KR20180028895A

KR20180028895A - 간암 예후측정 또는 진단용 마커로서의 ard1의 용도

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Publication number: KR20180028895A
Application number: KR1020170049773A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 서지혜; 정영화; 이단비; 이혜신; 박지현; 류수형; 김정아; 최진혁
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2018-03-19
Also published as: KR101925715B1; CN109689895A

Abstract

간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 단계적으로 진행되는바, 만성 간질환에서 발생되는 이형성 결절, 특히 고분화 이형성 결절은 전암병변으로서 다단계 간암발생 과정의 조기 변화로 볼 수 있다. 이와 같은 이형성 결절 단계를 거쳐 점차 악성도가 증가하여 전이도가 높으며 분화도가 좋지 않은 간암으로 발전하게 되므로, 최근 간암을 조기에 진단하기 위하여 노력이 집중되고 있다.
이에, 본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있도록 간암 단계 진단 및 간암 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따라 ARD1 발현 수준을 분석하면 간암을 조기에 진단하여 대응하고, 간암의 진행 단계를 파악하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

간암 예후측정 또는 진단용 마커로서의 ARD1의 용도 {Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker}

본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있도록 간암 진행 단계 진단 및 간암 진단 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명자들은 정상인과 비교하여 간암 환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인하였는바, 본 발명에 따라 ARD1 발현 수준을 분석하면 간암을 조기에 진단하고, 간암의 진행 단계를 파악할 수 있을 것으로 기대된다.

간암 또는 간세포암 (hepatocellular carcinoma; HCC)은 세계에서 5번째로 흔한 암이며, 국내에서는 2013년 통계청 자료에 의하면 암에 의한 사망의 22.6%가 간암으로, 암 사망 원인 4위에 해당된다. 간세포암종에 관한 가장 바람직한 치료법은 수술이지만, 종양의 절제할 수 없는 크기 및 수, 간기능 저하, 다양한 간내 또는 원격 전이 등의 요인이 간세포암종 환자의 수술 가능 여부 및 수술 이후 재발에 주요한 제한 요소로 작용하고 있다. 이와 관련된 암의 다양한 증식 및 전이 관련 단백질들이 연구되고 분리되어져 있다.

특히 간세포암은 간염바이러스나 알코올, 간경화와 같은 위험인자를 가지고 있는 환자에게서 호발하는 것으로 알려져 있고 조기진단 마커를 이용하여 고위험군에 대한 선별적 감시 검사 (surveillance)를 시행할 대상이 명확하다. 실제로, 6개월 간격으로 시행하는 조기진단은 간암 환자의 생존율 증대 (사망률 37% 감소)하는 것으로 나타났다.

정상인에서 간암을 조기에 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 고위험군에서 비침습적인 조기 간암 진단을 위하여 사용하고 있는 검사 방법이 혈청 알파태아단백 (α-fetoprotein; AFP) 검사이다. AFP는 개발 당시 민감도와 특이도를 모두 양호한 수준으로 달성할 수 있는 기준값이 20ng/mL로 제시되었으나, 이 경우 민감도가 60%에 지나지 않으며 현재 국제 학회의 간암 진단 가이드라인에 따라 200ng/mL를 기준으로 간암을 진단할 경우 특이도는 상승하지만 민감도가 22%에 불과하다. 기존의 연구 결과, AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다.

그 외 진단 기준으로 확립되어 있지는 않으나 간암 진단에 도움이 되는 혈청 마커로는 Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), 글리코실화 AFP 대 총 AFP (L3 fraction)분포, α-fucosidase, glypican 3, HSP-70 등이 있다. 그러나 각각은 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 대부분이고, 단독으로 사용하였을 때 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있으며, 단일 혈청학적 마커로 간암을 조기 진단하는 것은 이미 한계에 다다른 것으로 판단된다. 아울러 실제 수술이나 고주파 열치료술과 같은 근치적 치료가 가능한 단계에서 진단되는 환자들은 전체 간암 환자의 30% 정도에 국한된다(미국 공개특허공보 제2010/0304372호 참조).

Arrest-defective 1 protein (ARD1)은 다양한 암에서 발현이 증가되어 있음이 보고되었으며, 암세포 증식 및 암 혈관 신생에 관여됨이 알려져 있다. 그러나 ARD1이 간세포암종 환자에서 암의 악성화, 침윤, 재발 및 생존에 어떠한 역할을 수행하는지에 관한 구체적인 보고는 전무한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 간세포암종 환자의 종양 조직 및 종양 주변 조직을 분석하고, 정상인과 비교하여 간암환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물 및 간암 진행 단계 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함한 간암 예후예측용 키트 및 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법 및 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간암 진행 단계 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 ARD1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 ARD1 유전자의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 예후예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질의 발현량을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

또한, 본 발명은 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는데 사용되는, 간암 진단용 키트로서, 상기 간암 진단을 위하여 피검체 유래의 혈액 샘플을 이용하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단용 키트를 제공한다.

간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 단계적으로 진행되는바, 만성 간질환에서 발생되는 이형성 결절, 특히 고분화 이형성 결절은 전암병변으로서 다단계 간암발생 과정의 조기 변화로 볼 수 있다. 이와 같은 이형성 결절 단계를 거쳐 점차 악성도가 증가하여 전이도가 높으며 분화도가 좋지 않은 간암으로 발전하게 되므로, 최근 간암을 조기에 진단하기 위하여 노력이 집중되고 있다.

이에, 본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있도록 간암 진행 단계 진단 및 간암 진단 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 ARD1 발현 수준을 분석하면 간암을 조기에 진단하여 대응하고, 간암의 진행 단계를 파악하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 간암 환자의 간암 조직 (T) 및 간암 주변 조직 (NT)에서의 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 발현을 나타내는 도이다.
도 2는 간암 환자의 간암 조직 (T) 및 간암 주변 조직 (NT)에서의 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 발현량을 정량화하여 나타내는 도이다.
도 3은 ARD1 발현 레벨과 간암 수술 후 재발률 및 생존율 사이의 관련성을 분석하기 위하여, 실험 대상자인 환자들 총 698명의 clinical characteristics을 나타내는 도이고, 도 4는 상기 실험 대상자인 환자들의 tumor characteristics을 나타내는 도이다.
도 5는 상기 실험 대상자들 698명의 간세포암종 조직에 면역화학염색을 시행하여 ARD1 발현 정도에 따라 실험 대상자들을 네 개의 그룹으로 나타낸 도이고, 도 6은 이와 같이 간세포암종 조직에서 살펴 본 ARD1의 발현 레벨을 도식화 하여 나타낸 도이다.
도 7은 면역화학염색 한 조직에서 미세혈관 침윤 (microvascular invasion; MVI)이 존재하는 경우, ARD1 발현이 높은 경향을 보임을 나타낸 도이다.
도 8은 분화도가 좋지 않은 간암에서 ARD1 과발현 정도가 높은 경향을 보임을 나타낸 도이다.
도 9는 근치적 간절제술을 시행 받았던 536명의 간세포암종 환자들을 대상으로 간세포암종 조직에서 ARD1의 발현이 높은 그룹에서 수술 후 재발률 (cumulative recurrence rate)이 높은 경향을 보임을 나타낸 도이고, 도 10은 상기 간세포암종 환자들을 대상으로 간세포암종 조직에서 ARD1의 발현이 높은 그룹에서 간암 수술 후 생존율 (survival rate)이 낮은 경향을 보임을 나타내는 도이다.
도 11은 간암의 전단계인 이형성 결절 (displastic nodule; DN)에서의 ARD1 레벨을 간 정상 조직 및 간암 조직과 비교하기 위하여, 실험 대상자들의 clinical characteristics을 나타내는 도이다.
도 12는 정상조직 (Normal)에서 이형성 결절 (DN), 그리고 간암 (hepatocellular carcinoma; HCC)으로 병세가 진행될수록 ARD1의 발현량이 증가함을 확인한 도이다.
도 13은 이형성 결절 환자 (DN)와 간암 환자 (HCC)의 ARD1 발현 정도를 비교하였을 때, 간암 환자의 ARD1 과발현 정도가 이형성 결절 환자에 비하여 더 높다는 사실을 확인한 도이다.
도 14는 이형성 결절의 분화도 (grade)에 따라 ARD1의 발현 정도를 관찰하였을 때, 고분화 이형성 결절 (High-grade DN)에서 ARD1의 발현 비율이 유의하게 높음을 확인한 도이다.
도 15는 quantitative RT-PCR을 통하여 혈액 샘플에서 ARD1 mRNA의 레벨을 확인한 결과, 대조군에 비하여 간암 환자에게서 상기 ARD1 mRNA의 레벨이 전반적으로 높음을 나타내는 도이다.

본 발명자들은 간세포암종 환자의 종양 조직 및 종양 주변 조직을 분석하고, 정상인과 비교하여 간암환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인함으로써, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명자들은, ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자가 종양 주변 조직에 비해 종양 조직에서 높게 발현되는 점 및 정상인과 비교하여 간암환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인할 수 있었으며, 상기 ARD1 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.

본 발명의 일 실시예에서는, 16명의 간암환자들로부터 간 조직 샘플을 얻어 간 종양 조직에서 특이적으로 ARD1의 발현이 증가한다는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 면역화학염색 방법을 통하여 ARD1의 발현 레벨을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 간암 수술 후의 ARD1 발현 레벨을 확인하여 ARD1과 간암의 재발률 및 간암 환자의 생존율 사이의 관련성을 분석하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 간암의 진행 단계에 따라 ARD1의 발현 레벨이 증가한다는 것을 확인하였으며(실시예 4 참조), 또한, quantitative RT-PCR을 통하여 혈액 샘플에서 ARD1 mRNA 레벨을 확인한 결과, 간암 환자의 ARD1 발현 레벨이 높다는 사실을 확인하였다(실시예 5 참조).

따라서 본 발명에 따른 ARD1 유전자의 발현 레벨 측정을 통하여 간암을 조기에 진단할 수 있으며, 혈액 샘플을 사용하는 간암 진단 키트를 개발하는 등 간암의 진단이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간암 진행 단계 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서, "진단"이란 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 진행 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

본 발명에서, "예후측정"이란 간암으로 진단 후 치료를 받고 회복 여부를 판별하는 것을 포함하는 것이다.

또한, "진단용 마커 (diagnosis marker)"란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암 세포에서 발현량이 증가하는 ARD1 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 ARD1 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 ARD1 유전자의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 상기 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지 (Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

본 발명의 유전자는 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 이때, 인간 대상체는 간암이 발병했을 것으로 의심되는 사람, 간염, 간경화 환자, 또는 의심되지 않는 사람으로 간암 진단 여부가 필요한 사람을 포함한다.

본 발명에서 "생물학적 시료"는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생물학적 시료에서 존재하는 ARD1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 증가된 경우, 간암이 진행된 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에서 "유전자 발현량 측정"이란 간암의 진행 여부를 확인하기 위하여 간 조직 세포에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 유전자의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에서 "단백질 발현량 측정"이란 간암의 진행 여부를 확인하기 위하여 간 조직 세포에서 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서 "검출"이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명에서 "이형성 결절"이란, 1994년 world congress of gastroenterology에서 working international party의 토의를 거쳐 제정한 것으로서, 이형성 결절 (dysplastic nodule; DN)은 현재로서는 양성인지 악성인지 확실히 결정하기 어려우나 앞으로 간세포 암종이 발생될 가능성이 높다는 생물학적 특성에 중점을 둔 명칭이다. 이형성 결절은 이형성을 동반한 장경 1mm 이상의 간의 결절성 병변으로 확실한 악성의 조직학적 소견은 없으며 대부분 간경변증에서 발생한다. 육안 소견상 이형성 결절은 대부분 주위 간조직과 색, 성상 등이 틀리며 절단면이 불룩하게 나오는 특징을 보이며, 이형성 병소 (dysplastic foci)는 장경 1mm 이하의 간세포 군집으로 이형성은 관찰되나 확실한 악성의 조직학적 소견은 없는 것을 지칭하는데, 장경 1mm 이상은 이형성 결절로, 그 이하는 이형성 병소로 정의함으로써 이형성 결절을 진단 시 병변의 크기는 중요성이 줄어들었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 간암 조직 및 간암 주변 조직에서의 ARD1 발현 레벨 확인

1-1. 시료의 준비 (조직 샘플)

16명의 환자들로부터 간 조직 샘플을 얻었다. 본 실시예에서 사용된 상기 조직 샘플들은 서울아산병원 임상연구심의위원회의 승인을 받은 것이며, 헬싱키 선언의 요구에 부합되도록 사전에 참가자들로부터 동의를 받았다. 각 환자의 특성치는 하기 표 1에 나타내었다.

항목	특성치
연령 (년, 평균±SD)	59 ± 11.5
성별 (M:F)	12 : 4
간경변 유/무	7/8
원인 (HBV/HCV/NBNC)	12/1/3
HCC 크기 (cm, rnage)	1.4 ~ 11.8

*간암 환자 (총 16명) 특성치

1-2. 간암 조직에서의 ARD1 발현 증가 확인

ARD1 (Arrest-defective 1 protein)의 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서와 같이 간암 환자 간암 조직 및 간암 주변 조직을 채취하여 하기와 같이 실험하였다.

분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직을 세포 용해 버퍼 (lysis buffer)에서 균일화하여 단백질을 추출하고 BCA assay로 정량하였다. 각 샘플당 40 μg의 단백질을 95 ℃에서 5 분간 가열하여 변성 (denaturation) 시킨 후, SDS-PAGE 전기영동법으로 분리하였다. 이를 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에 옮긴 후 ARD1 항체를 1:3000의 비율로 희석하여 4 ℃에서 16 시간, HRP 태그 된 2차 항체를 상온에서 1 시간 반응시키고, 형광이미지 분석기 (LAS-4000)로 HRP 활성을 측정하였다. Image J 프로그램을 이용하여 촬영된 ARD1 밴드의 덴시토메트리 (densitometry)를 측정하여 ARD1의 발현량을 정량화 하였으며, 같은 방법으로 빈쿨린 (vinculin)을 정량하여 표준화하였다.

그 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 간암 주변 조직에 비해 간암 조직에서 ARD1의 발현이 증가하며, ARD1의 발현 증가폭이 클수록 간세포암종의 미세혈관성 침입 (microvascular invasion)이 증가하는 경향을 확인하였다.

실시예 2. 면역화학염색 방법을 통한 ARD1 발현 레벨 확인

면역화학염색(immunohistochemical staining)을 이용해 ARD1의 발현 레벨을 확인하기 위하여, 실험 대상자들의 tissue microarray block 조직에서 OptiView DAB IHC Detection Kit (Ventana Medical System)를 이용하여 Bench Mark XT automatic immunostaining device (Ventana Medical System, Tucson, AZ)에서 제조업체의 지침에 따라 ARD1 항체 (Ab155687, abcam, CAMBRIDGE, UK)의 면역화학염색을 시행하였다. 각 조직의 절편 (4 ㎛)을 실레인 처리된 유리 슬라이드 상에 붙인 후, 실온에서 10분간, 65°C 인큐베이터에서 20분간 건조시켰다. 그 후, CC1 buffer를 32분간 처리한 다음, ARD1 항체를 이용하여 조직표본염색장치 (autoimmunostainer)에서 16분간 염색시켰다.

상기와 같이 면역화학염색을 시행한 후, ARD1 면역염색의 강도는 전체 세포 중 면역 염색 양성을 보이는 세포의 비율로 결정하였는데, 모든 세포가 전혀 염색되지 않는 경우는 none; 일부의 세포가 양성 소견을 보이지만, 그 비율이 1/3을 넘지 않는 경우는 1+(+); 전체의 1/3에서 2/3사의 비율을 보이는 경우를 2+ (++); 2/3이상 세포가 면역 화학 염색에서 양성 소견을 보이는 경우를 3+(+++)로 정의하였다.

실시예 3. ARD1 발현 레벨과 간암 수술 후 재발률 및 생존율 사이의 관련성 분석

3-1. 간암 환자들의 ARD1 발현 레벨 확인

조직학적으로 간세포암종으로 확진된 698명의 환자들을 대상으로 ARD1 발현 레벨을 확인하였는데, 이중 162명은 간이식을 받았으며 536명은 근치적 간절제술을 받았다. 도 3 및 도 4는 실험 대상자인 환자들 총 698명의 clinical characteristics과 tumor characteristics을 각각 나타낸 것이다. 간세포암종의 특성과 ARD1 면역화학염색 발현정도 사이의 연관성에 대해 평가하기 위하여, 상기 실험 대상자들의 간세포암종 조직을 이용해 실시예 2에 기재된 방법으로 모든 간세포암종 tissue microarray block 조직에서 ARD1 항체 (Ab155687, abcam, CAMBRIDGE, UK)의 면역화학염색을 시행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 환자별 간세포암종 조직에서의 ARD1 발현 정도가 상이하였으며, ARD1 발현 정도에 따라 실험대상자들을 네 개의 그룹으로 나눌 수 있었다(-, nothing; +, <1/3; ++, 1/3 ~ 2/3; +++, >2/3). 도 6은 상기와 같이 간세포암종 조직에서 살펴 본 ARD1의 발현 레벨을 도식화하여 나타낸 것이다.

3-2. 간암 수술 후 ARD1 발현 레벨 확인

ARD1 발현 정도와 간암 환자들의 수술 후 간암의 재발 여부 및 생존율 사이의 관련성을 분석하기 위하여, 실험 대상자들을 상대로 간암 수술 후 ARD1 발현 레벨을 확인하였다.

그 결과, 실시예 2에 기재된 방법에 따라 면역화학염색 한 조직에서 미세혈관 침윤 (microvascular invasion; MVI) 존재 여부에 따른 ARD1 발현 정도를 비교하였을 때, 미세혈관 침윤이 존재하는 경우, ARD1 발현이 높은 경향을 보였다(도 7 참조). 또한, 면역화학염색을 시행한 간암조직에서 ARD1 발현 정도와 간암 분화도와의 관계를 비교하였을 때, 분화도가 좋지 않은 간암에서 ARD1 과발현 정도가 높은 경향을 보였다(도 8 참조).

한편, 실험 대상자 중 간이식을 받았던 경우를 제외하고, 근치적 간절제술을 시행 받았던 536명의 간세포암종 환자들만을 대상으로 간세포암종 조직에서의 ARD1 발현정도와 수술 후 재발률을 분석한 결과, 간세포암종 조직에서 ARD1의 발현이 높은 그룹에서 수술 후 재발률(cumulative recurrence rate)이 높은 경향을 확인하였으며(도 9 참조), 또한, ARD1의 발현이 높은 그룹에서 간암 수술 후 생존율(survival rate)이 낮은 경향을 확인하였다(도 10 참조).

상기 결과들을 종합하면, 회복도가 좋지 않은 간암 환자들에게서 ARD1의 발현량이 높다는 것을 관찰할 수 있으므로, 이는 ARD1의 발현정도와 간암의 분화도, 재발률, 및 생존율과의 관련성이 있음을 시사한다.

실시예 4. 간암의 진행 단계에 따른 ARD1 발현 레벨 확인

간암의 전단계인 이형성 결절 (displastic nodule; DN)에서의 ARD1 레벨을 간 정상 조직 (Normal liver) 및 간암 조직 (hepatocellular carcinoma; HCC)과 비교하기 위하여, 조직학적으로 확진된 이형성 결절 환자 51명 [저분화 이형성 결절 (Low-grade DN) 20명 (39%); 고분화 이형성 결절 (High-grade DN) 31명 (61%)] 의 ARD1 발현 정도를 평가하였으며, 이와 함께 226명의 간세포암종 환자들 및 4명의 정상인의 간조직에서의 ARD1 발현정도를 비교 분석하였다. 도 11은 상기 실험 대상자들의 clinical characteristics을 나타내는 도이다.

간암은 저분화 이형성 결절 (Low-grade displastic nodule)에서 고분화 이형성 결절 (High-grade displastic nodule)을 거쳐 간암으로 여러 단계에 걸쳐서 진행되는데, 상기 과정에서 종양 세포는 분화된 세포에서 점차 더 미분화되는 탈분화(dedifferentiation)가 단계적으로 서서히 일어나고, 이에 따라 악성도는 점차 증가하여, 미세혈관 침윤(microvascular invasion)이 존재하여 전이도가 높으며 분화도가 좋지 않은 간암으로 발전하게 된다.

이에 상기 실시예 2의 방법에 따라, 면역화학염색을 시행하여 간암의 진행 단계에 따른 ARD1의 발현 레벨을 분석한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 정상조직 (Normal)에서 이형성 결절 (DN), 그리고 간암 (HCC)으로 간암이 진행될수록 ARD1의 발현량이 증가함을 확인하였다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 이형성 결절 환자와 간암 환자의 ARD1 발현 정도를 비교하였을 때, 간암 환자의 ARD1 과발현 정도가 이형성 결절 환자에 비하여 더 높다는 사실을 관찰할 수 있었다.

아울러, 도 14에 나타낸 바와 같이, 이형성 결절의 분화도 (grade)에 따른 ARD1의 발현 정도를 관찰하였을 때, 고분화 이형성 결절 (High-grade DN)에서 ARD1의 발현 비율이 유의하게 높다는 사실을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 종합하면, 간 정상조직에서 이형성 결절, 그리고 간암조직으로 점차 병세가 진행돼 간암이 악성화 되어 갈수록 ARD1의 발현량이 높다는 사실을 관찰할 수 있는바, 이는 ARD1 발현 레벨을 측정하여 이형성 결절의 분화 정도를 판정하고, 간암을 이형성 결절 단계에서 조기에 진단하는 등, ARD1을 간암 진행 단계 진단의 용도로 이용할 수 있음을 시사한다.

실시예 5. 혈액 샘플에서의 ARD1 발현 레벨 확인

상기 실시예 2의 방법에 따른 면역화학염색 방법뿐만이 아니라, 혈액 샘플을 통해서도 ARD1 발현 레벨을 관찰하여 간암을 진단할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

먼저, 혈액 시료를 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 3개의 층 [hematocrit (아래층), buffy coat (중간층), plasma (상층)]으로 분리하였다. 그 다음 상층 혈장을 제거한 후, buffy coat를 조심스럽게 분리하여 1.5ml 튜브에 옮겼다. 분리한 buffy coat를 RBC lysis buffer에 현탁 시켜, 섞여 있는 적혈구를 용해시킨 후, 다시 2500 rpm에서 5분간 원심분리 하여 RBC lysis buffer를 제거하고, 세포 펠렛 (pellet)을 얻었다. 이 pellet을 TRIzol reagent로 용해하여 RNA를 분리한 후, 2ug의 RNA를 MMLV reverse transcriptase (Promega)로 역전사하여, cDNA를 얻어내었다. 그 후, StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems)를 사용하여, quantitative real-time PCR을 수행해 mRNA 상대량 (Relative quantity)을 측정하였다. mRNA 상대량은 GAPDH로 표준화하였다.

이와 같이 혈액 샘플에서 quantitative RT-PCR을 통하여 ARD1 mRNA 레벨을 확인한 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 간암 환자에서 ARD1 mRNA 레벨이 전반적으로 높음을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, 간암 진단 키트를 개발하는데 혈액에서 검출한 ARD1 발현 레벨을 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R & DB FOUNDATION THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker <130> MP17-118 <150> KR 1020160116510 <151> 2016-09-09 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1136 <212> DNA <213> Arrest-defective 1 protein <400> 1 gaccggctcc gcgcattggc ccgccccgtg cgctggcctg tcccgcgcat tggccaagcg 60 gccgggagga cgggcccggc ggccgtgcac ttccggccgg tggccggccc ggcgcgcacc 120 gccccttccg ccgtcgccca gcgagcccag ctccggtccc agccccggcc gtcccggcgt 180 cgcttcggag cgcggcggca gctgactgcg ccttcacgat ccgctgggac ccgcgagccc 240 cgccgccgtt atgaacatcc gcaatgcgag gccagaggac ctaatgaaca tgcagcactg 300 caacctcctc tgcctgcccg agaactacca gatgaaatac tacttctacc atggcctttc 360 ctggccccag ctctcttaca ttgctgagga cgagaatggg aagattgtgg ggtatgtcct 420 ggccaaaatg gaagaggacc cagatgatgt gccccatgga catatcacct cattggctgt 480 gaagcgttcc caccggcgcc tcggtctggc tcagaaactg atggaccagg cctctcgagc 540 catgatagag aacttcaatg ccaaatatgt ctccctgcat gtcaggaaga gtaaccgggc 600 cgccctgcac ctctattcca acaccctcaa ctttcagatc agtgaagtgg agcccaaata 660 ctatgcagat ggggaggacg cctatgccat gaagcgggac ctcactcaga tggccgacga 720 gctgaggcgg cacctggagc tgaaagagaa gggcaggcac gtggtgctgg gtgccatcga 780 gaacaaggtg gagagcaaag gcaattcacc tccgagctca ggagaggcct gtcgcgagga 840 gaagggcctg gctgccgagg atagtggtgg ggacagcaag gacctcagcg aggtcagcga 900 gaccacagag agcacagatg tcaaggacag ctcagaggcc tccgactcag cctcctagag 960 cctgccccat cccctcctca ccccacgagc tttcacaata aattcgctcc gtggcactgg 1020 ggaactttgt gtgtgagcgc gcgcacattt agagggtgtg tttctccagg tcctctggtg 1080 gggatgtgag ccttggcctt ttgacccaga gcatcctgaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1136

Claims

ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ARD1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 키트.
제1항에 있어서,
상기 ARD1 유전자의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물.
ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 예후예측용 키트로서,
상기 간암의 예후측정은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 예후예측용 키트:
a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계.
제6항에 있어서,
상기 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 간암 예후예측용 키트.
a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법.
제8항에 있어서,
상기 단백질의 발현량을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법.
피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법.
ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는데 사용되는, 간암 진단용 키트로서,
상기 간암 진단을 위하여 피검체 유래의 혈액 샘플을 이용하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단용 키트.