KR101004960B1 - 간암 진행 진단용 단백질성 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 진행 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진행 진단용 조성물, 상기 간암 진행 진단용 조성물을 포함하는 간암 진행 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진행 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 간암 진행 진단용 단백질성 마커는 Beclin-1, LC3, mTOR, p-mTOR, 또는 이들의 조합이다.

Description

간암 진행 진단용 단백질성 마커 {PROTEINIC MARKERS FOR DIAGNOSING PROGRESSION OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA}

본 발명은 간암 진행 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진행 진단용 조성물, 상기 간암 진행 진단용 조성물을 포함하는 간암 진행 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진행 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.

암은 악성 종양과 동일한 의미를 가지며, 다양한 원인으로 세포의 증식 조절 기능에 훼손되고 이러한 비정상적인 세포들이 통제되지 못하고 과다하게 증식하면서 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 정상 조직을 파괴하는 상태를 의미한다. 이러한 암은 빠른 성장, 침윤성(파고들거나 퍼져나감) 성장, 전이(원래 장소에서 떨어진 곳까지 이동함) 등으로 인하여 생명에 심각한 위험을 초래하게 된다.

암 중에서 간암은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로 알려져 있으며, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망 하고 있는 것으로 보고되고 있다. 간암은 크게 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암(간세포암; hepatocellular carcinoma)과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 구분할 수 있는데, 간암의 약 90% 이상은 원발성 간암이며, 흔히 간암이라 함은 원발성 간암을 지칭하는 것으로 이해된다.

비록 이러한 간암의 발병 원인 중 대다수는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 급성 또는 만성적인 감염이라는 것이 보고되고 있지만, 간암의 발병에 관한 세포 내의 분자적 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 못한 상태이다. 종래의 연구에 따르면 각종 성장인자 유전자와 같은 전-종양형성유전자(proto-oncogene)가 다양한 원인에 의하여 종양형성유전자(oncogene)로 돌연변이되어 과발현하거나 과활성을 갖는 경우, 또는 RB 단백질이나 p53 단백질과 같은 종양형성 억제 유전자(tumor suppressor gene)가 다양한 원인에 의하여 돌연변이되어 저발현하거나 기능을 잃는 경우 간암을 비롯한 다양한 암으로의 진행을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 특히 간암과 관련해서는, 변형된 p53, 베타-카테닌, AXINI, p21(WAF1/CIP1) 및 p27 Kip 등의 유전자가 관련되어 있다는 것이 밝혀지기도 하였다. 그러나, 최근에는 간암을 비롯한 대부분의 암의 발병은 특정한 몇몇 유전자들만에 의하여 이루어지는 것이 아니라 세포주기, 신호전달 등과 관련된 각종 유전자들의 복합적인 상호작용에 발병하는 것으로 인식되고 있으며, 따라서 개별적인 유전자나 단백질의 발현이나 기능에만 중점을 두는 것에서 벗어나 다양한 유전자나 단백질에 대한 총체적인 연구의 필요성이 대두되고 있다.

현대 의학에서 암을 진단하는 방법으로는, 각종 방사선 촬영, 조직병리검사, 초음파 진단과 같은 전문의의 임상적 판단을 필요로 하는 방법과 함께, 체내 또는 특정 조직에서 유래한 시료 내에 암의 존재를 암시하는 암 특이적 마커를 검출해내는 진단 방법이 활용되고 있다. 암세포에서 특이적으로 고발현 또는 저발현하는 유전자, 또는 암세포 내에 특이적으로 다량 또는 소량 존재하는 단백질이 통상적으로 암 특이적 마커로 사용되는데, 환자의 조직, 체액 등을 채취하여 암 특이적 마커의 변화 양상을 관찰함으로써 암의 유무를 예측할 수 있게 된다. 이러한 암 특이적 마커는 그 진단의 신속성, 용이성 및 정확성으로 인하여 암의 진단에 대하여 새로운 가능성을 제공하며, 암 특이적 마커의 기능 및 특성에 대한 심층적인 연구를 통하여 암의 발병이나 진행 메커니즘에 대한 단서를 얻을 수 있고, 궁극적으로는 발굴된 암 특이적 마커를 시발점으로 하여 암의 치료제나 예방법의 개발을 시도해볼 수도 있게 되므로, 이러한 암 특이적 마커의 발굴은 학술적 및 의학적으로 중요한 의미를 갖는다.

암 특이적 마커는 다양한 암에서 공통적으로 그 마커의 발현 양상이 변화하는 범종양 마커(Broad Spectrum Tumor Marker) 및 비교적 장기나 조직에 특이적인 발현 양상의 변화를 보이는 장기 특이적 종양 마커(Organ Specific Tumor Marker)로 분류될 수 있다. 이 중 장기 특이적 종양 마커로서는 현재 다양한 조직의 암에 대하여 몇몇 종류가 활용되고 있는데, 예를 들어, AFP는 간암의 대표적인 단백질성 마커로서 활용되고 있으며, 정상의 성인에게서는 극히 낮은 농도(정상의 경우 7-10ng/mL 이하)로만 존재하지만 간세포와 관련된 종양 환자의 50-70% 이상에서는 AFP의 현저한 수치 증가가 확인되고 있다.

간암 특이적 마커와 관련된 종래의 기술문헌으로, Xu 등은 문헌[Xu et al., Cancer Res. 61:3176-3181, 2001]에서 29개의 간암 환자들의 간암 조직과 주변 정상 조직을 사용하여 각각 cDNA 라이브러리를 구축한 후 그 발현빈도를 분석한 결과, 간암세포에서 발현빈도가 높은 유전자들로 혈청 알부민, α1-항트립신, 인터-α-트립신 저해제, 아포지질단백질 AII, 피브리노겐, 셀레노프로테인 P, 알돌라아제 등을 보고한바 있으며; Park 등은 문헌[Park et al., Int. J. Cancer 62:276-282, 1995]에서 간암 세포에서 트랜스페린(transferrin), IGF-II(insulin-like growth factor II) 및 IGF-1R(insulin growth factor-1 receptor) 의 과발현, 및 세포사멸에 관련된 파스(fas) 리간드의 발현 증가를 보고한 바 있다. 또한, 간암 특이적 마커와 관련된 종래의 특허문헌으로, 한국등록특허 제552,494호(2006. 2. 8 등록)에는 간암 특이적 고발현 유전자로서 K-ALPHA-1(NM_006082), LDHA(NM_005566), FTL(NM_000146), ANXA2(NM_004039), RPL4(NM_000968), ENO1(NM_001428), RPL9(NM_000661), GNB2L1(NM_006098), RPL10(NM_006013) 및 RPL13A(NM_012423) 와, 간암 특이적 저발현 유전자로서 AMBP(NM_001633), SERPINC1(NM_000488), GC(NM_000583) 및 A1BG(NM_130786) 가 개시되어 있고; 한국등록특허 제777088호(2007. 11. 9 등록)에는 LCN2(NM_005564), MIDKINE(NM_002391, NM_001012333, NM_001012334), 및 TFPI(NM_006287) 가 개시되어 있으며; 한국공개특허 제2007-99312호(2007. 10. 9 공개)에는 HLA-DMA(NM_006120), CD24(NM_013230), 및 SDFR1(NM_012428) 가 개시된 바 있고; 한국등록특허 제767,878호(2007. 10. 10 등록)에는 UBD(Hs.44532), PRKAG1(Hs.3136), CSTB(Hs.695), PSORS1C1(Hs.507), TUBB5(Hs.110837), Hs.62914, UBPH(Hs.3459), SPARC(Hs.111779), PDHB(Hs.161357), EIF4B(Hs.93379), ABCB10(Hs.1710), NDFIP2(Hs.30340), SPAG7(Hs.90436), RAN(Hs.10842), DDIT4(Hs.111244), RPS20(Hs.8102), C9orf9(Hs.62595), TBC1D14(Hs.72242), PIP5K2A(Hs.108966), SNX22(Hs.157607), C9(Hs.1290), CYP2E1(Hs.75183), ZFP36L1(Hs.85155), C6(Hs.1282), BHMT(Hs.80756), MICAL3(Hs.165551), DKFZp434C0328(Hs.24583), GZMB(Hs.1051), PCK1(Hs.1872), UGT2B7(Hs.10319), MGC45564(Hs.132230), UBE4A(Hs.75275), KIAA0316(Hs.92025), ADH1C(Hs.2523), RPS9(Hs.139876), SFXN1(Hs.135742), SLC12A8(Hs.36793), APOA1(Hs.93194), BF(Hs.69771), 및 ACAT1(Hs.37) 가 개시된 바 있다. 그러나, 상기 문헌 중 어디에도 간암의 진행을 특이적으로 진단하기 위한 마커는 개시되어 있지는 않다.

프로테옴(proteome)이란 유전체로부터 만들어질 수 있는 모든 단백질의 총체를 의미하는데, 이는 한 세포 또는 조직에서 특이적인 생리 상태나 병리 상태에 따라 프로테옴의 양상이 항상 변화하게 되는 동적인 개념이다. 프로테오믹스(proteomics)는 이러한 프로테옴을 연구하는 방법과 기술을 포괄적으로 지칭하는 것으로, 단백질의 성질을 유전자의 발현, 번역후 변형(post-translational modification), 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구함으로써 세포내 변형 과정과 네트워크 형성을 질병의 진행 과정과 연계시켜서 총체적으로 이해하고자 하는 연구 분야를 뜻한다. 이와 같이 프로테옴은 한 세포 또는 조직에서의 생리 상태나 병리 상태를 대변하므로, 질병의 진단에 직접 쓰일 수 있는 진단의 마커를 찾 는 방법으로는 가장 적합한 것이다. 또한, 암의 경우 특정 단백질의 존재가 암의 진행을 유발하는 것으로 확인된다면 그 단백질을 치료제 개발의 표적 단백질로 삼을 수도 있다. 게노믹스(Genomics)의 뛰어난 민감도와 유전자의 쉬운 증폭 등의 장점으로 이를 이용한 진단/치료제 개발 역시 많이 진행되고 있으나, DNA나 mRNA 단계에서의 변화가 실제로 세포 내에서 활성을 갖는 단백질의 변화로 곧바로 연결되지는 않을 수 있다는 점에서 이론상의 문제점이 남아있으며, 나아가 현실적으로는 유전물질이 없는 체액의 경우 프로테오믹스가 유일한 연구방법이다. 현재 비-침습적 접근(non-invasive approach)으로 진단에 쓰이고 있는 것은 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 양수, 분비액 등의 체액인데, 많은 연구자들이 진단 마커로 질병 특이적인 단백질을 발굴하기 위해 프로테오믹스 방법을 도입하고 있다.

한편, Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질은 세포자기파괴(autophagy)와 관련하여 그 기능이 연구된 바 있다. 세포자기파괴는 일정한 상황에서 활성화되는 오토파고좀성-리소좀성(autophagosomic-lysosomal) 단백질 분해의 이화 과정으로 정의되는데, 이러한 세포자기파괴는 일반적으로 영양소 부족의 조건 하에서 촉발되지만, 또한 발달, 분화, 신경퇴행성 질병, 감염 등의 생리학적 과정과 연관되어 있는 것으로도 알려져 있다[Reggiori, F. et al. (2002) Eukaryot. Cell 1, 11-21; Codogno, P. et al. (2005) Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518; Levine, B. et al. (2005) J. Clin. Invest. 115, 2679-2688].

Beclin-1(BECN1)은 세포자기과정에 관여하는 중요한 단백질 중 하나이며, 효모 세포자기파괴 단백질 Apg6/Vps30의 포유류 상동물(orthologue)이다[Kametaka, S. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22284-22291]. Beclin-1은 Apg6의 결실로 인하여 발생하는 효모에서의 세포자기파괴의 결함을 보충할 수 있으며, 포유류 세포에서 과다발현되는 경우 세포자기파괴를 유발할 수 있다[Liang, X.H. et al. (1999) Nature 402, 672-676]. 포유류 Beclin-1은 본래 Bcl-2와 상호작용하는 단백질에 대한 효모-투하이브리드 스크리닝으로 동정되었고, Bcl-2 및 Bcl-xL과는 상호작용하지만 Bax 또는 Bak와는 상호작용하지 않는 것이 증명되었다[Liang, X.H. et al, (1998) J. Virol. 72, 8586-8596]. Beclin-1은 일반적으로 다양한 세포에서 발현되며, 미토콘드리아를 포함한 세포질의 구조에 편재되지만, Beclin-1의 과다발현시 일부 핵성 염색 및 CRM1-의존 핵성 배출을 나타낸다[Liang, X.H. et al. (2001) Cancer Res. 6t1, 3443-3449]. Beclin-1^-/- 마우스는 초기 배아발생시 죽고 Beclin-1^-/+ 마우스는 자발적 종양의 빈도가 높다[Yue, Z. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 15077, 15082]. 생체 내에서 바이러스 감염된 뉴런에서의 Beclin-1의 과다발현은 신드비스(Sindbis) 바이러스 유도 질병 및 뉴런 세포자살에 대한 현저한 보호를 야기하였다[Liang, X.H. et al, (1998) J. Virol. 72, 8586-8596].

LC3(Light Chain 3)은 세포자기파괴시 그 양이 증가하는 단백질이며, 본래 미세소관-연관 단백질 1A 및 1B의 서브유닛(MAP1LC3으로 명명됨)으로서 동정되었고[Mannm S.S. and Hammarback, J.A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11492-11497], 이어서 세포자기파괴에 중요한 역할을 하는 효모 단백질 Apg8/Aut7/Cvt5에 유사한 것으로서 발견되었다[Lang, T et al. (1998) EMBO J. 17, 3597-3607]. 인간에서는 LC3의 세가지 동형(isoform)으로 LC3A, LC3B, 및 LC3C가 알려져 있고 이들은 세포자기파괴 과정 동안 전사후 변형의 과정을 거친다. LC3은 그 합성 후 즉시 이어지는 카르복시 말단의 첫번째로 절단을 통하여 세포질성 형태 LC3-I을 생성시키고, 세포자기파괴 동안 LC3-I는 Apg7 및 Apg3이 관여하는 유비퀴틴 유사 시스템으로 인하여 LC3-II으로 변환되어 LC3이 세포자기파괴성 소포(autophagic vesicle)에 연결된다[Kabeya, Y. Et al. (2000) Embo J. 19, 5720-5728; He, H. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 29278-29287; Tanida, I. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 47704-47710; Wu, J. et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 339, 437-442; Ichimura, Y. et al. (2000) Nature 408, 488-492]. 따라서, 오토파고좀에서 LC3의 존재와 LC3의 더 낮은 이동 형태인 LC3-II으로의 변환은 세포자기파괴의 지표로서 사용된다.

mTOR(mammlian target of rapamycin)은 또한 FRAP 또는 RAFP로도 알려져 있으며[Sabers, C.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 815-822; Brown, E.J. et al. (1994) Nature 369, 756-758; Sabatini, D.M. et al. (1994) Cell 78, 35-43], Ser/Thr 키나아제이다. mTOR은 ATP 및 아미노산의 변화에 반응하며 영양분의 이용가능성 및 세포 성장의 균형을 맞추는 역할을 하는 것으로 알려져 있다[Gingras, A.C. et al. (2001) Genes Dev. 15, 807-826; Dennis, P.B. et al. (2001) Science 294, 1102-1105]. 충분한 영양분이 이용가능할 때는, mTOR은 포스파티드산-매개 신호로 응답하며[Fang, Y. et al. (2001) Science 294, 1942- 1945], p70 S6 키나아제로 양성 신호를 전달하고 eIF4E 저해자인 4E-BP1의 불활성화에 관여하여 특정 mRNA 군의 번역을 야기한다. mTOR은 PI3 키나아제/Akt 신호 경로를 통하여 Ser2448에 인산화되거나 자발적으로 Ser2481에 인산화되어 p-mTOR이 생성된다[Nave, B.T. et al. (1999) Biochem. J. 344 Pt2, 427-431; Peterson, R.T. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 7416-7423]. mTOR은 세포 성장이나 항상성에 핵심적인 역할을 하며, 세포자기파괴 작용은 mTOR에 의하여 저해되는 것으로 알려져 있다.

그러나, Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR을 간암의 진행을 진단하기 위한 마커로서 사용한 예는 전혀 알려져 있지 않다.

종래 범종양 마커나 조직 특이적인 마커가 상당수 알려져 있고 특히 간암 특이적 마커들에 관한 연구도 일부 이루어진 바 있지만, 간암의 진행 정도를 특이적으로 정확하게 판별해낼 수 있도록 하는 간암 진행 진단용 마커는 거의 알려져 있지 않은 실정이다.

간암의 진행 정도를 판별하는 것은 간암 환자에 대한 치료법의 결정이나 간암 치료 후의 예후의 관찰에 있어서 매우 중요한 과정이다. 현재 이와 같은 간암 진행 정도의 판별은 간암 조직의 형태학적 관찰에 거의 전적으로 의존하고 있는데, 간암 조직을 채취하여 형태학적으로 관찰하는 과정은 환자에게 부담이 되고 매우 번거로우며, 나아가 이는 전문의의 주관적인 판단에 기초하는 것이라는 문제가 있다. 따라서, 보다 간편하고 객관적이면서 정확한 간암 진행 진단 방법을 개발할 필요성이 있다.

본 발명자는 간세포암 조직의 등급별로 단백질의 존재 양상의 변화를 면밀하게 관찰하였고, 초기 간세포암 조직에 비하여 간암이 더 진행된 조직에서 그 존재 양상이 특징적으로 변화하는 특정 단백질들을 검출하고 추가의 연구를 통하여 간암의 진행 정도를 진단하는데 사용될 수 있는 단백질성 마커를 개발해내었다. 구체적으로, 상기 단백질성 마커는 Beclin-1, LC3, mTOR, p-mTOR, 또는 이들의 조합이다.

본 발명의 첫번째 국면은 Beclin-1, LC3, mTOR, p-mTOR, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단용 단백질성 마커에 관한 것이다.

간암의 종양 세포의 등급은 그 분화 정도에 기초하여 크게 4등급으로 나누어진다 (Edmonson 분류; Edmondson H. et al. (1954) Cancer 7(3), 462-503). 종양세포들이 정상 간세포와 구별이 어려울 정도로 분화가 좋고 얇은 코오드로 구성된 것을 1등급(E1)이라 하고, 종양 세포의 핵이 다소 크고 농염되며 선 구조가 많이 보이는 경우를 2등급(E2)이라 하며, 종양 세포의 핵이 더욱 커지고 거대 세포들이 많이 나타나는 경우를 3등급(E3)이라 하고, 종양 세포들의 분화가 매우 나빠서 종양 세포들의 대부분이 크고 농염된 핵을 가지며 세포들의 접착성이 없이 밀집되어 있는 경우를 4등급(E4)으로 분류한다. 본 명세서에서 기술된 연구는 이형성 결절(dysplastic nodules; DN) 조직, E1 등급 내지 E4 등급 간세포암 조직, 및 전이성 선암 조직을 포함하는 다양한 간암 조직에서 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR의 존재 양상을 검사함으로써 진행되었다.

본 명세서에서 "간암 진행 진단용 단백질성 마커"는 간암의 진행 정도를 구분해내는 기준이 되는 물질 중에서 단백질을 주요 구성물질로 하고 있는 것을 지칭하며, 구체적으로 본 발명에서는 Beclin-1, LC3, mTOR, p-mTOR, 또는 이들의 조합을 지칭한다. 본 발명에서 이 단백질성 마커는 특정 등급 이후의 간세포암 조직에서의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴이 그 전의 간세포암 조직이나 이형성 결절에서의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴과 비교할 때 유의미한 차이가 있다. 하나의 측면으로, 본 발명에서 Beclin-1, LC3, 및 mTOR는 E2 등급 이전의 간세포암 조직에 비하여 E3 등급 이후의 간세포암 조직에서 그 존재량이 유의미하게 증가하며, p-mTOR은 E3 등급 이전의 간세포암 조직에 비하여 E4 등급 이후의 간세포암 조직에서 그 존재량이 유의미하게 증가한다.

본 발명은 임상적으로 수득된 간암 조직을 저등급 이형성 결절, 고등급 이형성 결절, E1 등급 내지 E4 등급 간세포암 조직, 및 전이성 선암으로 분류하여 각 등급별로 단백질의 존재 양상을 검사한 것이기 때문에, 이렇게 확인된 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, p-mTOR, 또는 이들의 조합은 이형성 결절이나 간세포암 조직의 등급에 따라 그 존재 양상의 변화가 두드러지며 간암의 진행 정도를 간편하고 객관적이며 정확하게 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 이렇게 확인된 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR이 특정 등급 이후의 간세포암 조직에서 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴이 유의미하게 변화하는 것이라는 점을 감안한다면, Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 생리학적 기능은 간암의 진행에 직접적으로 관련된 것일 수 있으며, 따라서 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR은 간암 진행의 메커니즘을 연구하거나 간암의 진행을 억제하는 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 활용될 수 있다.

더구나, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR은 실제의 간암 조직에서의 연구에 기초하여 발굴해낸 것이므로, 인공배양 세포주에서 DNA 또는 mRNA 수준으로 발견된 종래의 대부분의 간암 특이적 마커들에 비하여 더욱 임상적으로 활용 가치가 높은 마커들이다. 나아가, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR은 특정 등급 이후의 간암 세포에서 특징적으로 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴이 변화하는 것이므로, 간암의 진행을 억제하는 치료제의 표적으로 활용될 수 있다는 점에서 종래기술의 범종양 마커들이나 간암 특이적 마커들과 차별화되는 것이다.

본 발명의 두번째 국면은 상기 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 특이적인 검출은 생물학적 시료 내에 본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커가 존재하는지 여부 및 그 양과 패턴을 확인하는 과정을 의미하며, 예를 들어, Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 단독으로 또는 조합하여 이용하여 해당 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 확인하는 과정이 활용될 수 있다. 본 명세서에서 "생물학적 시료"란 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴이나 이 단백질성 마커에 관한 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 검출할 수 있는 세포나 조직 등을 의미하며, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 예로 들 수 있지만 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 명세서에서 "항체"란 항원의 항원결정기(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하는 개념이다.

항체를 이용하여 단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 측정하는 방법 으로는, 면역조직화학염색(immunohistochemistry stain), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(ouchterlony) 면역확산, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

이 분석 방법들을 통하여, 간암 환자의 생물학적 시료에서의 항원(즉, Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR)-항체 복합체의 형성량과 형성 패턴을 비교할 수 있고, 이로부터 생물학적 시료에서의 본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 판단할 수 있으며, 간암 환자에게서 간암의 진행 여부와 그 정도 및/또는 패턴을 간편하고 객관적이며 정확하게 진단할 수 있게 된다. 아울러, 각 단백질성 마커에 관한 항체를 조합하여 사용함으로써 더욱 정확하고 객관적인 진단이 가능할 수 있다.

여기서 "항원-항체 복합체"란 간암 진행 진단용 단백질성 마커와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량이나 형성 패턴은 통상 2차 항체에 연계된 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기 및 패턴을 검출함으로써 측정이 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자, 방사선 동위원소 등을 예로 들 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에 는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 형광물이 사용되는 경우 이용 가능한 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 리간드가 사용되는 경우 이용 가능한 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 발광물이 사용되는 경우 이용 가능한 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 미소입자가 사용되는 경우 이용 가능한 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 레독스 분자가 사용되는 경우 이용 가능한 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 방사성 동위원소가 사용되는 경우 이용 가능한 방사성 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 두번째 국면에서의 "간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부 와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"은 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 검출하기 위한 분석 방법에서 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR에 대하여 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 항체로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 두번째 국면은 간암 환자의 생물학적 시료에서의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이러한 차이의 검출을 가능하게 하는 물질이라면 어떠한 것이라도 "간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식 및 공지기술을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 특별한 어려움 없이 선택/선별하여 사용할 수 있을 것이다.

본 발명의 세번째 국면은 상기 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴은, 상기 본 발명의 두번째 국면과 같이 단백질 자체의 존재량이나 존재 패턴을 검출하는 방법을 사용하는 것 외에도, 조직 내에서 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR을 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발 현량 및/또는 발현 패턴을 검출함으로써 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 유추하는 방법을 사용할 수도 있다.

여기서 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 검출은 통상적으로 해당 유전자의 전사로 인해 생성된 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 확인하는 과정으로써 수행될 수 있다. 이러한 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 확인하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 인-시투 혼성화(in-situ hybridization), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블랏, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

이 분석 방법들을 통하여, 간암 환자의 생물학적 시료에서 본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR에 대응하는 mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 분석할 수 있고, 이로부터 그 단백질성 마커 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 판단하며, 간암 환자의 간암 진행 여부를 간편하고 객관적이며 정확하게 진단하는 것이 가능하게 된다. 아울러, 각 단백질성 마커에 관한 mRNA를 조합하여 분석함으로써 더욱 정확하고 객관적인 진단이 가능할 수 있다.

mRNA의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커에 관한 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 본 명세서에서 "프라이머"는 템플레이트(template)와 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 템플레이트의 복제를 개시할 수 있도 록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 특정 유전자의 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp 의 길이, 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이가 사용될 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 구체적인 실시 양상에 따라 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시시킬 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 다른 염기 서열을 포함할 수도 있다. 프라이머는 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

본 발명의 세번째 국면에서의 "간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"은 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR을 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 분석 방법에 있어서 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 발현 분석에 특이적으로 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있으며, 반드시 RT-PCR용 프라이머에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 세번째 국면은 간암 환자의 생물학적 시료에서 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 것에 기술적 특징이 있는 것이기 때문에, 이러한 차이의 검출을 가능하게 하는 물질은 어떠한 것이라도 "간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질"로서 사용될 수 있고 발명이 목적하는 기술적 효과를 달성할 수 있으며, 당업자라면 당업계의 평균적인 지식을 참고하여 구체적인 실시양상에 따라 적당한 물질을 선택/선별하여 사용할 수 있을 것이다.

본 발명의 네번째 국면은 상기 본 발명의 두번째 국면 또는 세번째 국면의 간암 진행 진단용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 간암 진행 진단용 키트는, 간암 진행 진단용 조성물에 포함되는 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 물질 또는 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴을 특이적으로 검출하는 물질 외에 각 검출에 적합한 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 진단 키트가 단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 진단 키트가 유전자의 발현 여부와 그 발현 량 및/또는 발현 패턴을 검출하기 위한 진단 키트인 경우에는, 이 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 또한, 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 간암 진행 진단용 키트는 DNA 칩 또는 단백질 칩을 포함할 수 있다.

본 발명의 다섯번째 국면은, 상기 본 발명의 두번째 국면의 간암 진행 진단용 조성물을 간암 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하는 제 1 단계; 및 제 1 단계의 처리 결과를 대조군과 대비하여 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴의 차이를 검출하는 제 2 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 추가로, 본 발명의 다섯번째 국면은, 상기 본 발명의 세번째 국면의 간암 진행 진단용 조성물을 간암 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하는 제 1 단계; 및 제 1 단계의 처리 결과를 대조군과 대비하여 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 제 2 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단 방법에 관한 것이다.

Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패 턴의 차이를 검출하는 경우에는, 예를 들어, 만약 간암 환자의 생물학적 시료에서의 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질의 존재량이 대조군에서의 존재량보다 많다면 이는 진행된 간세포암 조직을 더 많이 보유하고 있을 가능성, 즉 간암이 더욱 진행하였을 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있을 것이다.

한편, Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량 및/또는 발현 패턴의 차이를 검출하는 경우에는, 예를 들어, 만약 간암 환자의 생물학적 시료에서의 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질을 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 존재량이 대조군에서의 존재량보다 많다면 이는 진행된 간세포암 조직을 더 많이 보유하고 있을 가능성, 즉 간암이 더욱 진행하였을 가능성을 제시하는 것이라고 할 수 있을 것이다.

본 발명의 여섯번째 국면은, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커에 시험 화합물을 결합시키는 제 1 단계; 및 시험 화합물이 상기 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 제 2 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질은 특정 등급 이후의 간암 조직에서 변화 양상이 두드러지는 것이기 때문에 간암의 진행에 직접 관여하는 단백질일 수 있으며, 따라서 간암 진행의 메커니즘을 연구하거나 간암의 진행을 억제하는 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있는 것이다. 즉, 본 발명의 첫번째 국 면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 발굴은 간암의 진행을 억제하는 치료제 개발의 중요한 전제를 해결한 것이므로, 따라서 이 단백질성 마커를 이용하여 간암의 진행을 억제하는 치료제를 스크리닝하는 방법도 본 발명의 범주에 속한다.

이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 어피니티 칼럼에 고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투-하이브리드 방법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 블랏["Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝 방법[Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시 양상에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험 화합물을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일곱번째 국면은, 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.

본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커인 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR을 특이적으로 인식하는 항체는 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR 단백질의 존재 여부와 그 양 및/또는 패턴을 특이적으로 검출하는 대표적인 물질이며, 따라서 간암의 진행 여부를 진단하는데 유용하게 사용할 수 있는 물질에 해당한다. 나아가, 경우에 따라서는 이 항체가 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR의 생리학적 활성에 영향을 주며, 이에 따라 간암의 진행을 억제하기 위한 치료제로서도 활용될 수 있다.

본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 마커로서 Beclin-1, LC3, mTOR, 또는 p-mTOR이 발굴되었으므로 이를 이용하여 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 제조하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.

다클론 항체는 상기한 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 다양한 동물 종 숙주로부터 제조 가능하며, 그 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) [Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조], 또는 파지 항체 라이브러리[Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991] 기술 등을 이용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 하이브리도마 방법은 본 발명의 첫번째 국면의 간암 진행 진단용 단백질성 마커 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 조직들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique) 에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 원하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 공지된 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 파지 항체 라이브러리 방법은 원하는 항체의 유전자를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현시킴으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 원하는 단일클론 항체를 분리하여 단일클론 항체를 제작하는 방법이다. 상기 방법으로 제조된 단일클론 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일곱번째 국면의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에 의하여 간암 진행 진단용 단백질성 마커, 상기 단백질성 마커의 변화를 검출하는 물질을 포함하는 간암 진행 진단용 조성물, 상기 간암 진행 진단용 조성물을 포함하는 간암 진행 진단용 키트, 상기 단백질성 마커를 이용하는 간암 진행 진단 방법, 상기 단백질성 마커를 활용한 간암 치료제 스크리닝 방법, 및 상기 단백질성 마커를 특이적으로 인식하는 항체가 제공된다.

본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 활용함으로써, 간암 조직의 형태학적 관찰에만 전적으로 의존하는 종래 기술에 비하여 간암의 진행 정도를 보다 간편하고 객관적이며 정확하게 판단해낼 수 있게 된다.

나아가, 본 발명의 간암 진행 진단용 단백질성 마커는 간암의 진행에 직접 관여하는 단백질일 수 있으며, 따라서 간암 진행의 메커니즘을 연구하거나 간암의 진행을 억제하는 치료제의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 면역조직화학염색을 통한 임상샘플로부터의 Beclin -1, LC3 , mTOR , 및 p- mTOR 의 확인

간세포암 환자로부터 69 개의 이형성 결절 또는 간세포암 조직(12 개의 저등급 이형성 결절, 14 개의 고등급 이형성 결절, 9 개의 E1 등급 간세포암, 12 개의 E2 등급 간세포암, 15 개의 E3 등급 간세포암, 3 개의 E4 등급 간세포암, 및 4 개의 전이성 선암)과 주변부의 정상 간조직을 포함하는 임상샘플을 수득하였으며, 각 임상샘플에 대하여 하기와 같은 면역조직화학염색을 수행하였다.

파라핀에 포매된 임상조직에 대하여 통상적인 방법으로 면역염색이 수행되었다. 파라핀으로 포매시킨 조직을 마이크로톰(microtome)으로 얇게 박절한 후 이 절편을 유리 슬라이드 위에 고정한 후 파리핀을 제거하고 재수화하였다. 1차 항체로서 항 Beclin-1 항체(BECN1, 다클론, 1:135; Santa Cruz Biotechnology 사), 항 LC3 항체(MAP1LC3B, 다클론, 1:100; Abgent 사), 항 mTOR 항체(7C10, 1:40; Cell Signaling Technology 사), 및 항 p-mTOR(Ser2448) 항체(49F9, 1:50; Cell Signaling Technology 사)를 사용하였다. 실란으로 코팅된 4 ㎛ 두께의 절편을 시트레이트 완충액 (pH 6.0; Beclin-1의 경우) 또는 TE 완충액 (pH 9.0; LC3, mTOR, 및 p-mTOR의 경우) 내에서 예열하였다. 가시화를 위하여 DAB를 사용하고, 핵 대항염색을 위하여 헤마톡실린을 사용하여 통상적인 아비딘-비오틴 퍼옥시다아제 기법을 수행하였다. Beclin-1의 경우에는 제조사의 프로토콜에 따라서 수행하였다.

Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR에 관한 대표적인 면역조직화학염색 이미지의 대표적인 예를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, E3 등급의 간세포암 조직 및 전이성 선암 조직에서 각 단백질성 마커에 대한 면역염색이 확인된다.

이 실험에 따라 수득된 69개의 이형성 결절 또는 간세포암 조직의 임상샘플에 대한 면역조직화학염색의 분석 결과는 하기 표 1 내지 표 3과 같다. 표 1은 이형성 결절 조직에서의 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR의 존재 여부 및 그 양과 패턴에 관한 결과이고, 표 2는 E1 내지 E2 등급의 간세포암 조직에서의 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR의 존재 여부 및 그 양과 패턴에 관한 결과이며, 표 3은 E3 등급 이후의 간세포암 조직에서의 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR의 존재 여부 및 그 양과 패턴에 관한 데이터이다. 표 1 내지 표 3 중, "강도"는 면역염색이 관 찰된 경우 강도를 나타내며 0, 약, 중, 및 강으로 구별하였고, "위치"는 세포 내 면역염색이 관찰된 위치를 지칭하고, "비율"은 해당 이형성 결절 또는 간세포암 조직 내 면역염색이 확인되는 세포의 비율(%)을 나타낸다. 정상 간조직의 경우에는 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR 중 어느 것도 실질적인 면역염색이 관찰되지 않았다.

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이형성 결절 조직의 경우 Beclin-1은 극히 일부의 조직에서(2/26) 면역염색이 약하게 관찰되었고, LC3은 어떠한 조직에서도(0/26) 전혀 관찰되지 않았고, mTOR은 일부의 조직에서(11/26) 하나의 조직을 제외하고는 약한 면역염색이 관찰되었고, p-mTOR은 극히 일부의 조직에서(2/26) 약하거나 중간 강도인 면역염색이 관찰되었다.

또한, 상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, E1 내지 E2 등급의 간세포암 조직의 경우 Beclin-1은 일부의 조직에서(8/21) 약하거나 중간 강도인 면역염색이 관찰되었고, LC3은 하나의 조직에서만(1/21) 중간 강도인 면역염색이 관찰되었고, mTOR은 일부의 조직에서(11/20) 면역염색이 관찰되었고, p-mTOR은 극히 일부의 조직에서(4/21) 약하거나 중간 강도인 면역염색이 관찰되었다.

반면, 상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, E3 등급 이후의 간세포암 조직의 경우 Beclin-1은 모든 조직에서(22/22) 상당한 강도의 면역염색이 관찰되었고, LC3은 과반수의 조직에서(13/20) 상당한 강도의 면역염색이 관찰되었고, mTOR은 모든 조직에서(20/20) 중간 이상의 강도의 면역염색이 관찰되었고, p-mTOR은 일부의 조직에서(11/20) 면역염색이 관찰되었다.

면역염색의 강도, 빈도, 패턴은 해당 단백질성 마커의 양, 빈도, 패턴을 나타내는 것이며, 따라서 상기 결과는 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR이 간암의 진행에 따라 그 양, 빈도, 패턴이 변화함을 보여준다.

상기 결과를 수치화하여 도 2로 정리하였다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 강도-합계 점수 및 면역양성도 모두에서 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR은 간세포암이 진행되면 될수록 그 수치가 증가하는 뚜렷한 경향성을 보였다. 특히 Beclin-1, LC3, 및 mTOR의 경우에는 E2 등급의 간세포암 조직과 E3 등급의 간세포암 조직 간에 특별히 유의미한 변화가 관찰되었으며, p-mTOR의 경우에는 E3 등급의 간세포암 조직과 E4 등급의 간세포암 조직 간에 특별히 유의미한 변화가 관찰되었다. 이는 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR이 각각 단독으로, 또는 서로 조합되어, 간세포암의 진행의 여부와 진행 정도 및/또는 패턴의 판별을 가능하게 하는 단백질성 마커가 될 수 있음을 보여준다.

아울러, Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR이 모두 E3 등급 이후의 간세포암 조직(Beclin-1, LC3, 및 mTOR) 또는 E4 등급 이후의 간세포암 조직(p-mTOR)에서 현격하게 존재량이나 존재빈도가 증가한다는 점으로부터 이들 단백질이 간세포암의 진행의 특정 단계에서 중요한 역할을 담당할 수 있다는 점이 예상되며, 따라서 이는 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR이 간암의 진행을 예방 또는 저해하는 치료제의 표적이 될 수 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다.

실시예 2: 웨스턴 블랏을 통한 조직 내의 Beclin -1, LC3 , mTOR , 및 p- mTOR 확인

간세포암 환자로부터 13 개의 간세포암 조직(3 개의 E2 등급 간세포암 조직 및 10 개의 E3 등급 간세포암 조직)과 주변부의 정상 간조직을 포함하는 임상샘플을 수득하였으며, 13 쌍의 간세포암 조직 및 주변부의 정상 간조직에 대하여 하기와 같은 웨스턴 블랏법을 수행하였다.

조직 추출 제제 II 키트(Tissue Extraction Reagents II kit; Biosource International 사)를 사용하여 급속히 동결되고 -70℃ 에서 보존된 13 쌍의 조직으로부터 각각 세포 단백질을 추출해내었다. 전체 세포 파쇄물 중 25 ㎍ 을 8~10% 트리스-글리신 SDS-PAGE로 분리하였고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 이동시켰다. 막을 0.05% Tween 20이 있는 5% 탈지 우유를 함유하는 TBS로 블로킹하였고, 0.05% Tween 20을 함유하는 TBS (TBST) 로 세척하였고, 1차 항체와 함께 4℃ 에서 밤새 배양하였다. 1차 항체로서 항 Beclin-1 항체(BECN1, 다클론, 1:500; Santa Cruz Biotechnology 사), 항 LC3 항체(MAP1LC3B, 다클론, 1:500; Cell Signaling Technology 사), 및 항 mTOR 항체(7C10, 1:500; Cell Signaling Technology 사)를 사용하였다. TBST에서 세척한 후, 막을 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 염소 항 토끼IgG 항체(1:15000; Zymed Laboratories 사)와 함께 4℃ 에서 밤새 배양하였다. 증가된 화학발광 검출 제제(enhanced chemiluminescence detection reagents; Milipore 사)를 사용하여 신호를 검출하였다. 프로게네시스 새임스팟스 소프트웨어(Progenesis Samespots software; Nonlinear Dynamics 사)를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 전체 단백질의 표준화가 사용되었다.

13 쌍의 조직에 대한 웨스턴 블랏의 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 A 패널에서 확인할 수 있다시피, Beclin-1, LC3, 및 mTOR 모두는 정상 간조직에서보다 간세포암 조직에서 그 밴드의 강도가 현저하게 증가하였다. 이는 Beclin-1, LC3, 및 mTOR 각각이 모두 정상 간조직보다 간세포암 조직에 보다 많은 양이 존재한다는 점을 나타내며, 따라서 각각 독립적으로 또는 서로 조합되어 간암의 진단을 위한 단백질성 마커로서 유용하게 활용될 수 있다는 점을 보여준다.

도 3의 B 패널에서 확인할 수 있다시피, Beclin-1, LC3, 및 mTOR 모두는 E2 등급의 간세포암 조직과 비교할 때 E3 등급의 간세포암 조직에서 T/N 비가 특별히 유의미하게 상승하였다. 이는 Beclin-1, LC3, 및 mTOR 모두는 E2 등급의 간세포암 조직에 비하여 E3 등급의 간세포암 조직에서 특별히 더 많이 존재하는 것임을 증명하며, 따라서 Beclin-1, LC3, 및 mTOR은 각각 독립적으로 또는 조합되어 간암의 진행 정도를 진단할 수 있는 마커로서 유용하게 활용될 수 있다는 점을 보여준다.

따라서, 이상의 결과들은 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR이 각각 독립적으로 또는 서로 조합되어 유용한 간암 진행 진단용 단백질성 마커로 활용될 수 있음을 보여주며, 또한 이 간암 진행 진단용 단백질성 마커가 간암의 진행을 예방 및 억제하는 치료제의 유용한 표적이 될 수 있음을 시사한다.

도 1은 간세포암 조직에서 Beclin-1, mTOR, LC3, 및 p-mTOR에 대한 면역조직화학염색을 수행한 이미지의 대표적인 예이다. I 패널은 E3 등급의 간세포암 조직을 포함하는 임상샘플(수술 번호: S06-17485-B)에 대한 이미지이며, II 패널은 전이성 선암 조직을 포함하는 임상샘플(수술 번호: S06-57053-A)에 대한 이미지이다.

도 2는 표 1 내지 3의 면역조직화학염색 분석 결과를 토대로 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다. A 패널에서 "강도-합계 점수"는 등급 별로 각 조직의 강도 점수에 비율 점수를 곱한 값의 평균을 의미하는데, 여기서 강도 점수는 면역염색의 강도가 0인 경우를 0점, 약인 경우를 1점, 중인 경우를 2점, 강인 경우를 3점으로 한 것이며, 비율 점수는 해당 조직에서 면역염색이 확인된 세포의 비율을 의미한다. A 패널에서 막대의 하한 및 상한은 강도-합계 점수가 각각 상위 75% 및 상위 25%인 값이고, 각 막대에서 연장된 선은 각 막대의 길이의 1.5 배 내에 존재하는 최소값 및 최대값이며, 중간값은 굵은 선으로 표시된다. B 패널에서 "면역양성도"는 등급 별로 전체 조직의 개수 중 면역염색이 관찰된 조직(즉, 강도가 약, 중, 또는 강인 경우)의 개수의 비율(%)을 의미한다. "LDN"은 저등급 이형성 결절을 지칭하고, "HDN"은 고등급 이형성 결절을 지칭하고, "E I"은 E1 등급 간세포암 조직을 지칭하고, "E II"은 E2 등급 간세포암 조직을 지칭하고, "E III"은 E3 등급 간세포암 조직을 지칭하고, "E IV"는 E4 등급 간세포암 조직을 지칭하고, "Meta"는 전이성 선암 조직을 지칭한다.

도 3은 13 쌍의 간세포암 조직(3 개의 E2 등급 간세포암 조직, 10 개의 E3 등급 간세포암 조직, 및 각각에 대응하는 13 개의 주변부 정상 간조직)에서 Beclin-1, LC3, mTOR, 및 p-mTOR에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸 것이다. "Grade II"는 E2 등급 간세포암 조직을 지칭하고, "Grade III"는 E3 등급 간세포암 조직을 지칭한다. A 패널은 웨스턴 블랏을 수행한 후 수득한 밴드의 이미지이며, "N"은 정상 간조직을 지칭하고 "T"는 간세포암 조직을 지칭한다. B 패널은 웨스턴 블랏에 의하여 수득한 밴드의 강도를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것인데, "T/N 비"는 정상 간조직에서 수득한 밴드의 강도에 대한 간세포암 조직에서 수득한 밴드의 강도의 비를 지칭한다. B 패널에서 막대의 하한 및 상한은 T/N 비가 각각 상위 75% 및 상위 25%인 값이고, 각 막대에서 연장된 선은 각 막대의 길이의 1.5 배 내에 존재하는 최소값 및 최대값이며, 중간값은 굵은 선으로 표시된다.

Claims (10)

1. 삭제
2. LC3 (Light chain 3), mTOR (mammalian target of rapmycin), p-mTOR (phospho-mammalian target of rapamycin), 또는 Beclin-1, LC3, mTOR 및 p-mTOR 로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 조합인 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양, 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 상기 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단용 조성물.
3. LC3 (Light chain 3), mTOR (mammalian target of rapmycin), p-mTOR (phospho-mammalian target of rapamycin), 또는 Beclin-1, LC3, mTOR 및 p-mTOR 로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 조합인 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량, 발현 패턴, 또는 양자 모두를 특이적으로 검출하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단용 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 2 항 또는 제 3 항의 간암 진행 진단용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진행 진단용 키트.
7. 간암 진행 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 제 2 항의 간암 진행 진단용 조성물을 간암 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하여, 시료 중의 LC3 (Light chain 3), mTOR (mammalian target of rapmycin), p-mTOR (phospho-mammalian target of rapamycin), 또는 Beclin-1, LC3, mTOR 및 p-mTOR 로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 조합인 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 존재 여부와 그 양, 패턴, 또는 양자 모두의 차이를 검출하는 방법.
8. 간암 진행 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 제 3 항의 간암 진행 진단용 조성물을 간암 환자에게서 채취한 생물학적 시료에 처리하여, 시료 중의 LC3 (Light chain 3), mTOR (mammalian target of rapmycin), p-mTOR (phospho-mammalian target of rapamycin), 또는 Beclin-1, LC3, mTOR 및 p-mTOR 로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 조합인 간암 진행 진단용 단백질성 마커를 코딩하는 유전자의 발현 여부와 그 발현량, 발현 패턴, 또는 양자 모두의 차이를 검출하는 방법.
9. LC3 (Light chain 3), mTOR (mammalian target of rapmycin), p-mTOR (phospho-mammalian target of rapamycin), 또는 Beclin-1, LC3, mTOR 및 p-mTOR 로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 조합인 간암 진행 진단용 단백질성 마커에 시험 화합물을 결합시키는 제 1 단계; 및

   시험 화합물이 상기 간암 진행 진단용 단백질성 마커의 생리학적 활성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 제 2 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료제의 스크리닝 방법.
10. 삭제

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