CN112964877A - 一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒及染色程序 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒及染色程序。本发明提供的试剂盒包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、组合一抗试剂、组合二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、快红显色剂、活化剂、快红缓冲液、苏木素复染液；所述组合一抗试剂包括鼠抗人k轻链单克隆抗体、兔抗人λ轻链单克隆抗体、兔抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体；所述组合二抗试剂包括HRP标记的抗鼠二抗聚合物、AP标记的抗兔二抗聚合物。该试剂盒能够在一张组织样本切片上同时呈现三个抗原靶标的表达情况，便于观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，对组织样本的需求量显著降低；且该试剂盒能够应用于自动化染色机，显著提高准确度和可重复性，简便高效。

Description

一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒及染 色程序

技术领域

本发明属于临床病理检测技术领域，具体涉及一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒及染色程序。

背景技术

淋巴瘤是一种起源于淋巴结和结外淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤。依据肿瘤的组织学特点，将淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。依据肿瘤细胞起源的不同，非霍奇金淋巴瘤可分为B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤，其中，套细胞淋巴瘤是B细胞淋巴瘤的一种亚型，该疾病恶性程度高、预后差。

K轻链(Kappa Light Chain)和λ轻链(Lambda Light China)可标记带有轻链的B淋巴细胞、浆细胞和免疫母细胞，它们是免疫球蛋白上的两条肽链。在正常情况下，轻链和重链的表达是平衡的，可形成完整的免疫球蛋白分子。在正常的淋巴结中，表达不同轻链的B细胞数K轻链：λ轻链为2:1，如果例K轻链：λ轻链比例大于3或者λ轻链：K轻链的比例大于2，或者单个指标的表达细胞量大于73％，则表示淋巴增生性失调。B细胞淋巴瘤中，K轻链蛋白和λ轻链蛋白常常成限制性表达，是B细胞单克隆增生的标志。但是，对于套细胞淋巴瘤而言，其早期病变常常有局限性，混杂多量反应性增生的淋巴细胞，其中含有较多的浆细胞，仅仅计算K轻链蛋白和λ轻链蛋白的比值来确定限制的轻链类型不太可靠，常常还需要参考其他指标，才能较准确地确定肿瘤细胞的准确位置和限制性轻链的类型。

目前，在套细胞淋巴瘤疾病的检测主要依赖于免疫组织化学法，利用合适的免疫组化抗体来检测抗原靶标，通过不同指标的表达情况来鉴别疾病的分型。该方法的特点是：①每个靶标的检测需要一张组织切片；②应用常规免疫显色试剂，显示一种颜色，显色为棕色，该方法的原理为：利用抗体与切片中的靶抗原形成抗原抗体复合物，再通过辣根过氧化物酶(HRP)标羊抗鼠/兔聚合物与抗原抗体复合物中的抗体结合，最后HRP催化二氨基联苯胺(DAB)在抗原部位形成棕色沉淀，借助显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞的结构；③需要判读多张切片的染色结果，综合分析，得到病理诊断结果。该技术为传统免疫组化的检测方法，单个样本的染色切片数量多，技术操作和病理医师阅片的工作量大，对取材样本的大小要求高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒及染色程序，该试剂盒能够在一张组织切片上同时呈现三个抗原靶标的表达情况，便于病理医生观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，并避免微小组织样本染色重复性差的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种免疫组化联合弹性纤维双重染色试剂盒，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、组合一抗试剂、组合二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、快红显色剂、活化剂、快红缓冲液、苏木素复染液；所述组合一抗试剂包括鼠抗人k轻链单克隆抗体、鼠抗人λ轻链单克隆抗体、兔抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体；所述组合二抗试剂包括HRP标记的抗鼠二抗聚合物、AP标记的抗兔二抗聚合物。

优选的，所述组合一抗试剂中的鼠抗人k轻链单克隆抗体的克隆号为L1C1，抗体效价为：1:05-1:200。

优选的，所述组合一抗试剂中的鼠抗人λ轻链单克隆抗体的克隆号为EP172，抗体效价为：1:100-1:300。

优选的，所述组合一抗试剂中的兔抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体的克隆号为EP12，抗体效价为1:50-1:200。

优选的，所述组合一抗试剂还包括6g/L的三羟甲基氨基甲烷、10g/L的牛血清白蛋白、8g/L的氯化钠、0.2g/L的果绿色素和质量浓度为0.15％的Proclin950。

优选的，所述组合二抗试剂主要由浓度为8-15μg/mL的HRP标记的抗鼠二抗聚合物、浓度为6-12μg/mL的AP标记的抗兔二抗聚合物、6g/L的三羟甲基氨基甲烷、8g/L的氯化钠、5g/L的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.1％的Proclin950组成。

优选的，所述DAB显色底物和DAB显色缓冲液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号为SD3004、SD3005。

优选的，所述苏木素复染液购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号为SD3006。

组合二抗试剂中的HRP标记抗鼠二抗聚合物与鼠抗人靶标抗原结合，DAB显色剂在HRP的催化作用下，在抗原靶标位置形成棕色不溶性沉淀；组合二抗中的AP标记抗兔二抗聚合物与兔抗人靶标抗原结合，快红显色剂在AP的催化作用下，在抗原靶标位置形成红色不溶性沉淀，可在显微镜下观察。

基于上述免疫组化检测试剂盒的使用方法，适用于全自动免疫组化染色机，染色程序包括如下步骤：

1)石蜡组织切片脱蜡水化；

2)抗原修复：采用Tris-EDTA修复缓冲液(pH9.0)对切片进行高温修复，温度为100℃，修复20分钟，；

3)滴加过氧化物酶封闭剂进行内源性过氧化物酶的封闭，常温孵育5-10分钟，加样量为50-100微升；

4)组合一抗试剂的孵育：20-37℃孵育30-60分钟，加样量为50-100微升；

5)组合二抗试剂的孵育：20-37℃孵育20-30分钟，加样量为50-100微升；

6)快红显色液的孵育：常温孵育5-10分钟，加样量为50-100微升；快红显色剂的配置：快红显色剂、活化剂和快红缓冲液按照1：1：30的比例配置所得；

7)DAB显色液的孵育：常温孵育3-5分钟，加样量为50-100微升；DAB显色液的配置：DAB显色底物和DAB显色缓冲液1：20比例配制所得；

8)衬染：苏木素常温孵育1-3分钟，加样量为50-100微升；

9)水性封片胶封片。

本发明取得的有益效果：

本发明提供的多重染色试剂盒采用组合一抗试剂对单个切片进行免疫组化显色，在同一张组织样本切片上可同时呈现三个抗原靶标的表达情况，便于病理医生观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，综合考虑染色结果，诊断结果更加精准，避免了微小组织样本染色重复性差的问题。本发明提供的试剂盒降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可满足需求；同时可节约病人取材的样本，便于样本有足够的量做其他的检测项目，如PCR检测等。

此外，本发明的操作技术实现了自动化，对于本发明复杂的染色技术，在临床应用中，自动化的实现为临床病理人员提供了简便有效的操作方法，可以得到最准确和可重复的染色结果，同时，也降低了病理技术人员的工作强度。

附图说明

图1为A1切片采用P1程序的免疫组化试验显色效果图；

图2为A2切片采用P2程序的免疫组化试验显色效果图；

图3为A3切片采用P3程序的免疫组化试验显色效果图；

图4为B1切片采用P1程序的免疫组化试验显色效果图；

图5为B2切片采用P2程序的免疫组化试验显色效果图；

图6为B3切片采用P3程序的免疫组化试验显色效果图；

图7为C1的染色结果图；

图8为C2的染色结果图；

图9为C3的染色结果图；

图10为D1的染色结果图；

图11为D2的染色结果图；

图12为D3的染色结果图；

图13为E1的染色结果图；

图14为E2的染色结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的各类试剂和仪器若无特殊说明均为市售商品。

实施例1用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒

该实施例提供了一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒，包括如下组分：

1)含量为3％～3.5％的过氧化物酶封闭剂(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD3002)

2)组合一抗试剂：主要由鼠抗人k轻链单克隆抗体(克隆号：L1C1，抗体效价：1:100)、兔抗人λ轻链单克隆抗体(克隆号：EP172，抗体效价：1:200)、兔抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体(克隆号：EP12，抗体效价：1:100)、6g/L的三羟甲基氨基甲烷、10g/L的牛血清蛋白、8g/L的氯化钠、0.2g/L的果绿色素和质量浓度为0.15％的Proclin950组成。

3)组合二抗试剂：主要由浓度为8-15μg/mL的HRP标记的抗鼠二抗聚合物、浓度为6-12μg/mL的AP标记的抗兔二抗聚合物、6g/L的三羟甲基氨基甲烷、8g/L的氯化钠、5g/L的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.1％的Proclin950组成。

4)DAB显色底物(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD3004)

5)DAB显色缓冲液(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD3005)

6)快红显色剂(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD8006)

7)活化剂(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD8006)

8)快红缓冲液(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD8006)

9)苏木素复染液(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD3006)

将上述组分组装成一套完整的试剂盒，具体的，试剂盒包括20mL过氧化物酶封闭剂、20mL组合一抗试剂、20mL组合二抗试剂、2mL快红显色剂、2mL活化剂、35mL快红缓冲液、3mL DAB显色底物、35mL DAB显色缓冲液、20mL苏木素。

实施例2试剂盒在全自动免疫组化机中的应用及染色程序

该实施例将实施例1提供的试剂盒应用于套细胞淋巴瘤和扁桃体组织，实施免疫组化染色，使用的机器为CNT330全自动免疫组化染色机。

1)取套细胞淋巴瘤和扁桃体组织各一个，各制备石蜡组织切片3张，厚度为3微米，65℃烤片1个小时，分别标记为A1、A2、A3、B1、B2和B3。

2)将本发明试剂盒放入全自动免疫组化染色机进行识别，设置病例编号，切片编号，将切片放入机器待启动。

3)在CNT330上进行脱蜡、抗原修复、免疫组化染色以及复染，染色步骤及孵育时间在机器软件上预先进行设置，共设置三个程序，分别为P1、P2和P3。

4)脱蜡水化：按照机器原始设置程序操作；

5)预处理：使用Tris-EDTA修复缓冲液(pH9.0)对组织进行预处理，100℃高温修复20分钟，Tris-EDTA修复缓冲液(pH9.0)购自河南赛诺特生物技术有限公司，货号为SD6004。

6)免疫组化染色程序设定如下表格所示：

7)免疫组化染色：A1和B1切片，采用P1程序；A2和B2切片，采用P2程序；A3和B3切片，采用P3程序。

8)切片染色结束，用水性封片胶封片。

染色结果如图1-6所示：

图1为A1切片采用P1程序的免疫组化试验显色效果，Kappa、Lamada和Cyclin D1的显色强度为中，阳性表达，背景干净；

图2为A2切片采用P2程序的免疫组化试验显色效果，Kappa、Lamada和Cyclin D1的显色强度为强，阳性表达，背景干净；

图3为A3切片采用P3程序的免疫组化试验显色效果，Kappa、Lamada和Cyclin D1的显色强度为强，阳性表达，存在微弱背景；

图4为B1切片采用P1程序的免疫组化试验显色效果Kappa、Lamada和Cyclin D1的显色强度为中，阳性表达，背景干净；

图5为B2切片采用P2程序的免疫组化试验显色效果，Kappa、Lamada和Cyclin D1的显色强度为强，阳性表达，背景干净；

图6为B3切片采用P3程序的免疫组化试验显色效果。Kappa、Lamada和Cyclin D1的显色强度为强，阳性表达，存在微弱背景；

对比例

该实施例提供了某基于传统的免疫组化检测试剂盒在套细胞淋巴瘤和扁桃体组织上的试验：

1)取套细胞淋巴瘤和扁桃体组织各一个，各制备石蜡组织切片3张，厚度为3微米，65℃烤片1个小时。

2)组织切片的标记，套细胞淋巴瘤标记为C1、C2和C3，扁桃体标记为D1、D2和D3，C1和D1用于抗体Kappa的检测，C2和D2用于抗体Lamada的检测，C3和D3用于抗体Cyclin D1的检测。

3)设置实验操作程序如下：

4)将免疫显色试剂(厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；货号：SD5201)放入全自动免疫组化染色机进行识别，设置病例编号，切片编号，将切片放入机器待启动。

5)脱蜡水化：按照机器原始设置程序操作。

6)预处理：使用Tris-EDTA修复缓冲液(pH9.0)对组织进行预处理，100℃高温修复20分钟。

7)免疫组化染色：依据设置程序染色。

8)切片的脱水透明，然后用中性树胶进行封片。

染色结果如图7-12所示：

图7为C1的染色结果，Kappa显色强度为强，阳性表达，有微弱背景；

图8为C2的染色结果，Lamada显色强度为强，阳性表达，有微弱背景；

图9为C3的染色结果，Cyclin D1显色强度为中，阳性表达，背景干净；

图10为D1的染色结果，Kappa显色强度为强，阳性表达，背景干净；

图11为D2的染色结果，Lamada显色强度为强，阳性表达，背景干净；

图12为D3的染色结果，Cyclin D1显色强度为中，阳性表达，背景干净。

实施例3在套细胞淋巴瘤和扁桃体组织上的免疫组化试验

该实施例将实施例1提供的试剂盒应用于套细胞淋巴瘤组织，实施免疫组化染色，使用的机器为CNT330全自动免疫组化染色机。

1)取二个套细胞淋巴瘤癌组织，分别制备石蜡组织切片1张，厚度为3微米，65℃烤片1个小时，分别标记为E1和E2；

2)将本发明试剂盒放入全自动免疫组化染色机进行识别，设置病例编号，切片编号，将切片放入机器待启动，实验程序采用P2程序；

3)脱蜡水化：按照机器原始设置程序操作；

4)预处理：使用Tris-EDTA修复缓冲液(pH9.0)对组织进行预处理，100℃高温修复20分钟；

5)免疫组化染色：采用P2程序，全自动免疫组化染色机自动完成染色步骤；

6)切片染色结束，用水性封片胶封片。

染色结果如图13-14所示：

图13为E1的染色结果图，如图所示，Kappa、Lamada和Cyclin D1均为阳性表达，背景干净。

图14为E2的染色结果图，如图所示，Kappa、Lamada和Cyclin D1均为阳性表达，背景干净。

由实施例3和对比例可知，在实施例3中，针对每个病例，仅对一张组织切片进行免疫组化检测，即可得到三个抗原靶标的表达情况，相较于对比例，减少了样本的使用量，降低了检测了工作人员的工作强度，减少了成本的投入，同时，从染色图片可明确看到，实施例3中的染色结果对比鲜明，三个抗原靶标的表达情况一目了然，可以直接观察到不同靶标之前的定位及表达情况，诊断结果更加精准，反观对比例，其结果评判需要对三个染色切片进行单独的判读和反复的比对，降低了检测结果的精准度。

Claims (7)

1.一种用于鉴别套细胞淋巴瘤的免疫组化多重染色试剂盒，其特征在于，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、组合一抗试剂、组合二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、快红显色剂、活化剂、快红缓冲液、苏木素复染液；所述组合一抗试剂包括鼠抗人k轻链单克隆抗体、兔抗人λ轻链单克隆抗体、兔抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体；所述组合二抗试剂包括HRP标记的抗鼠二抗聚合物、AP标记的抗兔二抗聚合物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组合一抗试剂中的鼠抗人k轻链单克隆抗体的克隆号为L1C1，抗体效价为：1:50-1:200。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组合一抗试剂中的兔抗人λ轻链单克隆抗体的克隆号为EP172，抗体效价为：1:100-1:300。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组合一抗试剂中的兔抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体的克隆号为EP12，抗体效价为1:50-1:200。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组合一抗试剂还包括6g/L的三羟甲基氨基甲烷、10g/L的牛血清蛋白、8g/L的氯化钠、0.2g/L的果绿色素和质量浓度为0.15％的Proclin950。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述组合二抗试剂主要由浓度为8-15μg/mL的HRP标记的抗鼠二抗聚合物、浓度为6-12μg/mL的AP标记的抗兔二抗聚合物、6g/L的三羟甲基氨基甲烷、8g/L的氯化钠、5g/L的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.1％的Proclin950组成。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其适用于全自动免疫组化染色机，染色程序包括如下步骤：

1)石蜡组织切片脱蜡水化；

2)抗原修复：采用Tris-EDTA修复缓冲液(pH9.0)对切片进行高温修复，温度为92-100℃，修复20-30分钟；

3)滴加过氧化物酶封闭剂进行内源性过氧化物酶的封闭，常温孵育5-10分钟，加样量为50-100微升；

4)组合一抗试剂的孵育：20-37℃孵育30-60分钟，加样量为50-100微升；

5)组合二抗试剂的孵育：20-37℃孵育20-30分钟，加样量为50-100微升；

6)快红显色液的孵育：常温孵育5-10分钟，加样量为50-100微升；快红显色剂的配置：快红显色剂、活化剂和快红缓冲液按照1：1：30的比例配置所得；

7)DAB显色液的孵育：常温孵育3-5分钟，加样量为50-100微升；DAB显色液的配置：DAB显色底物和DAB显色缓冲液1：20比例配制所得；

8)衬染：苏木素常温孵育1-3分钟，加样量为50-100微升；

9)水性封片胶封片。

Images