JP3336016B2 - 癌増殖状態の免疫組織化学的検出分析試験 - Google Patents
癌増殖状態の免疫組織化学的検出分析試験Info
- Publication number
- JP3336016B2 JP3336016B2 JP53085298A JP53085298A JP3336016B2 JP 3336016 B2 JP3336016 B2 JP 3336016B2 JP 53085298 A JP53085298 A JP 53085298A JP 53085298 A JP53085298 A JP 53085298A JP 3336016 B2 JP3336016 B2 JP 3336016B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ngal
- protein
- cancer
- sample
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、米国政府が後援し、NIHによって授与され
た基金＃CA58328によってなされた。米国政府は、本発
明について一定の権利を有する。
た基金＃CA58328によってなされた。米国政府は、本発
明について一定の権利を有する。
発明の背景 本発明は癌増殖状態を決定する方法に関するものであ
る。乳癌および隣接組織については、免疫組織化学的染
色法を用いてNGALタンパク質が試験される。
る。乳癌および隣接組織については、免疫組織化学的染
色法を用いてNGALタンパク質が試験される。
オンコジーンｃ−erbB−２はヒト乳癌の臨床的進行に
関連することが知られている。ｃ−erbB−２のげっ歯動
物同族体、neuを用いる生体内（in vivo）モデルが開発
され、哺乳動物の発癌および腫瘍生物学におけるｃ−er
bB−２の役割を評価することが試みられてきた。あるモ
デルにおいて、乳腺特異的プロモーターを用い、乳腺を
標的にして活性化neuを発現するトランスジェニックマ
ウスが作製された。第２のモデルにおいては、複製−欠
損レトロウィルス・ベクターを用いて、活性化neuオン
コジーンをその場にてラット乳房上皮細胞に直接かつ安
定的に導入した。両方法で、neuは強力な腫瘍誘発物質
であることが判明した。
関連することが知られている。ｃ−erbB−２のげっ歯動
物同族体、neuを用いる生体内（in vivo）モデルが開発
され、哺乳動物の発癌および腫瘍生物学におけるｃ−er
bB−２の役割を評価することが試みられてきた。あるモ
デルにおいて、乳腺特異的プロモーターを用い、乳腺を
標的にして活性化neuを発現するトランスジェニックマ
ウスが作製された。第２のモデルにおいては、複製−欠
損レトロウィルス・ベクターを用いて、活性化neuオン
コジーンをその場にてラット乳房上皮細胞に直接かつ安
定的に導入した。両方法で、neuは強力な腫瘍誘発物質
であることが判明した。
以前我々は、「neu開始−ラット乳癌における独特に
過剰発現したリポカリンの分離」を報告した（ステーツ
（S.Stoesz）ら、1994 AACR Abstract）。このリポカ
リンは「NRL」（neu−related lipocalin、neu関連性リ
ポカリン）と命名された。この要約書および本明細書に
おいて参照するその他の全ての出版物の開示は、ここで
完全に説明されたものとして参照して本明細書の記載の
一部とする。リポカリン類は広範囲の機能を有すること
が知られているが、NRLの特異的機能は知られていな
い。
過剰発現したリポカリンの分離」を報告した（ステーツ
（S.Stoesz）ら、1994 AACR Abstract）。このリポカ
リンは「NRL」（neu−related lipocalin、neu関連性リ
ポカリン）と命名された。この要約書および本明細書に
おいて参照するその他の全ての出版物の開示は、ここで
完全に説明されたものとして参照して本明細書の記載の
一部とする。リポカリン類は広範囲の機能を有すること
が知られているが、NRLの特異的機能は知られていな
い。
ラットNRLに若干類似するタンパク質、ヒトNGAL、が
分離され、配列決定された。NGALおよびNGALのタンパク
質配列をコードする種々のcDNA遺伝子配列がキールドセ
ン（L.Kjeldsen）らのJ.Biol.Chem.268:10425−10432
（1993）；バンドガード（J.Bundgaard）ら、Biochem.B
iophys.Res.Comm.202［３］:1468−1475（1994）；バー
チュ（S.Bartsch）ら、FEBS Let.37:255−289（1995）
に報告されている。NGAL（ヒト好中性リポカリン（HN
L）としても知られている）は種々の細胞型（例えば骨
髄、卵巣細胞癌）に見いだされている。この場合もその
特異的機能は知られていない。なお、バンドガードが成
熟タンパク質の第１塩基をCAGからのＱとして報告し、
一方、キールドセンがこの位置にＥを報告したことに注
目されたい。本願請求の範囲では、これらの両方の変種
を網羅するために「NGAL」を用いる。
分離され、配列決定された。NGALおよびNGALのタンパク
質配列をコードする種々のcDNA遺伝子配列がキールドセ
ン（L.Kjeldsen）らのJ.Biol.Chem.268:10425−10432
（1993）；バンドガード（J.Bundgaard）ら、Biochem.B
iophys.Res.Comm.202［３］:1468−1475（1994）；バー
チュ（S.Bartsch）ら、FEBS Let.37:255−289（1995）
に報告されている。NGAL（ヒト好中性リポカリン（HN
L）としても知られている）は種々の細胞型（例えば骨
髄、卵巣細胞癌）に見いだされている。この場合もその
特異的機能は知られていない。なお、バンドガードが成
熟タンパク質の第１塩基をCAGからのＱとして報告し、
一方、キールドセンがこの位置にＥを報告したことに注
目されたい。本願請求の範囲では、これらの両方の変種
を網羅するために「NGAL」を用いる。
乳癌の治療および診断は癌の増殖状態を正確に決定す
ることによって改善することができる。増殖状態の一つ
の重要な尺度は、「Ｓ期」細胞のパーセンテージであ
る。Ｓ期は細胞周期中の、DNA複製が起きる時期であ
る。一般的には、クロス（F.Cross）らのAnnu.Rev.Cell
Biol.5:341−395（1989）を参照。Ｓ期にある生検試料
における細胞のパーセンテージの測定は、細胞増殖状態
の指標である。高いパーセンテージのＳ期細胞は、非常
に積極的な治療法がない、腫瘍の好ましくない予後を示
すことが知られている。
ることによって改善することができる。増殖状態の一つ
の重要な尺度は、「Ｓ期」細胞のパーセンテージであ
る。Ｓ期は細胞周期中の、DNA複製が起きる時期であ
る。一般的には、クロス（F.Cross）らのAnnu.Rev.Cell
Biol.5:341−395（1989）を参照。Ｓ期にある生検試料
における細胞のパーセンテージの測定は、細胞増殖状態
の指標である。高いパーセンテージのＳ期細胞は、非常
に積極的な治療法がない、腫瘍の好ましくない予後を示
すことが知られている。
Ｓ期の癌細胞のパーセンテージは、細胞染色、フロー
サイトメトリーによって、およびある種のマーカーの分
析によって測定される。公知の技術には問題があり（コ
スト高、時間を要する等）、かつ特殊な装置も必要であ
るため、この技術に対して日常的臨床的に検査室で使用
する興味を欠わせるものとしている。このため、癌の増
殖状態を決定するための改良された分析試験が必要とさ
れている。
サイトメトリーによって、およびある種のマーカーの分
析によって測定される。公知の技術には問題があり（コ
スト高、時間を要する等）、かつ特殊な装置も必要であ
るため、この技術に対して日常的臨床的に検査室で使用
する興味を欠わせるものとしている。このため、癌の増
殖状態を決定するための改良された分析試験が必要とさ
れている。
発明の概要 一面において、本発明はヒト乳癌の相対的増殖度を測
定する方法を提供する。その癌の試料を採取した後、NG
ALタンパク質に特異性を有する抗体を用いて、試料中の
NGALタンパク質に結合させる。次に、抗体に結合したマ
ーカーを用いて、癌中にNGALタンパク質がどの程度存在
するかその程度をマークする。本明細書で用いるNGALタ
ンパク質とは、少なくとも配列番号１の配列21−197を
有するタンパク質である。
定する方法を提供する。その癌の試料を採取した後、NG
ALタンパク質に特異性を有する抗体を用いて、試料中の
NGALタンパク質に結合させる。次に、抗体に結合したマ
ーカーを用いて、癌中にNGALタンパク質がどの程度存在
するかその程度をマークする。本明細書で用いるNGALタ
ンパク質とは、少なくとも配列番号１の配列21−197を
有するタンパク質である。
好適な態様において、試料は癌に隣接する組織も含
む。そこでマーカーは隣接組織においてNGALタンパク質
がどの程度存在するかその程度も記マークする。
む。そこでマーカーは隣接組織においてNGALタンパク質
がどの程度存在するかその程度も記マークする。
一面において、上記方法は免疫組織化学的染色分析試
験であり、マーカーは可視色を発し、NGALの存在をマー
クする。
験であり、マーカーは可視色を発し、NGALの存在をマー
クする。
本発明の目的の一つは乳房組織における癌増殖の分析
試験法を提供することであると理解できるであろう。
試験法を提供することであると理解できるであろう。
本発明の別の目的は、周囲組織のNGALも分析すること
によって偽陽性を最小にする技術を提供することであ
る。
によって偽陽性を最小にする技術を提供することであ
る。
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下に述
べる明細書および請求の範囲を検討した後に明らかにな
るだろう。
べる明細書および請求の範囲を検討した後に明らかにな
るだろう。
発明の詳細な説明 フローサイトメトリーによってヒト乳腺腫瘍細胞パネ
ルのＳ期値を測定し、公知の同一試料について例えばク
ー（S.Xu）ら、J.Immunol.Meth.171:245−252（1994）
のNGALタンパク質分析試験を用いてNAGLタンパク質濃度
を測定するという方法により、標準曲線を作成すること
ができる。我々は、癌中のNGALたんぱく質濃度がＳ期値
を予測することを見いだした。免疫組織化学的染色「標
準」は、これらの知見により開発できるものである。
ルのＳ期値を測定し、公知の同一試料について例えばク
ー（S.Xu）ら、J.Immunol.Meth.171:245−252（1994）
のNGALタンパク質分析試験を用いてNAGLタンパク質濃度
を測定するという方法により、標準曲線を作成すること
ができる。我々は、癌中のNGALたんぱく質濃度がＳ期値
を予測することを見いだした。免疫組織化学的染色「標
準」は、これらの知見により開発できるものである。
初期の相関試験用ヒト試料の採取 癌が疑われるヒト女性乳房組織を当業者に公知の標準
的生検法によって採取した。例えば、吸引（または細
針）生検を用いた。それは疑わしい組織に導入した針に
よって細胞および組織断片を吸引することを含む。
的生検法によって採取した。例えば、吸引（または細
針）生検を用いた。それは疑わしい組織に導入した針に
よって細胞および組織断片を吸引することを含む。
針（またはコア）生検がもう一つの方法である。これ
は疑わしい組織に導入するために特別に設計された針に
よって組織の中心を採取することを含む。他には、より
大きい腫瘍塊から小さいＶ字型組織を取り出すことを含
む切開生検、および疑わしい全腫瘍組織を周囲の正常組
織の境界をほとんどもしくは全く含まずに切除すること
を含む切除生検が、Ｓ期との相関性を確認するために適
した組織抽出法の例である。一般的には、デヴィタ（V.
DeVita,Jr.）ら、Cancer Principles and Practice of
Oncology、Vol 1、第４版、J.B.リッピンコット社（J.
B.Lippincott Co.）、243−244頁（1993）を参照。
は疑わしい組織に導入するために特別に設計された針に
よって組織の中心を採取することを含む。他には、より
大きい腫瘍塊から小さいＶ字型組織を取り出すことを含
む切開生検、および疑わしい全腫瘍組織を周囲の正常組
織の境界をほとんどもしくは全く含まずに切除すること
を含む切除生検が、Ｓ期との相関性を確認するために適
した組織抽出法の例である。一般的には、デヴィタ（V.
DeVita,Jr.）ら、Cancer Principles and Practice of
Oncology、Vol 1、第４版、J.B.リッピンコット社（J.
B.Lippincott Co.）、243−244頁（1993）を参照。
タンパク質分析のためには、組織を次のように調製し
てもよい。タンパク質を抽出するために、組織を、PBST
DS（10mMリン酸ナトリウム、二塩基性;154mM塩化ナトリ
ウム;12mMデオキシコール酸、ナトリウム塩;1mMフッ化
ナトリウム;3.5mMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）;31mM
アジ化ナトリウム;1％トリトン（Triton）Ｘ−100;1mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド）中で、100mg/ml
の濃度で、ポリトロン（Polytron）で均質化し、４℃、
10,000gで15分間遠心分離すればよい。その後、可溶性
タンパク質を含む上澄液を移す。
てもよい。タンパク質を抽出するために、組織を、PBST
DS（10mMリン酸ナトリウム、二塩基性;154mM塩化ナトリ
ウム;12mMデオキシコール酸、ナトリウム塩;1mMフッ化
ナトリウム;3.5mMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）;31mM
アジ化ナトリウム;1％トリトン（Triton）Ｘ−100;1mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド）中で、100mg/ml
の濃度で、ポリトロン（Polytron）で均質化し、４℃、
10,000gで15分間遠心分離すればよい。その後、可溶性
タンパク質を含む上澄液を移す。
分析試験 我々は患者の乳癌組織についてNGALタンパク質の絶対
量を試験した。この試験はRIAによって行われた。例え
ばクーら、J.Immunol.Meth.171:245−252（1994）を参
照。また、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）
反応によって行うことができる。ELISAでは、試料をNGA
Lに特異的な抗体に曝す。NGALに対するポリクローナル
抗血清はNGALで免疫したウサギから得ることができる。
ポリクローナル抗体とNGALタンパク質との結合後、その
混合物を、酵素的変色標識と結合した第２抗体（例えば
ヤギ抗ウサギ）に曝す。この標識の検出は、NGAL抗原の
存在を示す。
量を試験した。この試験はRIAによって行われた。例え
ばクーら、J.Immunol.Meth.171:245−252（1994）を参
照。また、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）
反応によって行うことができる。ELISAでは、試料をNGA
Lに特異的な抗体に曝す。NGALに対するポリクローナル
抗血清はNGALで免疫したウサギから得ることができる。
ポリクローナル抗体とNGALタンパク質との結合後、その
混合物を、酵素的変色標識と結合した第２抗体（例えば
ヤギ抗ウサギ）に曝す。この標識の検出は、NGAL抗原の
存在を示す。
より詳細には、抗NGAL（モノクローナルまたはポリク
ローナル）捕獲抗体をミクロタイタープレートに被覆し
てもよい。洗浄後、未知濃度のNGAL抗原を含む患者試料
をプレート上でインキュベートする。非結合抗原を洗い
去った後、第２の抗NGAL抗体をウェルに加え、インキュ
ベートする。この第２の抗体は酵素標識されていてもよ
いし、或いはその後、第２の抗体類であって捕獲抗体で
はない抗体類を識別する、第３の酵素標識抗体を添加し
てもよい。非結合の抗体を洗い去った後、適切な発色性
酵素基質をウェルに加える。基質のインキュベーション
で生じた変色度は腫瘍試料中のNGAL由来タンパク質の濃
度に比例する。これを、平行して実験した組換えNGALの
既知濃度の標準物質と比較する。一般的ELISA法につい
ては、エングヴァル（E.Engvall）ら、Immunochemistry
8:871−879（1971）を参照。
ローナル）捕獲抗体をミクロタイタープレートに被覆し
てもよい。洗浄後、未知濃度のNGAL抗原を含む患者試料
をプレート上でインキュベートする。非結合抗原を洗い
去った後、第２の抗NGAL抗体をウェルに加え、インキュ
ベートする。この第２の抗体は酵素標識されていてもよ
いし、或いはその後、第２の抗体類であって捕獲抗体で
はない抗体類を識別する、第３の酵素標識抗体を添加し
てもよい。非結合の抗体を洗い去った後、適切な発色性
酵素基質をウェルに加える。基質のインキュベーション
で生じた変色度は腫瘍試料中のNGAL由来タンパク質の濃
度に比例する。これを、平行して実験した組換えNGALの
既知濃度の標準物質と比較する。一般的ELISA法につい
ては、エングヴァル（E.Engvall）ら、Immunochemistry
8:871−879（1971）を参照。
ELISAの結果分析から、患者組織試料に存在するNGAL
タンパク質の濃度を決定し、これを既知の予後およびＳ
期履歴を含む腫瘍パネルと比較することができる。ウェ
スタンブロット等のその他の方法を用いて試料中のNGAL
タンパク量を分析することもできる。
タンパク質の濃度を決定し、これを既知の予後およびＳ
期履歴を含む腫瘍パネルと比較することができる。ウェ
スタンブロット等のその他の方法を用いて試料中のNGAL
タンパク量を分析することもできる。
既知ヒト乳腫瘍試料 Ｓ期パーセンテージが既知のヒト乳腫瘍15例から無作
為に採取した組織を試験した（Ｓ期パーセンテージは他
の人から我々に報告された）。我々は４つの試料が高濃
度のNGAL発現生成物の存在を示したことを見いだした。
その結果を以下の表１に示す。
為に採取した組織を試験した（Ｓ期パーセンテージは他
の人から我々に報告された）。我々は４つの試料が高濃
度のNGAL発現生成物の存在を示したことを見いだした。
その結果を以下の表１に示す。
＋または＋＋の記号は、それぞれ発現または強く発現し
たNGAL発現生成物が検出されたことを示す。統計分析
は、Ｓ期とNGALとの関連がｐ＝0.0051であることを示
す。
たNGAL発現生成物が検出されたことを示す。統計分析
は、Ｓ期とNGALとの関連がｐ＝0.0051であることを示
す。
ポリクローナル抗体の産生および精製 まず、３匹の病原体フリーのニュージーランド白色ウ
サギ（ヘーゼルトン（Hazelton）、カラマズー、MI）を
400μｇの精製NGAL組換えタンパク質で免疫した。ルア
ー・フィッティング（luer fitting）によって結合した
２本の注射器を用い、そのタンパク質を等量のコンプリ
ートフロイント・アジュバント（シグマ（Sigma）、セ
ントルイス、MO）中で乳化した。混合物を10−20部位に
皮内注射により投与した。ダルベッコリン酸緩衝食塩水
（Ｄ−PBS）（ライフテクノロジーズ（Life Technologi
es）、ゲーザーズバーグ、MD）にて希釈し、インコンプ
リートフロイント・アジュバント（シグマ）中に乳化さ
せた100−300μｇタンパク質を用いて、ブースター（追
加抗原刺激）注射を皮下に４週ごとに４回増量させなが
ら行った。30mlの全血を追加抗原刺激の12日後に集め、
凝固させ、４℃、3000gで15分間遠心分離し、抗血清を
−80℃で冷凍した。相対的抗体産生、特異性およびバッ
クグラウンドを間接的酵素結合イムノソルベント検定法
（ELISA）（ピアース（Pierce））によって測定した。
陰性対照群としてウシ血清アルブミンおよび免疫前ウサ
ギ血清を用いた。
サギ（ヘーゼルトン（Hazelton）、カラマズー、MI）を
400μｇの精製NGAL組換えタンパク質で免疫した。ルア
ー・フィッティング（luer fitting）によって結合した
２本の注射器を用い、そのタンパク質を等量のコンプリ
ートフロイント・アジュバント（シグマ（Sigma）、セ
ントルイス、MO）中で乳化した。混合物を10−20部位に
皮内注射により投与した。ダルベッコリン酸緩衝食塩水
（Ｄ−PBS）（ライフテクノロジーズ（Life Technologi
es）、ゲーザーズバーグ、MD）にて希釈し、インコンプ
リートフロイント・アジュバント（シグマ）中に乳化さ
せた100−300μｇタンパク質を用いて、ブースター（追
加抗原刺激）注射を皮下に４週ごとに４回増量させなが
ら行った。30mlの全血を追加抗原刺激の12日後に集め、
凝固させ、４℃、3000gで15分間遠心分離し、抗血清を
−80℃で冷凍した。相対的抗体産生、特異性およびバッ
クグラウンドを間接的酵素結合イムノソルベント検定法
（ELISA）（ピアース（Pierce））によって測定した。
陰性対照群としてウシ血清アルブミンおよび免疫前ウサ
ギ血清を用いた。
アミノリンク（AminoLink）固定キット（ピアース）
及び予めセントリプラス（Centriplus）濃縮器で0.5ml
に濃縮した3mgの精製組換えNGAL、10kDのカットオフ
（アミコン（Amicon）、ビバリー、MA）とを用いて、ア
フィニテイー（親和性）カラムを作製した。ハイトラッ
プ（HiTrap）1mlタンパク質Ａカラム（ファルマシア・
バイオテク（Pharmacia Biotech））を用いて抗血清か
ら精製したIgG（8mg）をアフィニテイーカラムにかけ、
50mMトリス（pH7.5）で洗浄し、0.1Mグリシン−HCl（pH
2.9）で溶出した。カラム分画について、ピークIgGを28
0nmの吸光度でモニターした。
及び予めセントリプラス（Centriplus）濃縮器で0.5ml
に濃縮した3mgの精製組換えNGAL、10kDのカットオフ
（アミコン（Amicon）、ビバリー、MA）とを用いて、ア
フィニテイー（親和性）カラムを作製した。ハイトラッ
プ（HiTrap）1mlタンパク質Ａカラム（ファルマシア・
バイオテク（Pharmacia Biotech））を用いて抗血清か
ら精製したIgG（8mg）をアフィニテイーカラムにかけ、
50mMトリス（pH7.5）で洗浄し、0.1Mグリシン−HCl（pH
2.9）で溶出した。カラム分画について、ピークIgGを28
0nmの吸光度でモニターした。
免疫組織化学 免疫組織化学のための新鮮組織を乳房生検標本から採
取し、腫瘍組織および隣接正常乳房組織の小試料をOCT
コンパウンド（マイルズ（Miles）、エルクハート、I
N）に埋め込み、急速冷凍し、−70℃で保存した。５μ
ｍの凍結切片をポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上に載
せ、70％エタノール中で５分間固定した。内因性ペルオ
キシダーゼ活性をメタノール中３％H2O2、10分間で失活
させた。パワーブロック試薬（DAKO、カーピンテリア、
CA）で５分間ブロッキングした後、スライドを18μg/ml
濃度のアフィニテイー精製抗NGALウサギポリクローナル
抗体と共にインキュベートした。免疫前IgGを、同じタ
ンパク質濃度で、陰性対照として用いた。LSAB＋検出シ
ステム（DAKO）および3,3'−ジアミノベンチジン（DA
B）ペルオキシダーゼ基質を用いて結合を可視化した。
褐色着色度はNGAL濃度に比例した。
取し、腫瘍組織および隣接正常乳房組織の小試料をOCT
コンパウンド（マイルズ（Miles）、エルクハート、I
N）に埋め込み、急速冷凍し、−70℃で保存した。５μ
ｍの凍結切片をポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上に載
せ、70％エタノール中で５分間固定した。内因性ペルオ
キシダーゼ活性をメタノール中３％H2O2、10分間で失活
させた。パワーブロック試薬（DAKO、カーピンテリア、
CA）で５分間ブロッキングした後、スライドを18μg/ml
濃度のアフィニテイー精製抗NGALウサギポリクローナル
抗体と共にインキュベートした。免疫前IgGを、同じタ
ンパク質濃度で、陰性対照として用いた。LSAB＋検出シ
ステム（DAKO）および3,3'−ジアミノベンチジン（DA
B）ペルオキシダーゼ基質を用いて結合を可視化した。
褐色着色度はNGAL濃度に比例した。
別法として、パラフィン埋封切片を作ることができ
る。若干の我々の実験においては、乳癌の日常的に処理
したパラフィンブロックをウィスコンシス大学病理保管
庫から得た。そのようなスライドをオーブン中（55−60
℃）で乾燥した後、キシレンを数回代えながらパラフィ
ンを除去し、一連の段階的な比のアルコール／水で水和
した。公知の陽性対照を前記試験した場合と同様に処理
した。抗原回復（retrieval）のためにスライドを1mMの
EDTA（pH8.0）中で20分間マイクロウエーブ処理した
後、流水で20分間冷却した。スライドにバーコードを付
け、１×APK洗浄溶液に入れた（全ての器具および試薬
は特に記載のない限りヴェンタナ・バイオテク・システ
ムズ（Ventana Biotek Systems）、ツーソン、AZ、から
入手した）。
る。若干の我々の実験においては、乳癌の日常的に処理
したパラフィンブロックをウィスコンシス大学病理保管
庫から得た。そのようなスライドをオーブン中（55−60
℃）で乾燥した後、キシレンを数回代えながらパラフィ
ンを除去し、一連の段階的な比のアルコール／水で水和
した。公知の陽性対照を前記試験した場合と同様に処理
した。抗原回復（retrieval）のためにスライドを1mMの
EDTA（pH8.0）中で20分間マイクロウエーブ処理した
後、流水で20分間冷却した。スライドにバーコードを付
け、１×APK洗浄溶液に入れた（全ての器具および試薬
は特に記載のない限りヴェンタナ・バイオテク・システ
ムズ（Ventana Biotek Systems）、ツーソン、AZ、から
入手した）。
スライドを自動免疫染色器（Ventana genII）上に、
標準インキュベーション時間および温度でかけた。抗NG
ALアフィニテイー精製ウサギ抗血清または免疫前IgGを
陰性対照として、1.75μg/ml濃度、37℃で30分間用い
た。ジアミノベンチジン基質を用いるビオチン−アビジ
ン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ法を用いて抗
原を検出した。スライドをこの機器でヘマトキシリン
（シグマ、セントルイス、MO）で対比染色した。全スラ
イドを染色器から取り出し、洗剤水ですすぎ、カバーグ
ラスオイルを除去した。スライドを一連の段階的アルコ
ールで脱水し、キシレンを数回取り代えて清浄にした
後、カバーグラスを合成固定媒体と共に載せた。
標準インキュベーション時間および温度でかけた。抗NG
ALアフィニテイー精製ウサギ抗血清または免疫前IgGを
陰性対照として、1.75μg/ml濃度、37℃で30分間用い
た。ジアミノベンチジン基質を用いるビオチン−アビジ
ン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ法を用いて抗
原を検出した。スライドをこの機器でヘマトキシリン
（シグマ、セントルイス、MO）で対比染色した。全スラ
イドを染色器から取り出し、洗剤水ですすぎ、カバーグ
ラスオイルを除去した。スライドを一連の段階的アルコ
ールで脱水し、キシレンを数回取り代えて清浄にした
後、カバーグラスを合成固定媒体と共に載せた。
NGALの免疫組織化学的定位 乳腫瘍は、癌において高い陽性反応性（褐色染色）を
示し、その外側は隣接正常管以外はほとんど着色しなか
った。この結果からＳ期と関係しない一般炎症はNGALの
原因ではないことが確認された。
示し、その外側は隣接正常管以外はほとんど着色しなか
った。この結果からＳ期と関係しない一般炎症はNGALの
原因ではないことが確認された。
有用性 本発明は医学的スクリーニングのために、および診断
手段として有用であると考えられる。若干の既存の生検
法は分析用の凍結またはパラフィン埋封切片の作製を既
に含むため、本発明は補助的診断手段として容易に実施
できる。
手段として有用であると考えられる。若干の既存の生検
法は分析用の凍結またはパラフィン埋封切片の作製を既
に含むため、本発明は補助的診断手段として容易に実施
できる。
上記の好適実施態様は本発明の単なる例に過ぎないこ
とが理解されるであろう。この他にも多くの変形が請求
の範囲の範囲内にあると考えられる。例えば、我々は低
濃度のNGALが低濃度のエストロゲン受容体タンパク質お
よび低濃度のプロゲステロン受容体タンパク質とも相関
することを確認した。既知濃度のエストロゲン／プロゲ
ステロンの試料（例えば既知の方法で測定された）を用
いて、エストロゲン／プロゲステロン濃度に対するNGAL
免疫組織化学的分析試験の標準曲線を容易に作成するこ
とができる。
とが理解されるであろう。この他にも多くの変形が請求
の範囲の範囲内にあると考えられる。例えば、我々は低
濃度のNGALが低濃度のエストロゲン受容体タンパク質お
よび低濃度のプロゲステロン受容体タンパク質とも相関
することを確認した。既知濃度のエストロゲン／プロゲ
ステロンの試料（例えば既知の方法で測定された）を用
いて、エストロゲン／プロゲステロン濃度に対するNGAL
免疫組織化学的分析試験の標準曲線を容易に作成するこ
とができる。
本発明は他のNGAL分析試験における偽陽性をチェック
する技術も提供する。我々の試験ではNGAL陽性の４％ま
でが、癌とは無関係の組織の意義のある（significan
t）NGALを示した。
する技術も提供する。我々の試験ではNGAL陽性の４％ま
でが、癌とは無関係の組織の意義のある（significan
t）NGALを示した。
このため、本発明の全範囲を判断するためには請求の
範囲を参照するべきである。
範囲を参照するべきである。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ウィスコンシン アラムナイ リサー
チフォンデーション （ii）発明の名称：癌増殖状態の検出法 （iii）配列の数:1 （iv）通信住所： （Ａ）受信人：クウアレス アンド ブラデイ （Ｂ）通り：イースト ウィスコンシン アベニュ
ー411 （Ｃ）市：ミルウォーキー （Ｄ）州：ウィスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:53202−4497 （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパーチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース
＃1.0,バージョン ＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：シュワルツ、カール アール． （Ｂ）登録番号:29,437 （Ｃ）参照／名簿番号:960296.93618 （ix）電気通信情報： （Ａ）電話：（414）277−5715 （Ｂ）ファックス：（414）271−3552 （２）配列番号（SEQ ID NO）:1: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:197 アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:1:
チフォンデーション （ii）発明の名称：癌増殖状態の検出法 （iii）配列の数:1 （iv）通信住所： （Ａ）受信人：クウアレス アンド ブラデイ （Ｂ）通り：イースト ウィスコンシン アベニュ
ー411 （Ｃ）市：ミルウォーキー （Ｄ）州：ウィスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:53202−4497 （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパーチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース
＃1.0,バージョン ＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：シュワルツ、カール アール． （Ｂ）登録番号:29,437 （Ｃ）参照／名簿番号:960296.93618 （ix）電気通信情報： （Ａ）電話：（414）277−5715 （Ｂ）ファックス：（414）271−3552 （２）配列番号（SEQ ID NO）:1: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:197 アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:1:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ステーツ， ステイーブン ピー. アメリカ合衆国 07960 ニユージヤー ジー モーリスタウン ウイザースプー ン コート 40 (56)参考文献 国際公開96／24065（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/50 - 33/98
Claims (4)
- 【請求項１】（ａ）ヒト乳癌試料を採取し、 （ｂ）NGALタンパク質に特異性を有する抗体を用いて前
記試料中のNGALタンパク質に結合させ、 （ｃ）前記抗体に結合したマーカーを用いて前記癌中に
おけるNGALタンパク質の存在の程度を示す ことを含んでなるヒト乳癌の相対的増殖度を決定する方
法。 - 【請求項２】前記試料が前記癌に隣接する組織も含み、
前記マーカーが前記隣接組織中におけるNGALタンパク質
の存在の程度も示す請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記方法が、前記試料が切片で、前記マー
カーがNGALタンパク質の存在を示す可視色を作り出すよ
うな、免疫組織化学的染色分析試験である請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】前記マーカーが可視色を作り出し、そし
て、前記癌中におけるエストロゲン受容体タンパク質お
よびプロゲステロン受容体タンパク質の存在の程度を決
定する目的で前記色の色彩強度を既知の標準物質と比較
する請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/779,870 US5846739A (en) | 1995-12-05 | 1997-01-06 | Immunohistochemical detection assay for carcinoma proliferative status |
| US08/779,870 | 1997-01-06 | ||
| PCT/US1997/020998 WO1998030907A1 (en) | 1997-01-06 | 1997-11-18 | Immunohistochemical detection assay for carcinoma proliferative status |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000508074A JP2000508074A (ja) | 2000-06-27 |
| JP3336016B2 true JP3336016B2 (ja) | 2002-10-21 |
Family
ID=25117836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53085298A Expired - Fee Related JP3336016B2 (ja) | 1997-01-06 | 1997-11-18 | 癌増殖状態の免疫組織化学的検出分析試験 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5846739A (ja) |
| EP (1) | EP0958500B1 (ja) |
| JP (1) | JP3336016B2 (ja) |
| AT (1) | ATE222366T1 (ja) |
| AU (1) | AU712949B2 (ja) |
| CA (1) | CA2271092C (ja) |
| DE (1) | DE69714778T2 (ja) |
| DK (1) | DK0958500T3 (ja) |
| ES (1) | ES2182140T3 (ja) |
| IL (1) | IL129766A (ja) |
| NZ (1) | NZ335535A (ja) |
| WO (1) | WO1998030907A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000043550A2 (en) | 1999-01-21 | 2000-07-27 | Wayne State University | Method and apparatus for measuring factors in mammary fluids |
| US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
| WO2001077682A1 (fr) * | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni Akademikov M.M. Shemyakina I Ju. A. Ovchinnikova Rossiisskoi Akademii Nauk | Anticorps diriges contre le facteur hldf, procedes de fabrication correspondants, peptides avec des capacites antigeniques et a hydrolyse hk et procede de diagnostic de l'etat anaplasique de cellules humaines |
| US6866994B2 (en) | 2001-05-30 | 2005-03-15 | Neomatrix, Llc | Noninvasive intraductal fluid diagnostic screen |
| DE10230631A1 (de) * | 2002-07-02 | 2004-01-22 | Metagen Pharmaceuticals Gmbh | Verwendungen von an Ngal bindenden Substanzen zur Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen |
| CN101203759A (zh) | 2005-03-30 | 2008-06-18 | 普渡研究基金会 | 使用细胞叶酸维生素受体定量法而用于癌症预后的方法 |
| US20100105150A1 (en) * | 2008-10-24 | 2010-04-29 | Abbott Laboratories | Isolated human autoantibodies to neutrophil gelatinase-associated lipocalin (ngal) and methods and kits for the detection of human autoantibodies to ngal |
| US8394606B2 (en) * | 2008-11-05 | 2013-03-12 | Abbott Laboratories | Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) protein isoforms enriched from urine and recombinant chinese hamster ovary (CHO) cells and related compositions, antibodies, and methods of enrichment, analysis and use |
| EP2710041A4 (en) | 2011-05-18 | 2014-11-05 | Parkinson S Inst | ASSAY FOR DETERMINING LRRK2 ACTIVITY IN MORBUS PARKINSON |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996024065A1 (en) * | 1995-02-03 | 1996-08-08 | Oncogene Science, Inc. | Methods for the detection of pro-cathepsins and uses thereof |
| US5627034A (en) * | 1995-12-05 | 1997-05-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Assay for carcinoma proliferative status by measuring NGAL expression level |
-
1997
- 1997-01-06 US US08/779,870 patent/US5846739A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-18 WO PCT/US1997/020998 patent/WO1998030907A1/en active IP Right Grant
- 1997-11-18 NZ NZ335535A patent/NZ335535A/xx unknown
- 1997-11-18 DE DE69714778T patent/DE69714778T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-18 EP EP97952197A patent/EP0958500B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 AT AT97952197T patent/ATE222366T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 AU AU55867/98A patent/AU712949B2/en not_active Ceased
- 1997-11-18 DK DK97952197T patent/DK0958500T3/da active
- 1997-11-18 JP JP53085298A patent/JP3336016B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-18 IL IL12976697A patent/IL129766A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 CA CA002271092A patent/CA2271092C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-18 ES ES97952197T patent/ES2182140T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL129766A0 (en) | 2000-02-29 |
| NZ335535A (en) | 2000-08-25 |
| DK0958500T3 (da) | 2002-10-07 |
| WO1998030907A1 (en) | 1998-07-16 |
| DE69714778D1 (de) | 2002-09-19 |
| ES2182140T3 (es) | 2003-03-01 |
| ATE222366T1 (de) | 2002-08-15 |
| US5846739A (en) | 1998-12-08 |
| AU5586798A (en) | 1998-08-03 |
| EP0958500A1 (en) | 1999-11-24 |
| AU712949B2 (en) | 1999-11-18 |
| JP2000508074A (ja) | 2000-06-27 |
| IL129766A (en) | 2002-02-10 |
| EP0958500B1 (en) | 2002-08-14 |
| CA2271092C (en) | 2004-02-10 |
| DE69714778T2 (de) | 2003-04-10 |
| CA2271092A1 (en) | 1998-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101976219B1 (ko) | 유방암의 바이오마커 | |
| JP2007504463A (ja) | 卵巣癌用の診断マーカー | |
| US20020173053A1 (en) | Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry | |
| US20150038596A1 (en) | Differential Diagnosis Of Cancer And Other Conditions Based On Expression Of p63 | |
| US9075065B2 (en) | Prostate cancer biomarker | |
| CN109975549B (zh) | 肿瘤来源IgG在胰腺癌诊断或预后中的用途 | |
| JP3336016B2 (ja) | 癌増殖状態の免疫組織化学的検出分析試験 | |
| KR20130046457A (ko) | 신규한 대장암 진단용 마커 및 이를 이용한 대장암 진단 키트 | |
| CN113687085A (zh) | 一种评估实体肿瘤Claudin18.2蛋白表达的方法和应用 | |
| KR20190045200A (ko) | 방광암용 바이오마커로서의 케라틴 17 | |
| CN114660289A (zh) | 肝癌标志物及其应用 | |
| CN111879940B (zh) | 肺结核标志物及应用 | |
| Charpin et al. | Cathepsin D detected by automated and quantitative immunohistochemistry in breast carcinomas: correlation with overall and disease free survival. | |
| MXPA99005962A (es) | Ensayo de deteccion inmunohistoquimica del estado proliferativo de carcinomas | |
| US6162606A (en) | Immunohistochemical method for the detection of defective estrogen receptors | |
| JP2022076410A (ja) | 悪性末梢神経鞘腫瘍の診断マーカー | |
| WO2022269534A1 (en) | Use of single cell elisa starting from deparaffinzed cells for the detection of molecules of interest | |
| US20120094306A1 (en) | Predictive evaluation of the response to taxane-including chemotherapy | |
| CN114660291A (zh) | 一种膀胱癌预后标志物、预后评估系统及其应用 | |
| CN111208304A (zh) | 肿瘤来源IgG在甲状旁腺癌诊断和预后中的用途 | |
| CN114791492A (zh) | Cst1联合gpx4作为胃癌转移标志物或预后标志物的应用 | |
| CN117946263A (zh) | 一种抗人H3K27me3蛋白兔单克隆抗体及其应用 | |
| KR20210015259A (ko) | 방광암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| CN105372425A (zh) | 前列腺癌的恶性程度判定试剂盒和其方法 | |
| KR20080082109A (ko) | 유방암 진단용 단백질 마커 플라빈 환원효소 및 이에 대한항체를 포함하는 유방암 진단키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080802 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080802 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090802 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090802 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100802 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |