JP4196024B2 - 液体炭化水素燃料中の微生物の検出 - Google Patents

Description

本発明は、炭化水素燃料の分析のための方法に関する。

炭化水素燃料は、微生物が混入し得ることが公知であり、これは望ましくない。例えば、Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ（「ジェット燃料真菌（Ｊｅｔ Ｆｕｅｌ Ｆｕｎｇｕｓ）」）は、航空ケロシンで増殖し得、航空機翼のタンク中で腐食および閉塞問題を引き起こす。航空会社は、混入が疑われる場合、試験のために研究所にサンプルを送ることが要求される。多くの研究所は、確認するのに１０日までかかり得る標準的な培養技術を使用している。いわゆる「迅速な」試験が市場に存在する。しかし、全てが、結果が得られるのに７２時間かかる培養技術に基づいている。

多くの航空会社は、この遅延でさえ受け入れることができず、殺生物剤を自動的に使用する；従って、試験は単に問題を遡及的に確認する。純粋に迅速な試験方法は、中断時間（ｄｏｗｎｔｉｍｅ）の費用および実際に不必要な殺生物剤処理を取り除く。

現在のところ、依然として、炭化水素燃料中の微生物の存在について利用可能な迅速な試験は存在しない。本発明は、この問題を解決するために設計される。

第１の局面において、本発明は、微生物の存在についての液体炭化水素燃料の分析方法に関し、該方法は、微生物の存在または非存在を検出するために、微生物と反応性であるかまたは微生物によって生産される代謝物もしくは分解産物と反応性である抗体と燃料サンプルを接触させることを包含する。

該方法は、炭化水素燃料のサンプルと目的の微生物と反応性である抗体を混合する工程、その後、抗体の微生物との結合の検出工程を適切に包含する。

微生物に対して惹起された抗体での燃料の処理は、燃料中の微生物の存在についての非常に迅速なアッセイを提供することが見出された。例としては、９０分で結果を生じる、航空燃料中のＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅについての試験が開発された。この方法において、本発明は、殺生物剤が必要な場合にのみ使用されることを可能にし、このことは、殺生物剤が使用および取り扱いに潜在的に危険な化合物であるので、望ましい。対照的に、Ｃａｍｐｏｓ ＬｏｐｅｓおよびＧａｙｌａｒｄｅ，Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ＆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ（１９９６）３７−４０は、燃料サンプルを濾過し、次いでフィルターパッドをブロックし、乾燥し、ホルムアルデヒドで固定し、３回洗浄し、特異的な抗体と共にインキュベートし、そして再び３回洗浄する方法を開示している。次いで、抗体複合体を添加し、そしてさらにインキュベートする。３回の洗浄後、フィルターを乾燥および観察する。全体のプロセスは、４時間以上かかる。

いずれの液体炭化水素燃料も、本発明を使用して、微生物混入について分析され得るが、適切には、この分析は、軽質−中間留分燃料に対して行われる。３９０℃未満の沸点を有する液体燃料および燃料成分（例えば、航空燃料およびディーゼル燃料）ならびに等価物または同様の組成を有する炭化水素燃料が好ましい。他の適切な炭化水素燃料が当該分野で周知である。ガソリンは、本発明において別の好ましい燃料である。

本発明は、炭化水素燃料中に存在し得る任意の微生物の検出に関する。例えば、細菌、酵母および真菌種は全て、本発明の方法を使用して分析され得る。炭化水素燃料中で生存し得そして分析が好ましい細菌の例としては、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種が挙げられ、酵母の好ましい例としては、Ｃａｎｄｉｄａ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種が挙げられるが、本発明は、これらの種単独の分析に限定されない。特に好ましいのは、真菌種のＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｒｅｓｉｎａｅとしてもまた知られている）であり、その有性の段階（ｓｅｘｕａｌ ｓｔａｇｅ）の間は、Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ ｒｅｓｉｎａｅと呼ばれる。他の真菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｏｔｉｉおよびＰｅｎｃｉｌｌｉｕｍ種が挙げられる。

用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、特定の微生物と反応性である任意の適切な免疫因子（ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）に関する。従って、用語「抗体」は、単に天然に生じる抗体に限定されず、例えば、抗体全体のフラグメントおよび抗体誘導体を含む。抗体フラグメントまたは誘導体が使用される場合、本発明者らは、微生物の抗原に対する薬剤の反応性が、ネイティブな抗体全体と比較される場合に、実質的に維持され、その結果、抗体が微生物を検出するために使用され得ることを好む。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方が本発明において使用され得、そしてこのような抗体の調製が当該分野において標準的である。

分子レベルにおいて、抗体反応性または特異性は、微生物と共に発現されるかまたは微生物に関連する抗原によって、一般的に決定される。従って、本明細書中において、微生物についての抗体反応性についてのいずれの参照も、一般的に、この抗体−抗原相互作用（これは、抗体標的および特異性を規定する）を指す。

炭化水素燃料中の微生物の存在はまた、関心のある微生物の代謝物または分解産物の存在によって示され得る。このような代謝物または分解産物に対して惹起された抗体はまた、炭化水素燃料中の微生物の検出を可能にし、そしてこのような抗体の使用はまた、本発明によってカバーされる。

好ましくは、抗体は、関心のある微生物に対して特異的であるか、または関心のある微生物に特異的な代謝物および/または分解産物と反応性である。このように、特定の種の微生物は、本発明を使用して同定され得る。しかし、多数の種に共通である抗体または誘導体と反応性である本発明における抗体を使用することもまた可能である。この場合、抗体は種特異的ではないが、炭化水素燃料中に存在する微生物のクラスの検出を依然として可能にする。従って、本発明はまた、炭化水素燃料中の微生物のクラスの検出のための方法に関し、該クラスは、共通の抗原によって規定される。

使用されるアッセイおよび検出方法に依存して、本発明における使用のための抗体は、必要に応じて、抗原に結合する抗体の検出を容易にするために、他のタンパク質または化学的マーカーに複合体化され得る。アルカリホスファターゼのような酵素的エレメントまたはコロイド状金、ビオチンおよびストレプトアビジンのような容易に検出可能なグループに複合体化された抗体が好ましい。他の適切な複合化剤が当該分野で周知である。

任意の適切な検出方法が抗体結合の分析のために本発明において使用され得る。結果が光学的または視覚的に検出される方法（例えば、比色アッセイ）が好ましい。適切には、ＥＬＩＳＡアッセイ（サンドイッチまたは二重層アッセイ）が使用され得、これらの方法は当該分野で標準的である。抗原がサブストレート（例えば、マイクロタイターディッシュ）に結合し、試験サンプル中の抗原が抗体結合について競合する、競合アッセイが好ましい。

抗体結合の検出はまた、側方流動（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ）デバイス（例えば、ディップスティック）を使用して実行され得、これはまた当該分野で標準的である。市場で入手可能な妊娠キットは、このような技術の簡単な実施形態を示す。例えば、抗原の試験サンプルは、ディップスティックに適用され得、このディップスティックは、適切な芯（ｗｉｃｋ）および抗原と反応性の固定化した抗体を備える。ディップスティックに沿ったサンプルの芯材（ｗｉｃｋｉｎｇ）移動は、任意の抗原を固定化された抗体と接触させる。次いで、結合した抗原は、例えば、標識された抗体とのさらなる反応によって検出され得る。ディップスティック技術の他の実施形態およびこのような技術を使用する分析方法は、当該分野で標準的である。

放射標識した検出系はあまり好ましくないが、放射標識を含む方法（例えば、放射免疫アッセイおよびラジオアレルゴソルベント試験）はまた、本発明の抗体−抗原結合の検出において効果的である。

本発明の特に好ましい実施形態において、分析方法は、乳化剤の存在下で燃料および抗体を接触させることを包含する。乳化剤の存在は、燃料サンプル中の抗体と抗原との間の相互作用を容易にする。

任意の好適な乳化剤が本発明において使用され得る。強力な乳化剤および燃料サンプル中のアルカンの抗体に対するあらゆる変性作用を最小化する乳化剤が好ましい。乳化剤適切性は、例えば、異なる乳化剤の存在下で、混入した燃料サンプル中の抗原への抗体結合を比較することによって容易に評価され得る。

非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎのようなアルキルエトキシレート界面活性剤、および乳化剤として特に好ましいポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０としてもまた知られている）のようなポリオキシエチレンソルビタンモノエステルと共に、本発明において一般的に好ましい。適切には、Ｔｗｅｅｎ ２０のような乳化剤が脱イオン水中で調製され得、そして０．０１〜１０容量％、好ましくは１〜５容量％、最も好ましくは２．５容量％の濃度で使用され得る。しかし、乳化剤の最適な濃度は、分析される燃料で変化するようであり、当業者によって容易に確認され得る。

本発明の方法は、微生物の培養を必要とせず、これによって、非常に迅速に結果が得られ得る。代表的には、この方法は、燃料分析の開始（すなわち、任意の様式で燃料サンプルが最初に処理される時点）から２時間未満で結果を提供する。

本発明は更に、本発明の分析における使用のためのキットに関する。好ましくは、本発明における使用のためのキットは、液体炭化水素燃料中で増殖し得る微生物に由来する抗原のサンプル、この抗原と反応性の抗体、および上記のような適切な乳化剤を備える。

必要に応じて、本発明のキットは、以下のリストから選択される１つ以上のさらなる成分を備える：抗原または抗体で予めコーティングされる適切なサブストレート（例えば、マイクロタイターディッシュ）、適切なスタンダード抗原、微生物と反応性である抗体を標識するための標識試薬、第１の（微生物特異的）抗体と反応性であるさらなる（検出）抗体、ＥＬＩＳＡサブストレート試薬、停止溶液および洗浄溶液のような検出試薬。

本発明は更に、本発明における使用のための微生物および適切な抗原の調製のための方法に関し、この方法は、増殖プロセスの少なくとも一つの工程の間、液体炭化水素燃料中で微生物をインキュベートする工程を包含する。次いで、微生物および/または抗原は、標準的な技術を使用して増殖培地から適切に回収される。このように、微生物中および微生物上に存在する抗原のコンフィギュレーション、代謝物およびそれに由来する誘導体のコンフィギュレーションは、炭化水素燃料に由来するサンプル中に存在するものを反映するようである。このように、燃料の試験サンプル中の抗原に対する抗体反応は、最適化され得る。

従って、本発明はまた、液体炭化水素燃料中で増殖する微生物に対して産生された抗体、および燃料油中で増殖する微生物の代謝物または誘導体に対する抗体に関し、このような抗体は、必要に応じて、検出のための標識を備える。本発明はまた、このような抗体を利用する、本明細書中に記載されるような液体炭化水素燃料の分析のための方法およびキットに関する。

本発明は、ここで、以下の実施例によって例示されるが、これらに限定されない。
実施例１ ＥＬＩＳＡを使用する炭化水素燃料中のＨ．ｒｅｓｉｎａｅの分析
材料
抗原/Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ調製物
抗原調製物を、マイクロプレートのコーティングおよびＥＬＩＳＡ試験において使用されるスタンダードの生成の両方において使用する。
１ Ｈ．ｒｅｓｉｎａｅを、２５℃で７〜１０日間、麦芽抽出寒天（タフィー大麦麦芽抽出物２０ｇ、ａｇａｒ ｏｘｏｉｄ ｎｏ．３ ２０ｇ、１リットルの水道水（ｐＨ６．５）、１２１℃で１５分間オートクレーブされた）上で増殖する。
２ 胞子懸濁液を、「Ｂｕｓｈｎｅｌｌ Ｈａａｓ」（Ｄｉｆｃｏ）液体ブロス中で調製する。１００ｍｌの燃料調製物当たり約３ｍｌの懸濁液を、以下に記載するように、接種物（ｉｎｏｃｕｌａｎｔ）として使用する。
３ Ｈ．ｒｅｓｉｎａｅを、約１：３比で、滅菌したＢｕｓｈｎｅｌｌ Ｈａａｓブロス上に滅菌した影響を受けやすい燃料を浮かせることによって調製した燃料培地中に接種する。
４ 培地を、コンフルエントな真菌マットが容器中で得られるまで、２５℃でインキュベートする。
５ マットを、培地からフィルター収穫し（ｆｉｌｔｅｒ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ）、そして滅菌した蒸留水中で洗浄する。
６ 次いで、マットを、４分間、Ｍｉｃｋｌｅビーズビーター中で氷上で、滅菌した蒸留水中で均質化する。
７ 得られた懸濁液を、遠心分離機中でスピンし（５分間＠５０００ｒｐｍ）、そして滅菌蒸留水中で３回洗浄する。
８ 最終的な均質なペレットを凍結乾燥し、そしてこの生成物を抗原として使用する。

プレートコーティングのための抗原
１ 均質化した抗原の２ｍｇ/ｍｌ溶液を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製し、４℃で一晩激しく振盪した。
２ 次いで、２０μｇ/ｍｌの抗原懸濁液を、ｐＨ８．５でＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ）中で作製し、１００μｌ/ウェルでマイクロタイタープレートのウェルにコーティングする。
３ 次いで、プレートを４℃で一晩インキュベートする。
４ プレートを、脱イオン水中で作製した５重量％のラクトース、０．２重量％のフィッシュゼラチン、および０．１％のアジ化ナトリウムを含むブロッキング/グレイジング緩衝液（ブロッキングはフィッシュゼラチンタンパク質の存在に起因し、グレイジングはラクトースの存在に起因する）で洗浄する。
５ プレートを、室温で１時間インキュベートし、液体を吸引し、プレートを室温で一晩乾燥させる。

プレートスタンダードのための抗原
２０％エタノールを含むＰＢＳ緩衝液を、（公知濃度の（例えば、２ｍｇ/ｍｌ））一定の容量の抗原懸濁液に添加し、適切な濃度（例えば、適切には、１００μｇ/ｍｌ、３０μｇ/ｍｌ、５μｇ/ｍｌ）のスタンダードを生成する。

抗体
Ｈ．ｒｅｓｉｎａｅから調製される抗原（上記）を使用して、標準的な技術を使用して、ヒツジ中でポリクローナル抗体を産生した。

複合体試薬（トレーサー）
アルカリホスファターゼ複合体に複合体化したロバ抗ヒツジ抗体を、アッセイにおいてトレーサーとして使用して、ヒツジ抗Ｈ．ｒｅｓｉｎａｅ抗体を同定した。アルカリホスファターゼタンパク質をヒツジ抗Ｈ．ｒｅｓｉｎａｅポリクローナル抗血清に複合体化させ、次いでこれをアッセイ中でトレーサーとして直接使用することもまた可能である。

サンプル希釈液
サンプル希釈液は、脱イオン水中で調製した２．５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含む。

ＥＬＩＳＡ方法のためのアッセイ試薬（キットとして提供され得る）
１ Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅでプレコートしたマイクロプレート、１２×８ストリップ（密封バック中で適切に提供される）
２ Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅスタンダード：スタンダード濃度は０〜１００μｇ/ｍｌの間の範囲である。各バイアルは濃度で標識する。
３ 不活性な青色色素（クレシルブルー（１５ｍｇ/リットル））、タンパク質安定剤（ＢＳＡ１％ｗ/ｖ）およびアジ化ナトリウム０．１％ｗ/ｖを含むＴｒｉｓ緩衝液中のＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ抗体
４ ロバ抗ヒツジ二次標識抗体試薬：不活性な青色色素およびタンパク質安定剤（上記のような）およびアジ化ナトリウム０．１％ｗ/ｖを含むＴｒｉｓ緩衝液中
５ ＥＬＩＳＡサブストレート試薬：ジエタノールアミン緩衝液（２６２．５ｇ/２．５リットル、脱イオン水から作製）中、フェノールフタレイン（ｐｈｅｎｏｐｈｔｈａｌｅｉｎ）モノホスフェート（ＰＭＰ、２２．５ｇ/２．５リットルで作製）および酵素補助因子（ＭｇＣｌ₂ １Ｍ／２．５リットル）からなる。
６ ＥＬＩＳＡ停止溶液：上記のように、ジエタノールアミン緩衝液中、水酸化ナトリウム（７０ｇ/リットル）およびキレート剤（ＥＤＴＡ、７４．４ｇ/リットル）からなる。
７ ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液濃縮物（×１０Ｃｏｎｃ．）：アジ化ナトリウム、０．１％ｗ/ｖ最終濃度、およびＴｗｅｅｎ（０．５％ｖ/ｖ最終濃度）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４））からなる。

必要な材料および装置
精密ピペッターおよび使い捨てチップ
５５０ｎｍフィルターを有するマイクロタイタープレートリーダー
マイクロタイタープレート洗浄機
蒸留水または脱イオン水
マイクロプレート振盪器

方法
サンプル調製
１ 燃料サンプルを完全に混合する。
２ 容器からの燃料サンプルをアリコートし、等量のサンプル希釈液を添加する。試験を用いて水および/または燃料相を評価し得る。
３ 数秒間激しく混合し乳化する。
４ １００μｌの混合物を取り、アッセイプロトコル（以下）に示されるように添加する。

アッセイプロトコル
１ 密封バックから予めコーティングしたプレートを取り出し、１２×８テンプレートシートにサンプルおよびコントロールの位置を記録する。
２ １００μｌのスタンダードおよびサンプルを適切なウェル中にピペットする。スタンダードは、二連で行うべきである。各サンプルもまた、最適な結果のために二連で行うべきである。
３ ５０μｌのＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅ抗体を各ウェルに分配する。プレートをカバーし、プレート振盪器を使用して、３０分間、室温（２０〜２５℃）でインキュベートする。
４ 上記のように、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄溶液で４回洗浄し（３００μｌ/ウェル）、逆さにして、吸収紙上でしっかりと軽くたたく。ウェルがすっかり乾燥するように注意する。
５ １００μｌのロバ抗ヒツジアルカリホスファターゼ複合体抗体を各ウェルに分配する。プレートをカバーし、プレート振盪器を使用して、３０分間、室温（２０〜２５℃）でインキュベートする。
６ 上記のように、プレートを洗浄溶液で４回洗浄し（３００μｌ/ウェル）、逆さにして、吸収紙上でしっかりと軽くたたく。ウェルがすっかり乾燥するように注意する。
７ 上記のように、１００μｌのＥＬＩＳＡサブストレート試薬を各ウェルに分配する。プレートをカバーし、プレート振盪器を使用して、３０分間、室温（２０〜２５℃）でインキュベートする。
８ 上記のように、５０μｌ ＥＬＩＳＡ停止溶液を各ウェルに分配する。プレートの側面をゆっくりと軽くたたくことによって混合する。
９ 柔らかいティッシュで、凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）がないプレートの下表面をふき取る。５５０ｎｍでマイクロプレートリーダーを使用してプレートを読む。

実施例２ 燃料サンプルの分析
燃料サンプルは試験のために航空会社から提供された。２サンプルは、従来の培養アッセイによって試験される場合に真菌の混入を有することが知られていた。サンプルを、実施例１に概略するように処理した。サンプルを乳化し、アッセイの日にランする。結果を以下に示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、サンプル２０８２／３２および／３６が高真菌含量を有する培養アッセイを確認する。
サンプルイアデンティティ 濃度μｇ／ｍｌ 濃度μｇ／１００ｍｌ
２０８２／３２ ＞２００ ＞２００００
２０８２／３３ １ １００
２０８２／３４ ０．３０ ３０
２０８２／３５ ０．３４ ３４
２０８２／３６ １３４ １３４００
２０８２／３７ １．８ １８０
２０８２／３８ ０．４ ４０
２０８２／３９ ０ ０

Claims (9)

1. 微生物の存在についての液体炭化水素燃料の分析方法であって、該方法は、該微生物の存在または非存在を検出するために、乳化剤を含む水性希釈物と燃料サンプルを混合すること、および該炭化水素燃料と接触して増殖した該微生物に対して惹起されたかまたは該炭化水素燃料と接触して増殖した該微生物の代謝物もしくは分解産物に対して惹起された抗体とその混合物またはその一相を接触させることを包含する。
2. 前記方法が、抗体との接触の前に、燃料と水性希釈物を激しく混合することを包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記乳化剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記乳化剤がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記乳化剤が０．０１〜１０容量％の濃度で使用される、請求項４に記載の方法。
6. 前記炭化水素燃料が３９０℃未満の沸点を有する軽質−中間留分燃料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記微生物がＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓ ｒｅｓｉｎａｅである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 炭化水素燃料中で増殖し得る微生物に特異的な抗原であって該炭化水素燃料と接触して増殖した微生物から調製される抗原のサンプル；該抗原に反応性の抗体；および乳化剤を含む水性希釈液を備える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法における使用のためのキット。
9. 液体炭化水素燃料中で増殖した微生物の代謝物への暴露によって調整された抗体。