗体を組織の切片と、抗体の結合を実質的に完結するため に十分な時間の間、組み合わせる。スライドをリンスし、そして蒸発抑制液体を 再び適用する。改良された希釈剤の中の標識した第２抗体を組織の切片と、抗体 の結合を実質的に完結するために十分な時間の間、組み合わせる。スライドをリ ンスし、そして蒸発抑制液体を再び適用する。好ましい実施態様において、安定 化されたジアミノベンジン（ＤＡＢ）溶液を包含する、発色試薬を組織の切片と 、発色のために十分な時間の間、組み合わせる。リンス、および、必要に応じて 、ＤＡＢ色増強および／または反対染色後、組織の切片は分析に準備された状態 にある。

この方法において使用した改良された試薬を、また、記載する。

発明の詳細な説明 本発明は、一般に免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色手順に、および、とくに、ペル オキシダーゼの標識っけ試薬を使用するＩＨＣ法において有用である、改良され た組成物およびアッセイ法の工程を提供する。しかしながら、組成物および方法 の工程の多（は、当業者に明瞭であるように、より一般の応用可能性を有する。

現在、４つの主な方法は免疫染色に一般に使用される。これらの方法は、抗原に 対して特異的な抗体と複合化する試料の中の抗原の免疫反応に基づく。これらの 方法は抗原−抗体の複合体を検出する方法が異なる。

これらの方法の各々は標識された抗体を使用する。

ＩＨＣ技術を包含する、イムノアッセイ技術に適当な標識はよく知られている。

それらの標識は、次のものを包含する：直接観察または測定することができる標 識、例えば、放射能カウンティング装置で測定することができる放射線標識；分 光光度測定で視的に観察または測定することができる顔料、色素または他の色素 源；スピン標識分析器で測定できるスピン標識：および紫外線下で可視化または 、例えば、標準のフルオロメーターで測定することができる蛍光部分。標識はル ミネセンス物質、例えば、リンまたはフルオロアン、バイオルミネセンス物質、 化学ルミネセンス物質または金属含有金属であることができる。

バックグラウンドからの増幅およびより大きい分布は、酵素の標識または酵素の 標識つけ系の使用により達成することができる。酵素は基質を破壊して色素源を 生成し、スライド上の抗原／抗体複合体の部位を可視化する。基質は好ましくは 測定可能な生成物を生成するよに選択する。

発色性および蛍光発生性の酵素は好ましい。これらは、それぞれ、色素源および 蛍光源を生成する基質が既知である酵素である。

好ましい色素源の基質および酵素の組み合わせは、オキシドリダクターゼ、例え ば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび区別する色（それぞれ、褐色および 赤色）を生ずる基質、例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびアミノ−エ チルカルバゾール（Ａ　Ｅ　Ｃ）を使用する。

任意の他の酵素／色素源生成基質の組み合わせは、それが区別する着色を提供す る場合、使用することができる。

使用することができる蛍光源の基質との酵素の組み合わせは、例えば、米国特許 第４．１９０．４９６号、その開示をここに引用によって加える、に記載されて いる。好ましい蛍光源の基質およびそれに対応する適当な酵素は、次のものを包 含する・適当な基質がホモバニル酸または４−ヒドロキシ−３−メトキン−フェ ニル酢酸であるセイヨウワサビペルオキシダーゼ、適当な基質が４−メチルウペ リフェリルーβ−Ｄ−ガラクトンドであるベーターガラクトシダーゼ、適当な基 質が４−メチルウベリフェリルホスフエート、他のウベリフェリルホスフェート 、例えば、４−カルポキシウベリフエリルホスフェート、およびウベリフェリル ホスフェート４−カルボキシアルキルエステルなどであるアルカリ性プロテアー ゼ。

直接法において、抗体は標識、好ましくは酵素、例えば、ペルオキシダーゼまた は蛍光団に化学的に結合する。標識した抗体試薬を添加したとき、抗体は抗原に 結合して抗原−抗体／標識接合体の複合体を形成する。蛍光団を直接可視化する ことができる。標識が酵素であるとき、酵素の基質を適用し、そして着色した沈 澱物は抗原−抗体／酵素接合体の複合体の位置に生成する。

検出すべき各抗原に対して特異的な標識した抗体を必要とする場合、直接法の適 用は制限される。このような試薬は一般に商業的に入手可能ではない。しかしな がら、試薬は入手可能でありかつ感度が十分であるとき、直接法は抗原の検出に 好ましい方法である。

第２の方法は、問題の抗原に対して特異的な第１または一次抗体を使用して、初 期の抗原−抗体？１合体を形成する。標識した抗体、好ましくは酵素接合抗体は 、第２または二次抗体と呼び、−次抗体の種に対して特異的であり、次いで、こ れを使用して一次抗体を検出する。標識が酵素であるとき、基質を添加して複合 体を検出する。このようにして、同一の動物種において生成した種々の一次抗体 を、可視化のために、単一の標識した第２抗体とともに使用することができる。

さらに、増強された感度は第２抗体の使用により達成される。

第３の方法は、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼまたはＰＡＰ法と呼び、 広く使用されている。ＰＡＰ法は３つの主な試薬を有する。

−次および第２抗体に加えて、ペルオキシダーゼをペルオキシダーゼに対する抗 体と複合化する。第２または連鎖抗体は一次抗体および抗ペルオキシダーゼ抗体 の両者に対して特異的である。この複合体は基質−色素源反応を使用して可視化 する。

第４法、間接的ビオチン−アビジン法、において、第２抗体をビタミンのビオチ ンに接合する。第３試薬は方法に依存して変化する。ＡＢＣ法において、アビジ ンまたはストレプトアビジンをビオチン接合ペルオキシダーゼの前にまたはそれ と同時に添加する。ＬＡＢ法において、第３試薬はペルオキシダーゼ標識アビジ ンまたはストレプトアビジンである。アビジン分子の遊離部位は第２抗体上のビ オチンに結合する。複合体を適当な発色団で可視化する。ビオチンについてのア ビジンの強い親和性は、この方法に、他の接合抗体の技術より大きい感度を与え る。

明瞭のためにかつ非限定的に、本発明は間接的ビオチン−アビジンペルオキシダ ーゼ法により例示される免疫組織化学的方法により記載する。

当業者に明らかなように、この方法の改良された工程は池の免疫組織化学的方法 において使用することができる。事実、改良された工程の多数は免疫化学的方法 に一般に使用することができる。試薬および工程のあるものは、スライドについ て実施される臨界的試薬濃度範囲を包含する、任意の小さい体積のアッセイにア ルカリ性プロテアーゼすることができる。当業者は認識するように、改良された 試薬は任意のＨＲＰ　Ｏ染色法において使用することができる。さらに、試薬の 多くは他の、ペルオキシダーゼ以下意の免疫組織化学的染色法ならびに他の免疫 化学的技術において使用することができる。例示的方法において使用する試薬の 各々は、この方法において使用する順序で、下に記載する。

ここで使用するとき、用語「アッセイ領域」は、任意の１または２以上の試薬ま たは試料、例えば、抗体または組織の切片を結合するスライドの区域を意味する 。用語「組織の切片」を使用して組織の切片（ポルマリン固定、パラフィンに埋 め込んだ切片および凍結した切片の両者）、スミア、骨髄吸引液、サイトスピン 、および評価、と（に組織学的評価のためにスライドに添付した池の試料物質を 呼ぶために使用する。

延−！ 改良された免疫化学的リンス溶液 試料またはアッセイ試薬をスライドに添付する先行技術のアッセイ法、例えば、 免疫化学的法（イムノアッセイおよび免疫組織化学的染色法）および正常部位ハ イブリダイゼーション（ｒｓＨ）法は、塩添加した緩衝液を使用して、染色また は他の抗体、酵素または核酸を含有する試薬の添加の間にスライドのアッセイ領 域をリンスする。ここで使用するとき、用語「塩」は、溶液中でイオンに解離す る物質を意味し、そして中性塩、例えば、ＮａＣＩならびに緩ＩｖＴ液、と（に 生物学的アッセイの手順において使用される緩衝液の中に見いだされる酸性、ア ルカリ性および両性の塩を包含する。

塩添加した緩衝液の使用は、非特異的抗体の結合を減少し、これによりバックグ ラウンドを減少する。塩の存在は、また、特異的抗原−抗体の相互作用、酵素活 性および試薬の核酸の反応が起こるために必要である。

スライドについて実施するアッセイのために、リンス溶液はスライドから完全に 排除されず、そして残留してアッセイ試薬を希釈する。さらに、大過剰のリンス 溶液を使用して有効な希釈を保証して、スライドのアッセイ領域における結合し ない試薬を除去してバックグラウンドのシグナルを減少する。したがって、免疫 組織化学的方法を包含する、スライド上で実施するほとんどの方法は、次の反応 を実施すべき緩衝液、通常リン酸塩緩衝化生理的塩類溶液（ＰＢＳ）　、リン酸 塩緩衝液（Ｐ　Ｂ）または同様な生理学的緩衝液で洗浄する。

洗浄液適用ステーション塩添加した緩衝液の使用は、一般に、欠点を有し、自動 化されたシステム、とくに自動化された免疫組織化学的システムにおいて、いく つかの問題を発生した。ＰＢＳの調製は、マニュアルまたは自動化された方法の いずれにおいても使用しても、時間を消費しかつ経費がかかる。さらに、ＰＢＳ および他の生理学的緩衝液の中に含有される塩は、自動化された染色計器に対し て有害である。塩の蓄積はクリーニングを困難とする。

今回、洗浄剤を有する実質的に塩不含の水溶液は、スライドのアッセイ領域の洗 浄に有効な水性リンス溶液であることが発見された。驚くべきことには、このリ ンス溶液の使用免疫組織化学的調製物における染色品質を改良する。さらに、改 良されたリンス溶液の使用は計器への有害な作用を排除する。

今回、試薬の溶液の中に存在する塩はすぐれた染色に十分であること、および新 規なリンス溶液は試薬の相互作用を妨害しないことことが発見された。さらに、 改良されたリンス溶液は調製が経費が低くかつ消費時間が少ない。さらに、溶液 のシートは均一に、より効果的にスライドを洗浄する。これは、スライドをリン ス溶液の浴の中に＋ｎすることができない自動化された環境においてとくに重要 である。

本発明のリンス溶液は、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性 リンス溶液の平らなシートを形成するために十分な量の洗浄剤から本質的に成る 。大部分の適用のために、塩不含溶液は水である。

しかしながら、核の形態学の増大された保存が免疫組織化学的応用におけるよう に望ましいとき、塩不含の水溶液はトリス（Ｔｒｉｓ）である。

塩不含の水溶液は、スライド上に残留物を残すことがある因子を含有すべきでは ない。したがって、水は蒸留水または、好ましくは、脱イオン水であることがで きる。水は免疫組織化学的染色の応用において塩不含の水溶液として有用である が、トリス（Ｔｒｉｓ）溶液の使用はリンス溶液に塩を添加しないで核の形態学 を維持し、そして免疫組織化学的染色のために好ましい。好ましくは、トリス（ Ｔｒｉｓ）の濃度は約０．０５〜約０５モル、より好ましくは約０１モルである 。

前述したように、洗浄剤はリンス溶液の平らなシートを形成して、スライド区域 全体を効果的にリンスすることを保証する。洗浄剤は成分免疫組繊化学的染色試 薬および免疫化学的試薬と相溶性であるべきであり、そしてタンパク質および膜 の成分の可溶体のために１゛化学的に使用されている非イオン性の生物学的洗浄 剤のいずれであることもできる。ポリオキンエチレンソルビタンおよびポリオキ シエチレンエーテルは好ましい。ポリオキンエチレンソルビタンモノラウレート ［名称ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で販売されている］およびポリオキシエチレ ン２３ラウリルエーテル［名称ブリ′）（Ｂｒ　ｉ　ｊ）３５で販売されている ］はより好ましい。両者の洗浄剤は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉ　 ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｌ　ミゾリー州、セントルイスを包含する種 々の源から入手可能である。

好ましくは、洗浄剤は約０．０１〜約５％（ｖ／ｖＬ、より好ましくは約０．０ ５〜約１％（ｖ／ｖ）　、最も好ましくは約００５〜約０．５％（ｖ／ｖ）の濃 度で使用する。最も好ましい実施態様において、濃度は０．０５％である。（こ こで使用するとき、特記しない限り、％は１００ｍ１の合計の体積の中のグラム 数である重量％を意味する。ここに論する他の洗浄剤を含有する溶液の各々につ いて、適当な洗浄剤およびそれらの濃度範囲はここに論する範囲から変化しない 。

リンス溶液は、好ましくは、保存剤、例えば、抗真菌剤および抗菌剤を溶液中の 微生物の成長を阻害する有効濃度で含む。免疫化学的反応を妨害しない保存剤は よ（知られている。保存剤の例は、ゲンタマイシン、ペニンジン、ストレプトマ イシンおよび、好ましい、チメロサルである。

アジ化ナトリウムはペルオキシダーゼ酵素を不活性化することが知られており、 そして好ましくはＨＲＰＯＩＨＣ染色試薬とともに使用する。

保存剤は約０．００１％〜０．１％の範囲の濃度において有効であり、そして好 ましくは約１０１〜釣１１％、より好ましくは約０．０５％である。ここに記載 する他の保存剤を含有する溶液の各々について、適当な保存剤およびそれらの濃 度範囲はここに記載するものから変化しない。

好ましいリンス溶液は、脱イオン水の中の約０．１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０および約０．０５％のチメロサルから成る。免疫組織化学的染色について、 好ましいリンス溶液は脱イオン水の中の約０．１モルのトリス（Ｔｒ　ｉ　５） ｐＨ７，６、約０，０５％のブリジ（Ｂ　ｒ　ｉ　Ｄ３５および約０．０５％の 千メロサルから成る。

本発明のリンス溶液は、染色品質の有害とならないで計器への塩類の有害な作用 を排除した。さらに、リンス溶液は容易に調製され、そして先行技術の免疫化学 的洗浄溶液より安価である試薬を使用する。驚くべきことには、このリンス溶液 の使用は染色品質を実際に改良することが発見された。研究において、また、リ ンス溶液の中の塩の存在はすぐれた染色に十分であること、および本発明のリン ス溶液の使用は試薬の相互作用を妨害しないことを示す。とくに、リンス溶液の 使用は先行技術の緩衝化リンス溶液に比較して非特異的結合の量を増加しない。

リンス溶液を使用して任意の免疫化学的技術においてスライドのアッセイ領域を リンスすることができる。なぜなら、リンス溶液は抗体の結合または酵素活性を 妨害しないからである。

蒸発抑制液体 免疫組織化学的または正常部位ハイブリダイゼーションの反応において、インキ ュベーション期間の間のスライド上の反応混合物の蒸発を防止することが重要で ある。これは、反応速度のコントロールまたは増大に加熱を使用するとき、反応 混合物の体積が小さい場合、と（に重要である。蒸発が起こる場合、試薬の濃度 は変化することがあり、そして組織の切片は乾燥することがある。それらの導管 のいずれも誤差のある結果を引き起こすことがある。

伝統的には、蒸発は加湿したチャンバーの中にスライドを配置するか、あるいは ガラスのカバースリップをスライドの上に配置しそしてカバースリップの側面を シールすることによってコントロールされる。これらの方法の両者は時間を消費 しかつ面倒である。さらに、ガラスのカバースリップの使用は、カバースリップ を除去するとき、組織の切片がスライドから除去されるという危険を表す。

本発明の方法は、水性反応混合物を蒸発抑制液体でカバーすることによって蒸発 を抑制し、そして蒸発抑制液体は水性相中で不混和性であり、そして水性相より 低い密度を有する。このようにして、蒸発抑制液体は反応混合物の表面をカバー し、そしてカバースリップまたは加湿チャンバーの使用の必要性を排除する。

蒸発抑制液体は、小さい体積の試薬を高温（室温以上）に維持する、スライド上 で実施するアッセイに有用である。蒸発抑制液体は、試薬の塩化カルシウムが重 要である場合、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＩＳＨおよびＩＨＣの応用におい てとくに有用である。

蒸発抑制液体は、次の特性を有する液体から本質的に成る。液体は水性相中で起 こる反応を妨害しない。蒸発抑制液体は反応を実施する温度より有意に高い沸点 を有する。好ましくは、蒸発抑制液体は１００℃以上、好ましくは１５０以上の 沸点を有する。好ましくは、蒸発抑制液体は適用を容易にするために低い粘度を 有する。

これらの基準を満足する液体は、炭化水素、好ましくは６〜１８個の炭素を有す る非芳香族の炭化水素である。中程度の連鎖のアルカン族の油、例えば、デカン −ヘキサデカン（ＣＩＯ−Ｃ１６）はより好ましい。

ペンタデカンはより好ましい。

これらの油は、ＩＨＣおよびＩＳＨ反応における蒸発を防止するために有用な次 の性質を有する。油類はＩＨＣおよびＩＳＨにおいて使用する水性反応混合物中 で実際に不活性であるかつ不混和性である。油類は水の密度より有意に低い、０ ．７３〜０，７７の範囲の密度を有して、水性相の上に容易に浮く。油類は免疫 組織化学的または正常部位ハイブリダイゼーシヨンに必要な温度の範囲よりかな り上の沸点を有し、この沸点範囲は１７４℃〜２８０℃の範囲である。これは油 類がインキュベーションの間に蒸発するのを防止する。

要求される特性に加えて、これらの油類のすべてはこのような反応における使用 に望ましい追加の性質を有する。油類は室温より低い融点を有して、それらのデ ィスペンシングを容易とする。油類は、また、容易なディスペンシングを促進し かつ油類を水性相上に浮かす、比較的低い粘度を有する。油類は、また、安価で あり、そして高い純度で入手可能である。

蒸発抑制液体は、十分な量の液体をスライド上に滴下してアッセイ領域をカバー することによって、使用される。約５００μｍの使用は便利である。

蒸発抑制液体の使用は、ガラスのカバースリップまたは加湿したチャンバーを使 用する先行技術方法より効率よくかつ便利である。蒸発抑制液体は、数滴の液体 をスライドに単に適用することによって、水性相の上に容易に浮（。蒸発抑制液 体は、また、スライドを少量の水で洗浄することによって容易に除去される。さ らに、蒸発抑制液体の劇的な性質のために、水性相の試薬は、蒸発抑制液体相を 通して沈むので、任意の順序で添加することができ、先行技術の方法におけるカ バースリップの添加またはチャンバー内の配置の前に、蒸発は起こらない。

水性相は所定位置で蒸発抑制液体と混合することができる。水性相はスライドを 普通の撹拌機上に配置することによって混合することができる。好ましい自動化 された装置は、スライド上に空気ジェットを向けることによって、水性相を混合 する。その装置は実施例３に記載されている。蒸発抑制液体は、水性相の試薬を 混合の間にスライド上の所定位置に効果的に保持する。

ＩＳＨ反応のために、ＤＮＡは典型的には約９５℃において溶融することに注意 すべきである。蒸発抑制液体は９５℃において完全に有効である。蒸発を防止す るために先行技術の反応において使用した加湿チャンバーは有効ではない。なぜ なら、典型的なチャンバーの内側の蒸気圧は蒸発を防止するために十分に高くな いからである。

内因性ペルオキシダーゼ阻害溶液 ＩＨＣ染色法は、好ましくは、抗体試薬の使用前に、組織の切片を過酸化水素（ ＨｚＯ２）の溶液とインキュベーションして内因性ペルオキシダーゼ活性を排除 する工程を包含する。よく知られているように、水中の３％のＨ２Ｏ２の普通の 溶液ならびに１．０％のＨ２Ｏ２，０，１のアジドの溶液は有効である。好まし くは、この溶液は生理学的緩衝液、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン酸 塩緩衝液（ＰＢ）、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理的塩類溶液（ＰＢＳ ）を包含する。最も好ましい緩衝液はり１モルのＰＢＳＳｐＨ７，３，０１％の ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０である。

４０℃において約４０分のインキュベーションは、通常、内因性ペルオキシダー ゼ活性を排除するために十分である。

安定化されたタンパク質分解酵素 プロテアーゼ溶液を、種々の抗体、例えば、抗デスミンおよび抗ケラチン抗体を 使用する免疫組織化学的染色に対する予備処理として、パラフィンに埋め込んだ 、ホルマリン固定した組織の切片に適用する。抗原の認識するためにこのような 組織の処理、抗原のアンマスキングまたはアンマスキングと呼ぶ、を必要とする 抗体は、実験的に決定され、そして文献に報告されている。プロテアーゼ溶液は 、抗体の適用の前にそして、好ましくは、ベルオキシダーゼ処理の直後に適用す る。

プロテアーゼは、固定プロセスの間にホルマリンによりなされた損傷から、組織 を救うと言われる。ホルマリンの固定は組織の抗原をマスキングする架橋結合を 生じ、これにより抗原の抗体の認識を防止し、こうして、染色が起こるのを防止 する。これは誤った陰性の読みを生ずることがあり、その結果組織の試料の誤診 に導くことがある。プロテアーゼはホルマリンの架橋を混乱し、組織の抗原を標 識する試薬に暴露する。

プロテアーゼの表面に対する主要な欠点は、酵素が凍結しているときにのみ、延 長した時間の間安定であるということである。室温において、酵素は使用希釈に おいてわずかに１分間のみ安定であった。これは、ことに自動化された方法につ いて、有意な欠点である。

本発明は、タンパク質分解酵素のための安定剤として作用する希釈剤を提供する 。この希釈剤において、酵素は変化する程度の温度においである延長した時間の 間安定である。とくに、酵素は、実施例４に詳細に記載するように、希釈剤中で ２〜８℃および室温において１０週間貯蔵後安定である（もとの酵素活性の少な くとも９０％を保持する）ことが示された。安定化された酵素配合物は周囲の輸 送／郵送および反復した凍結／融解に耐えることができ、そして大きく延長した 貯蔵寿命を有する。

安定化されたタンパク質分解酵素の配合物は、グリコール、還元剤、カルシウム イオン、および、必要に応じて、保存剤を含有する緩衝液中で、好ましくは使用 希釈において、有効量の酵素を包含する。本発明の好ましい安定化されたタンパ ク質分解酵素の溶液は、生理学的１１ｉ液：約４０〜約６０％のグリコール；有 効量の還元剤；酵素の安定性を増大するために十分な濃度のカルシウムイオン源 ：および有効量のタンパク質分解酵素からなる。

緩ＷＴ液は生理学的緩ＷＴ液ｐＨ約７．０〜約７５、好ましくは７．４である。

この緩衝液は有効濃度のリン酸塩緩衝液の中のカルシウム沈澱物のようにリン酸 塩に基づかない。緩衝液は、約０．０１〜０．１モル、好ましくは約０．０２５ モルの濃度における、ＭＯＰＳ　（２−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸 ）　、ＴＥＳ　（２−（−ヒドロキシ−１，１−［ビス（ヒドロキシメチル）エ チルコアミノ）エタンスルホン酸、ヘベス（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）　、ＢＥＳ　（２−［ビス（２−ヒドロキシ エチル）アミノコエタンスルホン酸）、バルビタール緩ｌ！７液またはカコジル 酸緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）マレＪ−−トまたは、好ましくは、トリス（Ｔ　 ｒ　ｉ　Ｓ）　／′ＨＣ１であることができる。

還元剤はジチチオスオスレイトール、アスコルビン酸または、好ましくは、メタ 重亜硫酸ナトリウム（ＭＢＳ）。それらの還元剤は約０．０００５〜００５％の 範囲の濃度において酵素を安定化するために有効である（ＭＢＳについて、この 濃度は約０．０２６〜０６ミリモルである）。好ましい還元剤は約０．３ミリモ ルの濃度のＭＢＳである。

グリコールは任意のグリコールであることができ、そして好ましくはプロピレン グリコール、ポリエチレングリコールまたは、より好ましくは、プロピレングリ コールである。グリコールは酵素を安定化するために有効量で、好ましくは希釈 剤の約４０〜約６０容量％、より好ましくは約５０％（ｖ／ｖ）で存在する。

希釈剤は、また、カルシウムイオン源、便利には塩化カルシウムを、約１〜約１ ０ミリモル、好ましくは約５ミリモルの濃度で含む。カルシウムイオン源は、前 述のカルシウムの不溶性の問題のために、好ましくはリン酸カルシウムではない 。

この溶液は必要に応じて保存剤を含有する。適当な保存剤は前述のものと異なら ない。

この酵素は少なくとも有効量で存在するタンパク質分解酵素であるが、後の希釈 について濃縮することができる。好ましい濃度範囲は約０．　１〜約１０単位／ ｍｌ好ましくは約０．１〜約０，５単位／ｍｌである。

最も好ましくは約０．２５単位／ｍ＋である。酵素活性は、２８０ｎｍにおける 吸収に基づいて、標準のカゼインアッセイおよび合計のタンパク質を使用して測 定することができる。

酵素はエキソペプチダーゼ（例えば、カルボキシーおよびアミノ−ペプチダーゼ 、ジペプチダーゼ）または、好ましくは、エンドブチダーゼ（例えば、ペブンン 、カテブンンおよびパパイン）であることができる。

好ましくは、酵素はＶＩＩＩ型アルカリ性プロテアーゼ、シグマ・ケミカル・カ ンパニー　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から商業的に入手可能で ある、である。最も好ましい配合物を下表１に示す。

５０％のプロピレングリコール ０．０２５モルのトリス／ＨＣＩ、ｐＨ７，４０，３ミリモルのメタ重亜硫酸ナ トリウム５ミリモルの塩化カルシウム ０．０５％のチメロサル ０．０２単位／ｍｌのＶＩＩＩ型アルカリ性プロテアーゼ 本発明の安定化された酵素配合物は成分を一緒に混合することによって調製され る。調製後、配合物は好ましくは２〜８℃において貯蔵するが、−２０℃におい て貯蔵すると安定である。

バックグラウンドのノブナルの減少のための抗体の希釈−次（または第１）抗体 および引き続く種特異的第２抗体を利用する組織の切片の免疫組織化学的染色は 、標本の非特異的染色に導（、非特異的抗体の結合を普通に生ずる。非特異的染 色は結果の誤解を引き起こし、これは究極的に患者の状態の誤診に導くことがあ る。

非特異的抗体の結合をブロッキングするアプローチの大部分は、増加したタンパ ク質濃度、例えば、２〜５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と−緒に比較的濃 縮した非免疫血清希釈剤（１・５〜１：２０）の使用に頼る。非免疫血清／ＢＳ Ａ溶液は別々の試薬としてしばしば使用され、そして通常−次抗体試薬の前に添 加される。この方法は非特異的結合を減少するが、問題を排除しない。

今回、−次抗体の非特異的結合は非特異的結合の主要な源でないことが発見され た。−次抗体の非特異的結合はタンパク質、例えば、ＢＳＡを溶液に添加するこ とによって減少することができる。しかしながら、−ＩＨＣにおいて観測される 非特異的結合の大部分は組織の切片に非特異的に結合する第２または架橋する抗 体のためである。

本発明は、−次抗体または二次抗体の希釈剤の中の第２抗体棟と同一の種からの 非免疫血清のグロブリンの分画を含めることによって、非特異的抗体の結合の問 題を解決する。−次抗体および第２抗体の希釈剤の中のグロブリン分画の使用は 、−次抗体および第２抗体の両者による非特異的結合を排除する。

本発明の抗体の希釈剤は、適当な緩衝液の中の第２抗体の規定したのグロブリン 分画から木賃的に成る。マウスのモノクローナル抗体を一次抗体および引き続い てヤギ抗マウス第２抗体として使用するとき、非特異的結合は高い濃度のヤギグ ロブリンを一次抗体および第２抗体の両者のための希釈剤の中に組み込むことに よって排除する。第２抗体はウサギ抗体である場合、ウサギグロブリンを両者の 希釈剤に添加する。

グロブリン分画は非血清から飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）を使用することに よって調製することができる。あるいは、より精製したグロブリン分画、例えば 、ＤＥＡＥセルロース精製により調製されたもの（コーン分画ＩＩに類似する） をまた使用することができる。よく知られている方法により調製することができ かつシグマ・ケミカル・カン／ぐニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 ）（カタログＮｏ、Ｇ５　’６４０）を包含するある数の源から商業的に入手可 能である。

グロブリンは希釈剤の中に非特異的抗体の結合を抑制するために十分な濃度で存 在する。好ましくは、濃度は約０．１〜約５％、より好ましくは約１１〜約０． ５％、最も好ましくは約０．３％（または３ｍｇ／ｍｌ）である。

グロブリンに加えて、希釈剤は免疫化学的手順に適当な生理学的緩衝液を包含す る。適当な緩衝液は前述の生理学的緩衝液およびリン酸塩緩衝珠、例えば、リン 酸塩緩衝液（ＰＢ）およびリン酸塩緩衝化生理的塩類溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を包含 する。最も好ましい緩衝液は０．１モルのＰＢＳＳｐＨ７，３である。

緩衝液は、また、必要に応じて洗浄剤および保存剤を含む。洗浄剤は、前述した ように、溶液の表面張力を減少して、緩衝液の平らなシートを形成するために十 分な量で存在して、組織の切片全体を抗体溶液で効果的にカバーすることを保証 する。さらに、抗体希釈緩衝液の中に洗浄剤を含めることは、この手順を通して 一定の洗浄剤濃度を維持する。適当な洗浄剤は前述のものである。

希釈緩衝液は、また、溶液中の微生物の成長を阻害する有効濃度で保存剤を含む 。適当な保存剤およびそれらの濃度は前述した通りである。

アジ化ナトリウムは好ましくは使用しない。

最も好ましい希釈剤は、３ｍｇ／ｍ＋　（０，３％）のグロブリン、０．１％の ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０．３％のチメロサルを含有する０　１モル のＰＢＳ、　ｐＨ７，３である。本発明の抗体溶液は、本発明の希釈剤および抗 体の使用希釈の一次または第２抗体を含む。よく知られているように、−次抗体 は問題の抗原に対して特異的である。第２抗体は一次抗体に対して特異的であり 、そして標識する。好ましい実施態様において、−次抗体はマウスモノクローナ ル抗体であり、そして第２抗体は標識したヤギ抗マウス抗体である。間接的ビオ チン−アビジン法のために、第２抗体はビオチンで標識する。好ましい実施態様 において、第２抗体はビオチニル化ヤギ抗マウス抗体、より好ましくは抗体のＦ ａｂ’２分画である。ビオチニル化第２抗体を使用するとき、組織の切片を発色 の前にＨＲＰＯ標識したアビジンとインキュベーションする。

本発明の抗体溶液は、抗体を先行技術の配合物中で希釈した場合と同一の方法で 使用する。免疫化学的手順は、後述するように、非免疫血清のブロッキング工程 を排除することにおいて異なる。

高い濃度のグロブリンの使用は、非特異的結合のブロッキングの再現能力を改良 する。非免疫血清のロット毎の変動はブロッキングの精製したタンパク質分画の 使用により排除される。第２抗体の種からのグロブリンの使用は、−次抗体の非 特異的結合を減少するために十分なタンパク質を希釈剤の中に提供する。グロブ リンの使用は、また、非特異的結合をブロッキングするために先行技術の方法に おいて使用された濃縮した血清希釈剤の貯蔵の間に起こる沈澱を減少する。試薬 の沈澱は、試薬の成分が貯蔵の間に変化するので、再現可能な試験を障害する。

第２抗体種の非免疫血清のグロブリン分画の組み込みは、別のプロ・ソキング剤 の必要性を減少し、染色手順における１つの工程および染色試薬のキットから１ つの試薬を排除する。これは組織の染色の性能を合理化する。

ペルオキシダーゼ標識アビジン溶液 間接的ビオチン−アビジン染色法において、組織の切片をＨＲＰＯ標識アビジン の溶液とインキュベーションする。好ましいＨＲＰＯ標識アビジンは、ジャクソ ン・イムノ・リサーチ（ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（ ペンシルベニア州ウェストグローブ）を包含するある数の源商業的に入手可能な 、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンである。ＨＲＰＯ標 識アビジン溶液は普通のものであることができる。普通の溶液は、生理学的緩衝 液、非特異的結合を阻害するタンパク質源および、必要に応じて、保存剤を包含 する。

ＢＳＡは、そのＨＲＰＯとの相互作用のために、タンパク質源として好ましくは 使用しない。

好ましくは、ＨＲＰＯ標識アビジンを本発明の抗体希釈剤中で希釈する。ウシま たは他の種のガンマグロブリンを、必要に応じて、コストの節約のために第２抗 体種のグロブリンと置換することができる。

安定化されたペルオキシダーゼ発色団の配合物ペルオキシダーゼ発色団は電子供 与発色団であり、溶液の使用希釈の範囲において、低い濃度で水溶液中の安定性 を制限した。免疫組織化学的使用のために最も普通に使用されるペルオキシダー ゼは、３．３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤΔＢ１褐色の 不溶性最終生成物）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ，赤色 の不溶性最終生成物）である。酵素イムノアッセイのために、オルト−フェニル ジアミノ塩酸塩（ＯＰ　Ｄ、オレンジ−褐色の可溶性最終生成物）を、また、普 通に使用する。他のペルオキシダーゼ発色団は、次のものを包含する・２，２′ 　−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ 、緑色の可溶性最終生成物）；５−アミノーサリチル酸（５Ａ　Ｓ、褐色の可溶 性最終生成物］　；４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＩＮ、青色の不溶性最終 生成物）；オルト−ジアニシジン（ＯＤ、黄色−オレンジの可溶性最終生成物） および３．３’、　５゜５′−テトラメチル−ベンジン（ＴＭＢ、淡い青色の可 溶性最終生成物）。

現在、ＤＡＢの安定化液体配合物はカーケガード・アンド・べり−・ラボラトリ ーズ（Ｋｅｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）（ＫＰＬ）から市販されている。配合物は、高いＤＡ　Ｂ１１度（２５ｍｇ／ ｍｌ）　、使用濃度のほぼ１０倍、を含み、そして未知の型のグリコールの存在 下に低いｐＨで４℃における貯蔵を必要とする。この溶液は２〜８℃において約 ３０日間安定であり、ぞして使用濃度に希釈後使用できる。ＫＰＬ生成物は２ｍ ｇ／ｍｌの使用濃度において４５℃において１日稈麿に短く安定ではない。標準 のストレス試験は、４５℃において３日後抗原特異的免疫染色における酵素活性 を必要とする。

液体ＡＥＣ溶液は、また、入手可能である［ングマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）］ｏ配合物は未知であるが、高い濃度、 使用濃度のほぼ２００倍のＡＥＣを含む。配合物を希釈し、そして過酸化水素を 添加して使用溶液を形成する。いったん添加した過酸化水素で希釈すると、使用 溶液は多分数時間の間だけ安定である。

他のＨＰＲＯ発色団について、ユーザーは一般に発色団溶液を使用濃度で調製し 、そしてこの溶液を精通酸化水素と使用の日に新しく混合する。このような発色 団溶液を過酸化水素の添加の前に凍結して貯蔵することができる。対照的に、本 発明の発色団溶液はペルオキシダーゼを含まず、そしてスライド上のペルオキシ ダーゼと組み合わせる。これはペルオキシダーゼと発色団との混合により引き起 こされる酸化の加速を防止する。

本発明は、発色団の使用濃度範囲において、低い濃度の液体ＨＲＰＯ発色団を有 する安定化された溶液を提供する。レドックス発色団についての一般の範囲は約 １〜２ｍｇ／ｍｌ（約１〜約１−０ミリモル）である。

ＤＡＢについて、最も好ましい範囲は約４．６〜９．２ミリモルである。

安定化された配合物において、発色団は、標準の３日の４５℃のストレス試験後 、抗原特異的免疫染色手順において生物学的に活性に止まる。

本発明の安定化された配合物は発色団を使用濃度で含有するので、試薬のユーザ ーの希釈を必要としない。

発色団に加えて、配合物は６，０より低いｐＨを維持することができる酸性緩衝 液二発色団を安定化するために有効量の還元剤、および発色団を安定化するため に有効量のグリコールから本質的に成る。

緩１’ｉ液は、安定化された溶液のｐ　Ｉ−（を６０以下、好ましくはｐｉ−（ ５０〜５５に維持する酸性緩衝液である。緩衝液は、好ましくは、発色団溶液を スライド上の酵素を含有する混合物に適用するとき、酵素活性のために有効なｐ Ｈ（約ｐＨ６〜７）を提供する。酸性緩衝液は、クエン酸塩リン酸塩、クエン酸 塩酢酸塩、酢酸塩、コノ１り酸塩、フタル酸塩、およびマレモレ酸塩の緩衝液で ある。緩衝液の壬ル濃度を調節して、有効な酵素活性のために適当な緩衝化能力 を与える。特定の発色団のために適当な緩衝液の選択は当業者の技量の範囲内で ある。

さらに詳しくは、Ｄ　Ａ、　ＢのＩＨＣｐＨ最適値は６５以上であるが、ＤＡＢ はｐＨ５Ｎ近で最も安定である。これを得るために、弱いクエン酸塩−リン酸塩 緩衝液、これはＰＢＳ、ｐＨ７，３中で０．０２％の過酸化水素およびスライド 上に残留するリンス溶液（ｐｌ−Ｔ７．６）と組み合わせるとき、反応混合物の ｐＨは７より大きい。

対照的に、ＡＥＣの酵素ｐＨの最適値は約５．３である。したがって、より強い 酸性の緩衝液（例えば、０１モルの酢酸塩、ｐＨ５，３）を発色団配合物中で使 用する。好ましくは最適な活性のために低いｐＨを必要とする発色団についで、 過酸化水素溶液は、また、酸性緩衝液中で調製する。スライド上に残留するリン ス溶液と組み合わせるとき、６より低い［スライド上のＪｐＨが生じ、許容され うるＡＥＣの染色を与え要約すると、緩衝化能力は最適な発色団についてのｐＨ および体積、緩衝化能力および個々のスライド上に残留する液体のｐＨに基づい て選択する。

同様な緩衝液の選択のプロセスは、発色団およびスライドの染色状態の独特の要 件に基づいて、他のペルオキシダーゼについて実施する。

ＤＡＩ３とともに使用する好ましい緩衝液は、約５〜約１０ミリモル、好ましく は約７〜約８、より好ましくは約７，５ミリモルの濃度の、弱い緩衝液、好まし くはクエン酸塩−リン酸塩緩ｉｔｉ液である。緩衝液は酸性のｐＨ１好ましくは 約４０〜６０、より好ましくは約５５〜５５を有する。最も好ましくはｐＨ５， ３であり、こうしてＤＡＢ配合物をスライド上のＩ］２０２と混合して発色反応 を開始するとき、この混合物のｐＨ６，５またはそれ以−ヒであって、結果の誤 った解釈に導くことがある核周辺のＤＡＢの沈澱を回避する。

ＡＥＣとともに使用するために好ましい緩衝液は比較的強い酸性緩衝液、好まし くは約０．５〜約０，０１モル、好ましくは釣り２５〜約０．０５モル、より好 ましくは約０１モルの濃度の酢酸塩緩衝液である。

緩衝液は酸性のｐＨ１好ましくは約４．０〜６０、より好ましくは約４．５〜５ ．５を有する。最も好ましくはｐＨ５，０である。

発色団配合物は、また、グリコールおよび小さい分子、例えば、ＤＡＢおよびＡ ＥＣを安定化するために有効な濃度の還元剤を含有する。しかしながら、それら の濃度および発色団の濃度はバランスさせて、酵素活性を妨害しなくてはならな い。この場合において、約１〜約１０％、好ましくは約５％の濃度のポリエチレ ングリコール（ＰＥＧ）は任意のＨＲＰ　Ｏとともに好ましいグリコールである 。

還元剤は前述のものであることができる。濃度は選択したＨＲＰＯ発色団に依存 して変化しそして、また、各ロットの汚染物質の差のために、所定の発色団のロ ット毎に変化する。例えば、それらの還元剤はＤＡＢを約０．０００５〜００５ ％（はぼ００２６〜０６ミリモル）の範囲の濃度で安定化し、そしてＡＥＣを約 ｏ、ｏｏｏｓ〜ｏ、ｏｏｓ％（はぼ４０〜４００μミリモル）の範囲の濃度で安 定化するために有効である。

任意の発色団のための還元剤の適当な濃度は実施例において詳細に記載する。

ＤＡＢのために最も好ましい配合物は約５％のポリエチレングリコールおよび約 １ミリモルのメタ重亜硫酸ナトリウム（ＭＢＳ）（はぼ０゜０２％）である。Ａ ＥＣについて最も好ましい組み合わせは約５％のポリエチレングリコールおよび 約２００μモルのＭＢＳ（はぼ０．２％）である。

緩衝液は必要に応じて保存剤を含有する。適当な保存剤は前述のものと異ならな い。緩衝液は、必要に応じて、また、この手順を通して一定レベルに反応混合物 中で洗浄剤濃度を維持するために、抗体希釈剤中と同一の生物学的洗浄剤を含む 。安定化されたＤＡＢ配合物はグリコールを緩衝溶液（存在する場合、洗浄剤を 含有する）に添加することによって調製する。還元剤をその溶液に添加し、次い でＤＡＢを添加丈、る。ＡＥＣについて、還元剤を添加し、次いでＡＢＣをグリ コールを含有する緩衝溶液に添加する。安定化したＨＲＰＯ発色団溶液の調製は 、実施例に詳細に記載する。調製後、発色団配合物は２〜８℃において暗所で貯 蔵する。

本発明の安定化されたＨＲＰＯ発色団配合物の使用は、過酸化水素が配合物の中 に存在せずそしてスライドに直接添加する以外、先行技術の配合物の使用と異な らない。しかしながら、配合物は使用濃度で安定である。こうして、新しい使用 溶液を各々の日に調製する必要性は排除された。

下表は本発明のＤＡＢおよびＡＥＣの安定化された配合物およびＤＡＢ［カーク ガード・アンド・ベリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ　ａｎｄ　Ｐｅ ｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］およびＡＥＣ［ング７−ケミカル・カン パニー（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）］の性質の比較を示す。

表２ 発色団配合物 ＫＰＬ　ＳＩＧＭＡ 因子　ＤＡＢ　ＡＥＣ安定化 原緩衝液の酸性ｐ）（あり　Ｎ／Ａ　Ｉ　あり防止剤を含有する　Ｎ／Ａ　Ｎ／ Ａ　含有する’Ｎ／Ａ：製造業者から入手不可能。

”Ｎ／Ｔ：試験せず。

過酸化水素の発色溶液 ペルオキシダーゼ法において、発色団溶液を過酸化水素ペルオキシダーゼ溶液と 混合するとき、発色は開始する。Ｈ２Ｏ２溶液は普通のものであることができる 。好ましいＨ２Ｏ２は生理学的緩衝液を包含する。適当な生理学的緩衝液前述し た通りである。０．１モルのＰＢＳ、ｐＨ７，３、は最も好ましい。この溶液は 、必要に応じて、また、洗浄剤および保存剤、好ましくは０．１％のツイーン（ Ｔｗｅｅｎ）２０および０．０５％のチメロサルを含む。

Ｈ２Ｏ２溶液を発色団溶液と混合し、そして組織の切片と約４〜約５分間約４０ °Ｃにおいてインキュベージタンする。

ＤＡＢ色−増強溶液 ＤＡＢ色−増強溶液を、必要に応じて、カラースリッピングの前に使用して、Ｄ ＡＢの色をより顕著にする。ＤＡＢ染色は褐色である。金属イオンの溶液を使用 して、暗色化（りするか、あるいは染色の色を黒にッケル）または青（コバルト ）に変化させる。酢酸塩緩衝液中の硫酸銅の溶液は好ましい。

反対染色 反対染色を、必要に応じて、カラースリッピングの前に使用して、免疫組織化学 的染色をより顕著にする。反対染色は色が最初の染色と異なり、そして最初の染 色のそれら以外の組織、細胞または細胞の部分に対する親和性を有する。多数の 反対染色はよく知られている。好ましい反対染色はへマドキシリンである。

方法 明瞭のためおよび限定せずに、この方法は発色団としてＤＡＢを使用する間接的 ビオチン−アビジンペルオキシダーゼ法により例示されるように、免疫組織化学 的手順で記載する。当業者にとって明らかなように、この方法に改良された工程 を他の免疫組織化学的手順ならびに池の免疫化学的プロセス、例えば、ＥＬＩ　 ＳＡイムノアッセイにおいて使用することができる。

組織の切片を含有するスライドを本発明のリンス溶液で洗浄する。スライドは、 それをリンス溶液の浴の中に浸漬することによって、好ましくはこの溶液の３つ の浴の中に順次に浸漬することによって洗浄することができる。あるいは、リン ス溶液は、例えば、スクイーズびんを使用することによって、スライド上に吹き 出させることができる。過剰の液体は、スライドから滴下するか、あるいはスラ イドのへりを吸収性表面上で吸い取ることによって除去する。

染色試薬の各々について、組織の切片は、よく知られているように、インキュベ ーションの間に試薬でカバーする。スライドを試薬の浴の中に垂直の位置でイン キュベージタンする方法について、浴のレベルは全体の組織の切片をカバーする ために十分である。水平にインキュベージタンするスライドのために、約１００ 〜１５０μＩの試薬は通常組織をカバーするために十分である。２００μｍの使 用は便利である。

インキュベーション時間は変化し、そしてインキュベーション温度に依存する。

実質的に完全な抗体の結合のためのインキュベーション、発色およびこの方法の 他の工程はよく知られている。工程の多数、例えば、抗原のアンマスキング、抗 体の結合、および発色は、好ましくは、少なくとも約３５℃の高温、好ましくは 約４０〜約４５℃において実施する。

しかしながら、酵素活性に依存する工程（抗原のアンマスキングおよび発色）を 除外して、インキュベーション期間を適当に増加する場合、大部分の工程は、ま た、４℃程度に低い温度で実施することができる。次の工程の各々について記載 するインキュベーション期間は、特記しない限り、４０℃の好ましいインキュベ ーション温度においてである。

蒸発抑制液体をスライドに適用して、この液体を湿った組織の切片上に滴下する ことによって、組織の切片をカバーする。十分な量、好ましくは約５００μｌの 液体を添加して組織の切片をカバーする。

過酸化水素溶液をスライドに添加して、染色の内因性ペルオキシダーゼ誘発妨害 を排除する。■］２０□溶液を組織の切片をカバーする蒸発抑制液体に添加し、 そして■（２０２溶液は蒸発抑制液体を通して下の組織の切片に行く。Ｈ２Ｃｈ 溶液は内因性ペルオキシダーゼ活性を排除するために十分な時間、便利には約４ 〜約６分間インキュベーションする。

抗体染色試薬は、アンマスキングを必要とする抗原、例えば、デスミンまたはケ ラチンに対して特異的であるとき、組織の切片を、−次抗体の添加前に、本発明 の安定化されたタンパク質分解酵素溶液で処理する。

安定化されたタンパク質分解酵素溶液を組織の切片をカバーする蒸発抑制液体に 添加し、そしてこのタンパク質分解酵素溶液は蒸発抑制液体を通して沈んで下の 組織の切片に行く。抗原のアンマスキングのために十分なインキュベーション期 間後、最適には約４〜約５分後、スライドを洗浄し、そして蒸発抑制液体を再び 適用する。

抗体の適用後、好ましくはベルオキシダーゼ処理の直後、組織の切片をカバーす るために十分な量、便利には約２００μｍのプロテアーゼ溶液をパラフィンに埋 め込まれた、ホルマリン固定した組織に適用する。

この希釈剤中で、プロテアーゼは組織の抗原に損傷を与えないでホルマリンの架 橋を崩壊させる。こうして、抗原は標識試薬に暴露さね、より正確な結果を可能 とする。

インキュベーション期間は、抗原が破壊されないかぎり、架橋を崩壊するために 十分である。期間は温度、酵素濃度、組織の厚さおよびホルマリンの中の時間の 長さに依存する。適当な時間は容易に決定することができる。４０℃において４ 〜５分のインキュベーション、好ましくは４０℃において４分３０秒のインキュ ベーションは本発明の好ましい方法において有効である。インキュベーション後 、プロテアーゼ溶液を洗浄除去し、そして染色／標識プロセスにおける次の試薬 を適用する。これらの範囲が観測されないとき、プロテアーゼにより過度および ／または不完全な消化は起こることがあり、これは、それぞれ、破壊された抗原 ／マスキングされた抗原を生ずることがある。インキュベーション後、スライド をリンスする。

インキュベーション、各および蒸発抑制液体の再適用後、標識っけ試薬を組織の 切片に添加する。第１に、本発明の一次酵素溶液をスライドに添加する。抗体溶 液を、実質的に完全な抗体の結合のために十分な時間、少なくとも５分の間、イ ンキュベーションする。インキュベーション、各および蒸発抑制液体の再適用後 、本発明のビオチニル化第２抗体溶液をスライドに添加し、そして約５分間イン キュベーションする。インキュベーション、各および蒸発抑制液体の再適用後、 ＨＲＰＯ標識アビジン溶液を組織の切片と、実質的に完全なビオチン−アビジン 結合のために十分な時間の間、約３７〜４０℃において約４〜約５分間インキュ ベーションする。

インキュベーション、各および蒸発抑制液体の再適用後、発色試薬をスライドに 添加する。発色試薬は、本発明の安定化されたＤＡＢ溶液および過酸化水素溶液 を包含する。試薬を混合し、次いで使用の前に約１５分以下の間添加する。好ま しくは、ＤＡＢ溶液をスライドに添加し、次いでトＩ２０□溶液を添加する。溶 液を混合して発色反応を開始する。溶液はスライド上で、スライドを撹拌機−４ 二に配置することによって、混合することができる。発色のために十分な時間の 間、約５分間インキュベーンコンし、そして洗浄した後、免疫組織化学的染色手 順を完結する。

ＤＡＢ色増強溶液、好ましくは硫酸銅溶液および／または反対染色剤を、カバー スリッピングの前に、必要に応じて添加する。

自動化された方法について工程はマニュアル法と異ならない。詳しくは、試薬、 試薬の添加順序およびインキュベーションの時間および温度は異ならない。試薬 を組織の切片に適用しそして組織の切片とインキュベーションする方法、組織の 切片をリンスする方法および過剰のリンス溶液を除去する方法は、装置に依存す る。好ましい自動化された方法は実施例２に詳細に記載する。

次の特定であるが非限定的である実施例によって、本発明をさらに説明する。特 記しない限り、温度はセ氏度および濃度は重量％で記載する。

実施するために構成的に簡単にした手順は現在の時制で記載し、そして実験室で 実施した手順は過去の時制で記載する。

実施例　１ 本発明の新規な試薬の各々は後述するように調製した。

リンス溶液 １．０ｍｌのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　（Ｓｉｇｍａ　Ｐ−１３７９）およ び５００ｍｇのチメロサルを１リットルの蒸留水に添加して、０１％ノツイーン （Ｔｗｅｅｎ）２０および００５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を生成する。

安定化されたプロテアーゼ配合物 ２４２ｇのトリズマ（Ｔｒ　ｉ　ｚｍａ）塩基を１リツトル蒸留水に添加するこ とによって溶１ｆｆｌＡ［０，２モルのトリズマ・ベース（Ｔｒｉｚｍａ　Ｂａ ５ｅ）および溶液Ｂ（０，２モルのＨＣＩ）をつ（ることにヨッテ、０．５　モ ルノｌ−リス（Ｔｒ　ｉ　ｓ）／ＨＣｌ、ｐＨ７，４を調製する。５Ｑｍｌの溶 液Ａ、４１．４ｍｌの溶液Ｂ１および１０８．６ｍｌの蒸留水を添加して、０． ０５モルのトリス（Ｔｒ　ｉ　ｓ）／ＨＣＬ　ｐＨ７゜４壱調製する。

４００ｍ１の安定化されたプロテアーゼ配合物について、次を混合する： ２００ｍ１のトリス（Ｔｒ　ｉ　ｓ）／ＨＣＬ　ｐＨ７，４，２００ｍ１のプロ ピレングリコール＊ ０．０２ｇのメタ重亜硫酸ナトリウム＊０．２９４ｇの塩化カルシウム＊ ０．２０ｇのチメロサル＊ １００単位のＶｌｌｌ型アルカリ性ブコテアーゼ＊＊ノグマ・ケミカル・カンパ ニー（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から購入した形態で使用す る。

希釈剤は０．１モルのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）　、ｐＨ７，３を調製すること によって調製する。次の試薬を緩衝液に添加し、そして混合する３ｍｇ／ｍｌ　 （０，３％）のヤギグロブリン（シグマ・ケミカル・カンパニー、カタログＮｏ 、Ｇ５６４０）、０．１％ノツイー：／　（Ｔｗｅｅｎ）２０、および０．０５ ％のチメロサル。

安定化されたＤＡＢ配合物 １リツトルの７．５ミリモルのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ５，３を調製 するために、次の成分を次の順序で８００ｍ１の蒸留水に添加する： １．５１０．５ｍｇのクエン酸（Ｓｉｇｍａ　Ｃ−７１２９）、２．１．１７ｇ ＣＤリン酸カリウム（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｐ−５５０４）、３．１ｍｌのツイーン （Ｔｗｅｅｎ）２０（Ｓｉｇｍａ　＝、Ｐ−１３７９）、 ４．０．５ｇのチメロサル、 ５、蒸留水を添加して１リツトルにする。

次に、８０ｍ１のクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の中に５ｇのポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）を溶解することによって、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液の中の５ ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓ　ｉ　ｇｍａＰ−５４１３）を調製 する。次いで、追加の緩衝液で１００ｍ１に希釈する。５％のＰＥＧを含有する ５ｍｌのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の中に９５．０５ｍｇのメタ重亜硫酸ナト リウム（ＭＢＳ）（ＳｉｇｍａＳ−９０００）を溶解して（１００ミリモルのＭ ＢＳ）、溶液Ａを調製する。５％のＰＥＧを含有する１０ｍ１のクエン酸塩−リ ン酸塩緩衝液の中で１００μｍの溶液Ａを希釈して（１ミリモルのＭＢＳ）、溶 液Ｂを調製する。

２０ｍｇ＋７）ＤＡＢ　（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｄ−５６３７）を１０ｍ１の溶液Ｂの 中に溶解して、２ｍｇのＤＡＢ／ｍ＋の１．０ミリモルのメタ重亜硫　゛酸ナト リウムおよび５％のポリエチレングリコールを含有する７、５ミリモルのクエン 酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ５，３、を生成する。調製後、使用するまで暗所で ２〜８℃において貯蔵する。

安定化されたＡＢＣ配合物 １リツトルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０、を調製するために、次の試薬を次の順 序で８００ｍ１の蒸留水中に溶解する：ユ、９．５８ｇ（’ｌ酢酸ナトリウム３ Ｈ２０（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｓ−８６２５）、 ２．１．７０ｍ１の氷酢酸（Ｓｉｇｍａ　Ａ６２８３）、　−３，１，７ｍｌの Ｂｒ１ｊ−３５（Ｓｉｇｍａ　４３０ＡＧ−６）、４、蒸留水を添加して１リツ トルにする。

次に、ＰＥＧを８０ｍ１の緩衝液の中に溶解することによって、酢酸塩緩衝液の 中の５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓ　ｉ　ｇｍａＰ−５４１３） を調製する。次いで、追加の緩衝液で１００ｍ１に希釈する。１００ｍｇのＡＥ Ｃ（Ｓｉｇｍａ　Ａ−５７５４）をジメチルホルムアミド（Ｂａｋｅｒ　９２２ １−０１）。１０ｍ１のＡＥＣをＰＥＧを含有する９０ｍ１の酢酸塩緩衝液に添 加する。この溶液を室温において１０分間放置する。次いでこの溶液をワットマ ン（Ｗｈａｔｏｍａｎ）＃１濾紙を通して、はぼ１ｍｇ／ｍｌのＡＥＣｌｏ　１ モルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０，５％のポリエチレングリコールを生成してＡ ＥＣ溶液を調製する。

５％のＰＥＧを含有するｌＱｍｌの酢酸塩緩衝液の中に４０．９ｍｇのメタ重亜 硫酸ナトリウム（ＭＢＳ）を溶解する（２１．５ミリモルのＭＢＳ）。ＭＢＳが ＡＥＣの反応を阻害するまで、はぼ領　２絶対単位、ＭＢＳ溶液を滴定してＡＥ Ｃ溶液の中に入れる。最終のＭＢＳ濃度は、ＡＥＣのロットの精製に依存して、 約１００から２００μモルまで変化する。調製後、使用するまで暗所で２〜８℃ において貯蔵する。滴定は後述するように実施した。

発色団のアミノ−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）は、シグマ・ケミカル・カンバ ー１−−（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）からのほぼ９０％ の純粋な製品として入手可能である。発色団は純粋ではなく、そしてＡＥＣ（ジ メチルホルムアミド中に溶解した）を０．１モルの酢酸ナトリウム緩衝液に添加 するとき、発色団の沈澱は実施例１に記載する可溶化手順の間に起こる。こうし て、ＭＢＳの添加の前のＡＥＣの最終濃度は未知である。それゆえ、使用するＭ ＢＳは生成する液体ＡＥＣの各バッチについて滴定により実験的に決定しなくて はならない。

ＡＥＣの酵素反応を種々の濃度のＭＢＳの存在下に実施して、ＡＥＣ反応をほぼ ０．２吸収単位阻害するＭＢＳの濃度を決定する。これは通常１００〜２００μ モルのＭＢＳの範囲である（最終濃度）。反応成分を下に記載する。

ａ、４８３．４μｍの新鮮なＡＥＣ（、実施例１に記載するように調製した、Ｍ ＢＳの添加の前）、 ｂ、８．４μｌの０．３ｍｇのアビジン−Ｄセイヨウワサビペルオキソダーゼ／ ｍｌの５％のポリエチレングリコールおよび０．０５％のＢｒ１ｊ　３５洗浄剤 を含有する０、１モルの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，０、 Ｃ１５％のポリエチレングリコールを含有する０、１モルの酢酸ナトリウム緩衝 液、ｐＨ５，０、の中の８．４μＩの１８０ミリモルの過酸化水素、および ｄ、５％のポリエチレングリコールおよびＢｒ１ｊ　３５洗浄剤を含有する０、 １モルの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，０、中の５．０μｍの種々の濃度のＭ ＢＳ。

滴定は次のようにして実施した。反応混合物を室温において５分間インキュベー ションする。インキュベーション後、１００μｍのＡＥＣ反応混合物を９００μ ｌの脱イオン水（１：１０の希釈）に添加する。希釈したＡＥＣの吸収をＵＶ− ＶＩＳ分光光度計で８００から４００ｎｍまで走査する。５％のポリエチレング リコールを含有する０、１モルの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，０を脱イオン 水で１：１０に希釈した液体で計器をブラッケントする。

種々の吸収曲線をプロットし、そして各ＭＢＳ濃度について４８０ｎｍにおける ピークの吸収を決定する。これらのデータから、適当な最終ＭＢＳ濃度を選択し 、そして２１．５ミリモルの原溶液から十分なＭＢＳを全体のＡＥＣ溶液に添加 する。次いで、ＭＢＳを含有する最終ＡＥＣ溶液をアッセイし、そしてＭＢＳを 含有しないＡＥＣ溶液と比較して、ＭＢＳを含有する溶液についての吸収曲線は 安定化しない配合物についての曲線よりほぼ０．２の吸収単位だけ低いことが評 価される。完結した試薬を使用するまで暗所に冷却して貯蔵する。

実施例　２ デスミンを検出するためのマニュアルの間接的ビオチン−アビジンの染色 脱パラフィンした組織の切片を、スクイーズびんからほぼ１０ｍ１を組織の切片 より上のスライド上に吹き出させることによって、リンス溶液を使用してリンス した。次いで、組織の切片を５００μＩのドデカンの添加により蒸発抑制液体で カバーした。洗浄および蒸発抑制液体の手順を、各インキュベーション期間の終 わり後、この手順の残部を通して同一方法において実施した。

０．１モルのリン酸塩緩衝化生理的塩類溶液（０，１モルのリン酸塩、０．０５ ５モルのＮａＣ］）　、ｐＨ７，３，０，１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　 （２００μＩ）中の３％のＨ２Ｏ２の溶液を、この溶液を蒸発抑制液体の上に滴 下することによって、スライドに添加した。Ｉ］２０２溶液を４０℃において５ 分間インキュベーションした。

プロテアーゼ溶液（２００μｌ）をスライドに適用し、そして４０°Ｃにおいて ５分間インキュベーションした。

デスミンについて、−次抗体試料（２００μりは、実施例１に記載する希釈剤中 で１ニアに希釈したマウスのモノクローナル抗デスミン（クローンＤＥ−Ｒ−１ １：　Ｄａｋｏ、カリ７　＊ル＝７ｔＨｈ−ヘン９−）であった。４０℃におい て５分間インキュベーションした後、スライドを洗浄し、そして蒸発抑制液体を 適用した。

希釈剤中で１・５０に希釈した、第２抗体溶液（２００μＩ）、好ましくはビオ チニル化ヤギ抗マウス抗体、Ｆａｂ’　２　（Ｊａｃｋｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ）を、４０℃において５分間インキュベーションした。４０℃に おいて５分間インキュベーションした後、スライドを洗浄し、そして蒸発抑制液 体を適用したつ実施例１に記載するように調製した抗体希釈剤（ウシグロブリン をヤギヤギと置換した）中で１１００に希釈したペルオキシダーゼ欅識ストレプ トアビジン（Ｊａｃｋｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を、スライドに 添加し、そして４０℃において５分間インキュベーションした。スライドを洗浄 し、そして蒸発抑制液体を再適用した。

走化されたＤＡＢ溶液（２００μＩ）をスライドに添加した。０．１モルのＰＢ Ｓ、ｐＨ７，３，０，１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０中の０．０２％のＨ２ Ｏ２の溶液を添加し、そしてＤＡＢ溶液を混合して反応を開始した。この混合物 を４０℃において５分間インキュベーションした。

スライドをリンスした。蒸発抑制液体を適用し、次いでＤＡＢ色を硫酸銅溶液（ ０，１モルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５，０，０１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０ の中の０．５％のＣｕ５Ｏ４）でこの溶液を４０℃において５分間インキュベー ションすることによって増強した。ＤＡＢの増強後、スライドをリンスし、ヘマ トキシリンで反対染色し、脱水（アルコール／キシレンを使用する）し、そして カバースリッピングした。

実施例　３ デスミンを検出するための自動化された、間接的ビオチンーアヒジン染色法 最も好ましい自動化された染色装置を使用して、実施例２の手順を反復した。こ の装置は、本出願人に係る同時継続出願第０７／４８８．６０１号、１９９０年 ２月２日提出、発明の名称「自動化された生物学的反応装置」、発明者コウブラ ンド（Ｃｏｐｅｌａｎｄ）ら、に詳細に記載されている。その出願をここに引用 によって加える。

脱パラフィンした組織の切片をリンスし、計器の中に配置し、そして蒸発抑制液 体でカバーする。スライドをＤＡＢ増強後にリンスした後取り出し、そしてこの 手順の残部をマニュアルで実施した。自動化された工程の各々は、インキュベー ション期間が４分２０秒である以外、実施例２に記載するように計器により実施 した。

この手順を４分３７秒のインキュベーション期間を使用して反復した。

実施例　４ デスミンを検出するための自動化された、間接的ビオチン−アビジン染色法 次の例外を使用して、実施例３を反復した。実施例１に記載するよう、　に調製 した安定化されたＡＥＣ溶液を安定化されたＤＡＢ溶液の代わりに使用し、そし て過酸化水素溶液の中の緩衝液は０１モルの酢酸ナトリウムであった。発色後、 スライドをリンスし、ヘマトキシリンで反対染色し、そして水性マウント媒質で カバースリッピングした。

実施例　５ 安定化されたプロテアーゼ配合物の中の酵素活性の研究本発明の安定化されたプ ロテアーゼ配合物の２つの試料を、配合物の１つの試料がチメロサルを省略した 以外、実施例１に記載するように調製した。各溶液を３つのアリコートに分割し 、そしてバイアルの中に入れた。バイアルを２〜８℃、室温（Ｒ，Ｔ　、約２３ ℃）、および４５℃の雰囲気の中に入れ、その直後に、各バッチの酵素活性（第 ０日における初期活性）をカゼイン溶液のアッセイを使用して決定した。各温度 における各バイアルの活性を、同−力ゼインアッセイを使用して、初期酵素活性 の百分率について周期的に測定した。アッセイを３回実施し、そして平均値を取 った。１００％として５．０力ゼイン単位の活性（平均の初期活性）の値を使用 してプロットをつくった。結果を下表２に示す。

チメロサルを含まない酵素活性の値を１１週に決定し、そしてチメロサルを含む 場合１０週に決定した。

表２ 初期酵素活性の百分率 ２−８℃　ＲＴ　４５℃ チメロサルを含まない　１００　１００　２５チメロサルを含む　９２　１００ 　４２この表に示すように、安定化されたプロテアーゼ配合物は、２〜８℃およ び室温において少なくとも１０週の間、初期酵素活性の９０％より多くを保持し た。

要約書 本発明は、免疫化学的試薬を使用してスライドを染色する改良された方法を提供 する。この方法は次の工程からなる。スライドのアッセイ領域（組織の切片を含 有する領域）を水および洗浄剤からなる改良されたリンス溶液で洗浄する。蒸発 抑制液体をスライドに適用してアッセイ領域をカバーする。アンマスキングを必 要とする抗原について、組織の切片を改良された、安定化されたタンパク質分解 酵素の溶液と組み合わせる。スライドをリンスし、そして蒸発抑制液体をスライ ドに再度適用する。第２抗体と同一の種からのグロブリンを含有する改良された 希釈剤の中の一次抗体を組織の切片と、抗体の結合を実質的に完結するために十 分な時間の間、組み合わせる。スライドをリンスし、そして蒸発抑制液体を再び 適用する。改良された希釈剤の中の標識した第２抗体を組織の切片と、抗体の結 合を実質的に完結するために十分な時間の間、組み合わせる。スライドをリンス し、そして蒸発抑制液体を再び適用する。

好ましい実施態様において、安定化されたジアミノベンジン（ρＡＢ）溶液を包 含する、発色試薬を組織の切片と、発色のために十分な時間の間、組み合わせる 。リンス後、組織の切片は分析に準備された状態にある。

国際調査報告 １＋＋＋ａ、ｎ＋＋、＋１　？−１１１１−１＋＋轡””　Ｍ／ｌｅｔ　ＭＩＩ ｒ１ｍＰＣＴ１０９９１１０１１０８ ＶＬ　Ｃｌａｉｍｓ　５２−５５．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｎ　ｉｍｓｕｎｏｈ ｌｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓＬａｉｎｌｎｇｍｅｔｈｏｄ：　ＣＩＪＩＢｌｌ 　４３５．　１１ｕｂｃｌａｐ＋ｓ　７．２゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性リンス溶液の平らな シートを形成するために十分な量の非イオン性の生物学的洗浄剤から本質的に成 る、スライドのアッセイ領域のリンシングに使用する水性リンス溶液。 ２、前記非イオン性洗浄剤は０．０１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求 の範囲第１項記載の水性リンス溶液。 ３、前記非イオン性洗浄剤はポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエ チレンエーテルから選択される非イオン性洗浄剤である、請求の範囲第１項記載 の水性リンス溶液。 ４、前記非イオン性洗浄剤はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートおよ びポリオキシエチレン２３ラウリルエーテルから選択される、請求の範囲第３項 記載の水性リンス溶液。 ５、さらに有効量の保存剤を含む、請求の範囲第１項記載の水性リンス溶液。 ６、実質的に塩不含の水溶液はトリス（Ｔｒｉｓ）溶液である、請求の範囲第１ 項記載の水性リンス溶液。 ７、前記実質的に塩不含の水溶液は水である、請求の範囲第１項記載の水性リン ス溶液。 ８、約０．０５〜約０．１モルのトリス（Ｔｒｉｓ）、０．０１〜５％（ｖ／ｖ ）の濃度のポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンエーテルか ら選択される非イオン性洗浄剤、および、必要に応じて、有効量の保存剤から本 質的に成る、スライドのアッセイ領域のリンシングに使用する水性リンス溶液。 ９、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性リンス溶液の平らな シートを形成するために表面張力を減少するために十分な量の非イオン性の生物 学的洗浄剤から本質的に成る溶液で、スライドのアッセイ領域をリンスすること からなる、アッセイ試薬または試料をスライドのアッセイ領域に結合させる改良 されたアッセイ方法。 １０、前記アッセイ領域は組織の切片を結合するスライドの区域からなる、請求 の範囲第９項記載の方法。 １１、スライドの試薬を適用したアッセイ領域に蒸発抑制液体でカバーすること からなる、前記アッセイ領域に適用した試薬の蒸発を防止する方法。 １２、前記蒸発抑制液体は中程度の連鎖のアルカン族の油から本質的に成る、請 求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記アルカンは１０〜１６個の炭素を有する、請求の範囲第１２項記載の 方法。 １４、前記蒸発抑制液体はペンタデカンから本質的に成る、請求の範囲第１３項 記載の方法。 １５、中程度の連鎖のアルカン族の油から本質的に成る蒸発抑制液体でアッセイ 領域をカバーすることからなる、アッセイ試薬または試料をスライドのアッセイ 領域に結合する、改良されたアッセイ法。 １６、前記方法は免疫組織化学的染色法である、請求の範囲第１５項記載の方法 。 １７、前記方法は正常部位ハイブリダイゼーションである、請求の範囲第１５項 記載の方法。 １８、ａ、４０〜６０％のグリコール、ｂ、生理学的緩衝液、 ｃ、有効量の還元剤、 ｄ、酵素の安定性を増大するために十分な濃度のカルシウムイオン源、 ｅ、有効量のタンパク質分解酵素、およびｆ、必要に応じて、有効量の保存剤、 からなる、安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 １９、前記酵素はＶＩＩＩ型アルカリ性プロテアーゼである、請求の範囲第１８ 項記載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 ２０、前記緩衝液はトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液ｐＨ７．０〜７．５である、請求 の範囲第１８項記載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 ２１、前記緩衝液は０．０１〜０．１モルのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣＩ、ｐＨ ７．４である、請求の範囲第２０項記載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶 液。 ２２、前記還元剤はジチチオスオスレイトール、アスコルビン酸およびメタ重亜 硫酸ナトリウムから成る群より選択される、請求の範囲第１８項記載の安定化さ れたタンパク質分解酵素の溶液。 ２３、前記還元剤は０．０００５〜０．０５％の濃度のメタ重亜硫酸ナトリウム である請求の範囲第２２項記載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 ２４、前記グリコールはポリエチレングリコールである、請求の範囲第１８項記 載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 ２５、前記カルシウムイオン源は１〜１０ミリモルの塩化カルシウムである、請 求の範囲第１８項記載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 ２６、前記保存剤が存在し、そして０．００１％〜０．１％の範囲の濃度のチメ ロサルである、請求の範囲第１８項記載の安定化されたタンパク質分解酵素の溶 液。 ２７、ａ、有効量のＶｌＩＩ型アルカリ性プロテアーゼ、ｂ、生理学的トリス（ Ｔｒｉｓ）緩衝液ｐＨ７．０〜７．５、ｃ、０．０００５〜０．０５％のメタ重 亜硫酸ナトリウム、ｄ、４０〜６０％のプロピレングリコール、ｅ、１〜１０ミ リモルの塩化カルシウム、およびｆ、０．００１％〜０．１％のチメロサル、か らなる、安定化されたタンパク質分解酵素の溶液。 ２８、抗原をアンマスキングする組織の切片を、生理学的緩衝液、４０〜６０％ のグリコール、有効量の還元剤、酵素の安定性を増大するために十分な濃度のカ ルシウムイオン源、有効量のタンパク質分解酵素、および必要に応じて、有効量 の保存剤からなる安定化されたタンパク質分解酵素の溶液で、前記抗原をアンマ スキングするために十分な時間の間カバーすることからなる、前記組織の切片を 免疫組織化学的に染色する改良された方法。 ２９、ａ、生理学的緩衝液、および ｂ、非特異的抗体の結合を阻害するために十分なタンパク質濃度の第２抗体の種 からの非免疫血清のグロブリン分画、から本質的に成る、第１および第２の抗体 を有する免疫化学的方法において使用するための改良された抗体の希釈剤。 ３０、前記グロブリンは０．１〜５％の濃度で存在する、請求の範囲第２９項記 載の改良された抗体の希釈剤。 ３１、前記第２抗体はヤギ抗体であり、そして前記グロブリンはヤギグロブリン である、請求の範囲第２９項記載の改良された抗体の希釈剤。 ３２、前記ヤギグロブリンはコーン分画ＩＩ／ＩＩＩである、請求の範囲第３１ 項記載の改良された抗体の希釈剤。 ３３、前記生理学的緩衝液はリン酸塩緩衝化生理的塩類溶液ｐＨ７．０〜７．５ である、請求の範囲第２９項記載の改良された抗体の希釈剤。 ３４、前記リン酸塩緩衝化生理的塩類溶液は０．０１〜０．５モルのである、請 求の範囲第３３項記載の改良された抗体の希釈剤。 ３５、希釈剤の平らなシートを形成するために表面張力を樹脂するために十分な 量の洗浄剤をさらに含む、請求の範囲第２９項記載の改良された抗体の希釈剤。 ３６、前記洗浄剤はポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンエ ーテルから選択される非イオン性洗浄剤である、請求の範囲第３５項記載の改良 された抗体の希釈剤。 ３７、前記非イオン性洗浄剤はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートお よびポリオキシエチレン２３ラウリルエーテルから選択される、請求の範囲第３ ６項記載の改良された抗体の希釈剤。 ３８、有効量の保存剤をさらに含む、請求の範囲第２９項記載の改良された抗体 の希釈剤。 ３９、ａ、０．０１〜０．５モルのリン酸塩緩衝化生理的塩類溶液ｐＨ７．０〜 ７．５、 ｂ、０．１〜５％の前記第２抗体の種のグロブリン、ｃ、０．１〜５％（ｖ／ｖ ）の塩化カルシウムのポリオキシェチレンソルビタンおよびポリオキシエチレン エーテルから選択される非イオン性洗浄剤、および ｄ、において、有効量の保存剤、 から本質的に成る、第１および第２の抗体を有する免疫化学的方法において使用 するための改良された抗体の希釈剤。 ４０、第１および第２の抗体を、生理学的緩衝液および非特異的抗体の結合を阻 害するために十分なタンパク質濃度の第２抗体の種からの非免疫血清のグロブリ ン分画からに成る希釈剤中で、前記抗体を抗原と組み合わせる前に、希釈するこ とからなる、第１および第２の抗体を使用する改良された免疫化学的方法。 ４１、ａ、酵素の働く範囲の濃度のペルオキシダーゼ発色団、ｂ、６．０より低 いｐＨを維持することができる酸性緩衝液、ｃ、有効量の還元剤、および ｄ、１〜１０％のグリコール、 から本質的に成る、安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４２、前記ペルオキシダーゼ発色団は３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒド ロクロライド（ＤＡＢ）であり、そして前記酸性緩衝液は５〜１０ミリモルのク エン酸塩−リン酸塩緩衝液である、請求の範囲第４１項記載の安定化された水性 ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４３、前記ペルオキシダーゼ発色団は３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ａ ＥＣ）であり、そして酸性緩衛液は０．０１〜０．５モルの酢酸塩緩衝液である 、請求の範囲第４１項記載の安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４４、前記還元剤はジチチオスオスレイトール、アスコルビン酸およびメタ重亜 硫酸ナトリウムから成る群より選択される、請求の範囲第４１項記載の安定化さ れた水性ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４５、前記還元剤はメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求の範囲第４４項記載の 安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４６、前記グリコールはポリエチレングリコールであり、請求の範囲第４１項記 載の安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４７、ポリエチレングリコールは約１〜約１０％の濃度で存在する、請求の範囲 第４１項記載の安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶液。 ４８、前記溶液の平らなシートを形成するために表面張力を減少するために十分 な量の洗浄剤をさらに含む、請求の範囲第４１項記載の安定化された水性ペルオ キシダーゼ発色団溶液。 ４９、ａ、２ミリモルのＤＡＢ、 ｂ、５〜１０ミリモルのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液ｐＨ５．０〜５．５、 ｃ、０．０００５〜０．０５％のメタ重亜硫酸ナトリウム、ｄ、１〜１０％のポ リエチレングリコール、およびｅ、必要に応じて、０．０１〜５％（ｖ／ｖ）の ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンエーテルから選択され る非イオン性洗浄剤、 からなる安定化された水性３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライ ド（ＤＡＢ）溶液。 ５０、ａ、２ミリモルのＡＥＣ、 ｂ、０．０１〜０．５モルの酢酸塩緩衝液ｐＨ４．５〜５．５、ｃ、０．００８ 〜０．００８％のメタ重亜硫酸ナトリウム、ｄ、１〜１０％のポリエチレングリ コール、およびｅ、必要に応じて、０．０１〜５％（ｖ／ｖ）のポリオキシエチ レンソルビタンおよびポリオキシエチレンエーテルから選択される非イオン性洗 浄剤、 からなる安定化された水性３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）溶液 。 ５１、酵素の働く範囲の濃度のペルオキシダーゼ発色団、６．０より低いｐＨを 維持することができる酸性緩衝液、有効量の還元剤、および前記ペルオキシダー ゼ発色団を安定化するために有効な濃度のグリコールから本質的に成る安定化さ れた水性ペルオキシダーゼ発色団溶液をペルオキシダーゼと組み合わせることか らなる、改良されたペルオキシダーゼに基づく免疫化学的方法。 ５２、次の順序： ａ、組織の切片を、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性リン ス溶液の平らなシートを形成するために十分な量の非イオン性の生物学的洗浄剤 から本質的に成る水性リンス溶液でリンスし、 ｂ、前記組織の切片をカバーするために十分な量の蒸発抑制液体を適用し、 ｃ、一次抗体を、生理学的緩衝液および非特異的抗体の結合を阻害するために十 分なタンパク質濃度の第２抗体と同一の種からの非免疫血清のグロブリン分画か ら本質的に成る希釈剤中で、前記組織の切片と、抗体の結合を実質的に完結する ために十分な時間の間、組み合わせ、 ｄ、前記組織の切片を、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性 リンス溶液の平らなシートを形成するために十分な量の非イオン性の生物学的洗 浄剤から本質的に成る水性リンス溶液でリンスし、 ｅ、前記組織の切片をカバーするために十分な量の蒸発抑制液体を適用し、 ｆ、標識した第２抗体を、生理学的緩衝液および非特異的抗体の結合を阻害する ために十分なタンパク質濃度の前記第２抗体と同一の種からの非免疫血清のグロ ブリン分画から本質的に成る希釈剤中で、前記組織の切片と、抗体の結合を実質 的に完結するために十分な時間の間、組み合わせ、 ｇ、前記組織の切片を、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性 リンス溶液の平らなシートを形成するために十分な量の非イオン性の生物学的洗 浄剤から本質的に成る水性リンス溶液でリンスし、 ｈ、前記組織の切片をカバーするために十分な量の蒸発抑制液体を適用し、 ｉ、発色試薬を前記組織の切片と、発色のために十分な時間の間、組み合わせ、 そして ｊ、前記組織の切片を、実質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性 リンス溶液の平らなシートを形成するために十分な量の非イオン性の生物学的洗 浄剤から本質的に成る水性リンス溶液でリンスする、 ことからなる、改良された免疫組織学的方法。 ５３、工程（ｂ）の後にかつ工程（ｃ）の前に、ｉ、過酸化水素溶液を前記組織 の切片と、内因性ペルオギシダーゼ活性を実質的に排除するために十分な時間の 間、組み合わせ、ｉｉ、前記組織の切片を、実質的に塩不含の水溶液および表面 張力を減少して水性リンス溶液の平らなシートを形成するために十分な量の非イ オン性の生物学的洗浄剤から本質的に成る水性リンス溶液でリンスし、そして ｉｉｉ、前記組織の切片をカバーするために十分な量の蒸発抑制液体を適用する 、 ことをさらに含む、請求の範囲第５２項記載の方法。 ５４、工程（ｄ）の後にかつ工程（ｅ）の前に、ｉ、前記組織を、４０〜６０％ のグリコール、生理学的緩衝液、有効量の還元剤、酵素の安定性を増大するため に十分な濃度のカルシウムイオン源、有効量のタンパク質分解酵素、および必要 に応じて、有効量の保存剤からなる安定化されたタンパク質分解酵素の溶液で、 組織の抗原をアンマスキングするために十分な時間の間、カバーし、そして ｉｉ、前記組織の切片をカバーするために十分な量の蒸発抑制液体を適用する、 ことをさらに含む、請求の範囲第５３項記載の方法。 ５５、前記標識した第２抗体はビオチニル化抗体であり、そして方法はさらに、 工程（ｈ）の後にかつ工程（ｉ）の前に、ｉ、ペルオキシダーゼ標識したアビジ ンを、適当な希釈剤中で、前記組織の切片と、ビオチン−アビジンの結合を実質 的に完結するために十分な時間の間、組み合わせ、ｉｉ、前記組織の切片を、実 質的に塩不含の水溶液および表面張力を減少して水性リンス溶液の平らなシート を形成するために十分な量の非イオン性の生物学的洗浄剤から本質的に成る水性 リンス溶液でリンスし、そして ｉｉｉ、前記組織の切片をカバーするために十分な量の蒸発抑制液体を適用する 、 ことをさらに含む、請求の範囲第５４項記載の方法。