CN115466793A

CN115466793A - Acot9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒

Info

Publication number: CN115466793A
Application number: CN202211169158.2A
Authority: CN
Inventors: 王大志; 刘新泳
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2042-09-26
Also published as: CN115466793B

Abstract

本发明涉及ACOT9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。本发明首次揭示了ACOT9基因在胃癌患者中的表达水平显著提高且具有统计学意义，并且不同胃癌分期中ACOT9基因的表达水平不同。基于此，本发明将ACOT9基因的检测试剂应用于制备胃癌的检测试剂盒，制备得到的试剂盒具有方便、快捷等特点，可用于胃癌的早期诊断、判断胃癌分期等领域，为胃癌患者的治疗提供指导。同时还可用于评估胃癌肿瘤大小，对于辅助胃癌患者治疗等，有着较高的临床使用价值及推广价值。

Description

ACOT9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒

技术领域

本发明涉及ACOT9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

胃癌具有高发病率和高死亡率的特点，是世界上主要的癌症之一，也是重要的全球医疗保健问题，对全人类的健康造成了重要影响。有资料显示，超过70%的胃癌发生在发展中国家。胃癌患者具有发病率高、转移率高、死亡率高，早诊率低、根治性切除率低、5年生存率低的特点。胃癌的生存又与胃癌的分期、瘤体情况和肿瘤大小密切相关。另一方面，有研究显示肿瘤分期是胃癌患者预后的危险因素，分期较晚的胃癌患者相对于分期较早的患者，通常其预后不佳、生存期较短。并且，对于肿瘤本身来说，其瘤体情况又对肿瘤的恶性程度、及可能的浸润扩散转移等，有重要影响。目前，传统判断肿瘤分期的检查方法，还存在着不足。例如，一些细小肿瘤病灶，包括转移灶，传统CT检查可能并没有明显的显示出来。又如，对于肿瘤瘤体本身的情况，也存在着传统CT检查不能满足临床充分评估的需求。但是，对于分期评估的不准确，会直接影响患者的后期治疗，进而影响患者预后、生存质量。和肿瘤本身瘤体情况密切相关的T分期，特别是T1、T2和T3、T4分期对于手术及围手术化疗等有着重要影响，但是传统的CT检查对于T分期评估存在着不足。肿瘤的大小通常又和肿瘤负荷有关，肿瘤负荷进而影响肿瘤的疾病程度和预后，但是目前十分缺乏与肿瘤大小或肿瘤负荷相关的肿瘤标志物。随着生物分子医学和精准医学的发展，急需借助这方面的技术来帮助癌症患者的分期，及肿瘤瘤体情况的评估。目前在胃癌领域，仍然十分缺乏有效的利用生物分子医学等技术进行检测胃癌的试剂盒，及胃癌分期及肿瘤大小相关的肿瘤标记物，因此迫切的需要相关的标志物，为胃癌的早期诊断和分期判断提供客观依据。

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外特异性扩增目的DNA片段的技术，其基本原理是利用碱基互补配对原则。实时荧光定量PCR是以cDNA作为模板，在DNA Polymerase（聚合酶）作用下，参照目的片段的特异性引物序列，特异性合成上、下游引物之间的目的片段。检测结合在DNA双链中的荧光信号，根据Ct值等可以对目的mRNA进行定量检测。因此设计出能够识别目的片段的特异性引物序列，是保证目的mRNA定量准确的重要保证和重要环节。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了ACOT9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

ACOT9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。

根据本发明优选的，所述ACOT9基因的NCBI Gene数据库Gene ID为23597。

根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。

根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒用于检测细胞、组织、血浆或血清中的ACOT9基因。

一种胃癌检测试剂盒，包括ACOT9基因的荧光定量PCR反应试剂。

根据本发明优选的，所述ACOT9基因的荧光定量PCR反应试剂包括ACOT9基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：

ACOT9_F：5’-GCAGTGAGCCTGAATTACGA-3’，

ACOT9_R：5’-GAGACATCTTGGCGGAGTG-3’。

根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒还包括内参体系。

进一步优选的，所述内参体系为内参基因β-actin（beta-actin）的荧光定量PCR的检测体系，包括β-actin基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：

β-actin_F：5’-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3’，

β-actin_R：5’-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3’。

根据本发明优选的，所述试剂盒中还包括用于荧光定量PCR的酶液和缓冲液体系，为现有的市购产品。

上述胃癌检测试剂盒在胃癌早期诊断中的应用。

上述胃癌检测试剂盒在判断胃癌分期，胃癌肿瘤瘤体情况T分期，评估胃癌肿瘤大小中的应用。

根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒评估胃癌肿瘤大小时，胃癌患者的年龄小于等于65岁。

有益效果：

1、本发明首次揭示了ACOT9基因在胃癌患者中的表达水平显著提高且具有统计学意义，并且不同胃癌分期中ACOT9基因的表达水平不同。基于此，本发明将ACOT9基因的检测试剂应用于制备胃癌的检测试剂盒，制备得到的试剂盒具有方便、快捷等特点，可用于胃癌的早期诊断、判断胃癌分期等领域，为胃癌患者的治疗提供指导。

2、本发明中所述ACOT9基因作为标志物对于胃癌早期诊断及判断胃癌的分期具有重要参考价值。根据ACOT9基因设计的试剂盒不仅可用于胃癌的筛查，同时可用于指导判断胃癌患者的分期，评估胃癌肿瘤大小，对于辅助胃癌患者治疗等，有着较高的临床使用价值及推广价值。

附图说明

图1是实施例1中统计学检验分析结果图。

图2是实施例2中以胃癌TNM综合分期为标准的统计学检验分析结果图。

图3是实施例2中以胃癌肿瘤T分期为标准的统计学检验分析结果图。

图4是实施例3中统计学检验分析结果图。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作。

实施例1 、ACOT9基因在胃癌患者中的表达水平

1、检测90个样本，分别来自45例胃癌患者，其中每例患者均取癌组织和癌旁组织样本，共90个样本（45对癌组织和癌旁组织）的cDNA。该90个样本的cDNA购买于上海芯超生物科技有限公司，型号为胃癌 MecDNA-HStmA030CS01和MecDNA-HStmA060CS01。

2、荧光定量PCR：

根据NCBI Gene数据库Gene ID为23597所示的ACOT9基因设计引物，具体如下：

ACOT9_F：5’-GCAGTGAGCCTGAATTACGA-3’，

ACOT9_R：5’-GAGACATCTTGGCGGAGTG-3’。

以β-actin（beta-actin）基因作为内参基因，所述β-actin基因NCBI Gene数据库Gene ID为60；

所述内参基因β-actin的引物序列如下：

β-actin_F：5’-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3’，

β-actin_R：5’-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3’。

荧光定量PCR体系：总反应体系为10μL； 2×SYBR Green PCR Master Mix 5μL，QNROX Reference Dye 0.05μL，上游引物稀释液0.7μL（终浓度0.7μM），下游引物稀释液0.7μL（终浓度0.7μM），RNase-Free water加cDNA溶解液3.55μL。反应试剂2×SYBR Green PCRMaster Mix，QN ROX Reference Dye购买自QuantiNova™ SYBR® Green PCR Kit。

反应条件（最大/快速模式）：PCR初始活化步骤，95℃，2分钟；两步循环变性 95℃，5秒；退火/延伸步骤，60℃，10秒，共40循环。仪器为赛默飞QuantStuidio 3。

通过以上荧光定量PCR获得45对来自胃癌患者的癌组织和癌旁组织样本中ACOT9基因的表达水平。

3、统计学分析：

以2^-∆∆Ct法进行数据标准化及分析，对每例胃癌患者（分别有一个癌组织样本和一个癌旁组织样本），分别进行2^-∆∆Ct法进行计算，以计算出目的基因在每例胃癌患者的表达情况。

ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=癌样本ΔCt值-癌旁样本ΔCt值，2^-ΔΔCt反映每例胃癌患者的癌组织样本目的基因的相对表达水平。对实验检测的原始数据进行质控，其中取CT平均值的基本方法为，目的基因CT值取重复样本复孔平均值；内参基因CT值取重复样本复孔平均值。对数据进行质控后，分别按照以下三种方法分别进行分析。

①.单样本t检验，H0：胃癌患者中ACOT9的相对表达水平为1，H1：胃癌患者中ACOT9的相对表达水平大于1，取α=0.1000，以p值小于α为拒绝H0。此次检测分析，样本例数为n=45例，单样本单侧t检验，对ACOT9的mRNA相对表达水平进行统计学分析，取mu=1，α=0.1000（单侧）。

统计结果：t = 3.8841，p-value = 0.000171。经检验，按α水准拒绝H0。在45例胃癌中的ACOT9的mRNA的相对表达水平平均为1.6189，因此胃癌患者ACOT9高表达且具有统计学意义。

②. u检验，样本均数与总体均数的比较，H0假设为μ=1.0000，H1假设为μ>1.0000，α=0.1000（单侧）

统计结果：u=3.8841，p=0.000051。经检验，按α水准拒绝H0。在45例胃癌中的ACOT9的mRNA的相对表达水平平均为1.6189，因此胃癌患者ACOT9高表达且具有统计学意义。

③. 秩和检验，H0：差值的总体中位数等于0，H1：差值的总体中位数不等于0，α=0.1000（单侧）。

统计结果，V=864，P=0.0000。经检验，按α水准拒绝H0，接受H1, 故可认为差值的总体中位数不等于0。在45例胃癌中的ACOT9的mRNA的相对表达水平平均为1.6189，因此胃癌患者中ACOT9高表达且具有统计学意义。

以上分析通过简明统计14.0 (Concise Statistics,CS14.0)计算。如图1所示，以上统计结果说明胃癌患者中ACOT9基因的表达水平显著升高，具有统计学意义，可以根据ACOT9基因的表达水平进行胃癌的早期诊断，因此可基于ACOT9基因制作用于胃癌早期诊断的试剂盒。

实施例2、ACOT9基因在不同胃癌分期中的表达水平差异

1、检测90个样本，分别来自45例胃癌患者，其中每例患者均取癌组织和癌旁组织样本，共90个样本（45对癌组织和癌旁组织）的cDNA。该90个样本的cDNA购买于上海芯超生物科技有限公司，型号为胃癌MecDNA-HStmA030CS01和MecDNA-HStmA060CS01。其中，16例患者处于胃癌早期（TNM1期和TNM2期），29例患者处于胃癌晚期（TNM3期和TNM4期）。

2、采用荧光定量PCR获得45对来自不同胃癌分期胃癌患者的癌组织和癌旁组织样本中ACOT9基因的表达水平，以上均按照实施例1中的操作方法进行。

3、以胃癌TNM综合分期为标准的统计学分析，分析早期（TNM1期和TNM2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平，和晚期（TNM3期和TNM4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平是否存在统计学差异：

①.两样本的秩和检验，H0：两个总体分布相同，H1：两个总体分布不相同，α=0.1500（单侧），此次检测分析，样本为胃癌患者，例数为n=45例。

统计结果，T=309.0000，P=0.0812，u=-1.3990，P=0.0809。经秩和检验，按α水准拒绝H0，故可认为两组的总体分布不同。早期（TNM1期和TNM2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.3488，晚期（TNM3期和TNM4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.7680。即晚期（TNM3期和TNM4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平明显高于早期（TNM1期和TNM2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平。

②.两样本均数比较的t′检验，H0：为两个总体均数相等，即μ1＝μ2；H1：为两个总体均数不等，即μ1≠μ2，α=0.1500（单侧）

统计结果：t′=1.4344，P=0.0833。经检验，按α水准拒绝H0，接受H1，可认为两个总体均数不相等。早期（TNM1期和TNM2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.3488，晚期（TNM3期和TNM4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.7680。即早期（TNM1期和TNM2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平与晚期（TNM3期和TNM4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平具有明显差异。

以上分析通过简明统计14.0 (Concise Statistics,CS14.0)计算。如图2所示，以上统计结果说明晚期（TNM3期和TNM4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平明显高于早期（TNM1期和TNM2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平，具有明显差异和统计学意义。

4、鉴于T分期和肿瘤本身瘤体情况密切相关，特别是早期（T1、T2）和晚期（T3、T4）分期对于手术及围手术化疗等有着重要影响。因此对胃癌肿瘤瘤体情况的统计学分析, 以胃癌肿瘤T分期为标准，分析早期（T1、T2）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平，和晚期（T3、T4）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平的统计学差异，其中，6例患者处于胃癌早期（T1期和T2期），39例患者处于胃癌晚期（T3期和T4期）：

统计结果，T=71.0000，P=0.0118，u=-2.2371，P=0.0126。经秩和检验，按α水准拒绝H0，故可认为两组的总体分布不同。早期（T1和T2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为0.9436，晚期（T3和T4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.7228。即晚期（T3和T4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平明显高于早期（T1和T2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平。

②.两样本均数比较的t′检验，H0：两个总体均数相等，即μ1＝μ2；H1：两个总体均数不等，即μ1≠μ2，α=0.1500（单侧），此次检测分析，样本为胃癌患者，例数为n=45例。

统计结果：t′=3.0817，P=0.0078。经检验，按α水准拒绝H0，接受H1，故可认为两个总体均数不相等。早期（T1和T2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为0.9436，晚期（T3和T4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.7228。即早期（T1和T2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平与晚期（T3和T4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平具有明显差异。

以上分析通过简明统计14.0 (Concise Statistics,CS14.0)计算。如图3所示，以上统计结果说明晚期（T3和T4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平明显高于早期（T1和T2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平，具有明显差异和统计学意义。

以上统计结果说明晚期（TNM3期、TNM4期或T3、T4期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平明显高于早期（TNM1期、TNM2期或T1、T2期）胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平，具有明显差异和统计学意义。可以根据ACOT9基因的表达水平帮助判断胃癌分期和胃癌肿瘤瘤体情况分期，因此可基于ACOT9基因制作用于判断胃癌分期和胃癌肿瘤瘤体情况分期的试剂盒。

实施例3、ACOT9基因在胃癌患者不同体积胃癌肿瘤中的表达水平差异

1、检测90个样本，分别来自45例胃癌患者，其中每例患者均取癌组织和癌旁组织样本，共90个样本（45对癌组织和癌旁组织）的cDNA。该90个样本的cDNA购买于上海芯超生物科技有限公司，型号为胃癌 MecDNA-HStmA030CS01和MecDNA-HStmA060CS01。以肿瘤的三径乘积表示肿瘤的大小。其中，年纪小于等于65岁且肿瘤三径记录清楚的患者共25例，并对这25例胃癌患者进行ACOT9基因在不同体积胃癌肿瘤中的表达水平差异的统计分析。以这25例患者肿瘤大小的中位数为分界线（cut off值），大于等于中位数为肿瘤体积较大，小于中位数为肿瘤体积较小。年纪小于等于65岁共25例胃癌患者中，13例患者肿瘤较大，12例患者肿瘤较小。

2、采用荧光定量PCR获得45对胃癌患者的癌组织和癌旁组织样本中ACOT9基因的表达水平，以上均按照实施例1中的操作方法进行。

3、统计学分析，对这25例胃癌患者进行ACOT9基因在不同体积胃癌肿瘤中的表达水平差异的统计分析。以这25例患者肿瘤大小的中位数为分界线（cut off值），大于等于中位数为肿瘤体积较大，小于中位数为肿瘤体积较小，其中13例患者肿瘤较大，12例患者肿瘤较小。

①.两样本的秩和检验，H0：两个总体分布相同，H1：两个总体分布不相同，α=0.1500（单侧）。

统计结果，T=118.0000，P=0.0187，u=-2.0669，P=0.0194。经秩和检验，按α水准拒绝H0，故可认为两组的总体分布不同。肿瘤较大的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.8017，肿瘤较小的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.0600。即肿瘤较大的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平和肿瘤较小的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平具有明显差异。

②.两样本均数比较的t′检验，H0：两个总体均数相等，即μ1＝μ2；H1：两个总体均数不等，即μ1≠μ2，α=0.1500（单侧）

统计结果：t′=2.4551，P=0.0153。经检验，按α水准拒绝H0，接受H1，故可认为两个总体均数不相等。肿瘤较大的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.8017，肿瘤较小的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平平均为1.0600。即肿瘤较大的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平和肿瘤较小的胃癌患者的ACOT9的mRNA相对表达水平具有明显差异。

以上分析通过简明统计14.0 (Concise Statistics,CS14.0)计算。如图4所示，以上统计结果说明，在年纪小于等于65岁的患者中，ACOT9的mRNA在肿瘤较大的患者相对于肿瘤较小的患者高表达，具有明显差异和统计学意义。因此可基于ACOT9基因制作用于评估胃癌肿瘤大小的试剂盒。

上述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.ACOT9基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ACOT9基因的NCBI Gene数据库Gene ID为23597。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌检测试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌检测试剂盒用于检测细胞、组织、血浆或血清中的ACOT9基因。

5.一种胃癌检测试剂盒，其特征在于，包括ACOT9基因的荧光定量PCR反应试剂。

6.如权利要求5所述的胃癌检测试剂盒，其特征在于，所述ACOT9基因的荧光定量PCR反应试剂包括ACOT9基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：

ACOT9_F：5’-GCAGTGAGCCTGAATTACGA-3’，

ACOT9_R：5’-GAGACATCTTGGCGGAGTG-3’。

7.如权利要求5所述的胃癌检测试剂盒，其特征在于，所述胃癌检测试剂盒还包括内参体系；所述内参体系为内参基因β-actin（beta-actin）的荧光定量PCR的检测体系，包括β-actin基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：

β-actin_F：5’-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3’，

β-actin_R：5’-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3’。

8.权利要求5所述的胃癌检测试剂盒在胃癌早期诊断中的应用。

9.权利要求5所述的胃癌检测试剂盒在判断胃癌分期，胃癌肿瘤瘤体情况T分期，评估胃癌肿瘤大小中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胃癌检测试剂盒评估胃癌肿瘤大小时，胃癌患者的年龄小于等于65岁。