JP2017519191A - ヘマトキシリン沈殿物の洗浄方法及びシステム - Google Patents

Abstract

ヘマトキシリン沈殿物を除去するための方法及び試薬系、及び特に前記試薬系を使用する自動染色装置からのヘマトキシリン沈殿物の自動除去方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ヘマトキシリン沈殿物を除去するための方法及び試薬系、及び特に、前記試薬系を使用する自動染色装置からのヘマトキシリン沈殿物の自動除去方法に関する。

ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及びパパニコロウ（ＰＡＰ）染色を含めた幾つかの組織化学的な染色プロトコルは、染料ヘマトキシリンに依存して、細胞学的及び組織試料を染色している。特に、細胞核のヘマトキシリン染色は、腫瘍生検試料における悪性及び／又は転移性細胞の存在を検出するために病理学者に使用されている。

ヘマトキシリンは、ヘマトキシロン属（Hematoxylon）の樹木の赤色の心材に見られる天然化合物である。ヘマトキシリン自体は水溶液中で無色であり、組織成分を染色する有効成分ではない。というよりもむしろ、ヘマトキシリンの酸化生成物であるヘマテインが、特に媒染剤と錯体を形成すると、ヘマトキシリン染料溶液の有効染色成分となる。ヘマテインは、空気及び日光への曝露を通じて自然に生成される。この自然過程は「熟成」と呼ばれ、細胞の染色に適した溶液をもたらすには３か月以上要しうる。

自動化された染色手順及びシステムは、染色溶液を生物試料に届けるための機械的システムを使用する。標準的なヘマテイン染色手順は、ヘマトキシリン−ヘマテインと媒染剤の両方を含む予混合ストックを使用した。これらの予混合ストック内では沈殿物が形成される。これは、スライドがガラス容器などの容器内でヘマトキシリン染色溶液で処理される、手動による染色手順については概して問題ではない。しかしながら、沈殿物は自動染色システムでは問題であり、沈殿物が配送ラインを目詰まりさせたり汚損したりする場合があり、配送ラインの洗浄又はパージを困難にしうる。染色溶液中のヘマトキシリン及び沈殿物に対するこれらの変化は、一貫性のない染色を生じうる。例えば、媒染剤を含むヘマトキシリン染色ストックは、しばしば、長期間の間に熟成され、ヘマテイン−媒染剤錯体の発生を可能にする。この方法は良好な染色結果を可能にしうるが、望ましくない沈殿物の形成も生じる。

自動化されたＨ＆Ｅ染色機器は多大なコストを有する多くの部品で構成される。チューブ、弁、分配マニホルド等の表面でのヘマテイン沈殿物の蓄積は、オン−スライド沈殿物からヘマトキシリンの分配に対する干渉又は閉塞にまで及ぶ範囲に影響を及ぼしうる。沈殿はまた、金属と接触することによっても悪化する。これは、沈殿物によって閉塞されうる非常に小さい直径の開口を有する、ノズル及び噴頭などの金属部品を備えた自動化されたシステムにとって、特に問題である。オン−ザ−スライド沈殿物の場合には、影響は、スライドを観察する病理学者にとって不愉快なほどの低さから、診断的有用性に影響するほどの高さまででありうる。染色モジュールにおける沈殿物の実質的な蓄積は、この問題を修正するために、部品の交換、又は最悪の場合には染色モジュール全体の交換を必要とすることがある。

沈殿物の問題は、沈殿物を溶解するある種の洗浄液の使用を通じて解決されうる。洗浄液の化学的構成及び物理的特性は、溶液がモジュールのさまざまな部品を構成する材料と適合するように、染色モジュールの設計に合わせなければならない。腐食性及び健康／安全性上の危険などの追加的検討事項は、製造及び顧客の使用の両方の観点から留意しなければならない。

ヘマトキシリン沈殿物の除去用の従来の洗浄液は、一般に、「酸アルコール」をモデルとしており、その組成はエタノール−水混合物（典型的には７０％エタノール、３０％水）中、塩酸を低い割合で（１〜２％）含む。プロピレングリコールと水の混合物中、塩酸（〜１％）からなる溶液が 、ヘマトキシリンから形成される沈殿物を溶解することが見出された。この溶液における沈殿物の溶解度は〜１５ミリグラム／ミリリットルであることが確定され、積極的な混合の不存在下での溶解率は極めて低かった（経験的観察）。この洗浄剤を用いた実際の実験では、洗浄剤と染色モジュールの内部部品との接触時間は、沈殿物全体の除去を達成するためには、およそ数日（on the order of days）が必要とされうる。染色機器又はモジュールのための予防保全洗浄液としては、この従来の洗浄剤による沈殿物の溶解速度の遅さは許容できないくらい長い。より高濃度の塩酸は、より腐食性かつ有害な物質であることを代償とすれば、溶解速度及び全溶解度の両方を改善するであろう。

影響を受ける表面からヘマトキシリン染色を除去するための塩素系漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）の使用もまた知られている。しかしながら、これらの漂白溶液は腐食性であり、しばしば衣類及び他の布地を変色させてしまうことから、これらは、使用して作業するには不愉快かつ潜在的に安全性欠陥でありうる。加えて、多くの人々は、これらの溶液から発生する塩素フュームに対して敏感である。

この問題に対するさらに良好な溶液は、より大量にかつより速い速度で沈殿物を溶解させることができる、より有効な配合物の使用におけるものであろう。したがって、自動化された試料処理装置の内部貯蔵容器、配送ライン及びノズルに適合するヘマトキシリン／ヘマテイン沈殿物洗浄システム及び手順の開発が必要とされている。

過酸化水素は、布地における臭気発生分子の強力な酸化剤であることが知られている。影響を受ける臭気のある布地の処理の間、過酸化水素は、臭気のある沈殿物分子を非悪沈殿物（non-malprecipitateous）化合物へと酸化する。例えば、ペットの尿沈殿分子は酸化されて、非悪沈殿物に変換されうる。処理方法は、しばしば真空掃除機などの清掃装置と組み合わせられる。過酸化水素の水溶液は室温で比較的安定であり、過酸化水素は活性化されない限り実質的には酸素と水に分解しないことから、布地の臭気除去方法は、２種類の薬剤が混合されると過酸化水素を活性化する緩衝剤を提供する。既知の布地の臭気除去処理では、液状緩衝剤は炭酸ナトリウムであることが多い。

１つの実施態様は、自動化されたヘマトキシリン染色装置の内部貯蔵容器、配送ライン、ノズル、及び他の試薬配送要素からヘマテイン沈殿物を除去するための方法である。これは、過酸化物と水を含む液体酸化成分及びアルカリ成分を容器内で合わせて、約８．９から１０．５の間の範囲のｐＨを有するヘマテイン沈殿物除去液を形成することによって達成することができる。すなわち、液体酸化成分及びアルカリ成分は、容器内で合わされる前に、別々の成分として提供される。次に、容器を、ヘマトキシリン自動染色システムのヘマトキシリン分配要素がこれらの分配要素の内部表面を通って溶液を受け取りかつ移動させることを可能にする位置に置く。自動染色システムを作動させて、沈殿物除去液を自動染色システムのヘマトキシリン分配要素の内部表面内に移動させ、そこで、内部表面が少なくとも３０分間、沈殿物除去システムと接触した状態にする。

別の実施態様は、過酸化物と水を含む液体酸化成分；及びクエン酸ナトリウムと水を含む液体アルカリ成分を含む沈殿物除去系に関し、ここで、液体酸化成分と液体アルカリ成分は合わせることが可能であって、ヘマテイン沈殿物との接触の前に、あるｐＨを有する溶液を形成する。

自動化されたスライド染色装置は、組織学的に処理された検体のある特定の属性（例えば染色強度）の一貫性及び可制御性を増大させる。処理時間（すなわち、所与の組織学的処理の継続時間）及び処理温度（すなわち、所与の組織学的処理が行われる温度）は、これらの属性の全てではないにしてもほとんどに影響を与える２つの変数である。自動化された組織学的システムは、一般に処理時間及び／又は処理温度の一貫性及び／又は可制御性を促進する特性を備える。例えば、これらのシステムの少なくとも幾つかは、正確に制御された液体の分配及び除去動作の実行を可能にする処理ヘッドを有する染色装置を備える。これらの染色器は、高い基底温度で維持できる内部環境も有しうる。そのように構成されたこれら及び他の自動化されたシステムの性能（例えば品質及び／又は多用途性に関する）は、通常の自動化された「ディップアンドダンク（dip and dunk）」装置の性能をはるかに上回る。

診断的組織染色に用いられるヘマトキシリン溶液は、望ましくない沈殿物の形成に悩まされることが多い。自動化された線形の（ディップアンドダンク）染色又は手動による染色を行う解剖病理学研究室では、溶液から沈殿物を単純に濾過すること、及び染色用のフィルタを再使用すること、又は、古い溶液を新しい溶液と交換することによって、沈殿物が染色処理に干渉することを制御可能である。溶液を保持するのに用いられる容器の表面の沈殿物に対しては、化学洗浄によって、又は単純にその容器を新しいものに交換することによって対処することができる。

自動化されたＨ＆Ｅ染色機器内には、多くの部品が存在する。多くの部品は多大なコストを有しうる。チューブ、弁、分配マニホルド等の表面上でのヘマトキシリン沈殿物の蓄積は、オン−スライド沈殿物からヘマトキシリンの分配に対する干渉又は閉塞にまで及ぶ範囲に影響を及ぼしうる。オン−スライド沈殿物の場合は、影響は、不愉快なほどの低さから診断的有用性に影響を与えるほどの高さまででありうる。染色モジュールにおける沈殿物の実質的な蓄積は、この問題を修正するために、部品の交換、又は最悪の場合にはモジュール全体の交換を要しうる。この問題は、沈殿物を溶解するある種の洗浄液の使用を通じて解決されうる。

この洗浄液の化学的構成及び物理的特性は、溶液がモジュールのさまざまな部品を構成する材料と適合するように、染色モジュールの設計に合わせなければならない。腐食性及び健康／安全性上の危険などの追加的検討事項は、製造及び顧客の使用の両方の観点から留意しなければならない。

本発明の沈殿物除去処理システムは、過酸化物及び水を含む液体酸化成分；及びアルカリ成分を含み、ここで液体酸化成分は錯化する成分とは別に保管される。沈殿物除去システムの各成分は合わされて、ヘマテイン沈殿物と接触する前に、９．５から１０のｐＨを有する溶液を形成する。一般に、液体酸化成分及びアルカリ成分は、容器内で合わせられ／混合されて沈殿物除去液を形成する。沈殿物除去液容器は自動化された染色器の試薬受入位置に嵌入する容器、又は独立型の容器でありうる。容器が独立型の容器である場合、沈殿物除去液を染色器の（strainers）流体分配装置の内部表面にアクセス可能にするためのホース、チューブ又は他の流体輸送手段が必要である。沈殿物除去液が調製されると、自動化された染色器の流体分配装置を通じてヘマトキシリン試薬と置換され、その後、試薬配送要素の内部流体通路と少なくとも３０分間、接触させたままにされる。沈殿物除去液はまた、溶液容器が空になるまで、自動染色システムの試薬分配装置の内部表面を通じてポンプ圧送（圧力）又は吸引（真空）されてもよい。次に、染色分配装置では、沈殿物除去液がパージされ、自動化されたシステムの標準的な染色試薬が補充又は提供される。

スポッティングのテスト実験：
ヘマトキシリン溶液（グリコール安定化溶液中、＜１％ ヘマトキシリン染料、＜４％ 硫酸アルミニウム、＜０．１％ ヨウ素酸ナトリウム、＜１％ ハイドロキノン、及び＜２％ β−シクロデキストリン水和物）の６ヶ月を経た未開封瓶を入手した。溶液を瓶から排出し、瓶を脱イオン水で３回濯いだ。ヘマトキシリン溶液が接触した瓶の内側には顕著な沈殿残渣が存在していた。瓶を切り開き、残留脱イオン水を蒸発させた。沈殿残渣を含んでいた瓶の部分を入手し、スポッティングテストに使用した。

切り取った瓶の一部分を、内側を上向きにしてラボベンチ上に置いた。この内側は、瓶の一部分の沈殿残渣で覆われた側である。試験洗浄液１滴を瓶の一部分に置き、１５秒間そのままにした。１５秒後、試験洗浄液を脱イオン水で濯ぎ流し、スポットを沈殿物除去の形跡について目視検査した。

チューブ状ループ実験：
パーフルオロアルコキシポリマー（ＰＦＡ）チューブの１２インチ片を、ヘマトキシリン水溶液［２５％ エチレングリコール（ｖ／ｖ）、２０ｍＭ ヘマトキシリン、３．３ｍＭ ヨウ素酸ナトリウム、２０ｍＭ 硫酸アルミニウム１８水和物、８５ｍＭ ハイドロキノン及び１０ｍＭ β−シクロデキストリン６０水和物、ｐＨ約２．５］で満たした。連結器でチューブの両端を連結し、ループを形成した。チューブ状ループを、約１４日間にわたり６０℃に保たれた炉内に置いた。この期間に、加熱によりヘマテインが沈殿して、チューブ状ループの内側を被覆する。この加熱インキュベーション期間の後、チューブ状ループを取り出し、排水し、脱イオン水で濯いだ。次にループを開放したままにして乾燥させた。これにより、チューブの内壁を被覆するヘマテイン沈殿物の暗色の被覆を伴ったチューブを得た。

洗浄液を試験するため、予め沈殿させたチューブ状ループを試験洗浄液で満たし、閉じてループを形成し、室温で約１分間、静置した。次に溶液を排出し、チューブを脱イオン水で濯いだ。次いで、チューブを沈殿物除去の形跡について目視検査した。

実験１：
３％過酸化水素溶液と０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液の１：１混合物を使用するスポットテスト実験は、優れた洗浄結果を示した。

実験２：
０．１２５Ｍ塩化鉄（ＩＩＩ）溶液、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝２）、０．６４Ｍリン酸溶液、５０％プロピレングリコール中０．１Ｍ塩酸、及び３％過酸化水素−５０ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液を比較する、チューブ状ループ実験を行った。３％過酸化水素−５０ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液はチューブを完璧に洗浄した。他の溶液ではすべて、チューブ壁に沈殿残渣が残った。

実験３：
２部式の過酸化物溶液を比較する、スポットテスト実験を行った。実験設定及び結果を表１に示す。

実験４：
０．２Ｍシュウ酸溶液、０．２Ｍ亜硫酸ナトリウム溶液、０．２Ｍ二亜硫酸カリウム溶液、及び１Ｍ過硫酸ナトリウム−１０ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液を比較するスポットテスト実験を行った。１Ｍ過硫酸ナトリウム−１０ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液及び０．２Ｍシュウ酸溶液は優れた洗浄結果を示した。他の溶液は洗浄能力を示さなかった。

実験５：
炭酸ナトリウム溶液と１：１で混合した過硫酸ナトリウムを様々な強度で用いて、修正チューブ状ループ実験（６０分間の洗浄浸漬）を行った。実験設定及び結果を表２に示す。

実験６：
別の塩基を使用して過酸化水素溶液のｐＨを高くした、チューブ状ループ実験を行った。実験設定及び結果を表３に示す。塩基としての炭酸とリン酸の混合物は、炭酸のみよりも良好な結果を示すように見えた。

Claims (12)

1. ヘマトキシリン自動染色システムからヘマテイン沈殿物を除去する方法であって、
   過酸化物と水を含む液体酸化成分とアルカリ成分を提供し、ここで、液体酸化成分とアルカリ成分は分離されており；
   容器内で液体酸化成分とアルカリ成分を合わせて、約８．９から１０．５の間の範囲のｐＨを有するヘマテイン沈殿物除去液を形成し；
   沈殿物除去液の容器を、ヘマトキシリン自動染色システムのヘマトキシリン分配要素がこれらの分配要素の内部表面を通って溶液を受け取りかつ移動させることを可能にする位置に置き；
   自動染色システムを作動させて、沈殿物除去液を自動染色システムのヘマトキシリン分配要素の内部表面内に移動させ；
   前記内部表面と少なくとも３０分間接触させることを含む方法。
2. 過酸化物が過酸化水素である、請求項１に記載の方法。
3. 溶液の過酸化水素の重量百分率が１％から８％未満の範囲にある、請求項２に記載の方法。
4. 溶液の過酸化水素の重量百分率が約３％から７％の間の範囲にある、請求項２に記載の方法。
5. 溶液の過酸化水素の重量百分率が約６％である、請求項２に記載の方法。
6. 溶液のｐＨが約９．５から１０．５の間の範囲にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 溶液のｐＨが約１０である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. アルカリ成分が炭酸ナトリウム、グリシンナトリウム及びリン酸三ナトリウムからなる群から選択されるアルカリ性剤を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. アルカリ成分が液体形態であり、水をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 除去液容器が、洗浄されるヘマトキシリン自動染色システムのための染色試薬容器として構成される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 除去液容器が、ヘマトキシリン自動染色システムにおける試薬容器の置換により、ヘマトキシリン自動染色システムのヘマトキシリン分配要素がこれらの分配要素の内部表面を通って溶液を受け取りかつ移動させることを可能にするためのキーイング機能を備える、請求項１０に記載の方法。
12. 自動化された分配要素の内部表面から沈殿物除去液を除去し、自動染色システムをさらに作動することによって前記沈殿物除去液を染色試薬に置き換えることをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。