JP2002517725A

JP2002517725A - 顕微鏡スライド上で不安定試薬を合わせることによる生物学的検体を染色する方法

Info

Publication number: JP2002517725A
Application number: JP2000552498A
Authority: JP
Inventors: パルラメータ、; マーシャグラハム、; アンルイーズポメランツ、
Original assignee: ヴェンタナメディカルシステムズインコーポレイテッド
Priority date: 1998-06-02
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2002-06-18
Also published as: EP1082611A4; WO1999063342A1; EP1082611A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、目的の生物学的試料上で直接混合された成分組織化学溶液を使用することを特徴とするスライド上で生物学的材料を染色する自動方法に関する。該方法は、一緒になって不安定染色溶液を含む少なくとも２つの安定溶液を供し、安定溶液を表面上の目的の生物学的試料に順次送達し、目的の生物学的材料上で直接的に安定溶液を混合して該材料の染色を行うことを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本出願は１９９８年６月２日に出願された米国出願番号第６０／０８７，６７
３号の一部継続出願である。

【０００２】（発明の分野）本発明は成分の組織化学的染色溶液のための処方ならびに不安定組織化学染色
溶液の成分を処方し、貯蔵しおよび合わせる方法に関する。特に、本発明は目的
の生物学的試料上で直接的に成分組織化学溶液を合わせる方法に関する。

【０００３】（背景）組織化学は、化学反応を用いて細胞内の特定の物質を同定する科学である。細
胞中の特定の物質を同定する１つの方法は、このような物質または構造をより可
視的とする化学薬品（染料）で細胞を染色することによる。恐らくは、最も普通
の染色材料はヘマトキシリンおよびエオシンである。ヘマトキシリンは細胞の核
を暗い青色に染色するのに利用され、他方、エオシンは細胞質を核の青色染色と
は対照的な赤色または黄色の種々の色彩に染色する。他の染色を用いてコラーゲ
ン、エラスチン、ムチン、鉄および他の物質のごとき細胞内の他の物質を同定す
ることができる。さらに他の染色を用いて細菌および菌類のごときヒトの身体に
感染する病原菌を同定することができる。細胞内または細胞外のある種の物質お
よび／または構造を同定するのに使用される染色の多くは不安定で毒性であり、
一般に乱雑であって取り扱うのが困難な染色の使用を要する。

【０００４】現在、多くの自動および手動組織化学染色プロトコルは、試料組織の染色に先
だって２以上の溶液の予備混合を要する。多くの場合において、染色用の単一溶
液を調製するためのいくつかの溶液の混合により固有に不安定な染色溶液が生じ
る。不安定性は、染色溶液中の沈殿または薄膜の出現によってそれを呈し得る。
例えば、多くの銀染色溶液は光不安定性である。アンモニア性銀溶液は迅速に分
解し、混合から数時間内に溶液の頂部に銀残渣が観察することができる。薄膜お
よび沈殿の形成は組織の染色に悪影響を及ぼし、従って、組織化学テストの精度
を低下させる。さらに、新鮮な組織化学染色溶液の毎日の調製は時間を消費する
ものである。それはコストがかかることでもある。というのはもし染色溶液を調
製し、その日中に使用できない場合、硝酸銀のような高価な試薬が浪費されるか
らである。従って、不安定染色溶液を使用する改良された組織化学染色方法に対
する要望が存在する。

【０００５】本発明は、毎日のベースでの新しい染色調製物を調製する必要性を軽減する。
本発明は、試料組織スライド上の成分組織化学染色溶液、従前には、スライド試
料を染色するに先だって実験室で合わされた溶液の混合を可能とする。不安定で
ある合わされた溶液とは異なり、分離された成分溶液は長時間安定である。本発
明の成分組織化学溶液は長時間別の溶液として貯蔵することができ、次いで、顕
微鏡スライド上に置かれた試料組織上で合わせることができる。本発明の成分組
織化学染色を用いる組織アッセイの結果は、完全に混合された標準的組織化学染
色溶液を利用する手動または自動方法と同等またはそれよりも優れている。

【０００６】（発明の要約）本発明は目的の生物学的試料上で直接合わされた成分組織化学溶液を使用する
ことを特徴とするスライド上の生物学的材料を染色する自動方法に関する。１つ
の実施形態において、該方法は、不安定な染色溶液を一緒に含む少なくとも２つ
の安定溶液を供し、安定溶液を平面表面上の目的の生物学的試料に順次送達し、
次いで、目的の生物学的試料上で直接安定溶液を合わせて材料の染色を行うこと
を含む。特別の実施形態において、銀染色、鉄染色、三色染色およびムチカルミ
ン染色のための方法が提供される。

【０００７】種々の好ましい実施形態において、生物学的材料は組織セクション、組織培養
細胞、核酸、蛋白質および染色体よりなる群から選択され；不安定染色溶液は菌
類染色溶液、銀染色溶液、三色染色溶液、ムチン染色、ムチカルミン染色溶液、
鉄染色溶液、ベルホッフ（Ｖｅｒｈｏｆｆ）染色溶液およびステイナー（Ｓｔｅ
ｉｎｅｒ）染色溶液よりなる群から選択され、該溶液は混合され、該混合は生物
学的材料上の少なくとも第１および第２の安定溶液にガス流を適用することによ
って達成される。

【０００８】（好ましい実施形態の詳細な記載）本発明は、目的の生物学的試料上で直接混合された成分組織化学溶液を使用す
ることを特徴とする表面の生物学的材料を染色する自動方法に関する。いくつか
の成分溶液よりなる染色溶液の使用を要する多くの組織化学染色手法がある。こ
れらの成分溶液は、目的の組織セクションを含有する顕微鏡スライド上に置かれ
るに先だって一緒に混合される。本発明において、これらの成分溶液は別の容器
中に保持され、目的の生物学的材料上に順次に各溶液を置いた後のみに混合され
る。好ましい実施形態において、溶液は自動組織化学装置および該装置のために
最適化された溶液の濃度および混合の方法によってスライド上で混合される。本
発明の方法は溶液の混合を要しないが、このような混合は得られた溶液中の変動
をスピードアップし制限する。

【０００９】本明細書中で用いる用語「溶液」は溶液、エマルジョンおよび懸濁液を含む。

【００１０】本明細書中で用いる用語「安定な」は、溶液が貯蔵し再使用でき、このような
使用に先だって新たに作成される必要がないことを示す。好ましくは、「安定な
溶液」は少なくとも一週間の保持期限を有する。

【００１１】本明細書中で用いる用語「不安定な」は、１時間程度の任意の時間放置した場
合、溶液が標的生物または組織を染色するための能力の低下を呈するということ
を意味する。例えば、多くの銀染色溶液は光不安定であって熱不安定である。同
様に、多くの染色溶液は、鉄ヘマトキシレンのごとく酸化の結果として色彩を変
化させ、または沈殿物を形成し、使用後に捨てなければならない。本発明の方法
は、２以上の安定なサブ成分を一緒に混合することによって作成できる任意の不
安定なマルチ成分染色溶液にも適用される。特別の染色色彩、または金属でのコ
ート、ある種の特別の種類の細胞または細胞構造である。これは、標的染色が達
成されるまで、順に色素および他の化学物質（酸化剤、還元剤、金属）を適用す
ることによってなされる。いくつかの染色は１０種ほどの多くの異なる溶液を使
用する。各溶液は染色の成分と呼ばれる。

【００１２】染色のいくつかの個々の成分は「サブ成分」からなる。もし使用するのに必要
となるまで溶液の最終処方を貯蔵することができないならば、別の成分を「スト
ック溶液」として作成し、使用直前に合わせなければならない。合わされた溶液
は「安定」ではなく、それが分解し、染色手法においてその機能を呈さなくなる
前に短期間で使用しなければならない。この「不安定な」合わされた溶液を「作
用溶液」と呼ぶ。染色の単一成分は、所望の結果を達成するのに種々の方法で組
み合わせることができる複数のサブ成分を有することができる。

【００１３】本発明の方法は、１時間程度の任意の短い時間放置した場合、標的生物または
組織を染色するための能力の低下を呈する任意の組織化学溶液とともに用いるこ
とができる。このような不安定マルチ成分染色溶液は、限定されるものではない
が、菌類染色溶液、銀染色溶液、鉄染色溶液、鉄ヘマトキシリン溶液、三色染色
溶液、ムチン染色、ムチカルミン染色溶液、ベルホッフ（Ｖｅｒｈｏｆｆ）染色
溶液、アミロイド染色溶液およびステイナーＳｔｅｉｎｅｒ）染色溶液を含む。
例えば、ＭａｎｕａｌｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｉｃＳｔａｉｎｉｎｇＭｅ
ｔｈｏｄｓｏｆｔｈｅＡｒｍｅｄＦｏｒｃｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｌｅ
ｅＧ．Ｌｕｎａ，Ｅｄ．（１９６８年））（ＡＦＩＰＭａｎｕａｌ）；Ｔｅ
ｈｏｒｙａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＣＨｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＹ．Ｂａｎ
ｃｒｏｆｔおよびＳｔｅｖｅｎｓ編，第４版、１９９６年参照）；この両者を参
照によりその全体を本明細書に組み込む。本発明の方法は２成分、（後記実施例
におけるごとく）３成分および他のマルチ成分不安定組織化学溶液で用いること
ができる。

【００１４】例えば、菌類用の通常のグロコット（Ｇｒｏｃｏｔｔ）方法（ＧＭＳ）は菌類
組織の染色を達成するのに多数の溶液を必要とする（クロム酸、重亜硫酸ナトリ
ウム、塩化金、チオ硫酸ナトリウム、光緑色溶液）。加えて、この染色プロトコ
ルは、硝酸銀−メタナミンストック溶液（０．２５％硝酸銀、２．８５％メタナ
ミン）と５％ホウ砂溶液を混合して作用メタナミン−硝酸銀溶液（０．１２５％
硝酸銀、１．４２５メタナミン、０．２％ホウ砂）を得ることによって作成され
るメタナミン−硝酸銀−ホウ砂溶液の使用を要する。ストックメタナミン−硝酸
銀溶液は安定であるが、作用溶液は不安定であり、このように、毎日新たに作成
しなければならない。

【００１５】本発明においては、硝酸銀溶液は、２つの溶液が目的の組織上で直接的に混合
されるまでメタナミン−ホウ砂溶液から別に保持される。本発明の好ましい実施
形態において、硝酸銀溶液は約０．２％から約１．０％硝酸銀よりなる。本発明
の好ましい実施形態において、メタナミン−ホウ砂溶液は蒸留水中の約２．０％
から約４．０％のメタナミンおよび約０．２％から約０．６％のホウ砂である。
本発明の好ましい実施形態において、硝酸銀溶液を試料に添加し、カバーグラス
溶液の添加後、等用量のメタナミン−ホウ砂溶液を試料に添加する。また、３つ
のサブ成分の各々を別の溶液として試料に添加することができる。さらに、当業
者であれば、メタナミン−硝酸銀ストックをホウ砂溶液と組織上で混合すること
ができる。

【００１６】同様に、通常のアンモニア性銀染色は硝酸銀および水酸化アンモニウム／水酸
化ナトリウム溶液双方の使用を要する。ストック硝酸銀および水酸化アンモニウ
ム／水酸化ナトリウム溶液は安定であるが、合わせた作用溶液は不安定であり、
このように、毎日新たに作成しなければならない。

【００１７】本発明において、２つの溶液を目的の組織上で直接的に混合するまで硝酸銀溶
液を水酸化アンモニウム／水酸化ナトリウム溶液から別に保存する。本発明の好
ましい実施形態において、硝酸銀溶液は約０．２％から約１．０％の硝酸銀より
なる。本発明の好ましい実施形態において、水酸化アンモニウム／水酸化ナトリ
ウム溶液は蒸留水中の約０．３％から約１％水酸化アンモニウムおよび約０．１
％から約０．５％の水酸化ナトリウムである。また、３つのサブ成分の各々を別
の溶液として試料に添加することができる。

【００１８】三色染色およびムチカルミン染色はＷｅｉｇｅｒｔｓ鉄ヘマトキシリンＡおよ
びＢ溶液を共に要する。ストックＷｅｉｇｅｒｔｓＡおよびＢ溶液は安定である
が、合わせた作用溶液は不安定である。このように、毎日新たに作成しなければ
ならない。

【００１９】本発明において、２つの溶液を目的の組織上で直接混合するのまでＷｅｉｇｅ
ｒｔｓＡ溶液をＷｅｉｇｅｒｔｓＢ溶液から別に保存する。本発明の好ましい
実施形態において、ＷｅｉｇｅｒｔｓＡ溶液は９５％アルコール中の約０．７％
から１．５％ヘマトキシリンよりなる。本発明の好ましい実施形態において、Ｗ
ｅｉｇｅｒｔｓＢ溶液は蒸留水中の約０．７％から約１．５％水性塩化第２鉄お
よび約０．５％から１．５％ＨＣｌである。本発明の好ましい実施形態において
、ＷｅｉｇｅｒｔｓＢ溶液を試料に添加し、液体カバーグラス溶液の添加後に、
等用量のＷｅｉｇｅｒｔｓＡ溶液を試料に添加する。

【００２０】ゴモリ（Ｇｏｍｏｒｉ）鉄染色はフェロシアン化カリウムおよび塩酸溶液を共
に要する。ストック溶液は安定であるが、合わせた作用溶液は不安定であり、こ
のように、毎日新たに作用しなければならない。

【００２１】本発明において、２つの溶液が目的の組織上で直接的に混合されるまでフェロ
シアン化カリウムは塩酸溶液から別々に保存される。本発明の好ましい実施形態
において、フェロシアン化カリウム溶液は９５％蒸留水中の約８％から約１２％
フェロシアン化カリウムよりなる。本発明の好ましい実施形態において、塩酸溶
液は蒸留水中の約１５％から約３０％ＨＣｌである。

【００２２】本発明の方法において、溶液を種々の時間、生物学的材料と接触させて検体を
染色する目的を達成することができる。１つの実施形態において、溶液を約１秒
から約１時間の間、好ましくは約１０秒から４５分の間、最も好ましくは約１分
から３０分の間、生物学的検体と接触させる。

【００２３】本発明の方法は広い温度範囲にわたって行うことができる。１つの実施形態に
おいて該方法は約２０℃から約９０℃、より好ましくは約４０℃から約７０℃、
最も好ましくは約５０℃から約６０℃で行うことができる。

【００２４】染色を行う温度、および生物学的検体を溶液と接触させる持続のパラメーター
は、当業者に認識されるごとく、広く、染色、生物学的検体および使用される器
具に依存して変化させることができる。

【００２５】本発明の好ましい実施形態において、スライド上で溶液を混合することができ
る自動メカニズムによって溶液を試料組織に添加する。このような自動装置は、
参照によりその全部を本明細書に組み込む米国特許第５，５９５，７０７号；５
，６５４，１９９号；第５，６５４，２００号および第５，６５０，３２７号に
記載されているものを含む。成分溶液における試薬の特定の濃度は、濃度、酸化
／還元電位、イオン化、および／またはｐＨの最適範囲を供するように設計され
た標準的実験によって最適化することができる。

【００２６】好ましい実施形態において、本発明の方法は自動化される。手動および最も機
械な染色は、色素および化学物質の予備混合溶液を充填した開いた容器にスライ
ドを浸漬することによって行われる。この技術の変形はスライドを含有するチャ
ンバーをより混合溶液で満たすことである。対照的に、本発明の方法では、スラ
イドまたは他の表面は染色溶液のための容器としてそれ自体使用される。スライ
ドは平坦な生物学的材料に立て掛け、染色溶液のアリコットを順次送達し、生物
学的材料上で混合する。このような自動染色を行うための装置は限定されるもの
ではないがＮｅｘＥｓ^ＴＭシステム（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｔｕｓｃｏｓ，ＡＺ）および参照によりその全体を本明細書に組み込
む米国特許第５，６５４，２００号、第５，６５０，３２７号、第５，６５４，
１９９号および第５，５９５，７０７号に開示されたものを含む。

【００２７】好ましい実施形態において、出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす
米国特許５，６５４，２００号、第５，６５０，３２７号、第５，６５４，１９
９号および第５，５９５，７０７号に記載されているもののごとく、染色溶液の
「プール」上に層を適用して蒸発を妨ぎ、温度を調節し、混合を増強する方法が
用いられる。特に好ましい実施形態において、重ねる方法は（ａ）その上に取り
付けられた生物学的試料に隣接する平面表面に水性溶液を適用することによって
試料を水性表面層で被覆し、次いで、（ｂ）試料上に蒸発阻害液体の連続層を形
成するのに十分な量で生物学的試料に隣接する平面支持体表面に蒸発阻害液体を
適用することによって水性表面層を蒸発阻害液体で被覆することを含む。蒸発阻
害液体は実質的に水不溶性であり、実質的に水非混和性であって、実質的に非粘
性であり；水よりも小さな比重、および５０℃を超える融点を有し；試料上で行
われる生化学反応にかなり干渉するであろう化学的特徴を欠く。次いで、所望に
より、（ｃ）生物学的試料を生物学的試料に隣接する平面支持体表面に試薬溶液
を適用することによって水性試薬溶液で処理することができる。蒸発阻害液体層
下で試薬溶液は生物学的試料まで流動し、試料は蒸発阻害層によって脱水から連
続的に保護される。

【００２８】本発明の方法は生物学的材料の表面上で安定な溶液を混合することを含む。好
ましい実施形態において、これは、蒸発阻害層の中心および平面支持体表面のエ
ッジの間の蒸発阻害液体層の表面の領域に少なくとも１つのガス流を適用するこ
とによって達成され、該ガス流は平面支持体表面とで鋭角を形成する中心軸を有
する。本発明の１つの実施形態によると、試薬溶液は、蒸発阻害液体層に反対方
向に流れる２つのオフセンターガス流を適用することによって形成された渦によ
り好ましくは撹拌される。本発明のさらなる実施形態によると、安定な溶液は、
スライドの長手方向エッジにそって単一ガス流を適用することによって形成され
た渦により安定な溶液は撹拌され、該ガス流はスライドの遠位エッジに由来する
。

【００２９】本発明の方法によって染色することができる生物学的材料は、限定されるもの
ではないが、組織セクション、組織培養細胞、細胞オルガネラ、染色体、核酸、
炭水化物、脂質および蛋白質を含めた細胞成分、血液のスミア、および他の体液
、分泌物および分泌物類、寄生虫、ウイルス、細菌、菌類を含めた微生物を含む
。

【００３０】本発明の方法は新たに開発された染色を利用することもできる。本発明をほと
んどのいずれかの染色に適用するための上位概念方法は以下を含む：１．染色文献をレビューし、特定の染色プロトコルを選択する。２．使用すべき装置プラットフォームを評価して、装置で利用できる時間、温
度およびすすぎおよび混合事象におけるパラメーターおよび制限を決定する。３．染色手法を、装置パラメーターに適合させる。例：もし多かれ少なかれ必
要であるが、利用できなければ、温度または試薬濃度を増加または減少させる。４．修飾された染色手法をテストし、結果を評価する。５．もし結果が最適下であれば、問題の原因となる成分を特定する。６．試薬を置き換えまたは再処方して問題を解決する。７．染色が最適化されるまでループにて再テストし、再評価する。

【００３１】この手法は、当業者が、ＴｈｅｏｒｙａｎｄＰｒａｃｔｉｖｅｏｆＨ
ｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤｅｎｚａＣＳｈｅｅｈａｎＨ．Ｔ．
（ＡＳＣＰ），ＢａｔｔｅｌｌｅＰｒｅｓｓ，第２版，１９８０；および
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ＡｎｔｈｏｎｙＥ．
Ｗｏｏｄｓ＆ＲｏｙＣ．Ｅｌｌｉｓ，ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉ
ｎｇｓｔｏｎｅ，第１版，１９９４（参照によりその全部を本明細書に組み込む
）に記載されたものを含めたほとんどいずれかの染色手法に本発明を適用するの
を可能とするであろう。

【００３２】

【実施例】

以下の実施例は説明目的のみで提示し、断じて本発明を限定するものと解釈す
るものではない。当業者であれば、以下の変形は本発明の精神または範囲を逸脱
することなく成すことができるのを認識するであろう。

【００３３】（実施例１）菌類用グロコット（Ｇｒｏｃｏｔｔ）方法（ＧＭＳ）染色０．３５ｇの硝酸銀を１００ｍｌの脱イオン水に添加することによって０．３
５％硝酸銀の溶液を作成した。３ｇのメテナミンおよび０．４ｇのホウ砂を１０
０ｍｌの蒸留水に溶解させることによって３．０％メテナミンおよび０．４％ホ
ウ砂の溶液を作成した。０．５ｇの重亜硫酸ナトリウムを１００ｍｌの蒸留水に
溶解させることによって０．５％重亜硫酸ナトリウムを含有する溶液を作成した
。３．７５ｇの三酸化クロムを１００ｍｌの蒸留水に溶解させることによって３
．７５％クロム酸を含有する溶液を作成した。０．２ｇの塩化金を１００ｍｌの
蒸留水に溶解させることによって０．２％塩化金を含有する溶液を作成した。２
．０ｇのチオ硫酸ナトリウムを１００ｍｌの蒸留水に溶解させることによって２
．０％チオ硫酸ナトリウムを含有する溶液を作成した。ストック溶液（９９ｍｌ
蒸留水および１ｍｌ氷酢酸に溶解させたライトグリーンの２ｇ）の２５ｍｌを１
００ｍｌの脱イオン水に希釈することによって０．０５％ライトグリーン溶液を
作成した。自動組織化学分注装置（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔ
ｅｍｓＩｎｃ．，ＴｕｃｓｏｎＡｒｉｚｏｎａ）を用い、２００μｌの硝酸
銀溶液および２００μｌのメテナミン−ホウ砂溶液を顕微鏡スライド上に設けた
組織試料上に分注した。試料組織Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｔｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓは標準的な技術によって染色用に調製した。試料組織を自動組織化学染色
装置に入れ、組織を染色するのに以下のプロトコルを用いた。

【００３４】本実施例ならびに４つの連続した実施例において、洗浄溶液は脱イオン水中の
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０よりなるものであった（７．０±０．５までのｐＨ）
。液体カバーグラスは９９．９９％Ｎｏｒｐａｒ１５および０．０１％未満のオ
イルレッド０である。

【００３５】表１１．すすぎ緩衝液を４１℃まで加温する。２．スライドをすすぐ。３．スライド用量を調整する。４．液体カバーグラスを適用する。５．スライドチャンバーを６０℃まで加温する。６．スライドをすすぐ。７．スライド用量を調整する。８．液体カバーグラスを適用する。９．適時の工程を開始する。１０．スライドをすすぐ。１１．スライド用量を調整する。１２．２００μｌの４％クロム酸を適用し、１５分間インキュベートする。１３．液体カバーグラスを適用する。１４．スライドをすすぐ。１５．スライド用量を調整する。１６．２００μｌの０．５％重亜硫酸ナトリウムを適用し、３分間インキュベー
トする。１７．液体カバーグラスを適用する。１８．スライドをすすぐ。１９．スライドをすすぐ。２０．スライド用量を調整する。２１．２００μｌの０．５％硝酸塩溶液を適用し、３分間インキュベートする。２２．液体カバーグラスを適用する。２３．２００μｌの４％メテナミン／０．４％ホウ砂溶液を適用し、１８分間イ
ンキュベートする。２４．液体カバーグラスを適用する。２５．スライドをすすぐ。２６．スライド用量を調整する。２７．液体カバーグラスを適用する。２８．２００μｌの０．５％塩化銀を適用し、３分間インキュベートする。２９．液体カバーグラスを適用する。３０．スライドをすすぐ。３１．スライド用量を調整する。３２．２００μｌの２．５％チオ硫酸ナトリウム溶液を適用し、３分間インキュ
ベートする。３３．液体カバーグラスを適用する。３４．スライドをすすぐ。３５．スライド用量を調整する。３６．液体カバーグラスを適用する。３７．２００μｌのライトグリーン溶液を適用し、３分間インキュベートする。３８．液体カバーグラスを適用する。３９．スライドをすすぐ。

【００３６】前記した自動プロトコルを用いて調製した組織の間の視覚的比較を、Ｍａｎｕ
ａｌｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｉｃＳｔａｉｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆ
ｔｈｅＡｒｍｅｄＦｏｒｃｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰａｔｈｏ
ｌｏｇｙ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＬｅｅＧ．Ｌｕｎ
ａ，Ｅｄ．（１９６８）（ＡＦＩＰＭａｎｕａｌ）に記載されたＧＭＳのため
のプロトコルに従って行われた同一組織の手動染色と比較した。このような比較
は、自動システムにて成分溶液で染色された組織がより明瞭であり、すなわち、
試料組織の回りの黒色リングはないことを示した。すべての組織試料はスライド
に付着したままであり、手動で染色されたものはスライドからはずれはじめた。
染色コントラストは成分溶液で染色したスライドで良好であった。

【００３７】硝酸銀溶液およびメタナミン／ホウ砂溶液を４℃にて３カ月間保存し、その後
、表１のプロトコルを同様の組織で再度実行した。視覚的比較は、貯蔵した溶液
および新たに作成した領域での同一組織の手動染色を用いて前記したごとくに調
製した組織の間で行った。染色の比較は、自動システムで行った貯蔵溶液によっ
て染色された組織が新たに作成された溶液で手動染色された組織に匹敵するか、
またはそれよりも良好なことを示した。

【００３８】（実施例２）アンモニア性銀染色１０ｇの硝酸銀を脱イオン水に溶解させることによって１０％硝酸銀ストック
溶液を作成した。２ｍｌの１０％ストック溶液を４８ｍｌの脱イオン水で希釈す
ることによって０．２％硝酸銀の作用溶液を作成した。９．２０ｍｌの１Ｎ水酸
化アンモニウムおよび３．６０ｍｌの３％水酸化ナトリウムを３７．２ｍｌの脱
イオン水に溶解させることによって水酸化アンモニウム／水酸化ナトリウム溶液
を作成した。０．５ｇの過マンガン酸カリウムを１００ｍｌの蒸留水に溶解させ
ることによって０．５％過マンガン酸カリウムを含有する溶液を作成した。０．
５ｇのシュウ酸を１００ｍｌの蒸留水に溶解させることによって０．５％シュウ
酸を含有する溶液を作成した。２．５ｇの硫酸第二鉄アンモニウムを１００ｍｌ
の蒸留水に溶解させることによって２．５％硫酸第二鉄アンモニウムを含有する
溶液を作成した。１０ｍｌの濃ホルムアルデヒド（３７−４０％）を９０ｍｌの
蒸留水に希釈することによって１０％ホルマリン含有する溶液を作成した。０．
２ｇの塩化金を１００ｍｌの蒸留水に溶解させることによって０．２％塩化金の
溶液を作成した。２ｇのチオ硫酸ナトリウムを１００ｍｌの蒸留水に溶解させる
ことによって２．０％のチオ硫酸ナトリウムを含有する溶液を作成した。０．１
５ｇの核ファストレッドを硫酸アルミニウムの５％溶液（１００ｍｌ蒸留水中の
５％硫酸アルミニウム）に加熱しつつ溶解させることによって１．５ｇ／Ｌ各フ
ァストレッドの溶液を作成した。自動組織化学分注装置（ＶｅｎｔａｎａＭｅ
ｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，ＴｕｃｓｏｎＡｒｉｚｏｎａ）を用
い、２００μｌの０．２％硝酸銀および２００μｌの水酸化アンモニア／水酸化
ナトリウム溶液を顕微鏡スライド上に取り付けた組織試料上に分注した。試料肝
臓組織を標準的なプロトコルに従って調製した。試料組織を自動組織化学染色層
に入れ、以下のプロトコルを用いて組織を染色した。

【００３９】表２１．すすぎ緩衝液を４１．０℃まで加温する。２．スライドをすすぐ。３．スライド容量を調整する。４．液体カバーグラスを適用する。５．スライドチャンバーを６０．０℃まで加温する。６．スライドをすすぐ。７．スライド容量を調整する。８．液体カバーグラスを適用する。９．スライドをすすぐ。１０．スライド容量を調整する。１１．２００μｌの０．５％過マンガン酸カリウムを適用し、３分間インキュベ
ートする。１２．液体カバーグラスを適用する。１３．スライドをすすぐ。１４．スライド容量を調整する。１５．２００μｌの０．１５％シュウ酸を適用し、３分間インキュベートする。１６．液体カバーグラスを適用する。１７．スライドをすすぐ。１８．スライド容量を調整する。１９．２００μｌの２．５％硫酸第２鉄アンモニウム溶液を適用し、３分間イン
キュベートする。２０．液体カバーグラスを適用する。２１．スライドをすすぐ。２２．２００μｌの０．２％硝酸銀溶液を適用し、３分間インキュベートする。２３．２００μｌの水酸化アンモウム／水酸化ナトリウム溶液を適用し、３分間
インキュベートする。２４．液体カバーグラスを適用する。２５．スライドをすすぐ。２６．スライドをすすぐ。２７．スライド容量を調整する。２８．２００μｌの１０％ホルマリン溶液を適用し、３分間インキュベートする
。２９．液体カバーグラスを適用する。３０．スライドをすすぐ。３１．スライド容量を調整する。３２．２００μｌの０．２％塩化金を適用し、３分間インキュベートする。３３．液体カバーグラスを適用する。３４．スライドをすすぐ。３５．スライド容量を調整する。３６．２００μｌの２.0％チオ硫酸ナトリウムを適用し、３分間インキュベート
する。３７．液体カバーグラスを適用する。３８．スライドをすすぐ。３９．スライド容量を調整する。４０．２００μｌの１．５ｇ／Ｌ核ファストレッドを適用し、３分間インキュ
ベートする。４１．液体カバーグラスを適用する。４２．スライドをすすぐ。

【００４０】前記したごとくに調製した組織の間の視覚的比較は、ＡＦＩＰＭａｎｕａｌ
に記載された小網染色についてのプロトコルに従って行った同一組織の手動染色
と比較した。両技術によって染色された組織は同一であるように見えた。

【００４１】硝酸銀溶液および水酸化アンモニウム／水酸化ナトリウム溶液を４℃で２カ月
間所蔵し、その後、表１のプロトコルを硝酸銀に対して再度行った。貯蔵された
溶液を用いて前記したごとくに調製した組織の間の視覚的比較を、ＡＦＩＰＭ
ａｎｕａｌに記載された小網染色についてのプロトコルに従って行った新たに作
成した溶液での同一組織の手動染色と比較した。染色比較は、自動システムで行
った貯蔵溶液によって染色した組織が、新たに作成した溶液で手動により染色し
た組織と匹敵するまたはそれよりも良好なことを示した。

【００４２】貯蔵溶液を用いて前記したごとくに調製した組織の間の視覚的比較を、ＡＦＩ
ＰＭａｎｕａｌに記載された小網染色についてのプロトコルに従って行った１
日経った溶液での同一組織の手動染色と比較した。染色比較は、自動システムで
行った貯蔵された溶液によって染色された組織が、１日経った溶液で手動により
染色した組織よりも有意に良好であることを示した。

【００４３】（実施例３）マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）三色スキャンマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）三色染色のための溶液は以下のごとくに調製した。
１ｇのヘマトキシリンを１００ｍｌの９５％アルコールに添加することによって
Ｗｅｉｇｅｒｔｓ鉄ヘマトキシリン溶液Ａを作成した。４ｍｌの２９％水性塩化
第二鉄、９５ｍｌの蒸留水および１ｍｌの塩酸を一緒に添加することによってＷ
ｅｉｇｅｒｔｓ鉄ヘマトキシリン溶液Ｂを作成した。９０ｍｌのビーブリッヒス
カーレットの５％水溶液を１０ｍｌの１０％酸性フクシン水溶液および１ｍｌの
氷酢酸と合わせることによってビーブリッヒスカーレット−酸性フクシン溶液を
作成した。得られた溶液を混合し、ワットマン３濾紙を通して濾過した。

【００４４】１ｇのリンタングステン酸を１００ｍｌの脱イオン水中に合わせることによっ
て１％リンタングステン酸溶液を作成した。０．４ｇのアニリンブルーを１００
ｍｌの蒸留水および１ｍｌの酢酸に添加することによってアニリンブルー溶液を
作成した。０．５ｍｌの酢酸を１００ｍｌの蒸留水に添加することによって酢酸
溶液を作成した。

【００４５】表３１．すすぎ緩衝液を４１．０℃まで加温する。２．スライドをすすぐ。３．スライドチャンバーを６０．０℃まで加温する。４．スライドをすすぐ。５．３００μｌのＷｅｉｇｅｒｔｓＢ溶液（１×）を適用し、３分間インキュベ
ートする。６．液体カバーグラスを適用する。７．２００μｌのＷｅｉｇｅｒｔｓＡ溶液（１×）を適用し、６分間インキュベ
ートする。８．液体カバーグラスを適用する。９．スライドをすすぐ。１０．スライドをすすぐ。１１．２００μｌの５％ビーブリッヒスカーレットを適用し、９分間インキュベ
ートする。１２．液体カバーグラスを適用する。１３．スライドをすすぐ。１４．３００μｌの１％リンタングステン酸溶液を適用し、６分間インキュベー
トする。１５．液体カバーグラスを適用する。１６．スライドをすすぐ。１７．２００μｌの０．４０％アニリンブルーを適用し、３分間インキュベート
する。１８．液体カバーグラスを適用する。１９．スライドをすすぐ。２０．３００μｌの０．５％酢酸を適用し、３分間インキュベートする。

【００４６】前記したごとくに調製した組織間の視覚的比較を、ＡＦＩＰＭａｎｕａｌに
記載されたＭａｓｓｏｎ三色染色のためのプロトコルに従って行った同一組織の
手動染色と比較した。染色比較は、手動システムで行った場合の所蔵溶液によっ
て染色された組織が新たに作成された溶液で手動により染色された組織と匹敵す
ることを示した。

【００４７】（実施例４）ムチカルミン染色ムチカルミンのための溶液は以下のごとくに作成した。Ｍｅｙｅｒのストック
ムチカルミン溶液は、１ｇのカルミンおよび０．５ｇの無水塩化アルミニウムを
パイレックスビーガー中で合わせ、２ｍｌの蒸留水を添加することによって作成
した。溶液を小さな火炎上で加熱し、溶液が紫色に変わり、シロップの粘度を有
するようになるまで、ほぼ２時間ガラスロッドで撹拌した。その後、１００ｍｌ
の５０％エタノールをシロップ混合物に添加し、溶液を室温で２４時間インキュ
ベートした。溶液をワットマン３濾紙を通して濾過した。

【００４８】表４１．すすぎ緩衝液を４１．０℃まで加温する。２．スライドをすすぐ。３．スライド容量を調整する。４．液体カバーグラスを適用する。５．スライドチャンバーを６０．０℃まで加温する。６．スライドをすすぐ。７．スライド容量を調整する。８．液体カバーグラスを適用する。９．適時の工程を開始する。１０．スライドをすすぐ。１１．スライド容量を調整する。１２．３００μｌのＷｅｉｇｅｒｔｓＢ溶液を適用し、３分間インキュベートす
る。１３．３００μｌのＷｅｉｇｅｒｔｓＡ溶液を適用し、３分間インキュベートす
る。１４．液体カバーグラスを適用する。１５．スライドをすすぐ。１６．スライド容量を調整する。１７．２００μｌの０．４０％ムチカルミン溶液を適用し、６分間インキュベー
トする。１８．液体カバーグラスを適用する。１９．スライドをすすぐ。２０．スライド容量を調整する。２１．液体カバーグラスを適用する。２２．１００μｌの０．１％タートラジン溶液を適用し、３分間インキュベート
する。２３．液体カバーグラスを適用する。２４．スライドをすすぐ。

【００４９】前記したごとく調製した組織の視覚的比較を、ＡＦＩＰＭａｎｕａｌに記載
されたムチカルミンについてのプロトコルに従って行った同一組織の手動染色と
比較した。両技術によって染色された組織は同一であるように見えた。

【００５０】（実施例５）ゴモリ（Ｇｏｍｏｒｉ）鉄染色０．１５ｇの核ファストレッドを硫酸アルミニウムの５％溶液に加熱しつつ溶
解させることによって１．５ｇ／Ｌ核ファストレッドの溶液を作成した。２０ｍ
ｌの濃塩酸を８０ｍｌの蒸留水に添加することによって２０％塩酸の溶液を作成
した。１０ｇのフェロシアン化カリウムを１００ｍｌの蒸留水に溶解させること
によって、１０％フェロシアン化カリウムの溶液を作成した。

【００５１】表５１．すすぎ緩衝液を４１．０℃まで加温する。２．スライドをすすぐ。３．スライド容量を調整する。４．液体カバーグラスを適用する。５．スライドチャンバーを６０．０℃まで加温する。６．スライドをすすぐ。７．スライド容量を調整する。８．液体カバーグラスを適用する。９．適時の工程を開始する。１０．スライドをすすぐ。１１．スライド容量を調整する。１２．２００μｌの１０％フェロシアン化カリウム溶液。１３．２００μｌの２０％塩酸を適用し、９分間インキュベートする。１４．液体カバーグラスを適用する。１５．スライドをすすぐ。１６．スライド容量を調整する。１７．１００μｌの１．５％核ファストレッド溶液を適用し、３分間インキュベ
ートする。１８．液体カバーグラスを適用する。１９．スライドをすすぐ。

【００５２】前記したごとくに調製した組織の間の視覚的比較を、ＡＦＩＰＭａｎｕａｌ
に記載されたＧｏｍｏｒｉ鉄染色のためのプロトコルに従って行った同一の組織
の手動染色と比較した。両技術によって染色された組織は同一であるように見え
た。

【００５３】本発明は前記した特定の好ましい実施形態によって限定されない。当業者であ
れば、本発明の概念から逸脱することなく開示された好ましい実施形態に対して
種々の修飾をなすことができる。全てのこのような修飾は本発明の範囲内である
ことを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グラハム、マーシャアメリカ合衆国 85711 アリゾナ州ツーソンイーストウィンセットストリート 4858 (72)発明者ポメランツ、アンルイーズアメリカ合衆国 85705 アリゾナ州ツーソンエルカミノデセーロ 4656 Ｆターム(参考） 2G045 BA14 BB01 BB14 BB24 BB29 BB50 BB51 CB01 FA16 FB16 2G058 BB02 BB15 FB01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）少なくとも第１および第２の安定な溶液を供し、ここで
、該少なくとも第１および第２の安定な溶液は組み合わせた場合に不安定な染色
溶液を含み；ｂ）スライドを供し、ここで、染色されるべき生物学的材料がスライド上に存
在し；ｃ）該少なくとも第１および第２の安定な溶液の所定量をスライド上の生物学
的材料に送達するための自動送達システムを供し；次いでｄ）該少なくとも第１および第２の安定な溶液を自動送達システムを用いてス
ライド上の生物学的材料に順次適用することを特徴とするスライド上の生物学的材料を染色する自動方法。
【請求項２】さらに、生物学的材料上で少なくとも第１および第２の安定
な溶液を混合することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】該生物学的材料が組織セクション、組織培養細胞、細胞小器
官、染色体、核酸、炭水化物、脂質および蛋白質を含む細胞成分、血液のスミア
、痰および他の体液、分泌物および分泌物類、および寄生虫、ウイルス、細菌お
よび菌類を含めた微生物よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】該不安定染色溶液が菌類染色溶液、銀染色溶液、鉄染色溶液
、鉄ヘマトキシリン、三色染色溶液、ムチン染液、ムチカルミン染色溶液、Ｖｅ
ｒｈｏｆｆ染色溶液、アミロイド染色溶液、およびステイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ
）染色溶液よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】該混合が、生物学的材料上の少なくとも第１および第２の安
定溶液にガス流を適用することによって達成される請求項２記載の方法。
【請求項６】ａ）約０．２％から約１．０％の硝酸銀の溶液を供し、ここ
で、該硝酸銀は組み合わせた場合に不安定な染色溶液を含む少なくとも第１およ
び第２の安定な溶液であり、ｂ）約２．０％から約４．０％のメテナミンの溶液を供し、ｃ）約０．２％から約０．６％のホウ砂の溶液を供し、ｄ）スライドを供し、ここで、染色すべき生物学的材料は水平なスライド上に
存在し、ｅ）硝酸銀、メテナミンおよびホウ砂溶液の所定量をスライド上の生物学的材
料に送達するための自動送達システムを供し、ｆ）自動送達システムを用いてスライド上の生物学的材料に硝酸銀、メテナミ
ンおよびホウ砂溶液を順次適用し、次いで、ｇ）硝酸銀、メテナミンおよびホウ砂溶液を混合して生物学的材料を染色することを特徴とするスライド上の生物学的材料を銀染色する自動方法。
【請求項７】ａ）約０．２％から約１．０％の硝酸銀の溶液を供し、ｂ）約０．３％から約１．０％の水酸化アンモニウムの溶液を供し、ｃ）約０．７％から約１．５％の水酸化ナトリウムの溶液を供し、ｄ）スライドを供し、ここで、染色すべき生物学的材料は水平なスライド上に
存在し、ｅ）硝酸銀、水酸化アンモニウムおよび水酸化ナトリウム溶液の所定量をスラ
イド上の生物学的材料に送達するための自動送達システムを供し、ｆ）自動送達システムを用いてスライド上の生物学的材料に硝酸銀、水酸化ア
ンモニウムおよび水酸化ナトリウム溶液を順次適用し、次いで、ｇ）硝酸銀、水酸化アンモニウムおよび水酸化ナトリウム溶液を混合して生物学
的材料を染色することを特徴とするスライド上の生物学的材料を銀染色する自動方法。
【請求項８】ａ）約０．７％から約１．５％のヘマトキシリン溶液を供し
、ｂ）約０．５％から約１．５％の水性塩化第二鉄の溶液を供し、ｃ）スライドを供し、ここで、染色すべき生物学的材料は水平なスライド上に
存在し、ｄ）ヘマトキシリンおよび水性塩化第二鉄溶液の所定量をスライド上の生物学
的材料に送達するための自動送達システムを供し、ｅ）自動送達システムを用いてスライド上の生物学的材料にヘマトキシリンお
よび水性塩化第二鉄溶液を順次適用し、次いで、ｆ）ヘマトキシリンおよび水性塩化第二鉄溶液を混合して生物学的材料を染色
することを特徴とするスライド上の生物学的材料の三色またはムチカルミン染色の自
動方法。
【請求項９】ａ）約８％から約１２％のフェロシアン化カリウムの溶液を
供し、ｂ）約１５％から約３０％の塩酸の溶液を供し、ｃ）スライドを供し、ここで、染色すべき生物学的材料は水平なスライド上に
存在し、ｄ）フェロシアン化カリウムの溶液の所定量をスライド上の生物学的材料に送
達するための自動送達システムを供し、ｅ）自動送達システムを用いてスライド上の生物学的材料にフェロシアン化カ
リウムの溶液を順次適用し、次いで、ｆ）フェロシアン化カリウムと塩酸の溶液を混合して生物学的材料を染色する
ことを特徴とするスライド上の生物学的材料の鉄染色の自動方法。