JP2004085305A - 癌の診断方法 - Google Patents

Abstract

【構成】患者由来の試料中のＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定し、それらの比に基づいて、癌の診断、癌の悪性度の判定および患者の予後を客観的に判定する方法を提供する。
【効果】ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６濃度比は、癌の進行度および悪性度、および患者の予後を反映してものである。ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６濃度比の相対的減少は癌疾患の存在、あるいは癌の悪性度がより高いこと、あるいは患者の予後がより乏しいことを示唆する。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の診断方法、および癌の悪性度あるいは癌患者の予後を判定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン１（ＩＬ−１）−インターロイキン６（ＩＬ−６）ネットワークは最も強力な炎症性サイトカインカスケードである。ＩＬ−１βはオートクリン的にＩＬ−６産生を誘導するので、ＩＬ−１βの生物学的効果は、細胞増殖のようなＩＬ−６により誘導されるいくつかの実験的効果とほぼ同じである（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８，　３１３２−４１，　１９９８、Ｃａｎｃｅｒ　８０，　４２１−３４，　１９９７、Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　８０，１５０６−１１，　１９９９、Ｈｅｍａｔｏｌ．　Ｏｎｃｏｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｎｏｒｔｈ．　Ａｍ　１３，　１１１７−２５，　１９９９、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　３１４２−９，　１９９８、Ｎａｔｕｒｅ　３３２，　８３−５，　１９８８、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２５０，　６０７−１０，
１９８９）。
【０００３】
ＩＬ−１−ＩＬ−６ネットワークはサイトカイン阻害物質であるインターロイキン１受容体アンタゴニスト（以下、ＩＬ−１ｒａと略記する。）および抗炎症性サイトカインであるインターロイキン１０（ＩＬ−１０）によりダウンレギュレーションを受ける。天然に存在する抗炎症性タンパクであるＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βがタイプＩおよびタイプＩＩ受容体へ結合するのを、アゴニスト活性や生物学的作用を発揮することなく、拮抗的に阻害する（Ｊ．　Ａｃｑｕｉｒ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃ．　Ｓｙｎｄ．　Ｈｕｍ．　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．　１６，　３４０−２，　１９９７、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９９，　２９３０−４０，　１９９７）。対照的に、ＩＬ−１０はＴリンパ球とマクロファージ両者の機能を抑制することによってＩＬ−６産生を間接的に阻害し、免疫反応および炎症反応に対する一般的な調節弁として働く（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　７７，　１３８−４７，　２０００、Ａｍ．　Ｊ．　Ｏｂｓｔｅｔ．　Ｇｙｎｅｃｏｌ　１７５，　１０５７−６５，　１９９６）。
【０００４】
ＩＬ−１−ＩＬ−６ネットワークは腫瘍増殖因子として働くことが知られており、腫瘍細胞表面の特異的膜受容体に作用して腫瘍細胞の増殖や生存期間延長をもたらす（Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　８０，　１５０６−１１，　１９９９、Ｈｅｍａｔｏｌ．　Ｏｎｃｏｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｎｏｒｔｈ．　Ａｍ　１３，　１１１７−２５，　１９９９、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　３１４２−９，　１９９８、Ｎａｔｕｒｅ　３３２，　８３−５，　１９８８、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２５０，　６０７−１０，　１９８９）。
【０００５】
本発明者らも、大腸癌細胞の細胞質に強い免疫反応性ＩＬ−６が存在する一方、免疫反応性ＩＬ−６受容体が大腸癌細胞の細胞膜に認められ、ＩＬ−６オートクリンメカニズムの存在が示唆されることを以前報告している（Ｃａｎｃｅｒ　８５，　２５２６−３１，　１９９９）。対照的にＩＬ−１ｒａは、ある種の消化器系癌細胞株において、ＩＬ−６タンパクだけでなくＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの分泌を阻害することが報告された（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　３１４２−９，　１９９８）。
【０００６】
また、ＩＬ−１ｒａを誘導すると、ミエローマ、メラノーマおよび白血病細胞に対し、抗炎症および抗増殖作用をもたらすことも報告されている（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ２，　２８−３４，　１９９５、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　６，　８９８−９０１，　１９９２、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５４，　２６６７−７２，　１９９４）。ＩＬ−１ｒａの産生はＩＬ−１よりはむしろＩＬ−６により制御されていることが知られている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５５，　９２１−７，　１９９５、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５２，　５０４１−９，　１９９４、Ｃｌｉｎ．　Ｅｘｐ．　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．　１３，　７７９−８４，　１９９５、Ｂｌｏｏｄ　８３，　１１３−８，　１９９４）。
【０００７】
頭部および頸部扁平上皮細胞癌の患者では、癌組織中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１比が減少していることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８，　３１３２−４１，　１９９８）。また、白血病細胞においては、ＩＬ−１およびその天然の受容体アンタゴニスト合成のアンバランスが無制限の細胞増殖と関連していることが報告されている（Ｂｌｏｏｄ　７８，　３２４８−５３，　１９９１）。
【０００８】
分子遺伝学の進歩により、発癌遺伝子の活性化や腫瘍抑制遺伝子の不活性化を含む遺伝子変異の蓄積が腫瘍の発生や増殖に必要なことが解ってきた（Ｊ．　Ｈｅｐａｔｏｌ．　２７，　６６９−７６，　１９９７、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ　Ａｓｉａｎ　Ｊ．　Ｔｒｏｐ　Ｍｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　２６　Ｓｕｐｐｌ　１，　１９０−６，　１９９５）。最近の研究では、炎症性サイトカインが転写活性化因子としてｐ５３活性を抑制する可能性が示されている（Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１９０，　１３６７−７０，１９９９）。ＭａｒｇｕｌｉｅｓとＳｅｈｇａｌは、ｐ５３がサイトカイン合成の制御のみならず腫瘍細胞のサイトカインに対する反応性の変化に関与しているという証拠を示している（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　１５０９６−１００，　１９９３）。多くの悪性腫瘍細胞株において、ＩＬ−６遺伝子の発現が恒常的にアップレギュレーションされていることが明らかにされ、腫瘍抑制遺伝子の変異がＩＬ−６遺伝子プロモーターのアップレギュレーションに関与していると想定されてきた（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　３１４２−９，　１９９８、Ｊ．　Ｈｅｐａｔｏｌ．　２７，　６６９−７６，　１９９７、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｉｎｔ．　２４，　１９５−２０９，　２０００）。
【０００９】
染色体１７ｐの一方の染色体の相同性の欠失がｐ５３遺伝子変化をもたらし、結果的に細胞増殖性に変化を与えると考えられている（Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｏｎｃｏｌ．　１３，　３１９−２３，　１９９８）。染色体１８ｑ２１の一方の染色体の相同性の欠失もまた、しばしば大腸癌において認められる。１８ｑ２１に存在するＳＭＡＤ−２およびＳＭＡＤ−４遺伝子は大腸癌で働く腫瘍抑制遺伝子の候補として同定されてきたものである（Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　８２，　１９７−２０２，　１９９９、Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　８０，　１９４−２０５，　１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８，　３０９８−１０３，　１９９９、Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　７８，　１１５２−５，　１９９８）。これら遺伝子が不活性化されると、ヒト大腸癌が遠位転移するような段階に進行する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８，　３０９８−１０３，　１９９９）。これらタンパクはＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βファミリーの細胞内シグナリングの主要因子として、また、ＴＧＦ−βに対する転写および抗増殖反応の重要因子として同定されてきたものである（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８，　３０９８−１０３，　１９９９）。ＤＣＣ遺伝子は、細胞接着分子と似たアミノ酸配列を持つタンパクをコードする別の腫瘍抑制遺伝子候補である（Ｓｕｒｇ．　Ｔｏｄａｙ　２５，　１００１−７，　１９９５、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９，　５２５−３１，　１９９４）。ＤＣＣ遺伝子は染色体１８ｑに位置し、癌や進行した腺腫においてしばしば欠失している（ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．　１，　９０２−９，　１９９５、　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３１９，　５２５−３２，　１９８８）。それゆえに、ＩＬ−１−ＩＬ−６制御システムは腫瘍抑制遺伝子や発癌遺伝子のようないくつかの因子と相互作用すると考えられている。
【００１０】
大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は老人によくみられる悪性の疾患である。従来は欧米において発症率が特に高かったが、日本においても食生活の欧米化により年々発症率が増加している。この癌は、しばしば、リンパ管および血管を介して他の臓器に転移する。大腸癌に罹患した多くの患者は、最終的にはこの疾患によって死亡する。実際、日本だけでも年間約１０万例の大腸癌が発生している。
【００１１】
しかし、早期に診断されれば、大腸癌は、癌性組織の外科手術による除去によって効果的に治療しうる。大腸癌は、大腸の上皮に由来し、多くの場合、発症の初期段階では高度に血管化せず、侵襲性ではない。高度に血管化され、侵襲性となり、最終的に転移性の癌に移行するには、一般に、１０年またはそれ以上を要する。癌が侵襲性になる前に検出された場合は、癌性組織の外科手術による除去が有効な治療である。
【００１２】
従って、初期の疾患段階で、治療の開始前に個々の患者の癌の進行度を同定できる診断法が必要とされている。癌の悪性度の同定は、一般的には、病理学者が組織切片の特徴を検査することにより行われている。この場合、標本を観察する観察者の技術レベルが一定でないことおよび観察者の主観が入るという欠点がある。組織切片の病理組織学的検査よりも、個々の患者の癌の悪性度を正確にかつ簡便におこなえる検査法が必要とされている。また、自覚症状が出る前に癌を検出できれば、疾患の初期段階で治療を開始できるであろうし、大きな治療効果が見込めるであろう。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
ＩＬ−１−ＩＬ−６ネットワークを解明することによって癌の診断、癌の悪性度の判定、患者の予後の判定方法および腫瘍増殖を制御する新しい治療的アプローチが得られると思われるけれども、大腸癌におけるＩＬ−１−ＩＬ−６ネットワークについて、炎症性サイトカインとその阻害物質のバランスに焦点を当てた研究は未だ十分なされていなかった。
従って、本発明の課題は、患者由来の試料中のＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定し、それらの比を算出することによって癌の診断、癌の悪性度の判定および患者の予後を判定する新しい方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、免疫反応性ＩＬ−１ｒａが癌細胞の細胞質に存在すること、癌組織中のＩＬ−１ｒａ濃度が正常粘膜および腺腫よりも有意に高いことを見出した。このことは腫瘍細胞が腫瘍増殖性サイトカインだけでなく、腫瘍増殖にとって好ましくない局所環境を作り出す抗増殖性サイトカインを産生しうることを示唆している。本発明者らはまた、腫瘍組織中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比が発癌および癌の進行過程で減少することを見出した。さらに、ＩＬ−１ｒａ−ＩＬ−６ネットワークシステムの悪化が、腫瘍抑制遺伝子の遺伝子変化を反映する染色体１８ｑ座での相同性の消失と相関していることを見出し本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は、患者由来の試料（組織、細胞または体液（血液または尿試料等））中のＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定し、それらの濃度比に基づいて癌の診断、癌の悪性度の判定および患者の予後を判定する方法に関する。本発明の診断方法および判定方法の対象となる好適な癌は大腸癌、胃癌および乳癌である。
【００１６】
より詳しく言えば、本発明は下記の１〜７の癌の診断方法および８〜１４の癌の悪性度の判定方法に関する。
１．試料中のＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）およびＩＬ−６濃度を測定し、その濃度比を指標にして判断することを特徴とする癌の診断方法。
２．試料が、組織、細胞または体液である前記１記載の癌の診断方法。
３．ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定してＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定する前記１記載の癌の診断方法。
４．ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパクの各々の抗体を用いてＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定する前記３記載の癌の診断方法。
５．癌が大腸癌である前記４記載の癌の診断方法。
６．癌が胃癌である前記４記載の癌の診断方法。
７．癌が乳癌である前記４記載の癌の診断方法。
８．試料中のＩＬ−１受容体アンタゴニストおよびＩＬ−６濃度を測定し、その濃度比を指標として判断することを特徴とする癌の悪性度の判定方法。
９．試料が、組織、細胞または体液である前記８記載の癌の悪性度の判定方法。
１０．ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定してＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定する前記８記載の癌の悪性度の判定方法。
１１．ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパクの各々の抗体を用いてＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定する前記１０記載の癌の悪性度の判定方法。
１２．癌が大腸癌である前記１１記載の癌の悪性度の判定方法。
１３．癌が胃癌である前記１１記載の癌の悪性度の判定方法。
１４．癌が乳癌である前記１１記載の癌の悪性度の判定方法。
【００１７】
本明細書において、「予後」とは本来の医学的な意味、すなわち、疾患からの回復の見込みを意味する。また、「対立遺伝子」とは対立形質を支配する２つ以上の遺伝子、あるいは染色体上の同じ座位を占める遺伝子の中で突然変異などのために生じた異なる塩基配列をもつ遺伝子を意味する。
【００１８】
組織試料は、当業者に周知である慣用的な生検技術または外科手術によって癌患者から取り出される。次に、その試料はＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０発現レベルの測定、およびＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　用に調製される。
【００１９】
組織試料中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０発現の相対レベルの測定は、組織試料中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０のＲＮＡ転写物、特に、ｍＲＮＡ転写物の相対数を測定すること、または組織試料中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０のタンパク質の相対レベルを測定することを含む。好ましくは、組織試料中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０タンパク質の相対レベルは、これらタンパク質を結合する抗体を組織試料と接触させる免疫学的方法により測定される。免疫学的方法には、免疫学的定量方法（ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法等）、ウェスタンブロッティング法および免疫組織染色法が含まれる。
【００２０】
免疫学的定量方法としては、例えばＩＬ−１ｒａを結合する固相化されたモノクローナル抗体および／またはその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと、これらモノクローナル抗体および／またはその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントとは認識部位を異にする、標識化された第２のモノクローナル抗体および／またはその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントとを用いる方法を挙げることができる（サンドイッチＥＬＩＳＡ法と呼ばれる）。
【００２１】
ウェスタンブロッティング法は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いてゲル上のタンパク質試料を拡散させ、そのゲルを硝酸セルロースフィルターにブロッティングし、標識抗体をフィルターに接触させることによって行うことができる。
免疫組織染色法は組織試料を脱水、定着の後、タンパク質に特異的な標識抗体を反応させることによって行うことができる。標識方法としては、酵素標識、蛍光標識、蛍光発光標識等を例示することができ、通常、目視により検出される。
【００２２】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法
以下に、ＩＬ−１ｒａを例として、サンドイッチＥＬＩＳＡ法について説明する。抗ヒトＩＬ−１ｒａモノクローナル抗体を担体に固相化し（固相化一次抗体）、これに組織試料（組織抽出液、血液（血清）や尿等）を加え、抗原抗体反応により試料中のヒトＩＬ−１ｒａを固相化一次抗体に結合させる。次に、酵素標識した異なる種類の抗ヒトＩＬ−１ｒａモノクローナル抗体（酵素標識二次抗体）を反応させ、抗原抗体反応により酵素標識二次抗体を上記固相化一次抗体に結合している抗原に結合させる。その後、抗原に結合しなかった酵素標識二次抗体を除去し、基質を加えて酵素反応を行うことにより、既知量のヒトＩＬ−１ｒａと二次抗体に標識した酵素活性との関係を示す検量線から、試料中のヒトＩＬ−１ｒａ量を求めることができる。
【００２３】
上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、モノクローナル抗体に代えて、ヒトＩＬ−１ｒａを特異的に結合できる抗体フラグメント、例えば、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ′）_２、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂ等の抗体可変領域からなる抗体結合部位を含むヒトＩＬ−１ｒａに結合する抗体フラグメントを使用することもできる。また、これらモノクローナル抗体、抗体フラグメントに標識する酵素としては、βーガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を例示することができ、これら酵素は、慣用的な方法（酵素標識法（生物化学実験法２７）第１版、学会出版センター、１９９１年、等）により標識することができる。また、これら酵素に代えて、例えば、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ等のラジオアイソトープやＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発色タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。また、固相としては、マイクロプレート、試験管、シリコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、フィルター、メンブラン等を用いることができる。
【００２４】
免疫組織染色法
組織試料を患者から得、慣用的な組織固定法にしたがってそれら試料を包埋した後、例えば３〜５μｍの厚さに切断し、定着、固定し、乾燥させる。定着剤としては、好ましくはホルマリンを含有することができる。標本を固定するための包埋剤として、例えば、パラフィンを含有させ、標本を保存することができる。脱パラフィン化および再水和後、ヒトＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０に特異的な標識抗体を含む試薬と標本を接触させる。組織試料中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０発現のレベルは、染色強度を比較することによって、または染色された細胞数を比較することによって、判定することができる。
【００２５】
上記免疫組織染色法において、抗体としてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いることができる。抗体には、自然のままの抗体、またはヒトＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０を特異的に結合できる抗体フラグメントが含まれる。このような抗体フラグメントとしては、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ′）_２、Ｆ（ａｂ′）_２を還元して得られるＦａｂ′、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂなどを例示することができる。また、これらポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗体フラグメントの標識は、一次抗体（抗ヒトＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０抗体）に対して直接的に結合することができるし、または一次抗体を結合する二次抗体に対して間接的に結合することができる。好ましくは、過剰のビオチン結合能力を有するアビジンービオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）を含む。ＡＢＣ法は、パラフィン包埋切片、凍結切片および塗抹標本に用いることができる。
【００２６】
ポリクローナル抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）にヒト由来のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０タンパク質、若しくはそれらのエピトープを含む断片を投与することにより産生させ、慣用的な方法に従って抗血清を集め、精製することができる。モノクローナル抗体は、Ｎａｔｕｒｅ　２５４，　４９３−７，　１９８０の技術を用いることによって作製することができる。また、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１０に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、試薬として販売されている。さらに、測定キットとしても販売されており、簡便に使用できる。
【００２７】
Ｄ１８Ｓ５１およびＴＰ５３マイクロサテライトマーカー遺伝子の変異の検出は、組織試料または血液からＤＮＡを抽出した後、対立遺伝子中の突然変異または多型について検討することにより行われる。組織試料または血液からＤＮＡを抽出する操作は、公知の方法に従って行うことができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊、Ａｕｓｕｂｅｌ　ＦＭ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．より発刊）。
【００２８】
次に、ＤＮＡを含む試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、プライマー対、緩衝液および鎖伸長を促進することができる酵素を用いて増幅させる。ＰＣＲを行う方法は公知である（Ｄｉａｇ．　Ｍｏｌ．　Ｐａｔｈ．　１，　５８−７２，　１９９２）。ＰＣＲにより作製した増幅生成物を用いて、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）またはプライマー・イン・サイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ＤＮＡ合成（ＰＲＩＮＳ）と呼ばれる手法を用いて、突然変異または多型を検出できる。突然変異または多型は、ＤＮＡを含む試料から遺伝子を単離し、塩基配列を決定し、対応する野生型Ｄ１８Ｓ５１およびＴＰ５３マイクロサテライトマーカー遺伝子のそれと配列を比較することによっても行うことができる。好ましいのは、簡単、迅速で効率がよいＳＳＣＰ法である。
【００２９】
ＳＳＣＰ法は、ゲルマトリックス内でのＤＮＡ断片の電気泳動移動度のシフトにより、単一塩基置換（ポイントミューテーション）を含む、塩基配列の変化を検出することができる。一つのヌクレオチドの違いにより、構造が変化し、対応する野生型ＤＮＡ断片の電気泳動移動度と比較した場合、変異ＤＮＡ断片では移動度のシフトがおこり、検出することが可能である（Ｇｅｎｏｍｉｃ　５，　８７４−９，　１９８９）。Ｄ１８Ｓ５１およびＴＰ５３マイクロサテライトマーカー遺伝子の変異検出キットは、試薬として販売されており、簡便に使用できる。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３１】
実施例１：炎症性および抗炎症性サイトカインの免疫組織染色
（１）患者からの組織標本の採取
インフォームドコンセントを実施した７４人の原発性大腸癌患者から外科手術により癌組織の新鮮標本を、同７４人の切除術患者の切除標本の遠位断端から正常結腸粘膜を、また、同３０人の外来患者から内視鏡により新鮮結腸腺腫を無菌条件下で採取した。外科手術中に得られた２０の腫瘍標本は１０％フォルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。
【００３２】
（２）免疫組織染色
パラフィン包埋標本を５μｍの切片に切り、６５℃で溶かしたワックスを用いてスライドグラスに付着させた。切片からワックスを除去、水和し、３％過酸化水素で３０分間保温した。切片を冷水道水で洗浄し、マイクロウェーブ中で処理し、ｐＨ７．４燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５分間ずつ３回洗浄した。
【００３３】
非特異的結合を防ぐために、切片に３％正常ウサギ血清を加えて２０分間保温した。ＰＢＳで洗浄後、切片にＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１０に対する山羊ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製，ミネアポリス，ミネソタ州）を加え、加湿器中で４℃に保温した。切片を洗浄し、ビオチン化した抗山羊免疫グロブリンＧをＰＢＳで希釈したものを加え、室温で６０分間保温した。次に、切片にアビジンビオチン複合試薬を加え、３７℃で６０分間保温した。ヴェクターＤＡＢ基質キット（ヴェクターラボラトリーズ社製，バーリンガム，カリフォルニア州）で２分間かけて発色させた後、メイヤーヘマトキシリンで対比染色した。
【００３４】
免疫反応の特異性は既知の陽性および陰性対照組織切片を染色すること、および一次抗体を正常ウサギ血清にして陰性染色することによって確認した。各々の腫瘍切片について、強拡大で１，０００個の細胞を計測することにより、陽性に染まった腫瘍細胞のパーセントを評価した。３０％以上の細胞が染色されたとき免疫反応性サイトカインの発現が陽性であると判定した。臨床情報、標本の性質および使用した抗体を知らされていない３人の別々の観察者がブラインドで３回スライドの評価をおこなった。
【００３５】
癌組織におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１０の発現を免疫組織染色によって調べた結果を図７に示す。免疫反応性ＩＬ−１βは、５人の患者（２５％）においては大腸癌細胞の細胞質と腫瘍間質細胞の両方に、１１人の患者（５５％）においては大腸癌細胞の細胞質においてのみ認められた。強い免疫反応性ＩＬ−６が大腸癌細胞の細胞質に認められ、大腸癌２０例中１２例（６０％）で検出可能であった。強い免疫反応性ＩＬ−１ｒａが大腸癌細胞の細胞質に認められたが、１５例（７５％）においては腫瘍間質細胞にも弱い免疫反応性ＩＬ−１ｒａが認められた。また、４人の患者（２０％）では、大腸癌細胞の細胞質と腫瘍間質細胞の両方に弱い免疫反応性ＩＬ−１０が検出された。
【００３６】
実施例２：炎症性および抗炎症性サイトカインの組織内濃度
外科的および内視鏡的に取り出した標本を、すぐに−８０℃の液体窒素中に保存した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１０の組織内濃度を分析するために、１７８標本（大腸癌：７４、正常結腸粘膜：７４）、ＩＬ−６およびＩＬ−１ｒａの組織内濃度を分析するために、大腸腺腫３０標本を調製した。
これらのサンプルを融解し、すばやく重量を測定した後に、５ｍＬのＰＢＳに入れ、電動式テフロン（登録商標）製乳棒で５分間ホモゲナイズした。ホモゲネートを次に４℃で１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を２００μＬバイアルに入れ−８０℃に保存した。その上清を癌組織、結腸腺腫および正常粘膜中のサイトカインおよびタンパク質量の測定に供した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１０濃度はＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）キット（ＩＬ−１βおよびＩＬ−６：エンドジェン社製，ウバーン，マサチューセッツ州、ＩＬ−１ｒａ：アマーシャムインターナショナル社製，アマーシャム，英国、ＩＬ−１０：バイオソースインターナショナル社製，カマリロ，カリフォルニア州）を用いて測定した。癌組織、結腸腺腫および正常粘膜中のサイトカイン濃度はｐｇ／ｍｇタンパク質量で、また、数値は平均±標準誤差で表した。
癌および正常粘膜におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１０の組織内濃度を測定した結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】

【００３８】
癌組織中のＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１ｒａの平均濃度は正常粘膜中の平均濃度に比し有意に高かった。しかし、ＩＬ−１０に関しては有意な差は認められなかった（統計処理はＷｉｌｃｏｘｏｎ　ｓｉｇｎｅｄ　ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ　によりおこなった）。サイトカインの組織内濃度と臨床病理学的要因の関連を調べた結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】

【００４０】
肝転移した癌組織におけるＩＬ−６の組織内濃度は転移していない肝臓に比し有意に高かった。癌組織中のＩＬ−１ｒａ濃度はリンパ節転移、リンパ管浸潤および奨膜浸潤を含む臨床病理学的要因と関連していた。しかし、ＩＬ−１βとＩＬ−１０の組織内濃度はいかなる臨床病理学的要因とも関連がなかった（統計処理はＡＮＯＶＡによりおこなった）。
癌組織中のＩＬ−１ｒａ濃度とＩＬ−６濃度の比（ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比）と臨床病理学的パラメーターの関係を表３に示す。
【００４１】
【表３】

【００４２】
癌組織中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比はリンパ節転移、脈管浸潤、リンパ管浸潤および奨膜浸潤を含むすべての臨床病理学的要因と有意に関連していた。また、癌組織中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比は肝転移とも関連する傾向が認められた（統計処理はＡＮＯＶＡによりおこなった）。さらに、癌組織中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比は腫瘍の大きさとも有意に相関していた。
患者を組織内ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比に基づいて分類分けした時の患者の累積生存率を図１に示す。組織内ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比が低いと（中央値６９．１４６以下）、患者の予後は乏しかった（統計処理はｌｏｇ　ｒａｎｋ　ｔｅｓｔによりおこなった。ｐ値が０．０５未満の時、有意と考えられた。）。
腺腫標本中のＩＬ−６およびＩＬ−１ｒａ濃度はそれぞれ６０．７±１６．３ｐｇ／ｍｇタンパク質および３９２７±８３１ｐｇ／ｍｇタンパク質であった。腺腫における組織内ＩＬ−６およびＩＬ−１ｒａ濃度は正常粘膜に比し有意に高かったが、癌との有意差は認められなかった。
【００４３】
癌組織、結腸腺腫および正常粘膜中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比を図２に示す。癌組織中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比は結腸腺腫および正常粘膜中のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比より有意に低かった。しかし、結腸腺腫と正常粘膜の間で組織内ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比に有意差はなかった。
癌を大きさによって、大きい方のグループ（４．４ｃｍ以上，３８例）と小さい方のグループ（４．４ｃｍ未満，３６例）に分けた。より大きい癌、より小さい癌、結腸腺腫および正常粘膜における組織内ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度の相関を図３〜６に示す。腺腫およびより小さい癌においては組織内ＩＬ−１ｒａ濃度はＩＬ−６濃度と有意に正に相関していた（図４および図５）。しかし、正常粘膜とより大きい癌においては組織内ＩＬ−１ｒａ濃度とＩＬ−６濃度に有意の相関は無かった（図３および図６）。
【００４４】
実施例３：ＤＮＡ抽出とＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）
外科的に摘出した標本から高分子量ＤＮＡを通常の方法、すなわちプロテイネースＫによる消化およびフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール抽出により抽出した。１７ｐおよび１８ｑ染色体上の相同性の消失を観察するために、ＤＮＡ抽出の後、Ｄ１８Ｓ５１およびＴＰ５３マイクロサテライトマーカーを用いてＰＣＲ増幅をおこなった（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｌｉｎｋａｇｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｓｅｔ、アプライドバイオシステムズ社製、パーキンエルマー、フォスター市、カルフォルニア州）。ロボサイクラー（Ｒｏｂｏ−Ｃｙｃｌｅｒ）４０ＰＣＲ機（ストラタジーン社製，ラホヤ，カリフォルニア州）を用いて、９４℃３分間、５５℃２分間および７２℃３分間を１サイクル、次に９４℃４５秒、５５℃１分間および７２℃１．５分間を３４サイクル、そして７２℃５分間および２０℃９９．９分間の最終伸張ステップをおこなった。増幅した反応生成物にフォルムアミド停止液（１００％脱イオン化フォルムアミドおよび０．０５％デキストランブルー）を加え、５％ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて分析した。泳動中に収集した蛍光ゲルデータをＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７自動蛍光ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製，パーキンエルマー，フォスター市，カリフォルニア州）により自動的に分析した。各々の蛍光ピークについて塩基対のサイズ、ピークの高さおよびピーク面積の見地から定量した。
７４例の腫瘍中３４例（４６％）においてｐ５３座での相同性の消失が認められた。また、７４例の腫瘍中２９例（３９％）において１８ｑ２１座での相同性の消失が認められた。
表４に、遺伝子変異と臨床病理学的知見ならびに組織内サイトカイン濃度の関係を示した。
【００４５】
【表４】

【００４６】
肝転移とリンパ節転移が１８ｑ座での相同性の消失と有意に関連していることが見出された。しかし、１７ｐ座での相同性の消失は病気の進行を示唆するような如何なる臨床病理学的知見とも関連しなかった。１７ｐ座での相同性の消失の有無によって組織内サイトカイン濃度に有意差は認められなかったが、１８ｑ座での相同性の消失は結腸癌における組織内ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比と有意に相関していた（統計処理はＡＮＯＶＡおよびＹａｔｅｓ修正ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ　ａｎａｌｙｓｉｓによりおこなった）。
【００４７】
【発明の効果】
ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６濃度比は、癌の存在の有無、癌の悪性度および患者の予後を反映したものであり、患者由来試料のＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６濃度比を測定することにより目的対象とする患者の癌の診断、癌の悪性度および患者の予後を客観的に判定することができる。本発明の方法により、患者に最適な治療を施すことができ、また、予後も的確に推定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】癌組織内ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６比に基づいて分類分けした患者の累積生存率を示すグラフである。
【図２】結腸癌、結腸腺腫および正常粘膜組織内ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−６濃度比を示す。
【図３】正常粘膜における組織内ＩＬ−１ｒａ濃度とＩＬ−６濃度の相関を示すグラフである。
【図４】腺腫における組織内ＩＬ−１ｒａ濃度とＩＬ−６濃度の相関を示すグラフである。
【図５】より小さい癌における組織内ＩＬ−１ｒａ濃度とＩＬ−６濃度の相関を示すグラフである。
【図６】より大きい癌における組織内ＩＬ−１ｒａ濃度とＩＬ−６濃度の相関を示すグラフである。
【図７】Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ、癌組織の組織染色法によるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１０の発現状態を示す図面代用写真である。

Claims (14)

1. 試料中のＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）およびＩＬ−６濃度を測定し、その濃度比を指標にして判断することを特徴とする癌の診断方法。
2. 試料が、組織、細胞または体液である請求項１記載の癌の診断方法。
3. ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定してＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定する請求項１記載の癌の診断方法。
4. ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパクの各々の抗体を用いてＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定する請求項３記載の癌の診断方法。
5. 癌が大腸癌である請求項４記載の癌の診断方法。
6. 癌が胃癌である請求項４記載の癌の診断方法。
7. 癌が乳癌である請求項４記載の癌の診断方法。
8. 試料中のＩＬ−１受容体アンタゴニストおよびＩＬ−６濃度を測定し、その濃度比を指標として判断することを特徴とする癌の悪性度の判定方法。
9. 試料が、組織、細胞または体液である請求項８記載の癌の悪性度の判定方法。
10. ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定してＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６濃度を測定する請求項８記載の癌の悪性度の判定方法。
11. ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパクの各々の抗体を用いてＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６タンパク質を測定する請求項１０記載の癌の悪性度の判定方法。
12. 癌が大腸癌である請求項１１記載の癌の悪性度の判定方法。
13. 癌が胃癌である請求項１１記載の癌の悪性度の判定方法。
14. 癌が乳癌である請求項１１記載の癌の悪性度の判定方法。

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