CN109689895A - 作为肝癌预后测定或诊断用标志物的ard1的用途 - Google Patents

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Abstract

肝细胞癌肿(hepatocellular carcinoma,HCC)分阶段发展，慢性肝病产生的异型结节，特别是高分化异型结节作为癌前病变，可视为多阶段肝癌发生过程的早期变化。经过上述异型结节阶段之后，其恶性程度逐渐增加，并会发展成为转移度高且分化程度差的肝癌。因此，最近正在集中努力攻关对肝癌进行早期诊断。本发明涉及一种肝癌阶段诊断用组合物及肝癌诊断试剂盒，其能够在早期对肝癌进行有效诊断及预测。依据本发明，通过对ARD1表达水平进行分析，能够在早期对肝癌进行诊断及应对，并掌握肝癌的发展阶段。

Description

作为肝癌预后测定或诊断用标志物的ARD1的用途
技术领域
本发明涉及一种肝癌发展阶段诊断用组合物及肝癌诊断试剂盒，其能够在早期对肝癌进行有效的诊断及预测。更具体地，本发明人确认到与正常人相比肝癌患者的ARD1表达水平高的事实。依据本发明，通过对ARD1表达水平进行分析，就能够在早期对肝癌进行诊断，并掌握肝癌的发展阶段。
背景技术
肝癌或肝细胞癌(hepatocellular carcinoma；HCC)是世界上第五大常见癌症。在国内，据2013年统计厅资料显示，癌症导致死亡病例的22.6％是因肝癌引起，排在癌症致死原因的第4位。肝细胞癌肿最优选的治疗方法就是手术，但是无法切除的肿瘤大小及数量、肝功能下降、多种肝内或远程转移等因素在肝细胞癌肿患者能否实施手术及术后复发方面作用为主要的限制要素。目前，已经研究并分离出了与这种癌症的多种增殖及转移相关的蛋白质。
特别是，肝细胞癌多发于携带肝炎病毒或者酒精肝、肝硬化等危险因素的患者，利用早期诊断标志物对高危人群实施选择性监测(surveillance)的对象比较明确。实际上，以6个月为间隔实施的早期诊断提高了肝癌患者的生存率(死亡率下降37％)。
目前，尚未开发出能够在早期从正常人中准确发现肝癌的生物标志物检查，用于对高危人群中非浸润性早期肝癌诊断的检查方法就是血清甲胎蛋白(α-fetoprotein；AFP)检查。AFP的参考值在研发当时确定为20ng/mL，以确保其灵敏度与特异性都能够达到良好水平。但是，在这种情况下，灵敏度只能达到60％，如果依据当前国际学会的肝癌诊断指南以200ng/mL为标准对肝癌进行诊断，则特异性虽有所升高，但是灵敏度却只有22％。现有研究结果表明，AFP整体上具有约66％的灵敏度与82％的特异性，因此在对所有肝癌患者进行诊断方面具有局限性。
此外，虽然尚未确立为诊断标准，但是作为有助于肝癌诊断的血清标志物有Descarboxyprothrombin(DCP)、Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II(PIVKA-II)、糖基化AFP占总AFP(L3fraction)的比例分布、α-fucosidase、glypican 3、HSP-70等。但是，大部分分别只具有作为预后因素的意义，但当将其单独使用时，其准确性低，目前尚不能用于筛查，可以说利用单一血清学标志物对肝癌进行早期诊断已经达到了极限。同时，实际上在可以采用手术或者高频热疗术等根治性治疗阶段被诊断出的患者仅仅占全部肝癌患者的30％左右(参见美国公开专利公报第2010/0304372号)。
据报告，Arrest-defective 1protein(ARD1)在多种癌症中其表达增加，并参与癌细胞增殖及癌血管新生。但是，至于ARD1对肝细胞癌肿患者的癌的恶化、浸润、复发及生存产生何种作用，目前尚无相关具体报告。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明就是为解决现有技术存在的上述问题而研发的。本发明人通过对肝细胞癌肿患者的肿瘤组织及肿瘤周边组织进行分析，确认到与正常人相比肝癌患者的ARD1表达水平高的事实，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种肝癌发展阶段诊断用组合物及肝癌发展阶段诊断用试剂盒，其包含对ARD1(Arrest-defective 1protein)基因的水平或ARD1蛋白水平进行测定的物质。
本发明的另一个目的在于，提供一种肝癌预后预测用试剂盒及用于肝癌预后测定的信息提供方法，其包括针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1protein)蛋白表达量的步骤。
本发明的又一个目的在于，提供一种用于肝癌诊断的信息提供方法及肝癌诊断用试剂盒，其包括对源于受检体的血液样本中ARD1(Arrest-defective1protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的步骤。
但是，本发明所要解决的技术问题并非仅仅局限于上面提到的课题，关于尚未提到的其它课题，本领域的技术人员通过以下记载就会有明确的了解。
解决技术问题的方法
为了实现上述目的，本发明提供一种肝癌发展阶段诊断用组合物及包含该组合物的肝癌发展阶段诊断用试剂盒，其包含对ARD1(Arrest-defective 1protein)基因的水平或ARD1蛋白的水平进行测定的物质。
作为本发明的一个实现例，所述ARD1基因具有序列号为1的碱基序列。
作为本发明的另一实现例，测定所述ARD1基因水平的物质是可以使A RD1基因扩增的引物或探针。
作为本发明的又一实现例，测定所述ARD1蛋白水平的物质是一种能够特异识别ARD1蛋白的抗体。
另外，本发明提供的肝癌预后预测用试剂盒，其特征在于，包括：a)针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1prot ein)蛋白表达量的步骤；b)将所述a)步骤肝癌组织中的ARD1蛋白表达量与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量进行比较的步骤；以及c)基于所述b)步骤中ARD1蛋白表达量的比较，当与肝癌周边组织中ARD1蛋白的表达量相比肝癌组织中的ARD1蛋白的表达量越大时，判定为肝癌预后越差的步骤。
作为本发明的另一实现例，测定所述ARD1蛋白表达量的物质是对AR D1蛋白进行特异识别的抗体。
另外，本发明提供的用于肝癌预后测定的信息提供方法，包括：a)针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1protei n)蛋白表达量的步骤；b)将所述a)步骤肝癌组织中的ARD1蛋白表达量与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量进行比较的步骤；c)基于所述b)步骤中A RD1蛋白表达量的比较，当与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量相比肝癌组织中ARD1蛋白表达量越大时，判定为肝癌预后越差的步骤。
作为本发明的又一实现例，测定所述蛋白表达量的方法可以是从由蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定；enzyme linked immunosorbent assay)、放射免疫分析法(RIA:Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodi ffusion)、双向(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、补体固定分析法(Co mplement Fixation Assay)、流式细胞分析法(Fluorescence Activated Cell So rter,FACS)及蛋白芯片(protein chip)构成的组中选择的1种以上的方法，但并非仅限定于此。
作为本发明的又一实现例，测定所述基因表达水平的方法可以是从由逆转录聚合酶反应(RT-PCR)、竞争性逆转录聚合酶反应(Competitive RT-PC R)、实时逆转录聚合酶反应(Realtime RT-PCR)、RNase保护分析法(RPA；R Naseprotection assay)、诺森印迹法(Northern blotting)及DNA芯片构成的组中选择的1种以上的方法。
另外，本发明提供的用于肝癌诊断的信息提供方法，包括：对源于受检体的血液样本中ARD1(Arrest-defective 1protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的步骤。
另外，本发明提供肝癌诊断用试剂盒，该试剂盒为用于对ARD1(Arrest-defective1protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的肝癌诊断用试剂盒，其特征在于，为了执行所述肝癌诊断而采用源于受检体的血液样本。
进一步地，本发明提供的肝癌发展阶段诊断方法，包括：将所述肝癌发展阶段诊断用组合物向个体施用的步骤。
此外，本发明提供一种测定ARD1(Arrest-defective 1protein)基因水平或ARD1蛋白水平的物质在诊断肝癌的发展阶段中的用途。
发明的效果
肝细胞癌肿(hepatocellular carcinoma,HCC)分阶段发展，慢性肝病产生的异型结节，特别是高分化异型结节作为癌前病变，可视为多阶段肝癌发展过程的早期变化。经过上述异型结节阶段之后，其恶性程度逐渐增加，并会发展成转移度高且分化程度较差的肝癌。因此，最近正在集中努力攻关对肝癌进行早期诊断。本发明涉及一种肝癌发展阶段诊断用组合物及肝癌诊断试剂盒，其能够在早期对肝癌进行有效的诊断及预测。依据本发明，如果对A RD1表达水平进行分析，就能够在早期对肝癌进行诊断且进行应对，并掌握肝癌的发展阶段。
附图说明
图1是显示肝癌患者的肝癌组织(T)及肝癌周边组织(NT)中ARD1(Arres t-defective 1protein)表达的示意图。
图2是将肝癌患者的肝癌组织(T)及肝癌周边组织(NT)中ARD1(Arrest-defective 1protein)表达量进行量化显示的示意图。
图3是为了分析ARD1表达水平与肝癌术后复发率及生存率之间的关联性而显示实验对象者即总共698名患者临床特征(clinical characteristics)的示意图；图4是显示所述实验对象者即患者的肿瘤特征(tumor characteristi cs)的示意图。
图5是对所述698名实验对象者的肝细胞癌肿组织实施免疫化学染色并根据ARD1表达程度将实验对象者显示为四个组的示意图；图6是将从上述肝细胞癌肿组织中观察到的ARD1表达水平进行图示化显示的示意图。
图7是显示当实施免疫化学染色的组织中存在微血管侵犯(microvascula rinvasion；MVI)情况时ARD1表达呈现高倾向的示意图。
图8是显示分化程度差的肝癌中ARD1超表达程度呈现高倾向的示意图。
图9是显示以接受过根治性肝切除术的536名肝细胞癌肿患者为对象其肝细胞癌组织中ARD1表达高的组术后复发率(cumulative recurrence rate)呈现高倾向的示意图；图10是显示以所述肝细胞癌肿患者为对象其肝细胞癌组织中ARD1表达高的组肝癌术后生存率(survival rate)呈现低倾向的示意图。
图11是为了将肝癌前阶段即异型结节(displastic nodule；DN)中的ARD1水平与正常肝组织及肝癌组织比较而显示实验对象者临床特征(clinical c haracteristics)的示意图。
图12是确认病情从正常组织(Normal)发展到异型结节(DN)以及肝癌(hepatocellular carcinoma；HCC)时ARD1的表达量越增加示意图。
图13是确认将异型结节患者(DN)与肝癌患者(HCC)的ARD1表达程度进行比较时肝癌患者的ARD1超表达程度比异型结节患者更高事实的示意图。
图14是确认根据异型结节的分化程度(grade)观察ARD1的表达程度时，在高分化异型结节(High-grade DN)中ARD1的表达比例明显地高的示意图。
图15是显示通过定量逆转录聚合酶反应(quantitative RT-PCR)对血液样本中ARD1mRNA水平确认的结果，与对照组相比肝癌患者的所述ARD1mRNA水平总体上更高的示意图。
具体实施方式
本发明人通过对肝细胞癌肿患者的肿瘤组织及肿瘤周边组织进行分析，并与正常人比较，确认肝癌患者ARD1表达水平更高的事实。在此基础上，完成了本发明。
下面，将对本发明进行详细说明。
本发明提供一种肝癌发展阶段诊断用组合物，其包含测定ARD1(Arrest-defective 1protein)基因水平或ARD1蛋白水平的物质。
本发明人确认了以下事实，即与肿瘤周边组织比较ARD1(Arrest-defecti ve1protein)基因在肿瘤组织中的表达水平更高，以及与正常人比较肝癌患者的ARD1表达水平更高，将所述ARD1基因的碱基序列用序列号1标示。
在本发明的一个实施例中，从16名肝癌患者中获取肝组织样本，确认了肝肿瘤组织中ARD1表达特异性地增加的事实(参照实施例1)。
在本发明的另一实施例中，通过免疫化学染色方法确认了ARD1的表达等级(参照实施例2)。
在本发明的另一实施例中，通过确认肝癌术后的ARD1表达等级，对A RD1与肝癌复发率及肝癌患者生存率之间的关联性进行了分析(参照实施例3)。
在本发明的另一实施例中，确认了随着肝癌发展阶段ARD1表达等级增加(参照实施例4)。另外，通过定量逆转录聚合酶反应(quantitative RT-PC R)确认了血液样本中ARD1mRNA等级。其结果表明，肝癌患者的ARD1表达等级高(参照实施例5)。
因此，依据本发明，通过测定ARD1基因的表达等级，可以在早期诊断出肝癌，以开发使用血液样本的肝癌诊断试剂盒等依据肝癌诊断所要求的多种目的及用途来使用。
因此，本发明提供一种肝癌发展阶段诊断用组合物及包含该组合物的肝癌发展阶段诊断用试剂盒，其包含测定ARD1(Arrest-defective 1protein)基因水平或ARD1蛋白水平的物质。
另外，本发明提供的肝癌预后预测用试剂盒，包括：a)针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1protein)蛋白表达量的步骤；b)将所述a)步骤肝癌组织中的ARD1蛋白表达量与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量进行比较的步骤；以及c)基于所述b)步骤中ARD1蛋白表达量的比较，当与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量相比肝癌组织中的ARD1蛋白表达量越大时，判定为肝癌预后越差的步骤。
另外，本发明提供的用于肝癌预后测定的信息提供方法，包括：a)针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1protei n)蛋白表达量的步骤；b)将所述a)步骤肝癌组织中的ARD1蛋白表达量与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量进行比较的步骤；c)基于所述b)步骤中A RD1蛋白表达量的比较结果，当与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量相比肝癌组织中的ARD1蛋白表达量越大时，判定为肝癌预后越差的步骤。
在本发明中，“诊断”是指确认病理状态。从本发明的目的来看，所述诊断是指通过确认是否有肝癌诊断标志物的表达而确认肝癌是否发展。另外，本发明中的诊断也包括以下内容，即通过确认是否有肝癌诊断标志物的表达及表达程度而对肝癌是否发病、病情发展及减轻等情况进行判断。
在本发明中，“预后测定”包括诊断为肝癌后接受治疗并判别是否康复。
另外，“诊断用标志物(diagnosis marker)”是指能够将肝癌细胞与正常细胞区分而进行诊断的物质，包括：肝癌细胞中比正常细胞呈现增加或减少的多肽或核酸(例如：mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖类(单糖类、双糖类、寡糖类等)等有机生物分子等。本发明提供的肝癌诊断用标志物可以是与正常细胞相比肝癌细胞中表达量增加的ARD1基因或蛋白质。优选地，所述ARD1基因具有用序列号1标记的碱基序列。
在本发明中，测定所述ARD1基因水平的物质可以是能够将ARD1基因扩增的引物或探针，测定所述ARD1蛋白水平的物质可以是对ARD1蛋白进行特异识别的抗体。
在本发明中，“引物”是带有短游离3末端羟基的核酸序列，意味着可以与互补模板(template)形成碱基对并发挥用于模板链复制起始点功能的较短核酸序列。引物可以在合适的缓冲液及温度条件、且存在用于聚合反应(即，DNA聚合酶或逆转录酶)的试剂及不同的4种核苷三磷酸的条件下开始DNA的合成。
在本发明中，“探针”是指与能够和mRNA构成特异性结合的短则几个碱基至长则数百个碱基相当的RNA或DNA等的核酸片断，通过标记(La belling)可以确认是否存在特定mRNA。探针可以制作成寡核苷酸探针、单链DNA(single stranded DNA)探针、双链DNA(double stranded DNA)探针、RNA探针等形态。合适的探针选择及杂交条件可以在本领域公知的基础上进行变更。
在本发明中。“抗体”是指针对抗原性部位指示的特异性蛋白质分子。从本发明的目的来看，抗体是指针对标志物蛋白质进行特异结合的抗体，包括：多克隆抗体、单克隆抗体及重组抗体。
本发明的基因其核酸序列已登记在基因银行中，因此本领域的技术人员可以基于所述序列对将这些基因的特定区域特异扩增的反义寡核苷酸、引物对或探针进行设计。
本发明的反义寡核苷酸、引物或探针可以采用固相亚磷酰胺法或其它广为熟知的方法通过化学方式合成。这种核酸序列还可以利用本领域公知的多种方法进行变更，作为这种变更的非限制性实例有：甲基化、加帽、向天然核苷酸一种以上同系物的置换，以及核苷酸间的变形，例如：向不带电的连接体(如：甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的连接体(如：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的变形。
另外，本发明提供的用于肝癌诊断的信息提供方法，包括：对源于受检体的血液样本中ARD1(Arrest-defective 1protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的步骤。
另外，本发明提供的肝癌诊断用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒作为用于对ARD1(Arrest-defective 1protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的肝癌诊断用试剂盒，为了执行所述肝癌诊断而采用源于受检体的血液样本。
本发明的方法以哺乳类特别是人类为对象。在这种情况下，人类对象包括：怀疑患上肝癌的人、肝炎与肝硬化患者、或未怀疑患病但需要诊断是否患上肝癌的人。
在本发明中，“生物学样本”可以由组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液及尿构成，但并非仅限定于此。另外，如果存在于所述生物学样本中的ARD1基因的表达量或蛋白质的量与对照组相比有所增加，就可以判定已经发展为肝癌。
在本发明中，“基因表达量测定”是指为了确认肝癌是否发展而对肝组织细胞中是否存在所述基因的mRNA与其表达程度进行确认的过程，其通过测定mRNA的量而实现。其分析方法，例如有逆转录聚合酶反应(RT-PC R)、竞争性逆转录聚合酶反应(Competitive RT-PCR)、实时逆转录聚合酶反应(Realtime RT-PCR)、RNase保护分析法(RPA；RNaseprotection assay)、诺森印迹法(Northern blotting)、DNA芯片等，但并非仅限定于此。
在本发明中，测定基因水平的制剂优选为反义寡核苷酸、引物对或探针。在本发明中，“反义”是指反义低聚物通过形成沃森-克里克碱基对与RNA内的目标序列杂交而带有核苷酸碱基的序列及次单元间的骨架的低聚物，其允许在目标序列内由mRNA与RNA形成典型的低聚物异源二聚体。低聚物针对目标序列具有精确的序列互补性或近似互补性。所述反义低聚物可以阻断或阻碍mRNA的翻译，并改变生产mRNA剪接变异体的mRNA处理过程。
在本发明中，“蛋白质表达量测定”是指为了确认肝癌是否发展而对肝组织细胞中是否存在由本发明的基因表达的蛋白质与其表达程度进行确认的过程，其通过测定蛋白质的量而实现。其分析方法有：蛋白质印迹法、E LISA(酶联免疫吸附测定；enzyme linkedimmunosorbent assay)、放射免疫分析法(RIA:Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、双向(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、补体固定分析法(ComplementFixa tion Assay)、流式细胞分析(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)、蛋白芯片(protein chip)等，但并非仅限定于此。在本发明中，测定蛋白质表达水平的制剂优选为抗体。
在本发明中，“检出”既包括定量及/或定性分析，也包括存在、不存在的检出及表达量检出，这种方法是本领域众所周知的，本领域的技术人员可以选择适当的方法实施本发明。
在本发明中，“异型结节”是1994年在世界胃肠病学大会(world congress ofgastroenterology)上经过“working international party”讨论后制定的。异型结节(dysplastic nodule；DN)是将重点放在当前难以准确无误地确定其是良性还是恶性，但是以后发展成为肝细胞癌肿的可能性高的生物学特性而取得名称。异型结节除了异型性以外，同时还伴随有长径达到1mm以上的肝结节性病变，没有组织学上的确实为恶性的见解，大部分肝硬变中会发生。从肉眼观察来看，异型结节与大部分周边肝组织在颜色、性状等方面就不一样，其截面鼓凸。异型性病灶(dysplastic foci)是指长径为1mm以下的肝细胞群落，虽能观察到异型性，但没有组织学方面确定为恶性的见解。长径为1mm的是异型结节，其以下则定义为“异型性病灶”。因此，在对异型结节进行诊断时，病变的大小的重要性降低了。
下面，为了有助于对本发明进行理解，列举了优选的实施例。但是，列举以下实施例的目的是为了能够更加容易地理解本发明，下述实施例并不限定本发明的范围。
[实施例]
实施例1.确认肝癌组织及肝癌周边组织中的ARD1表达等级
1-1、准备试料(组织样本)
从16名患者中获取了肝组织样本。本实施例中使用的所述组织样本获得了首尔牙山医院临床研究审议委员会的承认。为确保符合《赫尔辛基宣言》的要求，事先征得了参与者的同意。各患者的特性值如下面表1所示。
【表1】
*肝癌患者(总共16名)特性值
1-2.确认肝癌组织中ARD1表达增加
为了确认ARD1(Arrest-defective 1protein)的表达，如上述实施例1-1所述，采集肝癌患者肝癌组织及肝癌周边组织进行以下实验。
将分离的肝癌组织及肝癌周边组织在细胞裂解液(lysis buffer)中进行均匀化，提取出蛋白质，并用BCA assay进行定量。将每个样本中40μg的蛋白质在95℃条件下加热5分钟，使其变性(denaturation)。然后，再通过SDS-PAGE电泳法实施了分离。将其转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose membra ne)上之后，再将ARD1抗体按照1:3000的比例进行稀释，在4℃条件下放置16小时，将标记有HRP的2次抗体在常温条件下反应1小时，利用荧光图像分析仪(LAS-4000)测定了HRP活性。利用Image J程序对拍摄的ARD1带的密度(densitometry)进行了测定，将ARD1的表达量定量化。且采用相同的方法对黏着斑蛋白(vinculin)进行定量之后将其标准化。
其结果如图1及图2所示，可以确认，与肝癌周边组织相比，肝癌组织中ARD1的表达增加，且ARD1的表达增加幅度越大，肝细胞癌肿的微血管侵犯(microvascular invasion)就越呈现增加的倾向。
实施例2.通过免疫化学染色方法确认ARD1表达等级
为了通过免疫化学染色(immunohistochemical staining)确认ARD1的表达等级，在实验对象的组织微阵列块(tissue microarray block)组织中，利用OptiView DAB IHCDetection Kit(Ventana Medical System)在Bench Mar k XT自动免疫染色装置(automatic immunostaining device，Ventana Medica l System,Tucson,AZ)中按照制造商的指南对ARD1抗体(Ab155687,abcam,CAMBRIDGE,UK)实施了免疫化学染色。将各组织的切片(4μm)粘在用硅烷处理过的载玻片上，然后在室温条件下放置10分钟，接着在65℃的恒温箱进行20分钟的干燥。然后，再用CC1buffer处理32分钟，接着再利用A RD1抗体在组织标本染色装置(autoimmunostainer)中染色16分钟。
实施了如上所述的免疫化学染色之后，ARD1免疫染色的强度由所有细胞中免疫染色呈阳性的细胞比例决定。所有细胞均未染色的情况定义为non e；有一部分细胞呈阳性，但其比例不超过1/3的情况定义为1+(+)；呈阳性细胞的比例达到全部细胞的1/3至2/3的情况定义为2+(++)；观察到2/3以上的细胞在免疫化学染色中呈阳性的情况定义为3+(+++)。
实施例3.分析ARD1表达等级与肝癌术后复发率及生存率之间的关联性
3-1.确认肝癌患者的ARD1表达等级
以通过组织学方法确诊为肝细胞癌肿的698名患者为对象，对其ARD1表达等级进行了确认。其中，162名接受了肝移植，536名接受了根治性肝切除手术。图3及图4分别显示了实验对象即总共698名患者的临床特征(c linical characteristics)与肿瘤特征(tumor characteristics)。为了对肝细胞癌肿的特性与ARD1免疫化学染色表达程度之间的关联性进行评估，利用所述实验对象的肝细胞癌肿组织按照实施例2中记载的方法在所有肝细胞癌肿组织微阵列块(tissue microarray block)组织中实施了ARD1抗体(Ab155687,abcam,CAMBRIDGE,UK)的免疫化学染色。
其结果如图5所示，不同患者肝细胞癌肿组织中的ARD1表达程度各异，根据ARD1表达程度可将实验对象分为四组(-,nothing；+,<1/3；++,1/3～2/3；+++,>2/3)。图6对从所述肝细胞癌肿组织中观察到的ARD1表达等级进行了图示化处理。
3-2.确认肝癌术后ARD1表达等级
为了对ARD1表达程度与肝癌患者术后肝癌是否复发及生存率之间的关联性进行分析，以实验参与者为对象，对肝癌术后ARD1表达等级进行了确认。
结果表明，按照实施例2中记载的方法，在实施了免疫化学染色的组织中比较根据微血管侵犯(microvascular invasion；MVI)存在与否的ARD1表达程度时，存在微血管侵犯的情况下，ARD1表达就呈现高的倾向(参照图7)。另外，在实施了免疫化学染色的肝癌组织中对ARD1表达程度与肝癌分化程度之间的关系进行比较时，在分化程度差的肝癌中ARD1超表达程度呈现高的倾向(参照图8)。
另外，实验对象中除了接受过肝移植的情况外，仅以接受过根治性肝切除手术的536名肝细胞癌肿患者为对象，对肝细胞癌肿组织中ARD1表达程度与术后复发率进行了分析，结果表明，肝细胞癌肿组织中ARD1表达高的组其术后复发率(cumulative recurrencerate)呈现高的倾向(参照图9)。另外，ARD1表达高的组其肝癌术后生存率(survival rate)呈现低的倾向(参照图10)。
综合上述结果可知，康复情况较差的肝癌患者，其ARD1表达量高。因此，这意味着ARD1的表达程度与肝癌的分化程度、复发率及生存率之间存在关联性。
实施例4.确认随肝癌发展阶段的ARD1表达等级
为了将肝癌的前阶段即异型结节(displastic nodule；DN)的ARD1等级与正常肝组织(Normal liver)及肝癌组织(hepatocellular carcinoma；HCC)进行比较，对通过组织学方法确诊的51名异型结节患者[低分化异型结节(Lo w-grade DN)20名(39％)；高分化异型结节(High-grade DN)31名(61％)]的A RD1表达程度进行了评估。同时，对226名肝细胞癌肿患者及4名正常人肝组织中的ARD1表达程度进行了比较分析。图11是显示所述实验对象临床特征(clinical characteristics)的示意图。
肝癌从低分化异型结节(Low-grade displastic nodule)到高分化异型结节(High-grade displastic nodule)再发展成为肝癌，经过多个发展阶段。在上述过程中，肿瘤细胞中按步骤逐渐发生从分化的细胞渐渐进一步未分化的脱分化(dedifferentiation)。因此，恶性程度也逐渐增加，从而存在微血管侵犯(mi crovascularinvasion)，其转移程度高，进而发展成分化程度差的肝癌。
因此，按照所述实施例2的方法，实施免疫化学染色而分析随肝癌的发展阶段的ARD1表达等级，其结果如图12所示，可以确认，从正常组织(N ormal)发展到异型结节(DN)再发展到肝癌(HCC)，即在这种肝癌的发展阶段其ARD1表达量在增加。另外，如图13所示，可观察到，如果将异型结节患者与肝癌患者的ARD1表达程度进行比较，肝癌患者的ARD1超表达程度比异型结节患者更高。
同时，如图14所示，如果观察根据异型结节的分化程度(grade)的ARD1表达程度，可以确认，在高分化异型结节(High-grade DN)中ARD1表达比例明显地高。
综合上述结果可知，病情逐渐从正常肝组织发展到异型结节再发展到肝癌组织的过程中，即肝癌越往恶性化发展时，ARD1的表达量就越高。这意味着，通过测定ARD1表达等级判定异型结节的分化程度，且在异型结节阶段对肝癌进行早期诊断，即可以将ARD1以肝癌发展阶段诊断的用途进行利用。
实施例5.确认血液样本中的ARD1表达等级
为了确认除了按照所述实施例2的方法的免疫化学染色方法之外，是否能够通过血液样本观察ARD1表达等级从而对肝癌进行诊断，进行了以下实验。
首先，将血液试料在2500rpm条件下离心分离5分钟，使其分离为3层[hematocrit(下层)、buffy coat(中间层)、plasma(上层)]。然后，将上层血浆除去，接着将白细胞层(buffy coat)小心分离并转移到1.5ml的试管中。然后，使分离的白细胞层(buffy coat)悬浮于RBC裂解缓冲液(RBC lysi s buffer)中，使夹杂的红细胞溶解。然后，再次在2500rpm条件下离心分离5分钟，将RBC裂解缓冲液(RBC lysis buffer)除去，获得细胞聚合体(pellet)。将所述聚合体(pellet)利用TRIzol试剂(TRIzol reagent)溶解，分离出RNA之后，将2ug的RNA利用MMLV逆转录酶(MMLV reverse tra nscriptase，Promega)实施逆转录，获得cDNA。然后，使用StepOnePlus rea l-time PCR system(Applied Biosystems)执行定量实时PCR(quantitative re al-time PCR)操作，并对mRNA相对数量(Relativequantity)进行了测定。将mRNA相对数量利用GAPDH实施了标准化处理。
如上所述，将血液样本通过定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)对A RD1mRNA等级进行了确认，其结果如图15所示，可以确认，与对照组相比，肝癌患者中ARD1mRNA等级整体较高。通过上述结果可以期待，开发肝癌诊断试剂盒时能够利用从血液中检出的ARD1表达等级。
上述对本发明进行的说明是示例性的。通过上述说明，具有本发明所属技术领域一般知识的技术人员完全可以在不偏离本发明技术思想或者不改变其必要特征的前提下，容易地变更为其它具体形态。因此，以上列举的实施例在各个方面都是示例性的，不能理解成是限定性的。
工业上的可利用性
本发明涉及一种肝癌阶段诊断用组合物及肝癌诊断试剂盒，其能够在早期对肝癌进行有效地诊断及预测。依据本发明，如果对ARD1表达水平进行分析，就能够在早期对肝癌进行诊断并进行应对，且掌握肝癌的发展阶段。
<110> 首尔大学校产学协力团
财团法人峨山社会福祉财团
蔚山大学校产学协力团
<120> 作为肝癌预后测定或诊断用标志物的ARD1的用途
<130> DFP19KR3543
<150> KR 10-2016-0116510
<151> 2016-09-09
<150> KR 10-2017-0049773
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<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1136
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Arrest-defective 1 protein
<400> 1
gaccggctcc gcgcattggc ccgccccgtg cgctggcctg tcccgcgcat tggccaagcg 60
gccgggagga cgggcccggc ggccgtgcac ttccggccgg tggccggccc ggcgcgcacc 120
gccccttccg ccgtcgccca gcgagcccag ctccggtccc agccccggcc gtcccggcgt 180
cgcttcggag cgcggcggca gctgactgcg ccttcacgat ccgctgggac ccgcgagccc 240
cgccgccgtt atgaacatcc gcaatgcgag gccagaggac ctaatgaaca tgcagcactg 300
caacctcctc tgcctgcccg agaactacca gatgaaatac tacttctacc atggcctttc 360
ctggccccag ctctcttaca ttgctgagga cgagaatggg aagattgtgg ggtatgtcct 420
ggccaaaatg gaagaggacc cagatgatgt gccccatgga catatcacct cattggctgt 480
gaagcgttcc caccggcgcc tcggtctggc tcagaaactg atggaccagg cctctcgagc 540
catgatagag aacttcaatg ccaaatatgt ctccctgcat gtcaggaaga gtaaccgggc 600
cgccctgcac ctctattcca acaccctcaa ctttcagatc agtgaagtgg agcccaaata 660
ctatgcagat ggggaggacg cctatgccat gaagcgggac ctcactcaga tggccgacga 720
gctgaggcgg cacctggagc tgaaagagaa gggcaggcac gtggtgctgg gtgccatcga 780
gaacaaggtg gagagcaaag gcaattcacc tccgagctca ggagaggcct gtcgcgagga 840
gaagggcctg gctgccgagg atagtggtgg ggacagcaag gacctcagcg aggtcagcga 900
gaccacagag agcacagatg tcaaggacag ctcagaggcc tccgactcag cctcctagag 960
cctgccccat cccctcctca ccccacgagc tttcacaata aattcgctcc gtggcactgg 1020
ggaactttgt gtgtgagcgc gcgcacattt agagggtgtg tttctccagg tcctctggtg 1080
gggatgtgag ccttggcctt ttgacccaga gcatcctgaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1136

Claims (13)

1.一种肝癌发展阶段诊断用组合物，其特征在于，
其包含对ARD1(Arrest-defective 1 protein)基因的水平或ARD1蛋白水平进行测定的物质。
2.根据权利要求1所述的肝癌发展阶段诊断用组合物，其特征在于，
所述ARD1基因具有序列号为1的碱基序列。
3.一种肝癌发展阶段诊断用试剂盒，其特征在于，
其包含权利要求1所述的组合物。
4.根据权利要求1所述的肝癌发展阶段诊断用组合物，其特征在于，
对所述ARD1基因的水平进行测定的物质为能够将ARD1基因扩增的引物或探针。
5.根据权利要求1所述的肝癌发展阶段诊断用组合物，其特征在于，
对所述ARD1蛋白水平进行测定的物质为能够特异识别ARD1蛋白的抗体。
6.一种肝癌预后预测用试剂盒，其特征在于，
其作为一种包含测定ARD1(Arrest-defective 1 protein)蛋白表达量的物质的肝癌预后预测用试剂盒，所述肝癌的预后测定包括以下步骤：
a)针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1protein)蛋白表达量的步骤；
b)将所述a)步骤肝癌组织中的ARD1蛋白表达量与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量进行比较的步骤；以及
c)基于所述b)步骤中ARD1蛋白表达量的比较，当与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量相比肝癌组织中ARD1蛋白表达量越大，判定为肝癌预后越差的步骤。
7.根据权利要求6所述的肝癌预后预测用试剂盒，其特征在于，
对所述ARD1蛋白表达量进行测定的物质是能够特异识别ARD1蛋白的抗体。
8.一种用于肝癌预后测定的信息提供方法，其特征在于，
包括：
a)针对从个体分离的肝癌组织及肝癌周边组织测定ARD1(Arrest-defective 1protein)蛋白表达量的步骤；
b)将所述a)步骤肝癌组织中ARD1的蛋白表达量与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量进行比较的步骤；以及
c)基于所述b)步骤中ARD1蛋白表达量的比较，当与肝癌周边组织中的ARD1蛋白表达量相比肝癌组织中ARD1蛋白表达量越大时，判定为肝癌预后越差的步骤。
9.根据权利要求8所述的用于肝癌预后测定的信息提供方法，其特征在于，
测定所述蛋白表达量的方法为从由蛋白质印迹法、ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)、放射免疫分析法(RIA: Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、双向(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、补体固定分析法(Complement Fixation Assay)、流式细胞分析法(Fluorescence Activated CellSorter, FACS)及蛋白芯片(protein chip)构成的组中选择的1种以上的方法。
10.一种用于肝癌诊断的信息提供方法，其特征在于，
包括：对源于受检体的血液样本中ARD1(Arrest-defective 1 protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的步骤。
11.一种肝癌诊断用试剂盒，其特征在于，
其作为一种用于对ARD1(Arrest-defective 1 protein)基因的mRNA或所述基因编码的蛋白表达水平进行测定的肝癌诊断用试剂盒，
为了执行所述肝癌诊断而采用源于受检体的血液样本。
12.一种肝癌发展阶段诊断方法，其特征在于，
包括：将包含测定ARD1(Arrest-defective 1 protein)基因水平或ARD1蛋白水平的物质的肝癌发展阶段诊断用组合物向个体施用的步骤。
13.一种物质在诊断肝癌发展阶段中的用途，其特征在于，
该物质测定ARD1(Arrest-defective 1 protein)基因水平或ARD1蛋白水平。
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