KR0180800B1 - 면역세포화학적 염색에서 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제 조성물 및 이를 이용한 면역세포화학적 염색방법 - Google Patents

면역세포화학적 염색에서 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제 조성물 및 이를 이용한 면역세포화학적 염색방법 Download PDF

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Abstract

알칼라인 포스파타제를 표지제로 사용하여 면역세포화학적 염색을 실시할 때 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제제로서 EDTA를 사용하면, 내인성 알칼라인 포스파타제에 의한 위양성을 완전히 제거할 수 있다.

Description

면역세포화학적 염색에서 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제 조성물 및 이를 이용한 면역세포화학적 염색 방법
제1(a)도는 실시예 2의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제1(b)도는 비교예 2의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제1(c)도는 실시예 2-1의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제2(a)도는 실시예 7의 CD71에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제2(b)도는 비교예 7의 CD71에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제3(a)도는 실시예 8의 CD61에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제3(b)도는 비교예 8의 CD61에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제3(c)도는 실시예 8-1의 CD61에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제4(a)도는 실시예 9의 CD34에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제4(b)도는 비교예 9-1의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제5(a)도는 실시예 13의 EMA에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제5(b)도는 비교예 13의 EMA에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제5(c)도는 실시예 13-1의 EMA에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고,
제6도는 본 발명에 따른 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제제인 EDTA와 Tween-20 처리후에도 세포들의 항원성이 유지됨을 보여주는 사진이다.
[기술 분야]
본 발명은 면역세포화학적 염색(immunocytochemical stain)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역세포화학적 염색시 내인성 알칼라인 포스파타제(endogeneous alkaline phosphatase)의 활성에 의한 위양성 반응을 억제할 수 있는 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제 조성물 및 이를 이용한 면역세포화학적 염색 방법에 관한 기술이다.
[산업상 이용분야]
면역학의 발달과 함께 항체 또는 항원을 이용하여 특정 물질의 존재를 확인하는 방법이 많이 연구 개발되었다. 이와 같은 항원 또는 항체를 이용하는 기술들은 특정한 표지를 한 항원 또는 항체를 사용하며, 이때 표지를 위해서는 방사성 동위원소, 형광물질, 특정 기질과 반응하는 효소 등이 사용되고 있다. 그러나 상기한 방사성 동위원소는 인체에 유해하며, 상기한 방사성 동위원소 및 형광물질을 이용하여 표지를 할 경우 이를 검출하는데 별도의 고가 장비가 필요하다는 단점이 있어, 효소를 이용한 표지방법이 널리 사용되고 있다. 그리고 상기한 표지 방법중 형광물질을 이용한 표지방법과 효소를 이용한 표지방법은 면역조직화학(immnuohistochemistry)에 많이 이용되고 있다. 특히 상기한 효소를 표지한 항체 또는 항원을 이용하여 세포에 존재하는 특정 물질의 존재를 검사하는 방법은 면역세포화학적 염색에 많이 사용되고 있다. 이때 표지에 사용되는 대표적인 효소는 퍼옥시다제(peroxidase), 갈락토시다제(galactosidase) 또는 알칼라인 포스파타제가 있다. 상기한 효소중 퍼옥시다제, 갈락토시다제는 혈구세포들에 많이 포함되어 있어 말초혈액이나 골천자액 등의 혈구세포가 많이 포함되어 있는 검체의 검사에는 알칼라인 포스파타제가 많이 이용되고 있다. 그리고 상기한 효소를 사용하여 표지한 항체는 효소와 항체의 연결 방법에 따라, 효소, 항체 그리고 이를 연결하여 주는 링커가 효소-링커-항체의 순으로 직접 연결된 직접 표지 항체와, 두개의 중합체 즉, 제일 링커-항체 형태의 제일 중합체와 제이 링커-효소 형태의 제이 중합체를 이용하여 효소와 항체를 연결하는 간접 표지 항체 두 종류가 있으며, 상기한 직접 표지 항체에 사용되는 링커의 대표적인 예로는 글루타알데히드(glutaraldehyde), 퍼리오데이트(periodate)가 있고, 간접 표지 항체에 사용되는 제일 및 제이 링커 한쌍으로는 아비딘(avidin)과 바이오틴(biotin) 한쌍의 링커가 있다.
그리고 상기와 같이 표지한 항체 또는 항원을 이용하여 특정 물질을 검사하는 방법으로는 직접 검사법(direct test), 간접 검사법(indirect test) 또는 샌드위치 검사법(sandwich test) 등이 있으며, 효소를 이용하여 표지를 할 경우 주로 간접 검사법 또는 샌드위치 검사법 등이 사용된다. 간접 검사법은 검출하려는 세포 표면 항원에 대한 항체인 제일 항체를 세포에 첨가하여, 표면 항원과 항체를 반응시키고, 상기 항체에 대한 항체로서 효소를 표지한 제이 항체를 첨가하여 표면 항원과 반응한 제일 항체를 검출함으로써, 세포 표면 항원의 존재를 검사하는 방법이다. 그리고 샌드위치 검사법은 플라즈마 세포 등의 표면에 특정 면역글로불린 수용체(immunoglobulin receptor)인 항원의 존재를 검사하는 방법으로서, 세포에 다가의 항원(multivalent cognate antigen)을 첨가하여 상기 수용체와 반응시킨 후, 여기에 상기 다가의 항원에 대한 효소 표지된 제이 항체를 첨가하여 수용체와 반응한 항원을 검출함으로써 수용체를 존재를 검출하는 방법이다. 상기한 제이 항체에 대한 효소의 표지는, 직접 효소를 제이 항체에 표지하는 방법과 제이 항체와 반응하는 효소를 표지한 제삼 항체를 이용하는 방법인 효소-항효소(enzyme-antienzyme) 방법이 있다.
한편 말초혈액 도말이나 골수 도말 표본에서 나타나는 혈액종양세포의 감별이나 비혈구세포 등의 확인을 위하여, 상기한 면역세포화학적 염색 방법이 널리 사용되고 있으며, 특히 아비딘-바이오틴을 링커로 사용한 아비딘-바이오틴 콤플렉스와 알칼라인 포스파타제를 이용한 ABC-AP(avidine biotin complex-alkaline phosphatase) 방법이 1985년 Ormanns와 Schaffer에 의하여 개발되어 현재까지 널리 사용되고 있으며, 이때 내인성 알칼라인 포스파타제(endogenous alkaline phosphatase)에 의한 위양성을 억제하기 억제제로서 레바미졸(levamisole)이 사용되었다[Ormanns W. Schaffer R.(1985) An alkaline-phosphatase staining method in avidin-biotin immunohistochemistry, Histochemistry 82, 421-424]. 개발 당시 실험에 이용된 항체는 카텝신-G(cathepsin-G)에 대한 항체로써, 이는 전골수구(promyelocytes)부터 호중구(neutrophils)까지의 골수구계 세포질에 반응하는 항체이다. 그리고 상기한 아비딘-바이오틴 콤플렉스는 그 자체의 불안정성을 개선하여 최근에는 아비딘 대신 스트렙토아비딘을 이용하여 스트렙토아비딘-바이오틴을 링커로 사용한 SABC-AP(streptoavidine biotin complex-alkaline phosphatase)가 개발되어 사용되고 있다. 그러나 면역세포화학적 염색법중 상기한 ABC-AP 및 SAB-AP 방법의 가장 큰 단점은 골수구계 세포들의 세포질이나 일부의 림프구의 세포질에 존재하고 있는 알칼라인 포스파타제에 의한 위양성 반응이다[Yams L.T., English M.C., Janckila A.J., Zeismer S., Li C..Y.(1987), Immunocytochemistry of cerebrospinal fluid. Acta Cytologica 31, 825-833].
[발명이 해결하려 하는 과제]
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알칼라인 포스파타제를 이용한 면역세포화학적 염색 방법에 있어서, 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하여 위양성을 제거할 수 있는 새로운 그러면서도 저렴한 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제 조성물 및 이를 이용한 우수한 면역세포화학적 염색 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[발명의 개요]
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 많은 연구를 하던 끝에, 면역세포화학 염색에서 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제제로 사용되어 오던 레바미졸 대신 EDTA를 사용할 경우의 면역세포화학적 염색시 위양성을 일으키는 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 완전히 억제하여 정확한 면역세포화학적 염색 결과를 얻을 수 있음을 발견하였다.
일반적으로 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)는 금속 킬레이팅 시약으로서, 진단혈액 영역에서 항응고제로 널리 사용되고 있는 물질이다. 본 발명자는 면역세포화학적 염색시에 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하기 위한 방법을 연구하던중 알칼라인 포스파타제의 동위원소들을 억제하는 것으로 알려진 레바미졸을 사용하여서는 충분한 활성 억제 효과를 얻을 수 없으며, EDTA를 사용할 경우 면역세포화학적 염색시 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하고, 아울러 이와 같은 EDTA를 사용할 경우 세포내 항원 및 효소들의 항원성이 유지되는가 여부를 연구한 결과 EDTA를 처리하여도 항원성이 유지됨을 발견하고[제6도의 항마에로퍼옥시다제(anti-myeloperoxidase]를 이용한 면역세포화학 염색 결과 참조) 이를 기초로하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 EDTA를 포함하는 면역세포화학적 염색시의 내인성 알칼라인 포스파타제 활성 억제 조성물을 제공한다. 상기한 본 발명의 조성물은 계면활성제를 더욱 포함하는 것이 바람직하며, 상기한 계면활성제는 Tween-20, Triton X-100, Nonidet P-40, 옥틸그루코사이드 등과 같은 비이온성(nonionic) 계면활성제 또는 3-[(콜라미도프로필)디메틸-암모니오]-1-프로판설포네이트 쯔비터전트 3-14(3-[(Cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate Zwittergent 3-14:CHAPS)와 같은 양이온성(zwitterionic) 계면활성제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것이 바람직하다. 상기한 계면활성제는 특히 세포가 많이 모여있어 EDTA에 의한 내인성 알칼라인 포스파타제 활성의 완전한 억제가 이루어지지 않을 경우 사용하면, 세포막에 구멍(pore)를 형성하여 EDTA의 세포내 유입을 도와 활성 억제 효과를 증가시킬 수 있으며, 검사 시간을 단축시킬 수 있다. 그리고 상기한 계면활성제의 변성력(denaturing activity)이 너무 높을 경우 세포가 용해되어 검사를 할 수 없는 경우가 발생할 수 있으며, 따라서 비교적 낮은 비이온성 또는 양이온성 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다.
아울러 본 발명은 면역세포화학적 염색방법에 있어서, 상기한 본 발명의 내인성 알칼라인 포스파타제 활성 억제제를 처리하는 공정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포화학적 염색방법을 제공한다.
상기한 본 발명들에 있어서, 상기한 EDTA는 10 내지 20중량%의 수용액인 것이 바람직하다. 상기한 EDTA가 10중량% 미만일 경우 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하는데 장시간이 소요되며, 20중량%를 초과할 경우 첨가에 따른 효과의 증대가 미미하여 비경제적이다. 또 상기한 계면활성제의 첨가비는 상기한 EDTA에 대하여 10 내지 30중량%인 것이 바람직하다. 상기한 계면활성제의 첨가비가 10중량% 미만일 경우에는 검사 대상 세포가 많이 존재할 때 내인성 알칼라인의 활성을 억제하는데 장시간이 소요되며, 30중량%를 초과할 경우 첨가에 따른 효과의 증대가 미미하여 비경제적이다.
[실시예]
본 발명에 따른 면역세포화학적 염색시에 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하는 대표적인 방법은 다음과 같다.
혈구 또는 골수 세포를 슬라이드상에 도말하고, 이를 고정 용액으로 처리하여 슬라이드상에 고정하고, 슬라이드에 도말된 검체의 표면에 존재하는 단백질들에 의한 비특이적 항체 결합을 예방하기 위하여 블록킹 시럼을 처리하고, 본 발명의 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성 억제제 조성물인 EDTA 용액 또는 EDTA와 계면활성제의 혼합 용액을 처리한 후, 공지의 방법에 따라 면역세포화학적 염색을 실시한다.
상기한 면역세포화학적 염색의 대표적인 예로는 다음과 같은 방법이 있다. 상기한 EDTA 용액 또는 EDTA와 계면활성제의 혼합 용액을 처리한 세포에 검색하려는 물질에 대한 항체인 일차 항체를 반응시키고, 상기한 일차 항체에 대한 항체이며 제일 링커, 예를 들면 바이오틴이 부착되어 있는 이차 항체를 다시 반응시키고, 여기에 알칼라인 포스파타제가 부착된 제이 링커, 예를 들면 스트렙토아비딘을 첨가하여 반응시키고, 여기에 알칼라인 포스파타제에 의해 발색하는 기질을 첨가하여 발색을 확인하여 검색하려는 물질의 존재를 확인한다. 이때 발색의 감도를 높이기 위하여 대조 염색을 실시할 수 있다. 지금까지 이와 같은 면역세포화학적 염색 시험은 키트화하여 시판되고 있으며, 가장 대표적인 것은, 이차 항체로는 Dakopatts사에서 시판되는 LSAB KIT #K0674이 있고, 기질 용액으로는 Dakopatts사의 New Fuchsin Substrate System #K0698이 있다. 그러나 종래의 이와 같은 키트는 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하기 위하여 레바미졸을 사용하고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 본 발명의 바람직한 일실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1-12]
[EDTA를 이용한 SAB-AP 염색]
스트렙토아비딘-바이오틴 콤플렉스와 알칼라인 포스파타제를 이용한 면역세포화학적 염색방법에 있어서, 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하기 위하여 EDTA를 사용하여 면역세포화학적 염색을 실시하였으며, 그 구체적인 방법은 다음과 같다. 이때 항체 및 기질들은 Denmark, Dakopatts사제, Dakopatts Kit로 시판하는 LSAB kits #K0674, New Fuchsin Substrate System #K0698 등을 구입하여 그 추천 방법에 따라 사용하였다. 단 이때 레바미졸은 사용하지 않았다.
혈구 및 골수 세포를 슬라이드상에 도말하고 포르말린:아세톤:에탄올을 1:10:10의 비율로 혼합한 용액에 약 2분간 슬라이드를 침지하여 세포를 고정하고, TBS로 한번 씻어 준 후 TBS 용액에 약 5분간 담가 방치하였다. 상기 슬라이드를 꺼내어 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 블록킹 시럼(Blocking serum:Dako사제)을 몇 방울 떨어뜨린 후 약 5분간 방치한 후, 블록킹 시럼을 떨어버렸다. 15wt% EDTA:Tween-20을 4:1로 혼합한 용액에 슬라이드를 약 20분간 담가둔 후 꺼내어 과도하게 묻어있는 용액을 떨어버렸다. 하기한 (표)에 개시한 Dakopatts사, Immunotech사, Becton-Dickinson사에서 구입한 일차 항체를 약 50μL 슬라이드에 떨어뜨린 후 습윤 상자에서 약 30분간 반응시키고, TBS로 한번 씻어 준 후, TBS 용액에 약 5분씩 두번(새로운 용액으로 바꾸면서) 침지하였다. 꺼낸 슬라이드에서 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 스트렙토아비딘 50μL를 떨어뜨리고 습윤 상자에서 10분간 반응시키고, TBS로 한번 씻어 준 후, TBS 용액에 약 5분씩 세번(새로운 용액으로 바꾸면서) 담가 두었다. 꺼낸 슬라이드에서 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 키트내에 들어 있는 튜브에 키트내의 용액중 ⓐ1drop+ⓑ1drop+D.W.2cc를 혼합하고, 검정색의 용기에 ⓒ와 ⓓ를 각각 한 방울씩 넣고 혼합한 후 3분간 방치하고, 튜브에 들어 있던 ⓐ1drop+ⓑ1drop+D.W.2cc를 혼합액을 검정색 용기에 넣고 다시 혼합하여, 기질 용액을 제조하였다. 이와 같이 만들어진 기질 용액으로 슬라이드 전면을 덮은 후 10분간 반응시키고, 붉은 색이 보이면 D.W.를 세정한 후, 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 대조 염색을 하고, 수돗물로 씻어 낸 후 흐르는 물에 10분간 침지하여, 면역세포화학적 염색을 실시하였다. 그리고 상기 염색된 슬라이드를 말린 후 카바슬라이드를 덮고 현미경으로 관찰하였다.
[비교예 1-12]
[레바미졸을 이용한 SAB-AP 염색]
스트렙토아비딘-바이오틴 콤플렉스와 알칼라인 포스파타제를 이용한 면역세포화학적 염색방법에 있어서, 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제하기 위하여 레바미졸를 사용하여 면역세포화학적 염색을 실시하였으며, 그 구체적인 방법은 다음과 같다. 이때 항체 및 기질들은 Denmark, Dakopatts사제, Dakopatts Kit로 시판하는 LSAB kits #K0674, New Fuchsin Substrate System #K0698 등을 구입하여 그 추천 방법에 따라 사용하였다.
포르말린:아세톤:에탄올을 1:10:10의 비율로 혼합한 용액에 약 2분간 슬라이드를 침지하여 세포를 고정하고, TBS로 한번 씻어 준 후 TBS 용액에 약 5분간 담가 방치하였다. 상기 슬라이드를 꺼내어 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 블록킹 시럼(Blocking serum:Dakopatts사제)을 몇 방울 떨어뜨린 후 약 5분간 방치한 후, 블록킹 시럼을 떨어버렸다. (표)에 개시한 Dakopatts사, Immunotech사, Becton-Dickinson사에서 구입한 일차 항체를 약 50μL 슬라이드에 떨어뜨린 후 습윤 상자에서 약 30분간 반응시키고, TBS로 한번 씻어 준 후, TBS 용액에 약 5분씩 두번(새로운 용액으로 바꾸면서) 침지하였다. 꺼낸 슬라이드에서 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 이차 항체를 50μL 슬라이드에 떨어뜨린 후 습윤 상자에서 약 10분간 반응시키고, TBS로 한번 씻어 준 후 TBS 용액에 약 5분씩 세번(새로운 용액으로 바꾸면서) 침지하였다. 꺼낸 슬라이드에서 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 스트렙토아비딘 50μL를 떨어뜨리고 습윤 상자에서 10분간 반응시키고, TBS로 한번 씻어 준 후, TBS 용액에 약 5분씩 세번(새로운 용액으로 바꾸면서) 담가 두었다. 꺼낸 슬라이드에서 염색할 부위를 제외한 나머지 부분의 물기를 흡습지를 이용하여 제거하고, 키트(Denmark, Dakopatts사제, Dakopatts Kit)내에 들어 있는 튜브에 키트내의 용액중 ⓐ1drop+ⓑ1drop+D.W.2cc를 혼합하고, 검정색의 용기에 ⓒ와 ⓓ를 각각 한 방울씩 넣고 혼합한 후 3분간 방치하고, 튜브에 들어 있던 ⓐ1drop+ⓑ1drop+D.W.2cc를 혼합액을 검정색 용기에 넣고 다시 혼합하고, 여기에 레바미졸을 1mM의 농도로 첨가하여 기질 용액을 제조하였다. 이와 같이 만들어진 기질 용액으로 슬라이드 전면을 덮은 후 10분간 반응시키고, 붉은 색이 보이면 D.W.를 세정한 후, 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 대조 염색을 하고, 수돗물로 씻어 낸 후 흐르는 물에 10분간 침지하여, 면역세포화학적 염색을 실시하였다. 그리고 상기 염색된 슬라이드를 말린 후 카바슬라이드를 덮고 현미경으로 관찰하였다.
[실시예 2-1]
상기한 실시예 2에서 Tween 20을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기한 실시예 2와 실질적으로 동일하게 실시하였다.
[실시예 8-1]
상기한 실시예 8에서 Tween 20을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기한 실시예 8와 실질적으로 동일하게 실시하였다.
[비교예 9-1]
상기한 비교예 9에서 레바미졸을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기한 비교예 9와 실질적으로 동일하게 실시하였다.
상기한 실시예 1-12, 2-1, 8-1 및 비교예 1-12, 9-1에 의하여 면역세포화학적으로 염색된 결과를 살펴본 결과, 본 발명에 따라 EDTA를 처리하여 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제한 경우 세포의 염색 결과를 확연하게 확인할 수 있었으나, 종래의 레바미졸을 이용한 경우 또는 레바미졸도 이용하지 않은 경우에는 세포의 염색 결과가 불분명하였으며, 또 본 발명에 있어서 EDTA와 계면활성제인 Tween-20을 첨가하였을 경우 EDTA만을 첨가한 경우보다 더욱 우수한 염색 결과를 얻을 수 있었다. 상기한 실시예 및 비교예에 의하여 면역세포화학적으로 염색된 결과를 사진을 도면에 첨부한다.
제1(a)도는 실시예 2의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고, 제1(b)도는 비교예 2의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고, 제1(c)도는 실시예 2-1의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이다. 상기 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 레바미졸 처리한 비교예 2보다는 EDTA 또는 EDTA와 Tween-20을 처리한 실시예 2-1 및 실시예 2의 염색 결과가 우수하였다.
제2(a)도는 실시예 7의 CD71에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고, 제2(b)도는 비교예 7의 CD71에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이다. 상기 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 레바미졸 처리한 비교예 7 보다는 EDTA와 Tween-20을 처리한 실시예 7의 염색 결과가 우수하였다.
제3(a)도는 실시예 8의 CD61에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고, 제3(b)도는 비교예 8의 CD61에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고, 제3(c)도는 실시예 8-1의 CD61에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이다. 상기 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 레바미졸 처리한 비교예 8 보다는 EDTA를 처리한 실시예 8-1의 염색 결과가 우수하였으며, EDTA와 Tween-20을 처리한 실시예 8가 EDTA만을 처리한 실시예 8-1보다 염색 결과가 우수하였다.
제4(a)도는 실시예 9의 CD34에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이고, 제4(b)도는 비교예 9-1의 CD7에 대한 면역세포화학적 염색 결과를 나타내는 사진이다. 상기 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 레바미졸 처리한 비교예 9-1 보다는 EDTA와 Tween-20을 처리한 실시예 9의 염색 결과가 우수하였다.
[실시예 13]
일차항체로서 EMA(epithelial membrane antigen)에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기한 실시예와 실질적으로 동일하게 실시하였다.
[비교예 13]
일차항체로서 EMA(epithelial membrane antigen)에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기한 비교예와 실질적으로 동일하게 실시하였다.
[비교예 13-1]
레바미졸 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 상기한 비교예 13와 실질적으로 동일하게 실시하였다.
상기한 실시예 13, 비교예 13, 비교예 13-1에의 염색 결과를 제5(a)도, 제5(b)도, 제5(c)도에 첨부하였다. 이들 도면의 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 레바미졸 처리하지 않은 것 및 레바미졸을 처리한 것보다 EDTA와 Tween-20을 처리한 것이 우수한 염색 결과를 나타내었다.
상기한 실시예 및 비교예로부터 확인되는 바와 같이 본 발명에 따라 EDTA를 이용하여 내인성 알칼라인 포스파타제의 활성을 억제시킨 경우, 면역세포화학적 염색의 위양성이 전혀 없이 명백하게 염색 결과를 판정할 수 있다.

Claims (7)

  1. EDTA를 포함하는 면역세포화학적 염색시의 내인성 알칼라인 포스파타제 활성 억제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기한 EDTA는 10 내지 20중량%의 수용액인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제(nonionic detergent) 및 양이온성 계면활성제(zwitterionic detergent)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 계면활성제를 더욱 포함하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기한 EDTA는 10 내지 20중량%의 수용액인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기한 계면활성제의 첨가비는 상기한 EDTA에 대하여 10 내지 30중량%인 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 Tween-20, Triton X-100, Nonidet P-40 및 옥틸그루코사이드(octylglucoside)로 이루어진 군에서 선택되는 것이고, 상기 양이온성 계면활성제는 3-[(콜라미도프로필)디메틸-암모니오]-1-프로판 설포네이트 쯔비터전트 3-14인 조성물.
  7. 혈구 세포를 포함하는 말초 혈액 또는 골수 천자액을 슬라이드에 도말하는 단계와; 상기 혈구 세포를 세포 고정 용액으로 고정시키는 단계와; 상기 슬라이드에 도말된 말초 혈액 또는 골수 천자액에 존재하는 단백질들에 의한 비특이적 항체 결합을 예방하기 위해 상기 슬라이드를 블록킹 시럼으로 처리하는 단계와; 블록킹 시럼이 처리된 상기 슬라이드를 EDTA를 포함하는 면역세포화학적 염색시의 내인성 알칼라인 포스파타제 활성 억제 조성물에 침지시키는 단계; 및 상기 내인성 알칼라인 포스파타제 활성 억제 조성물이 처리된 슬라이드를 알칼라인 포스파타제를 이용하는 발색 공정으로 투입하는 단계를 포함하는 면역세포화학적 염색방법.
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